PSMC5，一种19S蛋白酶体ATP酶，调节伏隔核中的可卡因作用（2015）

公共科学图书馆之一。 2015 May 11; 10（5）：e0126710。 doi：10.1371 / journal.pone.0126710。 eCollection 2015。

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T.3, 大野M4, 肯尼迪PJ5, Yasuyuki O.6, 西A7, Neve R8, Tsuzuki T.4, Nestler EJ5.

抽象

ΔFosB是一种稳定的转录因子，可响应长期暴露于可卡因或其他滥用药物而积累在伏隔核（NAc）中，伏隔核是大脑奖励电路的关键部分。 尽管已知ΔFosB与Jun家族成员异源二聚体形成一个活性转录因子复合物，但迄今为止，还没有对大脑中ΔFosB的其他可能的结合伴侣进行开放式研究。 在这里，通过使用酵母双杂交测定法，我们将PSMC5（也称为SUG1）（一种19S蛋白酶体复合物的含ATPase的亚基）识别为与ΔFosB的新型相互作用蛋白。 我们验证了NAc中内源性ΔFosB和PSMC5之间的这种相互作用，并证明这两种蛋白还与其他与基因激活相关的染色质调节蛋白形成复合物。 我们继续表明，慢性可卡因增加了NAc中PSMC5的核水平，但不增加其胞质水平，并且该脑区域中PSMC5的过表达促进了对可卡因的运动反应。 总之，这些发现描述了一种有助于ΔFosB作用的新颖机制，并且首次将PSMC5牵涉到可卡因诱导的分子和行为可塑性中。

引文： Ohnishi YH，Ohnishi YN，Nakamura T，Ohno M，Kennedy PJ，Yasuyuki O，et al。 （2015）PSMC5，一种19S蛋白酶体ATP酶，调节伏隔核中的可卡因作用。 PLoS ONE 10（5）：e0126710。 DOI：10.1371 / journal.pone.0126710

学术编辑： 詹姆斯埃德加麦卡琴，莱斯特大学，英国

收稿日期： 12月10，2014; 公认： 四月7，2015; 出版日期： 2015 年 5 月 11 日

版权： ©2015 Ohnishi等。 这是一份根据条款分发的开放获取文章 知识共享署名许可，如果原始作者和来源被记入贷方，则允许在任何媒体中不受限制地使用，分发和复制

数据可用性： 所有相关数据都在论文中。

资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院，国家药物滥用研究所以及石桥基金会和日本科学促进会（KAKENHI编号：24591735，26290064，25116010）的资助。 资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称没有竞争利益存在。

介绍

ΔFosB，一种截短的产物 FOSB 基因，属于转录因子的Fos家族，其还包括c-Fos，全长FosB，Fra-1和Fra-2。 与其他Fos蛋白一样，ΔFosB与Jun家族蛋白-c-Jun，JunB或JunD-异二聚体形成活性AP-1（激活蛋白-1）转录因子复合物，其诱导或抑制特定靶基因的表达[1,2].

ΔFosB已被证明在药物成瘾中起关键作用[2]。 Fos家族蛋白质中独一无二，由于其高水平的稳定性，它在重复给药后累积在伏隔核（NAc）和其他与奖赏相关的脑区[3,4]，由缺乏C末端degron结构域和几种蛋白激酶的磷酸化介导[]5–7]。 NAc中ΔFosB的这种诱导介导了对滥用药物的行为反应的增加。 因此，通过使用病毒载体或可诱导的转基因小鼠，在成年动物的这个大脑区域中过表达ΔFosB，增加了动物对可卡因和鸦片制剂的运动激活和奖赏效果的敏感性以及动物自我管理的动机。可卡因[7–11]。 相反，ΔFosB的显性负性拮抗剂的过度表达导致相反的行为表型[10–12].

我们和其他人之前已经通过使用凝胶迁移试验证实，JunD和其他Jun家族蛋白是体内ΔFosB的主要结合伴侣[13–15]。 然而，到目前为止，尚未对ΔFosB在大脑中的结合配偶进行开放式，无偏见的评估。 在这里，我们试图通过使用酵母双杂交分析鉴定ΔFosB的新型结合配偶体[16,17]。 我们的数据显示PSMC5，也称为SUG1，是体外和体内NAc的ΔFosB的强有力的合作伙伴，其中它作为可卡因诱导的转录激活复合物的一部分加入ΔFosB，其也含有CBP（CREB结合蛋白）。 ）和p300-两种组蛋白乙酰转移酶（HATs） - 以及BRG1（染色质重塑蛋白）。 我们继续表明长期暴露于可卡因会改变NAMC中PSMC5（一种含有ATP酶的19S蛋白酶体复合体亚基）的核水平，而PSMC5则反过来控制对可卡因的行为反应。

材料与方法

酵母双杂交筛选

用pDBLeu共转染MaV203酵母细胞（Invitrogen Life Technologies），驱动ΔFosB蛋白的不同片段，并将小鼠脑文库亚克隆到pPC86（Invitrogen Life Technologies）中。 转化的细胞在缺乏亮氨酸，色氨酸和组氨酸的SC培养基上生长，并含有10 mM的3-氨基三唑。 FosB片段与候选伴侣之间的结合诱导三个报告基因（His3, Ura3及 的LacZ诱导使转化体能够在所用的培养条件下存活。 通过MaV203细胞中的再转化测定，用新鲜的pDBLeu-ΔFosB片段重新测试阳性克隆。

细胞系

小鼠神经2A神经母细胞瘤细胞（ATCC）维持在Eagle的最低必需培养基（EMEM）（ATCC）中，并在10°C和37％CO的条件下补充了5％胎牛血清（FBS）2。 大鼠1A细胞是来自Yusaku Nakabeppu（日本福冈）的礼物[18并维持在Dulbecco的MEM（DMEM）（Life Technologies）中，在10°C和37％CO中补充5％FBS2。 使用Effectene（Qiagen）根据制造商的说明书用质粒DNA转染细胞。

PSMC5和ΔFosB构造

产生几种突变形式的PSMC5，每个在其N-末端标记FLAG，用于免疫沉淀或病毒介导的基因转移实验。 这些包括：PSMC5-K196M，PSMC5-Δ卷曲螺旋结构域（PSMC5-ΔCC，缺少氨基酸27-68），PSMC5-NT（由蛋白质的N-末端片段，氨基酸1-151组成）和PSMC5。 -CT（由蛋白质的C末端片段，172氨基酸组成）（参见 图1）。 我们还利用N末端MYC标记形式的野生型ΔFosB以及ΔFosB，其亮氨酸 - 拉链结构域发生突变（氨基酸182突变为205，已知其与Jun家族蛋白的异二聚化作用已被消除[6].

缩略图
图1。 ΔFosB在体外与PSMC5结合。

 

A.ΔFosB，ΔFosB-LZM的示意图，其中亮氨酸拉链结构域被突变以消除与Jun蛋白的ΔFosB异二聚化，和Δ2ΔFosB，其缺少ΔFosBN-末端的第一个78氨基酸。 B. PSMC5，PSMC5-NT的示意图，其包含PSMC151的第一个5氨基酸，缺少PSMC5的第一个235氨基酸的PSMC5-CT，以及缺乏卷曲螺旋结构域的PSMC5-ΔCC（氨基酸28-68） 。 AAA结构域对应于许多ATP酶中存在的基序ATP酶，其与多种细胞活性相关。 C.将2.4μg的pcDNA3.1-ΔFosB（泳道1-4）或ΔFosB-LZM（泳道5）与2.4μg的FLAG标记的PSMC5或各种缺失突变体共转染到Neuro2a细胞中。 转染后两天，裂解细胞并用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后用抗ΔFosB或抗FLAG抗体进行蛋白质印迹。 注意，ΔFosB而非ΔFosB-LZM与PSMC5或PSMC5-NT结合稳健，但不与PSMC5-CT或PSMC5-ΔCC结合。 在三个独立实验的每一个中，图中所示的数据一式三份地复制。

DOI：10.1371 / journal.pone.0126710.g001

动物

将9至11周龄的C57BL / 6J雄性小鼠（The Jackson Laboratory）用于所有实验。 将动物圈养在12-h光 - 暗循环中，获得食物和水 随意 并且在实验前一周习惯了1。 使用了两种可卡因治疗方案。 为了研究可卡因的生化作用，给予动物7每日剂量的可卡因（20 mg / kg）或盐水，并在最后一次注射后通过断头24小时杀死。 这是一种标准方案，已被证明可对该药物产生大量分子和细胞反应[7]。 为了研究伏隔核中PSMC5对可卡因行为反应的影响，我们使用亚阈值剂量的药物（7.5 mg / kg;参见下文的运动致敏），基于PSMC5与ΔFosB一样会增加动物对其的敏感性的假设。可卡因[8]。 所有动物实验均由西奈山的机构动物护理和使用委员会批准。

免疫沉淀和Western印迹

用野生型或突变形式的PSMC2转染神经5A细胞。 转染后两天，将细胞在PBS中洗涤，在RIPA缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，10 mM丁酸钠，蛋白酶抑制剂混合物）中裂解。 。 将裂解物分开并与3℃下的非免疫IgG（Sigma）或抗FLAG抗体（Sigma）一起孵育4 hr。 如所述，用蛋白G珠（Invitrogen）进行免疫沉淀[19]。 简而言之，将免疫沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE并使用基于公开的方案的抗-FosB /ΔFosB抗体（Cell Signaling Technology）通过Western印迹进行分析[7]。 对于体内蛋白质结合测定，我们使用来自慢性可卡因治疗后小鼠的穿孔解剖NAc的纯化核部分（20 mg / kg IP每天7天，小鼠在最后一次注射后使用24 hr）。 使用Nuclear Complex Co-IP试剂盒（Active Motif）按照制造商的说明进行来自核级分的共免疫沉淀。 使用以下抗体：MYC或β-肌动蛋白，Cell Signaling Technology（Danvers，MA），PSMC5和组蛋白H3，Abcam（Cambridge，MA），CBP，p300和BRG1，Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA），和FLAG M2，Sigma。

免疫组化

根据公布的程序进行免疫组织化学[20]。 将小鼠麻醉并用PBS中的4％多聚甲醛心内灌注。 用30％蔗糖对脑进行冷冻保护，然后冷冻并在-80℃下储存直至使用。 在低温恒温器上切割冠状切片（40μm）并进行免疫组织化学处理。 将自由漂浮的切片在含有0.3％Triton和3％正常驴血清的封闭缓冲液中预温育。 使用针对蛋白质的N-末端部分产生的山羊多克隆抗体（1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology）检测ΔFosB。 使用兔多克隆抗体（5 / 1 Abcam，Cambridge，MA）检测PSMC100。 用共聚焦显微镜（60x放大倍数; Zeiss）拍摄图像。

运动致敏

所有小鼠每天接受IP注射盐水3天以使它们适应注射的压力。 第二天，给小鼠IP注射生理盐水或亚阈值剂量的可卡因（7.5 mg / kg;参见上面的动物）并立即置于新型运动箱中。 使用光束系统记录小鼠的运动活性，作为30 min的动态束断裂。 每天重复这些治疗3天。

病毒介导的基因转移

我们使用了广泛发表的病毒介导的基因转移方法[7,8,11,19]。 简而言之，将PSMC5或其几种突变体（参见上文的PSMC5和ΔFosB构建体）的表达质粒亚克隆到在CMV启动子控制下表达GFP的双顺反子p1005（+）HSV质粒中，并且将PSMC5或其突变体置于其下。 IE4 / 5启动子。 在氯胺酮（100 mg / kg）/甲苯噻嗪（10 mg / kg）麻醉下，将小鼠置于小动物立体定位仪器中，并暴露颅表面。 使用三十三个规格的注射器针头以0.5μl/ min的速率将10μlHSV载体以1.6°角（AP + 1.5; ML + 4.4; DV-0.1）双侧输注到NAc中。 在实验之前，允许接受HSV注射的动物在手术后恢复2天。

统计报表

使用方差分析和学生t检验，进行多次比较校正，显着性设置为p <0.05。

成果

PSMC5：ΔFosB的新型结合配偶体

我们进行了初步实验以鉴定ΔFosB的适当片段，其在酵母双杂交测定中用作诱饵而不自动激活系统。 Holo-ΔFosB本身诱导了报告基因活性，蛋白质的N-末端1-78氨基酸片段也是如此。 然而，N端截断的ΔFosB（图1A称，缺乏蛋白质的第一个2氨基酸的Δ78ΔFosB没有这种作用。 因此，我们使用Δ2ΔFosB作为诱饵蛋白。

为了筛选潜在的结合配偶体，我们使用了亚克隆在pPC86中的小鼠脑库。 我们为绑定伙伴确定了11候选者。 虽然这些蛋白质包括ΔFosB已知的异二聚化配偶体，c-Jun和JunD（表1），迄今为止最流行的候选人是PSMC5。 虽然令人惊讶，但这是一个有趣的发现，因为多年前PSMC5在一份报告中显示在体外与c-Fos结合[21]。 但是，之前没有关于PSMC5参与可卡因行动的报道。 然而，由于酵母双杂交测定中PSMC5信号的强度，我们开始进一步研究可能的ΔFosB-PSMC5相互作用。

缩略图
表1。 用Δ2ΔFosB进行酵母双杂交筛选的结果。

DOI：10.1371 / journal.pone.0126710.t001

首先，为了确认ΔFosB和PSMC5之间的物理相互作用，我们进行了体外共免疫沉淀实验。 我们发现了FLAG标记的PSMC5（图1B），转染到神经2A细胞中，有效地拉下ΔFosB（图1C）。 其次，为了鉴定PSMC5中负责其与ΔFosB结合的区域，我们生成了几个带有FLAG标记的PSMC5突变体（图1B）并重复免疫共沉淀实验。 使用PSMC151（PSMC5-NT）的N-末端5氨基酸有效地下拉ΔFosB，但不与蛋白质的C-末端172氨基酸片段（PSMC5-CT）（图1C）。 缺乏卷曲螺旋结构域（PSMC5-ΔCC）的PSMC5在沉淀ΔFosB方面也是无效的。 这些发现表明PSMC5通过其卷曲螺旋结构域（氨基酸27-68）结合ΔFosB。 此外，FLAG标记的PSMC5不会突变突变形式的ΔFosB与突变的亮氨酸拉链结构域（ΔFosB-LZM）（图1C），表明ΔFosB通过该结构域结合PSMC5，或更可能地，PSF5结合需要ΔFosB异二聚体化。

慢性可卡因给药后PSMC5-ΔFosB在NAc中的结合

基于这些体外研究结果，我们研究了NAc中PSMC5水平是否因慢性可卡因给药而改变。 我们通过亚细胞分离和蛋白质印迹发现慢性可卡因在这个脑区增加PSMC5的核水平，而细胞质水平没有变化（图2A）。 单剂量可卡因后未见这种效果（数据未显示）。 我们接下来通过共聚焦免疫荧光显微镜检查了PSMC5和ΔFosB在NAc中的定位。 我们在最后一次重复剂量的可卡因后分析了小鼠24小时，这是ΔFosB是唯一可检测的时间点。 FOSB 基因产物（参见Nestler 2008）。 我们在NAc中发现了强烈的PSMC5免疫反应性，包括强核信号。 ~85％的ΔFosB+细胞核共染色为PSMC5（图2B）。 此外，我们对NAc提取物进行了共免疫沉淀实验，发现在慢性可卡因处理后，ΔFosB被抗PSMC5抗体有效地降低（图2C）。 相反，对未经药物治疗的NAc（重复盐水注射后）的分析显示没有可检测的ΔFosB下拉（数据未显示）。 这些数据与我们在细胞培养中的发现一致，并证实ΔFosB和PSMC5在体内NAc中相互作用。

缩略图
图2。 小鼠NAc中的PSMC5调节。

 

A.每天用盐水或可卡因（20 mg / kg）处理7天的小鼠的NAc的核和胞浆级分的Western blotting，最后一次注射后24小时分析动物。 可卡因增加PSMC5的核水平但不增加其胞质水平。 不受可卡因影响的组蛋白H3和ß-肌动蛋白用作负荷对照。 数据为平均值±SEM（n = 8-10 /组，* p <0.05）。 B.慢性可卡因处理后，用可卡因长期治疗的小鼠的NAc中内源性PSMC5（绿色）和ΔFosB（蓝色）的共定位，将慢性可卡因处理后的小鼠NAc的核裂解液用抗PSMC5抗体或小鼠IgG作为对照进行免疫沉淀，然后用抗FosB /ΔFosB抗体进行蛋白质印迹。 该图证明了体内NAc中的PSMC5-ΔFosB相互作用。 B和C中的数据在三个单独的实验中的每一个中重复三次。

DOI：10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5在体外增强ΔFosB表达

由于PSMC5是蛋白酶体复合物的已知成员，我们测试了它是否使用大鼠1A细胞调节ΔFosB水平。 PSMC5过表达对ΔFosB的基础水平没有影响，但在血清刺激细胞时引起ΔFosB诱导的小但显着的增强（图3A）。 对于全长FosB，也出现了类似的趋势，但效果没有达到统计学意义。 相反，通过使用靶向PSMC5的siRNA实现的对大鼠1A细胞中内源性PSMC5表达的抑制不影响基础ΔFosB水平，但通过血清刺激强烈抑制ΔFosB诱导（图3B）。 对全长FosB也有类似的影响。 这些数据表明PSMC5不会促进ΔFosB的蛋白酶体降解，正如蛋白酶体的核心亚基所预期的那样，而是需要最大积累的蛋白酶体。 FOSB 体外基因产物，可能通过稳定蛋白质。

缩略图
图3。 PSMC5调节大鼠1A细胞中FosB /ΔFosB的表达。

 

A.大鼠1A细胞用4μgPSMC5或对照DNA转染。 通过Western印迹测定，PSMC5过表达对FosB或ΔFosB蛋白的基础表达水平没有影响，但通过血清刺激对ΔFosB的诱导产生了小幅但显着的增加（F（2,21）= 9.75，p = 0.001）。 B.用1 pmol的两种siRNA或加扰的RNA（对照）转染大鼠5A细胞。 与对照条件相比，两种siRNA均有效降低了PSMC5蛋白水平（siRNA＃1，占对照的23±5％； siRNA＃2，18±6％； p <0.05； n = 4）。 PSMC5敲低对基础水平的FosB或ΔFosB无影响，但通过血清刺激减弱了FosB和ΔFosB的诱导（FosB：F（2,6）= 20.99，p = 0.002;ΔFosB：F（2,6）= 22.83 ，p ＝ 0.002）。

DOI：10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB和PSMC5与NAc中的CBP，p300和BRG1形成复合物

为了更好地理解PSMC5可能影响ΔFosB功能的转录机制，我们研究了在慢性可卡因处理条件下NAc中两种蛋白质可能的其他结合配偶体。 有一篇报道称PSMC5与CBP-a HAT结合，并增加HeLa细胞中MHC-II近端启动子的组蛋白H3乙酰化[22]。 此外，缺乏CBP的小鼠表现出对可卡因的行为敏感性降低以及组织中乙酰化的减少。 FOSB 发起人[23]。 因此，我们测试了PSMC5是否可能与ΔFosB结合，作为也包含CBP和可能还有其他转录激活因子的复合物的一部分。

我们首先证明了ΔFosB在Neuro300A细胞中有效地降低了CBP和相关HAT的p2（图4A）。 相反，如所预期的，ΔFosB的亮氨酸拉链突变体形式没有表现出这种活性。 同样，PSMC5有效地拉低了CBP和p300（图4B）。 有趣的是，对于PSMC5-ΔCC也观察到这种效应，其没有降低ΔFosB，表明PSMC5通过蛋白质的其他结构域与CBP和p300相互作用并且独立于其与ΔFosB的结合。

缩略图
图4。 ΔFosB和PSMC5在体外和体内与CBP，p300和BRG1相互作用。

 

A.用2μg的MYC标记的ΔFosB或MYC标记的ΔFosB-LZM转染Neuro2.4A细胞。 用抗CBP或抗p300抗体免疫沉淀细胞提取物，并用相同抗体或抗MYC抗体对沉淀物进行Western印迹。 CBP和p300都与ΔFosB相互作用，这种相互作用需要完整的亮氨酸拉链。 B.用2μgFLAG标记的PSMC2.4或FLAG标记的PSMC5-ΔCC转染Neuro5A细胞。 用抗CBP或抗p300抗体免疫沉淀细胞提取物，并用相同抗体或抗FLAG抗体对沉淀物进行蛋白质印迹。 CBP和p300都与PSMC5交互，并且此类交互不需要CC域。 C.用抗CBP或抗p300抗体对慢性可卡因处理后小鼠NAc的核裂解物进行免疫沉淀。 随后用抗FosB /ΔFosB抗体对所得沉淀物进行Western印迹显示ΔFosB和CBP / p300之间的内源性相互作用。 D.用抗-BRG1或抗-PSMC5抗体对相同核裂解物的等分试样进行免疫沉淀，然后用抗-FosB /ΔFosB或抗-BRG1抗体对沉淀物进行Western印迹。 结果显示ΔFosB和BRG1以及BRG1和PSMC5之间的内源性相互作用。 E.由ΔFosB：JunD异二聚体与CBP / p300，BRG1和PSMC5相互作用组成的转录激活复合物的示意图。

DOI：10.1371 / journal.pone.0126710.g004

为了证实这些相互作用也在体内发生，我们长期施用可卡因以诱导ΔFosB和核PSMC5水平，然后用抗CBP或抗p300抗体免疫沉淀NAc提取物。 与我们的细胞培养数据一致，CBP或p300的免疫沉淀有效地降低了ΔFosB（图4C）。 我们测试了BRG1，SWI-SNF染色质重塑复合物的核心亚基是否也可能与ΔFosB和PSMC5结合，这是基于我们之前的发现，BRG1被招募到某些ΔFosB靶基因，与慢性可卡因后NAc的激活一致[24]。 我们发现BRG1的免疫沉淀降低了NAc提取物中的ΔFosB，并且PSMC5的免疫沉淀同样共沉淀了内源性BRG1（图4D）。 总之，这些结果表明ΔFosB-PSMC5在NAc中形成复合物，其还包括CBP / p300和BRG1（图4E).

PSMC5过表达增加了对可卡因的运动反应

PSMC5与ΔFosB在NAc中的显着结合促使我们研究在该脑区域中增加PSMC5水平是否调节对可卡因的行为反应。 我们生成了一种过表达野生型PSMC5或其突变体之一的单纯疱疹病毒（HSV）载体，并验证了体内NAc中的载体（图5A）。 病毒介导的PSMC5表达在细胞核中占优势（图5B）。 过量表达野生型PSMC5的小鼠对初始剂量的可卡因没有显示出改变的反应，但与表达GFP的对照小鼠相比，显示响应于重复可卡因剂量的运动激活增加。 相反，过表达缺乏其卷曲螺旋结构域（PSMC5-ΔCC）的突变形式的PSMC5的小鼠没有表现出这种效果（图5B）。 有趣的是，PSMC5-K196M的过量表达，其缺乏野生型蛋白的ATP酶活性，也增强了可卡因的运动反应。

缩略图
图5。 在NAc中PSMC5过表达增加了对可卡因的运动反应。

 

A.在内侧NAc中代表性的HSV介导的转基因表达。 AC，前连合。 NAc核心和外壳子区域在图中标出。 B.HSV-PSMC60注射后，NAc神经元中PSMC5的免疫组织化学染色的代表性高倍放大倍数（5x），显示该蛋白主要是核蛋白，如DAPI染色所示。 C.小鼠接受双侧HSV注射到NAc中，然后每天IP注射亚阈值以下剂量的可卡因（7.5 mg / kg）。 示出了对3种每日日剂量的药物的响应中的运动响应。 PSMC5或PSMC5-K196M的过表达增加了对重复可卡因的运动反应，而PSMC5-ΔCC则没有这种作用。 转基因对可卡因初始剂量的运动反应没有明显影响。 通过Dunnett的事后检验，方差分析F（3,125）= 4.163，* p <0.05

DOI：10.1371 / journal.pone.0126710.g005

讨论

本研究的结果揭示了ΔFosB介导其对大脑的影响的新机制以及涉及可卡因作用的新机制。 通过使用无偏方法，酵母双杂交测定，我们鉴定了PSMC5作为ΔFosB的新型结合配偶体。 我们通过证明稳健的PSMC5-ΔFosB结合，在体外培养细胞和体内NAc中验证了这一发现。 重要的是，通过慢性可卡因给药在NAc中诱导PSMC5的核水平。 我们进一步显示PSMC5-ΔFosB结合与几种其他转录激活蛋白，即CBP和p300（两种HAT）和BRG1（SWI-SNF染色质重塑复合物的关键组分）一起发生。 总之，我们的研究结果支持PSMC5是转录激活复合物的一部分的假设，该复合物在慢性可卡因给药过程中被招募至少某些ΔFosB诱导的基因（图4E）。 与此假设一致的另一个发现是，PSMC5在NAc中的过表达，如ΔFosB本身的过表达，促进了对可卡因的行为反应。 在未来的研究中，通过使用体外报道分子测定来跟踪这些体内观察以及PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1相互作用的表征将是有趣的。

PSMC5参与可卡因行动是完全新颖的。 最初鉴定为包含蛋白酶体的大家族ATP酶成员，多年来已证明PSMC5与几种转录因子相互作用，包括c-Fos，p53，核激素受体和基础转录复合物的成分[25然而，多年来几乎没有进行过功能研究[26]。 其最佳作用是促进培养细胞中MYC转录因子的活性[27]。 PSMC5在转录机制中的意义表明泛素化 - 蛋白酶体活性在基因转录调控中的潜在作用，但PSMC5在此类调节中的参与迄今为止几乎未经检验[28,29].

关于PSMC5在大脑中的功能知之甚少。 早期的一项研究表明PSMC5 mRNA在整个脑中广泛表达[30]，但其功能活动仍未得到研究。 我们的研究结果现在促使进一步研究这种有趣的蛋白质，以更好地了解它在调节基因转录中的作用及其与大脑中泛素化 - 蛋白酶体功能的关系。 PSMC5与ΔFosB的结合由PSMC5的卷曲螺旋结构域介导。 此外，PSMC5促进对可卡因的运动反应的能力，同时需要卷曲螺旋结构域，不需要蛋白质固有的ATP酶活性。 这些结果提出了这样的可能性，即至少在我们的系统中，PSMC5的主要活性可能是通过其与ΔFosB和其他转录调节蛋白的结合而非通过其蛋白酶体相关活性本身来介导的。 需要进一步的工作来直接测试这种和替代的可能性。 尽管使用5天可卡因治疗方案，病毒介导的PSMC3过度表达通过与ΔFosB的相互作用增加对可卡因的运动反应的假设是合理的，因为已知在这个时间范围内ΔFosB的可观水平在脑中累积[3].

本研究结果进一步证实了使用无偏见，开放式实验方法研究大脑调节的分子基础的效用。 我们对PSMC5的初步关注完全基于其在酵母双杂交测定中与ΔFosB的显着结合，但它似乎是通过重复可卡因施用在NAc中募集的转录变化的重要组分。 更好地理解可卡因诱导PSMC5核水平的详细机制，以及PSMC5随后促成可卡因诱导的转录激活复合物的详细机制是当前研究的焦点。 同时，我们的酵母双杂交分析揭示了ΔFosB的几个额外推定的结合配偶体（表1）现在也需要对可卡因模型进行直接检查。 总之，这项工作有助于增加对可卡因改变NAc功能的复杂分子机制的理解。

致谢

这项工作得到了国家药物滥用研究所，石桥基金会和日本科学促进会（KAKENHI编号：24591735，26290064，25116010）的资助。

作者贡献

构思并设计了实验：YHO YNO EJN。 进行了实验：YHO YNO PJK RN。 分析数据：YHO YNO EJN。 供稿试剂/材料/分析工具：TN MO OY AN RN TT。 写了这篇论文：YHO EJN。

参考资料

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