来源
Nathan Kline研究所，纽约Orangeburg，10962，美国。 [电子邮件保护]
抽象
儿童和青少年越来越多地接触精神兴奋剂，非法或用于治疗常见的神经精神疾病，例如有和没有活动过度的注意力缺陷症。 尽管在较年轻的年龄组中广泛使用精神运动兴奋剂，但对于未成熟脑中对这些药物的慢性分子神经适应性反应知之甚少。 在这里，我们证明，在长期服用精神兴奋剂后 可卡因 和 安非他明，转录因子 DeltaFosB 在伏隔核中被上调 periadolescent 小鼠 但不是在断奶后或成年后 小鼠。 感应 DeltaFosB 也只发生在尾状壳核中 periadolescent 小鼠 after 安非他明 管理。 这些结果证明了青春期大脑中一种调节精神兴奋作用的关键分子的独特可塑性，并表明这些神经适应性变化可能参与调节 增强 青少年相对于成年人的成瘾倾向。
介绍
精神兴奋剂用于治疗常见的儿童期疾病，例如注意力缺陷多动障碍。 此外，滥用兴奋剂，包括安非他明和可卡因，在青少年中很常见，有证据表明成年人的成瘾倾向增强（Estroff等，1989; 迈尔斯和安德森，1991）。 尽管数据表明发育受调节的行为效应，但对于在施用这些药剂期间发生的未成熟脑中的分子神经适应性反应知之甚少。 可卡因和安非他明可能通过刺激多巴胺D部分地影响持久的行为改变1受体和背侧纹状体（即尾壳核）和腹侧纹状体（即伏隔核）中转录因子（包括ΔFosB）水平的增加（陈等人，1997）。 在长期接触可卡因或安非他明后，ΔFosB水平的增加（可能通过稳定蛋白质产物）持续数周，并且至少部分受多巴胺信号转导途径的调节（陈等人，1997; Nestler等，2001).
由于正常发育过程中关键分子水平的变化，包括多巴胺D在内，幼小动物的中枢多巴胺能系统非常不稳定。1受体DARPP-32（多巴胺和cAMP调节的磷蛋白; Mr 32 kDa）和cAMP（Ehrlich等，1990;Teicher等，1993; Perrone-Capano等，1996; Tarazi等人，1999;安徒生，2002）。 在此期间暴露于增强多巴胺能神经传递的精神兴奋剂可因此导致定量和/或定性不同的分子反应，包括ΔFosB表达的改变。 为了检验慢性暴露于精神兴奋剂期间存在年龄依赖性神经适应性反应的假设，在连续实验中分析了三组小鼠：成人（注射开始时60 d岁），周期性（注射开始时33 d岁），和断奶后（24在注射开始时老化）。 这是这三个年龄组中分子神经适应性反应与慢性精神兴奋剂暴露的第一次直接比较。 我们发现，在相同的治疗范例之后，围产期小鼠显示出响应于可卡因和苯丙胺的ΔFosB上调增强。
材料和方法
动物和药物管理。 将雄性CD-1小鼠（Charles River Laboratories，Kingston，NY）置于12 hr光/暗循环（6：00 AM至6：00 PM）中， 随意获得食物和水。 在开始注射之前允许动物适应动物室至少10 d。 动物由两名研究人员处理，他们在饲养动物的同一房间内进行所有注射。 所有动物在21年龄断奶。 注射开始于24（断奶后），33（periadolescent）或60（成人）d岁。 对于20，动物每天在5：4和00：5 PM之间腹膜内接受00 mg / kg可卡因（Sigma，St.Louis，MO），7 mg / kg苯丙胺（Sigma）或等体积的盐水。 在短暂暴露于CO后，通过断头处死动物2 在10：00 AM，在最后一次注射后的第二天。 立即从颅骨中取出脑，并在冰上快速解剖尾状壳核和伏隔核。 所有解剖均由单个研究者从冠状脑切片进行，并且从新鲜组织制备蛋白质提取物而不冷冻。 所有动物程序均由机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院的规定 实验动物护理和使用指南.
蛋白质印迹分析。 对于蛋白质印迹分析，在用BCA测定法测量蛋白质浓度后，将等量的蛋白质（尾状壳核的40μg和伏隔核的20μg）加载到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中（Pierce，罗克福德，伊利诺伊州）。 在转移至硝酸纤维素和/或用抗肌动蛋白抗体（1：500; Sigma）印迹后，通过Ponceau Red可视化总蛋白质也证实了相等的蛋白质负载量。 识别ΔFosB同种型的Fos相关抗原（FRA）抗血清由M.Iadarola博士（美国国立卫生研究院，Bethesda，MD）慷慨提供，并以1：4000的浓度使用。 之前的学习 （陈等人，1997; Hiroi等，1997），包括用M-肽免疫原预吸附FRA抗血清，证明了该抗血清的特异性。 用于32：5的DARPP-1 10,000a单克隆抗体由Drs慷慨提供。 Hugh Hemmings和Paul Greengard（洛克菲勒大学，纽约，纽约）。 多巴胺转运蛋白（DAT）抗体来自 Chemicon公司 （特曼库拉，加利福尼亚州）。 将印迹与NEN-DuPont（Boston，MA）化学发光系统反应并暴露于膜。 使用ScanAnalysis for Apple（Biosoft，Ferguson，MO）获得ΔFosB免疫反应性的光密度值。 使用单向ANOVA确定统计学显着性，然后是 事后 Tukey的多重比较测试或未配对的两尾学生的 t 测试如图例中所示。 对于药物治疗实验，每个年龄组的分析在单独的印迹上进行，因此，每个盐水组任意地指定100％值用于年龄组之间的比较。 对于个体发育研究，来自所有年龄组的样品在单个印迹上一起分析。
成果
可卡因和苯丙胺诱导ΔFosB仅发生在周围小鼠的伏隔核中
在安非他明或可卡因给药的7 d后，在断奶后，青春期和成年小鼠的伏隔核和尾壳核中测量ΔFosB的表达。 伏隔核是被认为对于调节精神兴奋剂的奖赏效果最关键的大脑区域。 在长期服用安非他明后，在周围动物的伏隔核中选择性诱导ΔFosB免疫反应性（35 kDa）（图2）。 1 A）或可卡因（图。 1 B）。 相反，断奶后或成年动物的伏隔核中ΔFosB（35 kDa）的水平没有显着改变（图。1 A,B）。 在尾状壳核中，ΔFosB水平（35 kDa）在仅在早期动物中施用慢性安非他明后也显着上调（图2）。2 A）。 所有三个年龄组在长期服用可卡因后显示尾壳核中ΔFosB（35 kDa）表达显着增加（图2）。2 B）。 然而，在围产期动物中诱导的程度最大，特别是与断奶后相比（图2）。 2 B）。 其他FRA和Fos同种型在所有年龄组中都未改变（数据未显示）。
慢性精神兴奋剂给药后伏隔核中的ΔFosB免疫反应性。 从第1天开始，CD-7小鼠每天注射一次盐水，安非他明或可卡因用于24 d（请在24月XNUMX日至XNUMX日来台北台湾参观我们的展位PXNUMX。; 断奶后），日33（请在33月XNUMX日至XNUMX日来台北台湾参观我们的展位PXNUMX。; periadolescent），或天60（成人）。 慢性安非他明后显示伏隔核中ΔFosB（35 kDa）免疫反应性的水平（A）或可卡因（B管理。 来自盐水的代表性免疫印迹 - （S），安非他明 - （A）和可卡因 - （C注入后断奶（请在24月XNUMX日至XNUMX日来台北台湾参观我们的展位PXNUMX。），periadolescent（请在33月XNUMX日至XNUMX日来台北台湾参观我们的展位PXNUMX。），成年小鼠显示在 顶部面板. 底板 显示基础ΔFosB表达的平均值±SEM百分比。 n 每组的值显示在 酒吧。 仅在周围小鼠的伏隔核中发现ΔFosB显着增加。 *p <0.05； **p <0.01（学生的 t 测试; 生理盐水与药物）。
慢性精神兴奋剂给药后尾状壳核的ΔFosB免疫反应性。 从第1天开始，CD-7小鼠每天注射一次盐水，安非他明或可卡因用于24 d（P24; 断奶后），日33（请在33月XNUMX日至XNUMX日来台北台湾参观我们的展位PXNUMX。; periadolescent），或天60（成人）。 慢性安非他明后显示尾状壳核中ΔFosB（35 kDa）免疫反应性的水平（A）或可卡因（B管理。 来自盐水的代表性免疫印迹 - （S），安非他明 - （A）和可卡因 - （C）注射周围小鼠（请在33月XNUMX日至XNUMX日来台北台湾参观我们的展位PXNUMX。）显示在顶部面板. 底板 显示基础ΔFosB表达的平均值±SEM百分比。 n 每组的值显示在 酒吧。 仅在白化病小鼠的尾状壳核中发现显着的安非他明诱导的ΔFosB免疫反应性增加（A）。 慢性可卡因给药导致所有三个年龄组的ΔFosB增加（B）。 *p <0.05； **p <0.01（学生的 t 测试; 生理盐水与药物）。
慢性可卡因或安非他明后，DAT和DARPP-32水平不会改变
由多巴胺能和/或多巴胺能神经元表达的几种关键分子，包括DARPP-32，D1 多巴胺受体和DAT有助于对精神兴奋剂的急性和慢性反应（Moratalla等，1996; Fienberg等，1998; Sora等人，1998; Gainetdinov等，2001）。 来自DARPP-32，D的数据1 受体和DAT null和DAT敲低小鼠表明它们的水平之间的复杂关系，多巴胺能活性的调节和对精神兴奋剂的反应。 事实上，在接受慢性可卡因的DARPP-32无效小鼠中不会发生ΔFosB诱导（Fienberg等，1998）。 然而，在成年小鼠中，7 d暴露于20 mg / kg可卡因不会改变DARPP-32的总水平（Fienberg等，1998）。 DAT蛋白调节先前在长期暴露于精神兴奋剂的小鼠中尚未见报道，尽管有些物种报告放射性配体与接触精神兴奋剂后多巴胺转运蛋白结合的改变（Letchworth等，2001）。 在这里，我们测量了DARPP-32和DAT蛋白的水平，以确定这些蛋白的表达在三种小鼠的任何一年中的慢性精神兴奋剂给药后是否被改变。 我们的研究结果表明，在三个年龄组中任何一个年龄组中长期服用可卡因或安非他明后，整个尾状壳核或伏隔核中总DARPP-32或DAT水平没有显着变化（表 1).
ΔFosB的基线水平受发育调节
我们检查了ΔFosB的个体发育，因为在纹状体中具有基因工程增加的ΔFosB表达的成年小鼠对精神兴奋剂具有更高的行为反应（Kelz等人，1999）。 我们发现，在尾状壳核和伏隔核中，年轻动物的ΔFosB基线水平显着低于成年人（图2）。3 A）。 多巴胺系统功能标志物的水平，包括DARPP-32（Ehrlich等，1990），DAT（Perrone-Capano等，1996）和多巴胺受体（Teicher等，1993; Tarazi等人，1999）也受到发展监管。 CD-1小鼠先前的报道表明出生后第32天线（P28）纹状体DARPP-28达到峰值（Ehrlich等，1990）。 在大鼠尾壳核和伏隔核中，D1受体水平峰值从P28到P40（Teicher等，1993; Tarazi等人，1999但是，在小鼠中尚未进行类似的研究。 相反，在这里我们发现尾状壳核和伏隔核中的DAT蛋白水平在出生后第24天和成年期之间是恒定的（图2）。 3 B）。 因此，D之间的相对比率1 受体，DAT，DARPP-32和ΔFosB在不同年龄组之间有所不同，可能导致D的差异1 受体活性可能影响ΔFosB诱导的程度。
ΔFosB和DAT的发育表达。 A，ΔFosB（35-37 kDa）在幼稚CD-1小鼠的尾状壳核和伏隔核中的免疫反应性随年龄而变化。 代表性的免疫印迹显示在 顶部面板.底板 显示每组三只小鼠的平均值±SEM。 *p <0.05，成人vs P24； ＃p <0.05，成人vs P36（ANOVA后的Tukey多重比较测试）。 B，作为年龄函数的幼稚CD-1小鼠尾壳核和伏隔核中DAT免疫反应性的密度值。 DAT水平在三个年龄组之间没有差异。
讨论
精神运动兴奋剂的行为影响与年龄有关。 当非法物质的使用升级时，青春期的成瘾倾向最高（Estroff等，1989; 迈尔斯和安德森，1991）。 事实上，年幼的孩子在接触精神兴奋剂时经常会变得烦躁不安，而青少年和成年人则会感到欣快（Rapoport等，1980）。 在啮齿动物模型中，一些研究表明，青春期前动物的基线活动水平较高（Spear and Brake，1983并且相对于年轻和年长的动物，改变了对精神兴奋剂的反应。 因此，相对于断奶和成年动物，它们响应于急性低剂量施用精神兴奋剂而表现出较少的运动刺激和新奇寻求，但是在高剂量治疗后增加的过度活跃。 与成人相比，慢性给药对于可卡因诱导的运动的敏感性在早期大鼠中更大，而对刻板症的敏感性更低。 此外，微透析数据显示，在对安非他明诱导的多巴胺释放敏感方面，青春期和成年大鼠之间存在差异（Laviola等，1995; Adriani等，1998; Adriani和Laviola，2000;Laviola等，2001）。 然而，在青春期大鼠服用哌醋甲酯后对可卡因的长期反应性存在相互矛盾的研究（Brandon等，2001; Andersen等，2002）。 后两个报告强调了在使用不同实验范例时比较研究的困难。 通过使用不同的物种和菌株，进一步混淆了比较年轻动物的行为研究的尝试。
在精神兴奋剂的使用和滥用研究中，小鼠正成为越来越重要的动物模型，这是对小鼠或任何其他单一物种的三个不同发育年龄的分子神经适应性反应的首次系统分析。 我们得出治疗范例的先前研究表明，慢性可卡因和安非他明给药后，野生型成年大鼠离体背侧和腹侧纹状体的ΔFosB增加（Hope等人，1994; Nye等，1995; Turgeon等人，1997）但仅在慢性可卡因后的野生型成年小鼠的背侧和腹侧纹状体或孤立的背侧纹状体中合并（Fienberg等，1998; Zachariou等，2001).
我们现在证明断奶后，衰老和成年小鼠中精神兴奋剂诱导的ΔFosB的空间和数量差异。 与可卡因和安非他明治疗的小鼠相比，在成人和断奶后与动物和成年人之间的反应相似的观察结果得到了加强。 精神兴奋剂可卡因和安非他明都可以通过不同的机制增加突触多巴胺以及血清素和去甲肾上腺素。 可卡因与质膜转运蛋白结合，可以检测多巴胺，血清素和去甲肾上腺素，并抑制它们再摄入突触前末梢。 相比之下，安非他明促进了这些发射器的释放。 在兴奋剂施用7 d后，仅在周围年龄组的伏隔核中选择性诱导ΔFosB，并且在尾状壳核中相对较高的ΔFosB诱导可能是神经生物学表现或之前指出的滥用精神兴奋剂的趋势增加的原因。年龄阶层 （Estroff等，1989; 迈尔斯和安德森，1991）和基因表达的其他长期变化，不同年龄组（Andersen等，2002）。 此外，这些差异可能通过关键分子水平的发育变化来固有地调节，包括ΔFosB本身。 年龄组间ΔFosB基线水平差异的潜在影响类似于大鼠品系之间差异的建议（Haile等，2001）。 事实上，我们预计在近交系小鼠中会发现类似的菌株差异。 不同年龄的小鼠也可能在除伏隔核之外的脑区域中显示出不同的分子适应性。 使用关键分子水平和同时行为观察的遗传工程改变的periadolescent小鼠的额外分析将进一步测试这些假设。
脚注
- 收到 四月8 2002。
- 收到修订 August 6，2002。
- 已接受 August 8，2002。
这项工作得到美国国立卫生研究院/国家神经疾病研究所和中风格兰特NS41871（MEE和EMU）和国家药物滥用研究所P30-DA13429（EMU）的支持。
通讯应发给Michelle E. Ehrlich博士，Thomas Jefferson大学，Curtis 310，1025 Walnut Street，Philadelphia，PA 19107。 电子邮件： [电子邮件保护].
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