通过磷酸化调节 DeltaFosB 稳定性（2006）

J Neurosci。 2006 May 10;26(19):5131-42.

来源

德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心基础神经科学中心精神病学系75390-9070，美国。

抽象

转录因子DeltaFosB（也被称为FosB2或FOSB [短形式）是由长期暴露在脑诱导几种类型的精神刺激，包括滥用，应力的药物的长期的可塑性的重要介质，和电惊厥。 DeltaFosB的一个显着特征是，一旦被诱导，它在没有进一步刺激的情况下在相当长的时间内持续存在于大脑中。 然而，这种明显稳定性的机制仍然未知。 在这里，我们证明DeltaFosB是一种相对稳定的转录因子，在细胞培养中半衰期约为10 h。此外，我们表明，DeltaFosB是在大脑中的磷和高度保守的丝氨酸残基（Ser27）在DeltaFosB保护其免受蛋白酶体降解的磷酸化。我们提供了几个证据表明这种磷酸化是由酪蛋白激酶2介导的。这些发现构成了DeltaFosB被磷酸化的第一个证据，并证明磷酸化有助于其稳定性，这是其调节大脑长期适应能力的核心。

介绍

转录因子ΔFosB，也称为FosB2或FosB [短形式]，是立即早期基因的C末端截短的剪接变体。 FOSB (Dobrazanski等人，1991; Nakabeppu和Nathans，1991; Yen等人，1991）。像全长FOSB，ΔFosB具有DNA结合域基本并通过它与Jun蛋白二聚化以形成激活蛋白1（AP-1）转录因子复合物亮氨酸拉链，其调节许多基因的表达（Morgan和Curran，1995; Rylski和Kaczmarek，2004）。尽管在FosB的C末端缺乏部分反式激活结构域，但ΔFosB在培养细胞和脑中都是有效的转录激活因子和抑制因子（Dobrazanski等人，1991; Nakabeppu和Nathans，1991; 陈等人，1997; McClung和Nestler，2003; Kumar等人，2005).

ΔFOSB被诱导到高水平的特定区域的方式在大脑慢性经过，但不是急性，接触各种精神刺激，包括压力，某些病变，抗精神病药和抗抑郁药，滥用药物和天然奖励 (Hope等人，1994b; Hiroi和Graybiel，1996; Moratalla等，1996; Bing等人，1997; Mandelzys等，1997; Kelz等人，1999; Werme等，2002; Andersson等，2003; Colby等，2003; Peakman等人，2003; Perrotti等，2004; Zachariou等，2006）。 ΔFosB的诱导直接与这些刺激中的几种对大脑的功能影响有关。 ΔFosB的甚至在没有附加的刺激的持续从所有其它的Fos家族转录因子，其响应于急性刺激迅速诱导相区别，衰减回基线水平在几个小时内，一般慢性刺激后显示脱敏（Hope等人，1992; Daunais等，1993; Persico等，1993; Hiroi和Graybiel，1996; Perrotti等，2004）。这使得ΔFosB成为一种有吸引力的候选者，可以介导一些基因表达的长期变化，这些变化是某些慢性刺激引起的稳定神经元适应的基础。

因为ΔFosB的延长存在是在没有进一步诱导其mRNA的情况下发生的（陈等人，1995），我们推测，与全长FosB和本质上不稳定的所有其他Fos家族蛋白不同，ΔFosB可能是一种异常稳定的转录因子（Hope等人，1994b; 陈等人，1997; Nestler等，2001; McClung等，2004）。此外，急性和慢性刺激的脑组织的免疫印迹分析表明ΔFosB明显变化 M_r （分子量）从急性病情~33 kDa到慢性病治疗期间的〜35-37 kDa（Hope等人，1994a; 陈等人，1995）。因为没有证据表明存在可以编码这些不同同种型的额外mRNA，我们进一步推测ΔFosB是翻译后修饰的，这可能有助于其不寻常的稳定性。然而，迄今为止，尚未报道ΔFosB的转换或翻译后修饰的生化分析。本研究的目的是确定ΔFosB是否是磷蛋白以及磷酸化是否在其稳定性中起作用。

材料和方法

哺乳动物细胞系和DNA构建体。

PC12细胞（Clontech，Mountainview，CA）在含有1-谷氨酰胺（L-Gln）的高葡萄糖DMEM中培养，并补充有5％胎牛血清（FBS），10％马血清（均来自Invitrogen，Carlsbad，CA）。，100 U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素（均来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）。将HeLa细胞（American Type Culture Collection，Manassas，VA）在含有L-Gln并补充有10％FBS，青霉素和链霉素的高葡萄糖DMEM中培养。两种细胞系在潮湿的37％CO中维持在5℃₂ 气氛。

对于用DNA的瞬时转染，将PC12或HeLa细胞接种到六孔板（用PC12细胞的胶原蛋白I包被）上，以便第二天达到90-100％汇合，然后使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染。在一些实验中（见图 1 ⇓⇓⇓⇓⇓–7），ΔFosB通过重组单纯疱疹病毒（HSV）感染在PC12细胞中瞬时表达。

ΔFosB和FosB cDNAs来自我们自己的pTetop构建体（陈等人，1997），并亚克隆到pcDNA3.1载体（Invitrogen）中。这些pcDNA3.1-ΔFosB/ FosB构建体用于在哺乳动物细胞中表达并作为定点诱变的模板。如前所述制备重组HSV-ΔFosB（Neve等人，1997），制剂的滴度为〜1×10⁸ PFU /毫升。

脉冲追逐实验。

感染/转染后大约24 h，用12 ml PBS洗涤6孔板中的细胞（PC2或HeLa）2至3次，并在37℃下在1 ml的Cys / Met-free DMEM中孵育〜2 h （Invitrogen）补充有5％透析的FBS（Hyclone，Logan，UT）以消耗Met和Cys的细胞内库。在这个“饥饿”期结束时，加入药物（如果要处理细胞），并用12-25μCi标记（脉冲）细胞。 ³⁵S蛋白质标记混合物（珀金埃尔默，Wellesley，MA）在1°C的〜37 h标记所有新合成的蛋白质。然后通过用2 ml PBS洗涤细胞两到三次来除去放射性标记物 ³⁵通过用补充有5％FBS的“冷”（非放射性）培养基替换培养基并在不同时间点收获细胞来跟踪（追踪）S标记的蛋白质。在整个追逐期间保持细胞处理。这些实验的所有数据显示各种蛋白质的相似初始量以优化其周转率的比较。

动物和慢性电惊厥发作治疗。

成年Sprague Dawley雄性大鼠（200-300 g; Charles River Laboratories，Kingston，RI）每天用7-9 d的电惊厥性癫痫发作（ECS）治疗。 ECS如前所述进行（Hope等人，1994a使用一个 Ugo Basile （意大利Comerio VA）ECS单元具有以下设置：频率，100脉冲/秒; 脉冲，0.5 ms; 休克期，1.0 s; 和电流，75 mA。通过施加没有任何电流的耳夹电极平行处理假对照动物。

³² P代谢标记。

对于脑切片的标记，将大鼠断头，快速解剖脑，并用DSK显微镜（Ted Pella，Redding，CA）制备300μm额皮质切片。将切片在2 ml磷酸盐缺乏的人工CSF（ACSF）中的塑料管内孵育，并在恒定温和鼓泡下保持在30℃。₂/一氧化碳₂ 混合物（Hemmings等，1989）。在存在或不存在冈田酸（1.3 ng / ml）的情况下，用8 mCi标记10-100 h切片（每管两个切片）。在该温育结束时，用冷ACSF将切片冲洗至少三次，然后在250μl冷放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液[PBS，pH 7.4，150 mm NaCl，1％（v / v）中通过超声处理均质化。）Igepal，0.5％（w / v）脱氧胆酸钠，0.1％（w / v）SDS，1 mm EDTA]在使用前补充至SDS至0.6％，哺乳动物细胞的蛋白酶抑制剂混合物（以5μl/ ml使用; Sigma-Aldrich），磷酸酶抑制剂混合物I和II（用于1：100; Sigma-Aldrich），1 mm PMSF和2％甘油。然后将匀浆物煮沸15 min并通过在15,000×下离心澄清 g 对于15分钟使用BCA蛋白质测定法（Pierce，Holmdel，NJ）评估所得上清液中的蛋白质浓度。

如报名参加 ³²培养细胞的P标记，感染/转染后~24 h，用无磷培养基洗涤细胞2-3次，并在该培养基中培养~1 h。在这个饥饿期后，0.2-0.3 mCi的 ³²PH₃PO₄ (珀金埃尔默将孔加入每个孔中，根据实验的种类标记细胞4-12 h（参见图1-7的规格）。然后用PBS洗涤细胞三次，并在冰上裂解15 min，用50μl补充的RIPA缓冲液洗脱。通过刮擦收集裂解物，并通过10 ga针25次以剪切DNA，煮沸10 min，并在15,000 rpm下以15 rpm离心30-4 min。将澄清的裂解物（上清液）转移到新管中并进行BCA蛋白质测定（Pierce）。这些实验的所有数据显示相似量的总野生型（WT）和S27AΔFosB蛋白，以优化其相对磷酸化水平的比较。

化学品和细胞培养处理。

将冈田酸（OA; Sigma-Aldrich）溶解在乙醇中，并以100 ng / ml的终浓度使用。将5,6-二氯-1-β-d-呋喃核糖基 - 苯并咪唑（DRB; Biomol，Plymouth Meeting，PA）溶解在二甲基亚砜（DMSO; Sigma-Aldrich）中，并以最终浓度50μm用于细胞培养。将精胺（Sigma-Aldrich）溶解在水中并以200μm的终浓度使用。将Calphostin-C（Biomol）溶解在DMSO中并以0.2μm使用，而将佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA; Promega，Madison，WI）溶解在DMSO中并以0.1μm使用。将豆蔻酰化-autocamtide-2相关抑制肽（m-AIP; Biomol）溶解于水中，并以1和10μm的终浓度使用。将广谱蛋白激酶抑制剂H-7和H-8（Biomol）溶解在水中，并分别以150和200μm的终浓度使用。 MG132（Calbiochem，San Diego，CA）和epoxomicin（Peptides International，Louisville，KY）均溶解于DMSO中，并分别以12.5和7.5μm的终浓度使用。在所有实验中，根据需要将DMSO（载体）加入细胞中以在处理中维持恒定量的DMSO。对于 ³²在P标记实验中，药物在标签之前立即添加并保持标记期的剩余时间。对于脉冲追踪实验，在Cys / Met“饥饿”时加入药物，保持标记期，然后加回到追踪培养基中。在整个追踪过程中每个3-4 h掺入蛋白酶体抑制剂以补偿这些肽的快速更新。

ΔFosB免疫沉淀，免疫印迹和放射自显影。

对于免疫沉淀，裂解物用普通RIPA稀释1：5以使SDS浓度降至0.1％，然后进行免疫沉淀（IP）。为了限制非特异性结合，首先通过用非免疫IgG和蛋白G-Sepharose（Sigma-Aldrich）免疫沉淀至少4 h来清除裂解物。然后使用山羊多克隆抗体从清除的裂解物中免疫沉淀ΔFosB，所述山羊多克隆抗体识别存在于FosB和ΔFosB（SC-48G; Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）中的内部表位，0.5-1μgIgG/10μg裂解物蛋白（50-300μg总蛋白质），总体积为0.5 ml。将IP在4℃下在转子上轻轻混合至少8 h，然后加入15μl蛋白质G-Sepharose并将IP混合至少另一个4 h。通过在3000×下旋转来沉淀IP g 对于3-5 min，在4℃下，用0.5ml冷的普通RIPA洗涤三次，用含有0.1％Tween 20的冷PBS洗涤两次。然后将IP重悬于0.5 ml冷PBS中，转移，在新管中沉淀，然后通过加入15-25μl2×还原Laemmli蛋白样品缓冲液洗脱免疫沉淀的蛋白质。该IP方案导致裂解物中几乎所有ΔFosB的特异性和有效沉淀。通过将整个IP加载到12.5％Tris-HCl Criterion凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA）上对免疫沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE，然后转移到PVDF或硝酸纤维素上。转移后，将膜风干并进行 ³²P-和 ³⁵使用Kodak（Rochester，NY）放射自显影胶片通过放射自显影观察S-放射性标记的蛋白质条带，以及使用Storm（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）PhosphorImager进行磷光成像。通过免疫印迹免疫沉淀的蛋白质（使用用于检测细胞的相同膜）检测细胞裂解物或脑匀浆中的总（未磷酸化和磷酸化）ΔFosB。 ³²将P标记的蛋白质或等量的裂解物/匀浆蛋白质进行SDS-PAGE并转移到PVDF或硝酸纤维素上。首先通过在1℃下将0.1％（w / v）脱脂奶粉（Bio-Rad）在补充有20％（v / v）吐温1（Sigma）的PBS中孵育25 h来封闭膜。然后将膜用4℃用我们自己的针对FosB /ΔFosB的氨基酸1-16（用于1：10,000）产生的兔抗FosB多克隆抗体进行免疫印迹过夜。初次孵育后，用封闭缓冲液将膜洗涤4次，持续5 min，然后在25℃下与缀合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG一起孵育〜1 h（用于1：封闭缓冲液中的5000，来自载体）实验室，Burlingame，CA）。然后用封闭缓冲液洗涤膜三次10 min，用PBS洗涤一次5 min。通过增强化学发光（Pierce）和/或使用ECL-Plus试剂（Amersham Biosciences）和Storm PhosphorImager检测荧光，在Kodak MR膜上显现总ΔFosB蛋白条带。

昆虫细胞中重组ΔFosB的过表达和纯化。

使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）并按照制造商的说明，在Sf9昆虫细胞中过表达ΔFosB作为N末端六-His标记的蛋白质（N-His（6）ΔFosB）。简而言之，将亲和力N-末端标签MGHHHHHHAG前面的ΔFosBcDNA（残基2-237）亚克隆到pFASTBacTM1载体中，该载体用于产生重组杆状病毒。用重组病毒感染Sf9细胞，并通过几个色谱步骤从细胞裂解物中纯化N-His（6）ΔFosB，包括使用镍柱（Qiagen，Valencia，CA）的亲和层析，使用mono-Q柱的阴离子交换（Amersham） Biosciences），使用凝胶过滤柱（Amersham Biosciences）进行尺寸排阻。

细胞/组织磷酸化研究。

细胞/组织 在包含30μm底物（N-His（10）ΔFosB或阳性对照底物），6μmATP和250μCi/μl[γ-]的1μl体积中进行时间过程的磷酸化反应和化学计量分析。³²P 1 ATP，由激酶制造商提供的缓冲液，以及以下激酶之一：CK2（20 ng /μl; Upstate，Charlottesville，VA），CaMKII（10 ng /μl; Upstate），PKC（1.6 ng /μl; Calbiochem）或p70S6K（2.5 mU/μl; Upstate）。通过在指定时间点从反应溶液中除去5μl等分试样并加入等体积的4×还原性Laemmli蛋白质样品缓冲液来进行时程反应。在经验定义的线性稳态条件下测定CK2反应的Michaelis-Menten动力学参数。这些反应在15 min中进行，体积为10μl，含有2 ng /μl酶，250μmATP，1μCi/μl[γ-³²P] ATP和N-His（6）ΔFosB浓度范围为2.5-30μm。所有反应均在30℃下在水浴中进行。用SDS-PAGE和用Bio-Safe Coomassie（Bio-Rad）染色凝胶后，干燥凝胶，并且 ³²通过磷光成像分析评估磷酸盐掺入（参见下文，数据量化，计算和统计）。

二维磷酸肽图谱和磷酸氨基酸分析。

这些分析均按照如下所述进行 Ploegh和Dunn（2000）。简而言之，含有干燥的凝胶片段 ³²P标记的ΔFosB（来自 细胞/组织 将代谢标记的细胞的反应或免疫沉淀物切除，再水合，洗涤，并进行胰蛋白酶消化。将含有胰蛋白酶消化产物的上清液冻干，并将冻干物洗涤数次，并重悬于10μl电泳缓冲液，pH 1.9中。将样品（3μl）点在纤维素薄层色谱（TLC）板（Analtech，Newark，DE）上，并通过电泳分离一维，通过升高TLC分离另一维。通过放射自显影和磷光成像使得到的磷酸肽图可视化。对于磷酸氨基酸分析，已经重悬于电泳缓冲液中的2μl的胰蛋白酶消化物在105℃下在25 m HCl中在N下通过HCl水解进一步裂解。₂ 大气层。通过在水中稀释6倍来终止反应，并将混合物冻干。将冻干物重悬于5μl电泳缓冲液pH 1.9中，并与磷酸-Ser，-Thr和-Tyr标准物一起点在纤维素TLC板上。使用电泳缓冲液pH 1.9在TLC板的一半长度上进行电泳，然后将板转移到pH 3.5缓冲液中，并进行电泳以完成。通过用1％（v / v）茚三酮在丙酮中的溶液喷雾TLC板来观察磷酸氨基酸标准品，并且 ³²通过放射自显影和磷光成像使P标记的氨基酸样品可视化。

siRNA诱导的CK2α敲低。

我们使用RNA干扰方法选择性地降低CK2的水平（Di Maira等，2005）。将PC12细胞接种到胶原蛋白I包被的六孔板上，第二天达到〜70-80％汇合，当它们用20 nm（最终浓度）非靶向siRNA或针对催化mRNA的siRNA瞬时转染时大鼠CK2的α亚基，使用5μl转染剂SilentFectin（Bio-Rad）并遵循制造商的说明书。如上所述，大约24 h后，用ΔFosB质粒瞬时转染细胞。大约24 h后（siRNA转染后~48 h），对细胞进行处理 ³²如上所述的P代谢标记或脉冲追踪分析。使用以下四种CK2αsiRNA，具有相似的结果：5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3'，5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3'，5'P-UUCUCAUAUAAUCUUCCGUU3'，5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3'（Dharmacon，Lafayette，CO）。作为消极对照，我们使用了 消音器 来自Ambion（德克萨斯州奥斯汀）的阴性对照#3 siRNA。使用抗CK2多克隆抗体（来自Upstate的目录号#2-06）以873：1稀释度通过免疫印迹监测CK1000敲低的程度。 β-微管蛋白用作上样对照，并用05：661稀释的单克隆抗体（来自Upstate的目录号#1-20,000）检测过夜。

定点突变。

使用Quick Change Site-Directed Mutagenesis试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA）并按照制造商的说明完成Ser27向Ala或Asp的突变。为了在小鼠ΔFosB蛋白中引入Ser27突变，使用以下诱变引物。 Ser27至Ala :(反向引物）5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3“。 Ser27 to Asp（正向引物）5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3“。突变的碱基以粗体显示，Ser27密码子以斜体显示。

生物信息学。

通过将小鼠蛋白质序列提交到包括ProSite在内的专业数据库，搜索ΔFosB的潜在磷酸化位点和激酶（http://www.expasy.org/prosite/），PredictProtein（Rost等，2004）和NetPhosK（Blom等，2004).

数据量化，计算和统计。

使用Storm PhosphorImager和随附的ImageQuant软件（Amersham Biosciences / Molecular Dynamics）定量PVDF或硝酸纤维素膜中存在的蛋白质的量。在细胞培养和脑切片磷酸化研究中，获得的数值为 ³²然后将P标记的蛋白质除以获得的总ΔFosB的值，并表示为比率。在里面 细胞/组织 磷酸化研究，量 ³²如前所述计算每摩尔ΔFosB（化学计量）的P-标记的ΔFosB（Sahin等人，2004）。所有测量均在所用仪器的线性范围内进行。使用Michaelis-Menten模型计算动力学参数 V = V_max.[S] /（[S]+K_M) 以及 V_max. = k₂[E_合计]。半衰期（t_1/2）从脉冲追踪图（使用最适合数据点的非线性回归）估计ΔFosB和FosB，并且对应于剩余蛋白质的量是原始的50％的时间。在所有图中，所示结果代表至少两到三个独立实验。在所有图中，显示的数据是平均值±SEM（3≤ n ≤16）。使用未配对的评估差异的统计显着性 t 测试，校正多重比较，星号表示 p ≤0.05。

成果

ΔFosB是一种异常稳定的转录因子

虽然我们之前曾推测ΔFosB是一种相对稳定的转录因子（Nestler等，2001），迄今尚未对蛋白质的营业额进行直接分析。为了解决这个问题，我们使用PC12细胞进行脉冲追踪实验，PCXNUMX细胞已广泛用作神经元样细胞系，其中ΔFosB通过重组单纯疱疹病毒（HSV-ΔFosB）感染而瞬时表达。新合成的蛋白质用代谢标记 ³⁵S-Met / Cys及其降解模式 ³⁵S标记的ΔFosB（³⁵通过从去除放射性标记的氨基酸后在不同时间点获得的细胞裂解物中免疫沉淀来监测S-ΔFosB）。通过SDS-PAGE和放射自显影分析免疫沉淀物，发现ΔFosB在PC12细胞中的半衰期为〜10 h（图。 1）。这些发现表明ΔFosB的半衰期高于大多数诱导型转录因子（见讨论），包括全长FosB，据报道其细胞培养半衰期为〜90 min（Dobrazanski等人，1991; 卡尔等人。 2004）。此外，值得注意的是，ΔFosB的降解不适合一级指数衰减曲线，而是两相，从较慢的降解速率开始。这表明存在多于一种ΔFosB种类和/或多于一种降解途径。

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图1。

ΔFosB是一种异常稳定的转录因子。 ΔFosB的半衰期在细胞培养中是〜10 h。通过用HSV-ΔFosB感染或用含有ΔFosB的质粒瞬时转染，在PC12细胞中表达ΔFosB，并如材料和方法中所述对细胞进行脉冲追踪实验。无论用于过表达ΔFosB的方法如何，都获得了相同的结果。该图显示了ΔFosB降解的时间过程（和代表性放射自显影图）。绘制的数据是从至少五个独立实验获得的至少15个体数据点的平均值±SEM。为了比较，显示了报告的全长FosB的半衰期。

ΔFosB是脑中的磷蛋白

我们假设ΔFosB的翻译后修饰可能有助于其表观稳定性。因为磷酸化已被证明可以通过多种方式调节转录因子的活性，包括其稳定性（综述见 Desterro等，2000; 惠特马什和戴维斯，2000），我们研究了ΔFosB是否是磷蛋白。为此，使用慢性ECS在大鼠脑中诱导ΔFosB表达，这是一种已知诱导高水平ΔFosB的治疗，特别是在额皮质中（Hope等人，1994a）。在最后一次ECS治疗后一天，当ΔFosB水平保持高水平时，制备薄的额叶皮质切片并用代谢标记 ³²P-正。平行的切片组未放射性标记，并且这些切片用于检测总ΔFosB水平。用特异性抗FosB /ΔFosB抗体免疫沉淀并通过SDS-PAGE分离免疫沉淀蛋白后，磷酸化 ³²通过放射自显影检测P标记的ΔFosB，而通过免疫印迹检测总ΔFosB。该分析显示ΔFosB在脑中被磷酸化，如特异性证明 ³²在慢性处理的脑样品中存在P-标记的〜35 kDa条带，但在假处理的对照中几乎检测不到（图。 2A）。这与在没有慢性刺激的情况下ΔFosB的基础水平非常低的事实是一致的。免疫沉淀反应的特异性通过非免疫IgG沉淀物中缺乏信号来说明。

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图2。

ΔFosB是脑中的磷蛋白。 A，ΔFosB在脑中被磷酸化。如材料和方法中所述，通过慢性ECS处理在大鼠脑中诱导内源性ΔFosB。额叶皮质切片用代谢标记 ³²PH₃PO₄ 好几个小时在切片均质化后，ΔFosB被免疫沉淀，并且磷酸化ΔFosB（³²通过放射自显影检测P-ΔFosB（上图）。通过免疫印迹检测非放射性免疫沉淀物中的总ΔFosB（下图）。作为阴性对照，显示了假处理动物和非免疫IgG的免疫沉淀物。 B通过生物信息学分析获得具有小鼠ΔFosB蛋白序列的相应预测分数的候选磷酸化位点和激酶。具有较高预测分数的候选位点在蛋白质序列中突出显示并列于表中。 DNA结合（碱性）结构域和亮氨酸拉链在蛋白质序列中以粗体显示。 C, D，Ser / Thr磷酸酶抑制剂OA增加ΔFosB磷酸化。 C, ³²通过放射自显影检测在不存在（Ctr）或存在100 ng / ml OA（图和上图）时标记的额皮质切片的免疫沉淀物中的P-ΔFosB水平。下图显示通过免疫印迹从未标记切片的免疫沉淀物中检测到的总ΔFosB。 D，用HSV-ΔFosB或HSV-LacZ（载体）感染PC12细胞并代谢标记 ³²PH₃PO₄ 在不存在（Ctr）或存在100 ng / ml OA时。 ³²通过放射自显影检测免疫沉淀物中的P-ΔFosB水平（图，上图）。下图显示通过免疫印迹在细胞裂解物中检测到的总ΔFosB。

作为阐明哪种激酶和位点参与ΔFosB磷酸化的第一步，我们对其氨基酸序列进行了几次生物信息学分析。这表明尽管ΔFosB不含Tyr磷酸化候选位点，但它确实包含几个Ser / Thr激酶共有位点，包括三个CaMKII位点，三个CK2位点和两个具有非常高的磷酸化预测分数的PKC位点（图。 2B）。如果通过生物信息学预测ΔFosB仅在Ser或Thr残基上磷酸化，那么其磷酸化应该由Ser / Thr磷酸酶的活性显着调节。为了验证这个假设，我们用额外的皮质切片标记了 ³²在存在或不存在OA的情况下，P-正磷酸盐，Ser / Thr蛋白磷酸酶抑制剂。如图所示图2C，OA导致了大量（〜2.5倍）的增加 ³²P-ΔFosB。它还导致总ΔFosB水平略有增加，这与以前的报道一致，这些报道将OA的致癌作用与其诱导几种立即早期基因（包括Fos蛋白）的能力联系起来（Miller等，1998; Choe等，2004）。最终结果是磷酸化ΔFosB水平的显着总体增加（~60％）。

然后，我们研究了在PC12细胞中，哪种更适合实验操作，ΔFosB是否显示出类似于脑中所见的磷酸化模式。我们通过感染HSV-ΔFosB在PC12细胞中表达ΔFosB，并用代谢标记细胞 ³²在存在或不存在OA的情况下P-正磷酸盐。来自HSV-ΔFosB感染细胞的蛋白质的成功表达和免疫沉淀通过免疫印迹中的存在显示（图。 2D，下图）和〜35 kDa条带的放射自显影图（上图），在载体感染的细胞中不存在。如在大脑中观察到的，OA引起总ΔFosB水平的小幅增加，但是更高（大约两倍）增加 ³²P-ΔFosB，导致ΔFosB磷酸化显着（〜50％）净增加。此外，与生物信息学预测一致，用Tyr磷酸酶抑制剂治疗PC12细胞不会导致显着变化。 ³²P-ΔFosB水平（数据未显示）。总之，这些发现揭示了ΔFosB在脑和PC12细胞中的Ser和/或Thr残基上被磷酸化，并证实后者是一种良好的细胞培养系统，其中进一步研究ΔFosB的磷酸化和降解特征。

CK2但不是PKC或CaMKII使ΔFosB磷酸化细胞/组织

如上所述，ΔFosB氨基酸序列的分析揭示了CK2，PKC和CaMKII磷酸化位点的高预测评分。为了确定哪些激酶可以使ΔFosB磷酸化，我们进行了一系列的 细胞/组织 使用纯化的激酶和纯化的重组ΔFosB进行磷酸化反应。如图所示图3A在三种候选激酶中，只有CK2以显着方式磷酸化ΔFosB。此外，测试了几种其他激酶（例如，GSK3和p70S6K）但未能显着磷酸化ΔFosB（数据未显示）。通过时间过程分析对CK2反应的另外表征显示该激酶可催化每摩尔ΔFosB掺入〜0.5 mol磷酸盐（图。 3B）。 CK2可以使ΔFosB磷酸化的事实 细胞/组织 相当大的化学计量（〜50％）暗示了生理学相关的反应。然后我们通过在增加量的纯化ΔFosB存在下孵育CK2来研究该反应的动力学，并且我们确定CK2使ΔFosB磷酸化 V_最大 5.8 pmol·min^{- 1} ·μg^{- 1} 酶，a K_M 18.4μm和a k_猫 of 0.2 / s（图。 3C）。对这些动力学参数获得的值进一步支持该反应的生理相关性。例如， K_M CK2用于DARPP32，它是最着名的基材之一，是3.4μm， k_猫是〜0.3 / s（Girault等，1989）; 该 K_M 适用于ATP的范围从〜10-40μm（Cochet等，1983; Silva-Neto等人，2002）和酪蛋白的范围从〜10-50μm（Meggio等，1977; Pyerin等，1987）。总之，这些数据表明ΔFosB是CK2的真正底物 细胞/组织.

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图3。

CK2但不是PKC或CaMKII使ΔFosB磷酸化 细胞/组织。放射自显影照片（上图）显示磷酸化产物，考马斯染色凝胶（下图）显示反应中存在的总ΔFosB。 A，对纯化的重组ΔFosB进行处理 细胞/组织 各种候选激酶的磷酸化（其中三种显示）。 B，时程和化学计量分析表明CK2可以使ΔFosB磷酸化 细胞/组织 化学计量比为〜50％。 C，CK2反应的动力学分析显示ΔFosB是真实的 细胞/组织 基质。反应的线性化以双倒数图（底部）显示，但动力学参数源自Michaelis-Menten曲线（顶部）。

CK2调节完整细胞中ΔFosB的磷酸化和稳定性

为了评估CK2介导的ΔFosB磷酸化的生理相关性，我们使用比较磷酸肽作图进行了比较 细胞/组织 磷酸化和PC12-细胞磷酸化的ΔFosB。经SDS-PAGE和凝胶洗脱后得到 ³²P-ΔFosB（来自 细胞/组织 反应或来自免疫沉淀物 ³²P标记的细胞），用胰蛋白酶消化蛋白质，并将得到的磷酸肽进行二维分离。该分析显示来自CK2反应的主要磷酸肽与来自在PC12细胞中磷酸化的ΔFosB的两种主要磷酸肽之一共迁移（图。 4A而由PKC或CaMKII（数据未显示）反应产生的磷酸肽没有反应。在PC12细胞的图谱中存在第二个ΔFosB磷酸肽，但是由于我们测试的任何激酶都不能产生类似的磷酸肽 细胞/组织目前我们还不知道这种第二种磷酸肽是否含有与其他磷酸肽不同的磷酸化位点，或者它是否代表含有相同磷酸化位点的独特胰蛋白酶肽。

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图4。

CK2调节完整细胞中ΔFosB的磷酸化和稳定性。 A，CK2但不是PKC似乎磷酸化细胞中的ΔFosB。由CK2或PKC磷酸化的ΔFosB的二维磷酸肽图谱 细胞/组织 或完整的PC12细胞。箭头显示CK2-磷酸化肽的迁移，而不是PKC-磷酸化的肽与从PC12细胞获得的ΔFosB磷酸肽之一的迁移。 B通过用强效CK12活化剂精胺（SP）处理细胞，并通过用CK2抑制剂DRB处理降低，增加PC2细胞中的ΔFosB磷酸化。相反，PC12细胞中的ΔFosB磷酸化不受PKC活化剂（PMA）或PKC特异性抑制剂calphostin-C（Calph）处理的影响。显示了代表性放射自显影图（上图）和免疫印迹（下图）。 C-F，CK2活性对ΔFosB稳定性的影响。这些图显示了ΔFosB降解的时间过程（和代表性放射自显影图）。瞬时表达ΔFosB的PC12细胞在不存在或存在CK2抑制剂DRB的情况下进行脉冲追踪实验（C），CK2活化剂精胺（D），或广谱激酶抑制剂H-8（E），用于控制DRB的非特异性作用。 F，敲低CK2催化亚基对ΔFosB稳定性的影响。用非靶向siRNA（Ctr）或靶向大鼠CK12α的siRNA和随后用ΔFosB质粒转染的2 h转染PC24细胞。上图描绘了全细胞裂解物的免疫印迹，显示了CK2 siRNA对CK2和ΔFosB蛋白水平的影响。 β-微管蛋白的相应免疫印迹显示为上样对照。

为了进一步解决CK2作为ΔFosB激酶的生理相关性，我们用两种调节CK12活性的药物处理表达ΔFosB的PC2细胞。如图所示图4B，用细胞渗透性CK12抑制剂DRB处理PC2细胞，降低ΔFosB磷酸化（Meggio等，1990; Szyszka等，1995通过多胺精胺处理增加，已知是一种有效的CK2激活剂（Cochet和Chambaz，1983; Meggio等，1983）。相反，用PKC抑制剂calphostin-C治疗PC12细胞（Kobayashi等，1989; Tamaoki等人，1990）或PKC活化剂PMA（施密特和赫克，1975; Beh等人，1989）没有导致ΔFosB磷酸化的显着变化。在PMA的情况下，轻微（并且不显着）增加 ³²P-ΔFosB可以通过该药物引起的总ΔFosB水平的增加来解释; 事实上，据报道，佛波酯可诱导几种Fos家族蛋白的表达，包括FosB（Yoza等人，1992; Suh等人，2004）。此外，用特异性细胞渗透性CaMKII抑制剂m-AIP处理细胞（Ishida和Fujisawa，1995; Stevens等人，1999）也没有导致ΔFosB磷酸化降低（数据未显示）。总之，这些结果与我们的一致 细胞/组织 发现并表明在完整细胞中ΔFosB可能被CK2磷酸化而不是PKC或CaMKII。 CK2抑制不能完全阻止ΔFosB磷酸化的事实表明蛋白质中存在额外的磷酸化位点。

我们接下来检查了CK2是否在ΔFosB的转换中起作用，从而在其稳定性中发挥作用。为此，我们使用用磷酸化研究中使用的CK12抑制剂或CK2激活剂处理的表达ΔFosB的PC2细胞进行脉冲追踪实验。如图所示图4C用CK2抑制剂DRB处理细胞对ΔFosB的转换率有显着影响，由其降解曲线的形状变化证明，从双相到更接近指数衰变的曲线。相反，CK2激活剂精胺的存在导致ΔFosB的降解速率显着降低，这导致蛋白质在追踪的最初几小时内积累（图。 4D).

与许多激酶活化剂和抑制剂的情况一样，精胺和DRB可以在CK2活性调节之外具有代谢作用。事实上，DRB已被证明可抑制转录因子IIH（TFIIH）相关激酶（Yankulov等人，1995），这导致RNA聚合酶II介导的转录的抑制。因为这种效应可以想象地影响ΔFosB的稳定性，我们分析了广谱激酶抑制剂H-8的作用（Hidaka和Kobayashi，1992）已知抑制TFIIH相关激酶但不抑制CK200浓度（2μm）的ΔFosB转换（Yankulov等人，1995）。如图所示图4E，用H-8处理不影响ΔFosB的周转率。用另一种广谱激酶抑制剂H-7获得了类似的结果，其用于抑制TFIIH相关激酶但不抑制CK2的浓度（数据未显示）。这些数据进一步支持了由DRB引起的ΔFosB稳定性降低最有可能归因于CK2抑制的解释。

为了进一步确定CK2在ΔFosB转换中的作用，我们研究了通过siRNA敲低CK2的后果。我们使用PC12细胞进行这些实验，所述PC2细胞首先用对照（非靶向）siRNA或靶向大鼠CK2（CK24α）的催化亚基和随后用ΔFosB转染的XNUMX h的mRNA的siRNA转染。如图所示图4F，用CK2αsiRNA转染有效且特异性地敲低CK2α蛋白水平而不影响ΔFosB水平（上图）。脉冲追踪分析显示，敲低CK2导致ΔFosB转换率显着增加，这可由蛋白质的更快降解证明。抑制CK2活性（无论是通过DRB处理还是siRNA）的事实增加了ΔFosB的转换并导致双相曲线的慢速成分消失，而CK2激活增强了曲线的缓慢相位，为CK2在调节ΔFosB稳定性方面发挥作用的想法。

CK2使Ser27上的ΔFosB磷酸化

为了开始鉴定CK2磷酸化ΔFosB的位点，我们对CK2磷酸化的重组ΔFosB进行了磷酸氨基酸分析。 细胞/组织 以及在PC12细胞中磷酸化的ΔFosB。这些实验表明，在这两种情况下，检测到的唯一磷酸氨基酸是磷酸化Ser（图。 5A）。该发现与CK2获得的化学计量一起 细胞/组织 磷酸化反应（〜50％）（图。 3B）和CK2磷酸肽图上仅存在一个重要斑点（图。 4A），表明ΔFosB的CK2磷酸化可能仅限于单个丝氨酸残基。该结论与磷酸化共有位点分析一致（图。 2B），它预测只有一个候选丝氨酸，即Ser27，用于CK2。分类学分析显示，SerxNUMX通过Fos家族成员的进化而高度保守（图。 5B），表明它可能具有重要的生理功能。

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图5。

CK2在Ser27上磷酸化ΔFosB。 A，CK2磷酸化的磷酸氨基酸分析（细胞/组织）和PC12细胞磷酸化的ΔFosB，表明在两种情况下，磷酸化的主要残基是丝氨酸。 B，FosB /ΔFosB氨基酸序列的跨物种分析揭示了从人类到斑马鱼的Fos家族成员中的Ser27的高度保守性（黑暗突出）。然而，CK3共有位点所需的+ 2位的酸性残基不是保守的（亮点突出）。 C用野生型ΔFosB（WT）或含有点突变的ΔFosB瞬时转染HeLa细胞，用Ala（S27A）代替Ser27。细胞用代谢标记 ³²PH₃PO₄ 并用载体或精胺（SP）处理以激活CK2。显示了获得的ΔFosB免疫沉淀物的代表性放射自显影图（上图）和免疫印迹（下图）。显示了模拟转染细胞（载体）的免疫沉淀物。

为了确定Ser27是否在ΔFosB中被磷酸化，我们将该残基突变为Ala，并分析了对蛋白质磷酸化状态的影响。为此，我们使用HeLa细胞（可以更高效率转染）瞬时表达WT或S27A突变体ΔFosB。转染后大约24小时，细胞用代谢标记 ³²制备P-正磷酸盐和全细胞裂解物。免疫沉淀和SDS-PAGE后， ³²通过放射自显影检测P-ΔFosB，通过免疫印迹检测总ΔFosB。如图所示图5C （下图），在载体转染的细胞中未检测到ΔFosB，而用WT或S27A突变体ΔFosB转染的细胞成功表达了该蛋白质。我们发现S27A突变导致显着（〜30％）减少 ³²P-ΔFosB水平（图。 5C, 上图和图表），表明在活细胞中，ΔFosB在Ser27上被磷酸化。为了确定细胞Ser27是否确实被CK2磷酸化，我们比较了CK2激活剂精胺调节WT和S27AΔFosB的磷酸化的能力。正如我们之前在PC12细胞中观察到的（图。 4B），用精胺处理HeLa细胞显着增加WT蛋白的磷酸化。 S27A突变导致这种影响明显减弱的事实（图。 5C）支持ΔFosB中Ser27是CK2的生理学底物的解释。

Ser27的磷酸化调节ΔFosB的稳定性

已证实当CK2被抑制时ΔFosB的稳定性降低并且当CK2被激活时其增强（图。 4），CK2使Ser27上的ΔFosB磷酸化（图。 5），我们预测，防止该位点的磷酸化会破坏蛋白质的稳定性。用瞬时表达WT或S27A突变体ΔFosB的HeLa细胞进行的脉冲追踪实验显示，如预测的那样，S27A突变导致ΔFosB降解速率显着增加，并伴随蛋白质半衰期的减少。（图。 6A）。然后，我们研究了这种调节机制是否也发生在更像神经元的PC12细胞系中。这些实验表明，正如我们在HeLa细胞中观察到的那样，S27A点突变导致PC12细胞中ΔFosB的半衰期显着降低（从~11到〜4 h）（图。 6B）。事实上，这种不稳定与CK2抑制或击倒引起的相似（图。 4）进一步支持CK2介导的Ser27磷酸化调节ΔFosB稳定性的观点。使用磷酸模拟Ser27至Asp突变（S27D）获得了Ser27磷酸化对ΔFosB蛋白质转换的调节作用的其他证据。 S27D突变被认为是磷酸化的，因为它在氨基酸27处放置了大的带负电荷（羧基）基团，从而部分地模拟了Ser27的磷酸化。如图所示图6C，S27D突变引起S27A突变的相反作用，并导致蛋白质比WT蛋白质显着更稳定。与CK2激活后获得的效果相似（图。 4D），S27D突变导致积累，从而在追逐的第一个小时内增加ΔFosB水平。

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图6。

Ser27的磷酸化调节ΔFosB的稳定性。 A, C，脉冲追踪分析显示Ser27磷酸化对ΔFosB转换率的影响。显示了野生型ΔFosB（WT），Ser27至Ala突变体（S27A）和磷酸化模拟Ser27至Asp突变体（S27D）的降解谱和估计的半衰期。在HeLa细胞中获得了相同的结果（A）和PC12细胞（B, C).

Ser27磷酸化通过阻止其蛋白酶体降解来稳定ΔFosB

为了开始阐明Ser27的磷酸化稳定ΔFosB的机制，我们检测了蛋白酶体抑制剂MG132的能力（Palombella等，1994; Tsubuki等，1996）和epoxomicin（Hanada等，1992; Kim等人，1999）调节WT和S27A突变体ΔFosB的降解速率。使用表达WT或S12AΔFosB的重组HSV感染并用DMSO或两种蛋白酶体抑制剂之一处理的PC27细胞进行脉冲追踪实验。这些实验表明，尽管WT蛋白的降解速率对两种蛋白酶体抑制剂中任何一种的存在相对不敏感（图。 7A），S27A突变体对这些药物敏感（图。 7B）。这表明，与WT蛋白不同，S27A突变体是蛋白酶体降解的靶标。实际上，用MG132或环氧酶素处理细胞完全逆转了S27A突变对ΔFosB降解速率的影响，证明了S27A突变体的半衰期从〜4增加到~9 h对于MG132和〜 12 h为epoxomicin（图。 7B）。总之，这些发现表明ΔFosB在Ser27上的磷酸化保护蛋白质免于蛋白酶体降解，因此对其不寻常的稳定性至关重要。

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图7。

Ser27的磷酸化通过阻止其蛋白酶体降解来稳定ΔFosB。 A, B，HSV感染的PC12细胞的脉冲追踪分析显示野生型ΔFosB的降解特征和估计的半衰期（A）或S27AΔFosB（B）在两种蛋白酶体抑制剂[MG132和环氧酶素（Epoxo）]中不存在或存在的情况下。注意这两种药物对野生型ΔFosB的转换没有显着影响的事实，而用蛋白酶体抑制剂处理细胞导致S27AΔFosB的稳定化。 C，Ser27磷酸化在ΔFosB介导长期大脑可塑性能力中的作用模型。一旦被诱导，通过CK2介导的S27磷酸化，一部分ΔFosB在脑中稳定。这导致其积累，这反过来导致基因表达的长期变化。这些基因表达的稳定变化有助于稳定的行为适应。相反，Ser / Thr磷酸酶PP27和/或PP1A对S2的去磷酸化导致蛋白质的去稳定化和蛋白酶体机制的加工。

讨论

在本研究中，我们显示ΔFosB在细胞培养中具有〜10 h的半衰期，这使其与全长FosB和大多数其他诱导型转录因子相比稳定，其在细胞培养中的半衰期可以短。几分钟，很少超过3 h (Hann和Eisenman，1984; Dobrazanski等人，1991; Roberts和Whitelaw，1999; Ferrara等，2003; Hirata等，2004）。此外，我们发现ΔFosB在脑中被磷酸化，并且其磷酸化对PP1 / PP2A抑制剂冈田酸敏感。我们的细胞培养研究表明，ΔFosB的稳定性受CK2调节，CK2活性较高，可稳定蛋白质。最后，我们的研究结果表明，CK2在高度保守的N末端丝氨酸（S27）上磷酸化ΔFosB，并证明S27的磷酸化保护ΔFosB免于蛋白酶体降解。因此，我们提出了一个模型，即CK27对S2上ΔFosB的磷酸化是ΔFosB转换的关键调节机制（图。 7C）。这种磷酸化介导的ΔFosB稳定在功能上是重要的，因为已显示特定脑区域中ΔFosB水平的增加直接调节许多神经元基因。体内并在几种神经精神疾病的动物模型中发挥有效的行为效应（见引言）。

虽然磷酸化是一种快速且可逆的调节某些转录因子转录活性的方法，如CREB（cAMP反应元件结合蛋白）（Bohmann，1990），调节转录因子的降解提供了一种更强大（不易逆转）的调节形式（Desterro等，2000）。功能活性受其降解水平调节的转录因子包括NFκB（Desterro等，2000），c-Myc（Sears等，1999）和c-Fos（Ferrara等，2003）等等。在许多情况下，磷酸化是转录因子稳定性的关键调节因子，如c-Fos所示（Okazaki和Sagata，1995; Tsurumi等，1995），Fos相关抗原-1（Fra-1）（Vial和Marshall，2003），Fra-2（Manabe等，2001），c-Jun（Fuchs等，1996），JunB（Fuchs等，1997），ATF2（Fuchs等，2000）和p53（Buschmann等，2001）。因此，我们的研究将ΔFosB添加到这个转录因子列表中，其功能活性通过其磷酸化依赖性稳定性来调节。

CK2是一种普遍存在的组成型活性Ser / Thr激酶，迄今已鉴定出> 300个据称底物，并涉及多个生物学过程，包括细胞死亡和存活（Litchfield，2003; Unger等，2004），细胞应激反应（Yanagawa等，1997; Kato等，2003），DNA修复和染色质重塑（Barz等，2003; Krohn等人，2003）。超过三分之一的假定CK2底物是参与基因表达调控的蛋白质（Meggio和Pinna，2003）。事实上，CK2已被证明是一种突出的核激酶（Krek等，1992）（供审查，见 Yu等人，2001并与几种转录因子的bZIP结构域相互作用（Yamaguchi等人，1998）。 CK2介导的磷酸化也被证明可以调节许多蛋白质的降解（增强或降低），包括IkB（Schwarz等人，1996），PTEN（托雷斯和普利多，2001），lens connexin（Yin等人，2000），染色质相关蛋白HMG1（Wisniewski等人，1999）和几种转录因子，如HMGB（Stemmer等，2002），Myf-5（Winter等，1997）和c-Myc（Channavajhala和Seldin，2002）。 CK2在大脑中最丰富（Alcazar等人，1988; Girault等，1990），其活动与大脑功能的许多方面有关，包括神经元存活（Boehning等，2003），分化（Nuthall等，2004），离子通道功能（琼斯和雅克尔，2003; Bildl等，2004），以及长期增强和神经元可塑性（Diaz-Nido等，1992; 利伯曼和么，1999; Reikhardt等，2003).

尽管有越来越多的证据证明CK2在调节神经元功能方面的作用，但对控制其活性的因素知之甚少。 CK2被认为具有组成型活性，其磷酸化特异性底物的能力的调节主要依赖于其细胞内定位的变化（例如细胞质与细胞核）（Ahmed和Tawfic，1994; Yu等人，1999）。该信息提出了一个重要问题，即在慢性刺激后诱导脑内ΔFosB积聚所需的信号（图。 7C）。一个要求是重复激活 FOSB 基因和ΔFosBmRNA的诱导（陈等人，1995）。我们的数据表明ΔFosB的CK2磷酸化对其稳定性至关重要，表明ΔFosB对基因表达的长期作用可能需要第二信号，即通过CK2刺激蛋白质磷酸化的信号。这可能涉及通过某种未知机制或其向细胞核的易位激活CK2。或者，ΔFosB的CK2磷酸化可以是组成型的，使得当ΔFosB蛋白质响应于每种刺激而翻译时，其一部分被磷酸化并由此稳定化，因此通过重复刺激，其在受影响的神经元中累积至高水平。

我们的研究结果表明，CK2和S27可能不是唯一负责ΔFosB磷酸化的激酶和位点，因为CK2和S27A突变的抑制都不能完全阻止ΔFosB磷酸化。出于同样的原因，S27A突变导致磷酸-ΔFosB的30％减少的事实证明S27是蛋白质上的主要磷酸化位点。然而，我们正在研究ΔFosB上的其他推定的激酶和磷酸化位点。最终，分析大脑中ΔFosB中S27和任何其他磷酸化位点的磷酸化也很重要。体内经过各种类型的慢性刺激，例如，通过使用质谱或磷酸特异性抗体。

如上所述，ΔFosB中的S27在整个进化过程中以及其他Fos家族蛋白中是高度保守的。但是，CK2的共识网站不是：如图所示图5B，只有FosB /ΔFosB（和斑马鱼xenolog），而不是c-Fos或Fra-2，在+ 3处具有酸性残基，这是CK2磷酸化的关键决定因素（Marin等，1986; Meggio等，1994）。因此，S2缺乏CK27磷酸化可以解释为什么其他Fos家族蛋白质不如ΔFosB稳定。然而，这并不能解释为什么具有与ΔFosB相同的CK2共识位点的全长FosB不能同样稳定。我们不知道全长FosB是否被CK2磷酸化在这个保守的残基上。 FosB的唯一报道（Skinner等，1997）和c-Fos（Okazaki和Sagata，1995; 陈等人，1996磷酸化描述了这些蛋白质的C末端区域中的位点，其在ΔFosB中不存在。 CK2对全长FosB和其他Fos家族蛋白的潜在磷酸化需要直接研究。然而，即使它们被磷酸化，已知其他Fos家族蛋白在其C末端含有基序，其靶向蛋白质以快速降解（Papavassiliou等，1992; Jariel-Encontre等人，1997; Acquaviva等，2002）。例如，已经显示在所有Fos家族蛋白的C末端存在的一段〜21残基，但在ΔFosB中不存在，充当c-Fos的去稳定结构域（Acquaviva等，2001）。我们发现虽然这个序列同样会破坏全长FosB的稳定性（Carle等，2004），ΔFosB中缺少这个域并不能完全解释其稳定性。相反，缺乏该C末端结构域和Ser27磷酸化的组合似乎完全解释了ΔFosB和FosB之间稳定性的大约五倍差异。

尽管Fos家族蛋白的降解很复杂且尚未完全了解，但蛋白酶体降解似乎是所涉及的主要途径（Salvat等，1999; Acquaviva等，2002; Ferrara等，2003）。这里提供的数据，其中蛋白酶体抑制剂不会显着改变ΔFosB降解的速率，认为与其他Fos家族蛋白不同，ΔFosB逃避26S蛋白酶体，并且这在其稳定化中起重要作用。因此，我们提出了一种方案，其中ΔFosB的增强的稳定性可归因于两个主要因素的组合：（1）不存在C末端去稳定结构域和（2）CK27对S2的磷酸化。

总之，本研究提供了关于为什么ΔFosB，即早期基因的产物的机制见解 FOSB与所有其他Fos家族成员不同，它是一种相对长寿的蛋白质。 虽然其他Fos家族蛋白被认为可以介导快速但瞬时的刺激 - 转录偶联（Morgan和Curran，1995），ΔFosB的相对稳定性赋予其介导由慢性刺激诱导的更持久的转录变化的能力。这支持了ΔFosB在脑中作为持续分子开关起作用的观点，逐渐将急性反应转化为慢性适应。鉴定Ser27磷酸化作为ΔFosB稳定性的中心机制，开辟了调节ΔFosB功能的手段的新途径，从而调节其对神经和行为可塑性的长期影响。

脚注

11月收到21，2005。
修订于2月收到21，2006。
接受四月2，2006。

这项工作得到了PGU国家精神分裂症和抑郁症青年研究者奖研究联盟的支持，PGU国家药物滥用研究所（NIDA）国家研究服务奖以及国家精神卫生研究所和NIDA对EJN We的资助。感谢James Bibb博士对他的帮助 细胞/组织 磷酸化试验，Ming-Hu Han博士在制备用于代谢标记的脑切片方面的帮助，以及Rachael Neve博士对重组HSV包装的帮助。
G.鲁登科的现住址：密歇根大学生命科学研究所和药理学系，华盛顿州210 Washtenaw Avenue＃3163A，密歇根州安娜堡48109-2216。
通讯应发给Eric J. Nestler，5323 Harry Hines Boulevard，Dallas，TX 75390-9070。电子邮件： [电子邮件保护]

Acquaviva C，Brockly F，Ferrara P，Bossis G，Salvat C，Jariel-Encontre I，Piechaczyk M (2001) 鉴定在G（0）-S相转变期间参与控制c-Fos原癌蛋白的快速蛋白酶体降解的C-末端三肽基序。 癌基因 20:7563 - 7572。

抽象

介绍

材料和方法

哺乳动物细胞系和DNA构建体。

脉冲追逐实验。

动物和慢性电惊厥发作治疗。

32 P代谢标记。

化学品和细胞培养处理。

ΔFosB免疫沉淀，免疫印迹和放射自显影。

昆虫细胞中重组ΔFosB的过表达和纯化。

细胞/组织 磷酸化研究。

二维磷酸肽图谱和磷酸氨基酸分析。

siRNA诱导的CK2α敲低。

定点突变。

生物信息学。

数据量化，计算和统计。

成果

ΔFosB是一种异常稳定的转录因子

ΔFosB是脑中的磷蛋白

CK2但不是PKC或CaMKII使ΔFosB磷酸化 细胞/组织

CK2调节完整细胞中ΔFosB的磷酸化和稳定性

CK2使Ser27上的ΔFosB磷酸化

Ser27的磷酸化调节ΔFosB的稳定性

Ser27磷酸化通过阻止其蛋白酶体降解来稳定ΔFosB

讨论

脚注

参考资料

文章引用了这篇文章

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³² P代谢标记。

细胞/组织磷酸化研究。

CK2但不是PKC或CaMKII使ΔFosB磷酸化细胞/组织