评论：虽然压力，滥用药物和某些自然奖励都会引发DeltaFosB的积累，但压力会激活不同的下游细胞和后来不同的受体和基因。 换句话说，成瘾和对压力的抵抗依赖于根本不同的机制
J Neurosci。 2010 Oct 27; 30（43）：14585-92。
Vialou V，Maze I，Renthal W，LaPlant QC，Watts EL，Mouzon E，Ghose S，Tamminga CA，Nestler EJ。
来源
Fishberg神经科学系，西奈山医学院，纽约，纽约，10029，美国。
抽象
应激和药物诱导的神经元适应的分子机制尚不完全清楚。 涉及这种适应的一个分子是ΔFosB，一种转录因子，其累积在啮齿动物伏隔核（NAc）中，这是一种关键的脑奖励区域，响应于慢性应激或反复暴露于滥用药物。 Ť通过这些环境刺激控制ΔFosB诱导的上游转录机制仍然是难以捉摸的。 在这里，我们确定活动依赖性转录因子，血清反应因子（SRF），作为压力的新型上游介质， 但不是可卡因 - ，诱导ΔFosB。 SRF在抑郁的人类患者和长期暴露于社交失败压力的小鼠的NAc中被下调。 在弹性动物中不存在SRF的下调。 通过使用诱导型诱变，我们表明，应激介导的ΔFosB诱导，主要发生在弹性小鼠，依赖于这个大脑区域的SRF表达。 此外，SRF的NAc特异性遗传缺失促进了各种类似促肾上腺素和类似焦虑的表型，并使动物对慢性应激的有害作用更敏感。 相反，我们证明SRF在NAc中的ΔFosB积累中不起作用以响应慢性可卡因暴露。 此外，NAC特异性敲除SRF对可卡因诱导的行为没有影响，表明慢性社交失败压力和反复可卡因暴露通过独立机制调节ΔFosB积累和行为敏感性。
介绍
伏隔核（NAc）是一个关键的大脑奖励区域，对于整合感知和认知输入非常重要，这些输入可以驱动与环境刺激相关的动机相关行为（Nestler和Carlezon，2006; Sesack和Grace，2010）。 NAc还涉及与药物成瘾和抑郁有关的行为异常。 因此，已经证明以深部脑刺激靶向NAc可减轻人和啮齿动物中的抑郁和成瘾样行为（Schlaepfer等，2008; Vassoler等，2008; Heinze等，2009; Kuhn等。 al。，2009）。
反复暴露于滥用或压力的药物诱导NAc中基因表达的改变模式，潜在地成瘾和抑郁的慢性化（Berton等，2006; Krishnan等，2007; Maze等，2010; Vialou等。，2010）。 有趣的是，转录因子ΔFosB（fosB基因的剪接产物）响应于重复的药物或应激暴露而在NAc中积累（Nestler，2008; Perrotti等，2008; Vialou等，2010）。 ΔFosB已被提议作为潜在的分子开关，指导从娱乐性药物使用向慢性成瘾状态的转变（Nestler等，1999; McClung等，2004; Renthal等，2009），因为其在NAc中的积累增强奖励对几种滥用药物的回应。 最近，ΔFosB诱导在NAc慢性社交失败压力后的作用（Nikulina等，2008; Vialou等，2010）已被阐明：ΔFosB促进对压力刺激的积极应对反应并增加恢复力。 虽然ΔFosB诱导以刺激依赖性方式发生，但是在NAc中引起药物和应激诱导的ΔFosB积累的机制仍然是未知的。
血清反应因子（SRF）是几个即时早期基因（包括c-fos，fosb，Egr1和Arc）的活性依赖性转录激活所需的转录因子（Knöll和Nordheim，2009）。 最近的研究表明，SRF对神经元的形态和细胞结构特性具有影响，包括调节成年大脑中的突触活性和电路形成（Knöll和Nordheim，2009）。 这些发现促使我们调查长期暴露于滥用或压力药物下是否会调节SRF的功能，以及在这些情况下此类调节对ΔFosB诱导的潜在影响。
在这里，我们描述了一种新的机制，通过该机制，NAc中SRF的下调促进了促抑郁和焦虑症的表型，最终增加了动物对慢性应激的有害影响的脆弱性。。 这些作用部分地由应激动物的NAc中ΔFosB诱导的丧失介导。 观察到的从抑郁症患者获得的死后NAc组织中SRF和ΔFosB表达的降低支持了我们的发现与人类抑郁症的相关性。 有趣的是，这种控制ΔFosB积累的机制似乎是压力特异性的：长期暴露于可卡因对SRF表达没有影响，从NAc中缺失SRF对暴露于慢性可卡因后对ΔFosB积累没有影响，并且这种SRF缺失对可卡因-诱发的行为。 在压力的背景下，SRF和ΔFosB之间的这种新颖的相互作用可能代表了调节个人对慢性压力敏感性的重要稳态机制。
材料和方法
动物
在所有行为和生物化学实验中使用8周龄的C57BL / 6J雄性小鼠（Jackson Laboratory）。 在实验操作之前，所有动物在动物设施中习惯至少1周，并且在23 h光/暗循环（从25：12 AM到7：00 PM点亮）上保持在7-00℃，并随意进行获得食物和水。 实验按照西奈山医学院神经科学学会和机构动物护理和使用委员会的指导进行。
对于可卡因实验[蛋白质印迹和定量染色质免疫沉淀（ChIP）]，使用8-至10-周龄雄性C57BL / 6J小鼠。 动物每天接受7次盐水或可卡因腹腔注射（20 mg / kg可卡因-HCl; Sigma）。 最后一次治疗后，小鼠使用24 h。 对于行为实验，小鼠在术后单独饲养，并如下所述用10 mg / kg（运动致敏）或7.5 mg / kg（条件性位置偏爱）可卡因-HCl腹膜内处理。
如前所述产生Srff1 / fl小鼠（Ramanan等，2005）。 通过立体定位注射和随后使用腺相关病毒（AAV）载体与绿色荧光蛋白（GFP）融合的Cre重组酶（Cre）的病毒过表达实现了Src的NAc特异性敲除。 使用了非自我删除Cre。 在Srffl / fl小鼠中注射AAV-GFP代替AAV-Cre-GFP作为对照。 简而言之，使用氯胺酮（10 mg / kg）和甲苯噻嗪（10 mg / kg）的混合物麻醉小鼠，其中用于病毒递送的以下立体定位坐标：+ 1.6（前/后），+ 1.5（侧向）， - 4.4（背/腹）与中线成XNUMX°（相对于前囟）。 在10最小时间段（0.5μl/ min）双侧递送总共5μl的纯化病毒，然后休息0.1 min。 在手术后数周，当病毒表达最大时，对小鼠进行5测试，并使用标准组织学方法确认所有动物的病毒注射位点。 病毒介导的Cre表达的效率通过免疫组织化学和对来自给予AAV-Cre-GFP和AAV-GFP进入NAc的动物的显微切割NAc穿孔进行的Srf的逆转录酶PCR验证。 如前所述产生AAV-GFP和AAV-Cre-GFP病毒（Maze等，2）。
行为程序
社会失败压力。
如前所述（Berton等，57; Krishnan等，6; Vialou等，10），C2006BL / 2007J小鼠连续2010天经历慢性社交失败应激。 简言之，将每只小鼠暴露于不熟悉且具有攻击性的雄性CD1退役种鸡，每天5 min。 在与CD1攻击者直接相互作用后，然后将动物置于相同笼子的相邻隔室中，用于下一个具有感觉但非物理接触的24 h。 对照动物饲养在等同的笼子中，但具有相同菌株的成员。 在失败的最后一天之后，24进行了社交互动测试。
根据公开的方案评估了对陌生CD1雄性小鼠的社交回避（Berton等，2006; Krishnan等，2007; Vialou等，2010）。 首先将实验小鼠引入包含空金属丝网笼的开放场地2.5分钟。 在第二阶段中，将陌生的CD1雄性小鼠引入有线笼中。 测量在交互区域（笼子周围8厘米宽的走廊）中花费的时间。 如先前所述（Krishnan等，2007； Vialou等，2010）将失败的小鼠分为敏感的和有弹性的亚群。 由于大多数对照组小鼠与社交目标互动所花的时间要多于与空目标围栏互动所花费的时间，因此将互动比率100（存在或不存在社交目标的互动区域所花费的时间相等）设置为临界值。 得分<100的小鼠被标记为易感，得分≥100的小鼠被标记为有弹性。 广泛的行为，生化和电生理分析支持了这些不同的易感和弹性亚群的有效性（Krishnan等，2007； Wilkinson等，2009； Vialou等，2010）。
为了检查Srffl / fl小鼠对社交失败压力的脆弱性，用AAV-GFP或AAV-Cre-GFP双侧注射的小鼠在同一天连续三次失败，然后测试社交相互作用24 h。 先前已经验证了这种次最大失败程序，以揭示遗传操作后的易感性表型（Krishnan等，2007; Vialou等，2010）。
学会了无奈。
如前所述（Berton等，2007），过表达AAV-GFP或AAV-Cre-GFP的Srff1 / fl小鼠进行学习的无助程序。 简而言之，在1连续天（2 mA，0.45持续时间）内，小鼠暴露于5 h的间歇性，不可避免的足部休克。 在测试当天，将小鼠重新引入15连续逃避试验的盒子中。 在每次试验期间，进行持续的休克，并且通过进入相邻的非电气隔室使小鼠有机会逃脱。 成功逃生后，门自动关闭并记录逃生延迟。 当小鼠在25内没有逃脱时，试验终止并记录为失败。 先前的研究表明，在没有应激的情况下，NAc和其他区域中的病毒表达对基线逃避行为没有影响（Newton等，2002; Berton等，2007）。
运动致敏。
在NAc内注射AAV-GFP或AAV-Cre-GFP后两周，对Srffl / f30小鼠进行运动致敏。 使小鼠习惯于运动场所每天4分钟，持续10天。 适应后，给动物腹膜内注射30mg / kg可卡因-HCl，并放入运动箱中。 使用光光束系统（San Diego Instruments）记录动物的自发活动，每天动态束断6分钟。 在XNUMX天的时间内记录了运动敏化。
条件的地方偏好。
如先前所述（Maze等，2010）进行位置调节程序，并进行以下修改。 简而言之，在Srffl / fl小鼠的NAc内AAV-GFP或AAV-Cre-GFP的NAc内输注后18 d，将动物放入条件调节室，该条件室由三个背景不同的环境组成。 对这两个调节室中的任一个表现出明显偏好的小鼠被排除在研究之外（所有动物的<10％）。 调节组进一步平衡以调节仍然可能存在的任何腔室偏差。 在随后的几天中，给动物注射生理盐水并在下午限制在一个房间中30分钟，然后在第二天将可卡因（7.5 mg / kg，ip）注射到另一个房间中，总计30分钟每次治疗进行两轮关联训练（两个生理盐水和两个可卡因配对）。 在测试当天，将小鼠未经处理放回装置中20分钟，并进行测试以评估副作用。 通过可卡因配对室中的光束中断评估对可卡因的运动反应，以确保药物治疗的有效性。 对于所有组，评估对盐水的基线运动，以确保运动不受病毒治疗的影响。
其他行为测试。
基于公开的方案（Vialou等，2010）在开放场，光/暗和强迫游泳测试中测试Srff1 / fl小鼠。 在红光条件下使用视频跟踪系统（Ethovision）记录5 min中开放场中小鼠的活动。 对于明/暗测试，允许小鼠自由探索由一个连接到较小的封闭场地的大型照明场所组成的两室箱。 测试小鼠5 min的时间以评估在任一外壳中花费的时间量。 在开场和亮/暗测试中，分别在中心和光场中花费的时间被评估为焦虑相关反应的反向指数。 1 d强制游泳试验进行5 min的一段时间。 在强迫游泳测试期间增加的不动时间被解释为类似抑郁症的行为。 1 d强迫游泳测试已经在小鼠中广泛使用，并且已经被验证为预测有效性的量度，因为抗抑郁疗法减少了不动时间。
免疫组化
将Srff1 / fl小鼠麻醉并用4％多聚甲醛/ PBS心脏内灌注。 取出脑并在30％蔗糖/ PBS中冷冻保护。 在冷冻切片机上切割冠状切片（30μm）并进行免疫组织化学分析。 使用针对SRF的多克隆抗体（1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology）进行Srff1 / fl敲除的验证。 通过GFP（鸡多克隆，1 / 8000，Aves Labs）在解剖的脑中表达证实Cre表达，因为Cre与GFP融合。 为了定量Srff1 / fl敲除小鼠中社交失败应激后的ΔFosB诱导，使用针对蛋白质的N-末端区域产生的兔多克隆抗体（1 / 1000; Santa Cruz Biotechnology）检测ΔFosB。 用共聚焦显微镜（20×放大倍数; Zeiss）拍摄图像。 计数为ΔFosB免疫反应性阴性和阳性的GFP免疫阳性细胞的数量在每只动物的多个图像中定量，随后计算每只动物的平均值。 每只动物被认为是用于统计分析的个体观察。
人死后NAc组织
人类死后脑组织是从达拉斯大脑收藏中心获得的，该组织的组织是在得到近亲同意后，从达拉斯医学检验官办公室和德克萨斯大学（UT）西南组织的移植计划中采集的。 分析了年龄，验尸间隔，RNA完整性数（RIN）和pH值匹配的雄性和雌性组织。 特定的痛苦因素包括昏迷，缺氧，发热，癫痫发作，脱水，低血糖，多器官功能衰竭以及死亡时摄入神经毒性物质会影响死后脑组织的RNA完整性（Tomita等，2004）。 我们使用神经因素量表（AFS）来表征这八种情况下的组织样本。 不存在痛风性因素的评分为0，将其存在评分为1，以提供0至8的AFS总评分。 表0给出了病例统计数据。高RIN值证实了出色的组织质量。 将病例进行标准解剖，然后在-1°C的异戊烷中速冻并在-1°C的温度下保存； 在冷冻组织上进行NAc的进一步解剖。 UT西南机构审查委员会审查并批准了该组织的收集品，以供研究使用。 随后，对每个抑郁症病例进行了直接的线人访谈，并记录了有关该病的信息； 两名研究精神科医生使用DSM-IV标准对重度抑郁症进行了共识性诊断。 这项研究中没有一个病例的血液毒理学筛查结果显示，滥用药物，酒精或除抗抑郁药以外的处方药对血液毒理学检查呈阳性。 尽管进行了抗抑郁治疗，但所有患者在死亡时均处于临床抑郁状态。 以盲法分配组织样品用于分析。
表1。
人类死后研究的人口统计数据
蛋白质印迹
如前所述处理人和小鼠NAc样品（Maze等，2010）。 在含有5％SDS的1 mM HEPES裂解缓冲液中用蛋白酶（Roche）和磷酸酶抑制剂（Sigma）对冷冻组织进行超声处理。 通过Dc蛋白质测定（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。 将等量的蛋白质样品进行SDS-PAGE和Western印迹。 使用针对SRF的抗体（1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology）或GAPDH（1 / 1500; Abcam）探测Western印迹，然后使用Odyssey成像系统（Licor）扫描和定量。
RNA分离和定量PCR
如前所述进行RNA分离，定量PCR（qPCR）和数据分析（Maze等，2010; Vialou等，2010）。 简而言之，用TriZol试剂（Invitrogen）分离RNA，并用来自Qiagen的RNAeasy微量试剂盒进一步纯化。 确定所有RNA样品具有260 / 280和260 / 230值≥1.8。 使用iScript（Bio-Rad）进行逆转录。 使用具有以下循环参数的Applied Biosystems 7900HT RT PCR系统进行使用SYBR green（Quanta）的qPCR：2 min的95 min; 40的95°C 15的59°C，30的72°C，33的95°C; 并且分级加热至2006℃以产生解离曲线以确认单个PCR产物。 通过比较ΔΔC（t）方法（Tsankova等，XNUMX）的治疗条件（对照与易感或弹性小鼠，或人对照与抑郁患者）的C（t）值来分析数据。 ΔFosBqPCR引物：foward，AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT和反向，GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG。
芯片
如前所述（Maze等，2010）对来自对照，易感和有弹性的小鼠（四只14-规格的拳击/小鼠）的混合双侧NAc拳击进行ChIP，在最后一次失败经历之后1 h以及来自盐水和可卡因 - 最终治疗后治疗的动物24 h。 将组织在1％甲醛中交联。 随后通过施用甘氨酸中断固定，洗涤组织并保持在-80℃直至使用。 将剪切的染色质与预先与磁珠结合的抗SRF抗体（Santa Cruz Biotechnology）（Dynabeads M-280; Invitrogen）孵育过夜。 在反向交联和DNA纯化后，通过qPCR使用跨越含有两个血清反应元件结合位点的fosb启动子区域的引物测定SRF与fosb启动子的结合。 与无抗体对照相比，SRF下拉显着富集。 小鼠fosb基因启动子引物：正向，CCCTCTGACGTAATTGCTAGG和反向，ACCTCCCAAACTCTCCCTTC。
统计分析
在生化和行为分析中，单向方差分析用于比较对照，易感和有弹性的小鼠之间的均值。 双向方差分析用于比较Srf局部基因敲除小鼠中的社交失败引起的ΔFosB诱导，以及比较Srf基因敲除在学习到的无助感和运动敏化方案中的作用。 使用学生t检验比较Srf基因敲除对ΔFosB诱导的影响，以及人死后组织各组之间的均值和小鼠ChIP分析。 当p≤0.05时，实验条件之间的差异被认为具有统计学意义。
成果
SRF和ΔFosB在人类抑郁症和社交失败小鼠中的表达
为了探索SRF在抑郁样行为发展中的潜在作用，我们首先评估了死后抑郁人类患者NAc中SRF蛋白的表达。 与年龄相匹配的对照组相比，抑郁的受试者的NAc的SRF水平显着降低（t（19）= 1.9； p <0.05）（图1A）。 鉴于SRF在调节活动相关的立即早期基因表达中的作用（Ramanan等，2005），我们假设SRF可能参与控制该大脑区域的ΔFosB表达。 为了支持这一假设，我们观察到抑郁的人的NAc中的ΔfosbmRNA水平也显着降低（t（16）= 1.8； p <0.05）（图1B）。 这与最近发现的在这些条件下ΔFosB蛋白水平降低的发现是一致的（Vialou等人，2010）。
图1。
慢性应激诱导的SRF抑制与NAc中ΔFosB转录降低有关。 A，B，死后人类抑郁症患者的NAc中SRF蛋白水平降低（n = 10 /组； A），NAc中ΔfosbmRNA表达降低（n = 8 / group; B）。 C，遭受慢性（10 d）社交挫败压力的小鼠被分为易感和有弹性的亚群。 D，慢性社交衰竭应激与C中所示的社交互动测试后24小时的对照组相比，易感小鼠的NAc中的SRF蛋白水平降低，但不降低弹性小鼠的ERF。E，易感小鼠中NAc中的ΔfosBmRNA水平未改变，但显着韧性动物中的表达上调（n = 7–15 /组）。 F，SRF蛋白在慢性社交衰竭应激后仅对有弹性的小鼠表现出与fosb基因启动子的结合增强，而对易感小鼠则无影响（n = 5 /组）。 显示的数据以平均值±SEM表示（以误差线表示）。 缺点，控制； 郁闷Sus。，易感； Res。，富有弹性。 * p <0.05与对照相比； ***与对照相比，p ＜0.001； #p <0.05与易感性； ## p <0.01相对易感； ### p <0.001相对易感。
为了扩展这些发现，我们在小鼠中使用了慢性社交失败应激协议。 根据社交回避的度量，有两组可区分的失败小鼠是易感的和有韧性的（Krishnan等，2007），与对照和有韧性的动物相比，易感动物的社交互动明显减少（F（2,23， 157.2）= 0.001; p <0.001;采用Bonferroni校正的t检验，易感性vs对照，p <0.05;弹性性vs对照，p <0.01;弹性性vs易感性，p <1）（图2,32C）。 最后一次失败发作后两天，分析了易感，有弹性和不败的对照小鼠在NAc中的SRF表达。 与人类抑郁症的发现相似，与对照组相比，易感小鼠的NAc中SRF蛋白水平显着降低，而弹性小鼠的NAc中SRF蛋白水平不受影响（F（4.7）= 0.05; p <0.05; Bonferroni矫正，易感vs.对照，p <0.05；弹性vs.易感，p <1）（图XNUMXD）。
接下来，我们检查了这三组动物的NAc中的ΔfosbmRNA表达，并仅在有恢复力的动物中观察到了Δfosb表达的显着增加，而在易感小鼠中却没有观察到这种趋势，但没有显着增加（t（14）= 2.1； p <0.05 ）（图1E）。 为了进一步研究SRF水平与Δfosb转录之间可能存在的相互作用，我们使用ChIP来检查在易感和有抵抗力的小鼠的单独小组中慢性社交衰竭应激后，SRF与fosb基因启动子的结合是否发生了改变。 与对照（t（8）= 2.1; p <0.05）和易感小鼠（t（8）= 2.0; p <0.05）相比，有弹性的动物在NAc中显示出显着增强的SRF与fosb启动子的结合。 在对照组和易感小鼠之间未观察到差异，这可能反映了易感小鼠中SRF诱导的缺乏（图1F）。
为了证实SRF在慢性社交衰竭应激后在ΔFosB调控中的作用，使用Srffl / fl小鼠检查从NAc选择性缺失SRF对ΔFosB应激诱导的作用。 Srffl / f2小鼠在NAc内立体定向注射表达GFP或Cre-GFP的AAV载体。 免疫组织化学证实了由AAV-Cre-GFP诱导的SRF的NAc特异性敲除（图50A）。 实际上，SRF染色和Cre表达之间没有重叠，证明了敲除的有效性。 在显微解剖的NAc冲头中，我们检测到SRF蛋白水平显着降低了11％（t（4.3）= 0.001； p <XNUMX）。 数量级可能反映了这样的事实：这种显微解剖中的一部分组织没有被病毒感染。
图2。
SRF通过慢性社交失败压力介导ΔFosB诱导。 A，将AAV-Cre-GFP注入Srffl / fl小鼠的NAc中会导致表达Cre的神经元中SRF蛋白的敲除。 注射AAV-GFP没有明显的作用。 B，这种从NAc中选择性去除SRF完全阻断了慢性社交失败压力（n = 4 /组）后NAc中ΔFosB的诱导。 显示的数据以平均值±SEM表示（以误差线表示）。 与AAV-GFP对照相比* p <0.05； ** p <0.01，相对于AAV-GFP失败。
接下来，我们对注射AAV-Cre-GFP或AAV-GFP的NAc内失败的Srffl / fl小鼠的NAc中的ΔFosB进行了定量免疫组织化学分析。 在长期的社会挫败压力之后，在注射AAV-GFP的动物的NAc中明显诱导了ΔFosB表达（病毒×治疗相互作用，F（1,12）= 6.4；采用Bonferroni校正的t检验，对照与失败的比较，p <0.05； AAV-Cre与AAV-GFP，p <0.01）。 但是，在接受AAV-Cre-GFP的Srffl / f2小鼠中未观察到这种诱导作用（图XNUMXB），表明慢性应激在NAc中的ΔFosB诱导作用需要SRF。
NAc中的SRF敲除促进了表达抑制和表达类似的表型
由于先前已证明由慢性社交挫败压力诱导的ΔFosB介导了复原力（Vialou等人，2010），因此我们假设易感动物中SRF的下调以及由此导致的ΔFosB诱导的丧失可能代表了一种负适应，最终导致动物更容易受到压力的有害影响。 为了验证这一假设，我们如上所述诱导了成年Srffl / fl小鼠中Srf基因的局部NAc特异性缺失，并在一系列行为范式中对所得小鼠及其对照组进行了测试，以评估基线抑郁症和焦虑症。喜欢的行为。 SRF的局部NAc缺失通过强迫游泳试验（t（30）= 2.5; p <0.05）促进了类似抑郁的作用，以及在旷野中测量的促焦虑作用（t（38）） = 1.9; p <0.05）和明/暗测试（t（8）= 1.9; p <0.05）。 因此，接受AAV-Cre-GFP进入NAc的Srffl / f3小鼠在强迫游泳试验中显示出固定不动的潜伏期缩短，在空旷区域中央的时间更少，在明/暗盒的光室中的时间更少与注射AAV-GFP的动物相比（图3A–C）。 然而，NAF内SRF的删除并没有改变运动的基线水平，这表明在SRF敲除动物中观察到的行为影响不是由于总体运动活动异常引起的（图2010D）。 鉴于先前的报道表明，尽管NAc中的ΔFosB调节抑郁样行为，但这些数据似乎并不有趣（Vialou等人，XNUMX），这似乎是有趣的。 我们目前的发现，SRF的丢失会引起焦虑反应，这表明它是通过ΔFosB以外的靶标引起的。
图3。
从NAc的SRF基因敲除促进了抑郁和焦虑样表型。 A–C，通过将AAV-Cre-GFP注射到Srffl / fl小鼠的NAc中，从NAc中选择性剔除SRF，可减少强制游泳试验中固定的潜伏期（n = 14-18 /组； A）并分别减少了在野外测试（B）和明/暗（C）测试中在中心花费的时间和在明暗室中花费的时间（n = 5-15 /组）。 D，在接受NAV内注射AAV-GFP或AAV-Cre-GFP的小鼠的开阔视野中，未观察到基础运动能力的差异。 E，F，分别以逃避潜伏期和社交互动时间来衡量，对学习的无助感的敏感性增加（n = 7-8 /组； E）和社交失败压力（n = 5-6 / group; F） 。 显示的数据以平均值±SEM表示（以误差线表示）。 * p <0.05，相对于GFP或相对于目标缺失； **与GFP相比p <0.01； ***相对于GFP，p ＜0.001。
接下来，我们研究了NAc中SRF的缺失是否还会增加动物对反复胁迫的不利影响的脆弱性。 在两个抑郁症模型中检查了注射有AAV-Cre-GFP或AAV-GFP的Srffl / f14,180小鼠的NAC抑郁模型，即学习性无助和慢性社交挫败压力。 在习得性无助中，接受AAV-Cre-GFP的Srffl / fl动物在事先暴露于不可避免的足部震动压力后表现出逃避足部震动的潜伏期延长（治疗×试验交互作用，F（10.2）= 0.001；采用Bonferroni校正的t检验， p <0.01； AAV-Cre与AAV-GFP，p <3），表明对应激诱导的行为缺陷的敏感性增加（图10E）。 类似地，在慢性社交衰竭压力后，与注射AAV-GFP的对照动物相比，NAc的局部SRF缺失也增加了社交厌恶感（t（1.8）= 0.05; p <3）（图XNUMXF），类似于抑郁症。
缺乏SRF参与ΔFosB诱导和对可卡因的行为反应
鉴于在NAc中也对可卡因等滥用药物产生了ΔFosB的作用，因此有必要研究SRF在可卡因作用中的潜在作用。 与长期的社会失败压力不同，重复的可卡因暴露不会改变NAc中的SRF蛋白表达（t（14）= 0.8; p> 0.05）（图4A），并且对SRF与该脑区域中fosB基因启动子的结合没有影响。 （t（4）= 0.7; p> 0.05）（图4B）。 这表明，与压力相反，慢性可卡因诱导的ΔFosB不是通过SRF介导的。 我们通过检查在接受AAV-Cre-GFP与AAV-GFP进入NAc的Srffl / fl动物中慢性可卡因后ΔFosB积累是否发生改变，直接测试了这一点。 我们发现SRF缺失对可卡因诱导的ΔFosB在此大脑区域的蓄积没有影响（图4C）。
图4。
SRF的丧失对可卡因诱导ΔFosB或可卡因调节行为没有影响。 A，B，重复可卡因暴露（7 d，20 mg / kg可卡因-HCl）对NAc（A）中的SRF蛋白表达或SRF与该脑区域中的fosB基因启动子结合没有影响（B）24 h后药物暴露（n = 5 /组）。 在慢性可卡因暴露后免疫细胞化学测量的C，ΔFosB积累不受SRF的NAc特异性敲除的影响。 D，E，来自NAc的SRF的局部缺失也对盐水注射（d 1）后对可卡因诱导的运动活性和致敏（n = 8 /组）（d 1-7; D）的运动活性没有影响或关于可卡因条件性地点偏好（n = 8 / group; E）。 显示的数据表示为平均值±SEM（表示为误差条）。
为了跟踪这一令人惊讶的发现，我们研究了从NAc选择性剔除SRF是否会改变对可卡因的行为反应。 与SRF缺乏可卡因对ΔFosB诱导的调控相一致，NAc特异的SRF敲除对急性可卡因诱导的运动活动或重复可卡因暴露后的运动致敏作用没有影响（治疗×时间相互作用，F（4,80） ＝ 0.3； p＞ 0.05）（图4D）。 同样，NAc特异的SRF剔除对可卡因条件的位置偏好没有影响（t（14）= 0.1； p> 0.05）（图4E），这提供了可卡因奖励的间接衡量。
讨论
该研究将SRF鉴定为慢性社交失败应激后NAc中ΔFosB的新型上游介质，并暗示SRF在抑郁和焦虑样行为的发展中。 我们提供直接证据表明慢性社交失败压力会降低敏感但不具弹性的动物的NAc中的SRF水平，并且这种下调可以阻止在该脑区诱导ΔFosB，我们已经证明这对于有效应对慢性压力是必要的，即弹性（Vialou等，2010）。 在抑郁的人的NAc中发现了SRF表达的类似降低，其中ΔFosBmRNA和蛋白质表达也降低。 相反，尽管SRF下调，但ΔFosB水平在易感小鼠的NAc中没有降低，这表明在控制ΔFosB表达方面尚未知的其他转录机制。 通过使用来自该脑区域的SRF的诱导型遗传缺失，建立SRF在介导慢性应激后NAc中ΔFosB诱导中的因果作用。 具有这种NAc特异性SRF敲除的小鼠的行为分析进一步暗示SRF在基线和应激诱导的抑郁和焦虑样行为的发展中起关键作用。 与之形成鲜明对比的是，SRF缺失对响应慢性可卡因给药的ΔFosB诱导或可卡因的行为影响没有影响。 这些发现支持SRF在调节ΔFosB诱导和对不同环境扰动的行为反应中的新的刺激特异性作用。
先前已经显示SRF介导的转录响应于突触活动，主要由钙流入增加以及增强的神经营养活性引发，特别是在脑源性神经营养因子（BDNF）的情况下（Bading等，1993; Xia等人，1996; Johnson等人，1997; Chang等人，2004; Kalita等人，2006;Knöll和Nordheim，2009）。 这提出了一个有趣的问题，即为什么SRF在慢性社交失败压力后易感但不具弹性的老鼠的NAc中被下调。 这种差异调节可能不是由多巴胺或BDNF信号传导介导的，因为易感小鼠在NAc中显示出增加的BDNF蛋白水平和增加的下游BDNF信号传导以及增强的腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元的突发发射，其支配NAc，而弹性动物显示正常水平的BDNF信号传导和VTA激发率（Krishnan等，2007）。 另一种可能性是响应于该脑区域的改变的谷氨酸能神经支配而在NAc中抑制SRF表达，我们已经显示在易感性和有弹性的小鼠中差异调节（Vialou等人，2010）。 需要进一步的工作来直接研究这个和其他可能的机制。
最近使用全基因组和其他方法的研究表明，神经元中~5-10％的SRF靶基因是直接的早期基因（Philippar等，2004; Ramanan等，2005; Etkin等，2006;Knöll和Nordheim，2009）。 这与我们的数据一致，证明了SRF通过慢性应激诱导ΔFosB（fosb立即早期基因的截短产物）的关键作用。 有趣的是，在这些不同研究中鉴定的许多SRF靶基因也代表NAc中ΔFosB的已知靶标（Kumar等，2005; Renthal等，2008，2009; Maze等，2010）。 在这些通常调节的基因中，已知有几种调节神经元细胞骨架的基因（例如，Cdk5，Arc和Actb）。 反过来，这与SRF影响几种神经元细胞类型中肌动蛋白动力学和神经元运动的报道一致（Alberti等，2005; Ramanan等，2005;Knöll等，2006），而ΔFosB是已知的影响NAc神经元的树突棘向外生长（Maze等，2010）。 这些共同的功能终点可以反映SRF的协同作用，结合其诱导ΔFosB，作用于一系列共同的靶基因以影响神经元形态，并最终影响复杂行为。
SRF还被证明在突触可塑性和神经元活性依赖性基因表达和行为的调节中发挥关键作用。 例如，响应于新环境的自愿探索或电惊厥性癫痫发作的神经元激活，立即早期基因的SRF依赖性诱导的丧失与Srf突变体的海马中的长期突触增强受损相关（Ramanan等人。 ，2005; Etkin等，2006）。 此外，已显示海马中的SRF耗竭导致长期突触抑制的缺陷，由新环境诱导的立即早期基因表达，以及在新环境的探索期间受限的习惯性（Etkin等，2006）。 这些数据确立了SRF在动物适当适应环境扰动的能力中的重要性，例如在上述学习适应新环境的情况下，或者在适应负面压力刺激的情况下，防止压力的释放。导致的行为缺陷，如我们目前的研究。 因此，我们观察到动物表现出SRF表达的缺陷，无论是对易感个体的社交失败压力的反应还是通过SRF的直接敲低，都表现出抑郁和焦虑样行为增加。 鉴于抑郁的人类受试者在NAc中的SRF水平也降低，可以想象SRF在调节个体积极适应负面环境刺激的能力方面起着基本作用，部分是通过调节NAc中的ΔFosB表达。
不同的机制：成瘾与抗压力
本研究的一个令人惊讶的发现是，尽管响应于慢性应激，在NAc中ΔFosB积累需要SRF，但是响应于慢性可卡因，在同一脑区内ΔFosB诱导不需要SRF。 同样，SRF对于药物的正常行为反应不是必需的。 这些数据表明，尽管ΔFosB在NAc中响应许多类型的刺激而被诱导（Nestler等，1999; Nestler，2008），但似乎存在导致ΔFosB诱导的不同分子途径。 对这些发现的一种可能的解释是部分不同的细胞类型，其显示响应于应激与可卡因的ΔFosB积累。 慢性应激在NAc中型多刺神经元的两个主要亚群中大致相等地诱导ΔFosB，那些主要表达D1与D2多巴胺受体，而慢性可卡因主要在D1 +神经元内诱导ΔFosB（Kelz等，1999; Perrotti等，2004）。 。 因此，SRF依赖性途径可能对D2 +神经元中的ΔFosB诱导很重要。 然而，这不能解释慢性应激后SRF敲除小鼠中ΔFosB诱导的完全丧失，因为诱导发生在两种神经元亚型中。 另一种解释是慢性应激和慢性可卡因通过其对NAc神经元的不同作用模式影响不同的细胞内信号级联，如前所述，慢性应激可能通过改变的谷氨酸能传递而起作用，慢性可卡因主要通过D1起作用。受体信号传导（Nestler，2008）。 另一种可能性是慢性应激与慢性可卡因的ΔFosB诱导依赖于不同的转录机制，所述转录机制由支配来自各种谷氨酸能投射区域的NAc的不同神经输入差异控制，例如，前额皮质，海马和杏仁核的几个区域。 需要做更多的工作来探索这些和替代的可能性。
总之，我们的发现确定了一种新的转录机制，通过该机制在NAc中诱导ΔFosB以介导对应激刺激的抗衰老反应。 该研究还为SRF在抑制和焦虑行为的调节中在NAc水平上所起的作用提供了重要的新见解。。 更好地了解SRF在此类行为调控中的转录作用将有助于鉴定与应激相关疾病的适应力有关的新基因靶标，并可能促进未来更有效的抗抑郁疗法的发展。
这项工作得到了国家精神卫生研究所和国家药物滥用研究所的资助以及与阿斯利康的研究联盟的支持。 我们感谢David D. Ginty提供的Srffl / fl小鼠。
通讯应发送给西奈山医学院Fishberg神经科学系Eric J. Nestler，One Gustave L. Levy Place，Box 1065，纽约，纽约10029-6574。 [电子邮件保护]
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