可卡因自我给药和戒断期间对DeltaFosB，FosB和cFos的纹状体调节（2010）

J Neurochem。 作者手稿; 可在PMC Oct 1，2011中找到。
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抽象

慢性药物暴露诱导基因表达谱的改变，这被认为是药物成瘾发展的基础。 本研究检测了自我给药和yoked大鼠在慢性静脉内可卡因给药期间和之后纹状体亚区域中转录因子Fos家族的调节，特别是cFos，FosB和ΔFosB。 我们发现cFos，FosB和ΔFosB在慢性可卡因给药后表现出区域和时间上不同的表达模式，伏隔核（NAc）壳和核心中ΔFosB蛋白的积累更多，而尾状壳核（CPu）中ΔFosB增加与急性或慢性给药相似。 相反，在慢性给药的所有3纹状体亚区中，耐受性发展为可卡因诱导的ΔFosBmRNA。 容差也发展到FosB表达，最明显的是NAc shell和CPu。 有趣的是，对可卡因诱导的cFos诱导的耐受性取决于对腹侧而非背侧纹状体区域中可卡因摄入的意志控制，而FosB和ΔFosB的调节在可卡因自我施用和yoked动物中相似。 因此，CPu中ΔFosB介导的神经适应可能比先前认为的开始使用静脉内可卡因更早发生，并且与NAc中ΔFosB的更大积累一起，可能有助于与可卡因寻求行为相关的成瘾相关增加。

关键词： 可卡因，自我管理，退缩，纹状体，Fos

介绍

反复接触成瘾药物会在大脑奖励途径中产生神经适应，这种途径被认为是强迫吸毒的发展以及对戒断期间吸毒行为的渴望和复发的持续存在的基础。 这些神经适应性中的许多是由转录因子的诱导和随后的基因表达调控引起的，这可能对神经元结构和功能具有潜在的长期影响（张 et al. 2006）。 Fos转录因子家族特别令人感兴趣，因为该家族的成员在急性和慢性可卡因暴露后显示纹状体区域的差异诱导模式。 当可卡因以被动，非偶然的方式（即通过腹膜内（IP）注射）急性给药时，它会增加背侧（尾壳核，CPu）和腹侧（伏隔核，NAc）中的cFos和FosB mRNA和蛋白质。纹状体 (Graybiel et al. 1990; 年轻 et al. 1991; 希望 et al. 1992), 而慢性被动给药对这种反应有耐受性 (希望 et al. 1992, 1994; Alibhai et al. 2007). 相反，纹状体水平的ΔFosB（35-37 kDa），一种稳定的截短的剪接变体 FOSB 基因，在慢性但非急性被动可卡因暴露后升高 (希望 et al. 1994; 奈伊 et al. 1995; 陈 et al. 1995, 1997）。 与cFos或FosB相比，这些稳定的ΔFosB同种型可以与不同的Jun家族蛋白异二聚体化（陈 et al. 1995），也可以与自身形成功能性同源二聚体（Jorissen et al. 1997），提示慢性可卡因后激活蛋白-1（AP-1）复合物的差异形成可能改变AP-1位点的基因表达，其方式不同于急性可卡因暴露产生的基因表达（希望，1998; Kelz和Nestler，2000）。 基因表达谱的差异变化也取决于ΔFosB升高是短期还是持久，这些变化可能导致可卡因介导的行为差异表达 （McClung和Nestler，2003）。 长期接触其他药物，包括苯丙胺，吗啡，△9-THC，尼古丁，乙醇和苯环利定也导致纹状体区域中稳定的ΔFosB同种型的积累（麦克朗 et al. 2004; Perrotti et al. 2008）。 此外，最近的研究结果表明ΔFosB积累与苯丙胺诱导的cFos之间存在负相互作用，这可能解释了慢性兴奋剂暴露后对cFos诱导的耐受性（Renthal et al. 2008). 总之，这些发现导致了这样的假设：稳定的ΔFosB同种型可以作为“分子开关”并促进从最初的药物使用转变为更多成瘾的生物状态。 (内斯特勒 et al. 2001; Nestler，2008).

虽然大多数先前的研究利用重复的被动可卡因治疗来研究Fos家族蛋白的表达，并且当可卡因静脉内（IV）自我施用数小时典型的人类滥用模式时，该调节的实例相对较少。 一项研究发现，在小鼠中单次30-min可卡因自我给药后，cFos mRNA在CPu中升高（Kuzmin和Johansson，1999），而在亚慢性期后大鼠的CPu没有发现任何变化（ 3天）或慢性（6-12周）可卡因自我管理（Daunais） et al. 1993，1995）。 停药一段时间后，可卡因介导的NAc中cFos蛋白的增加在先前升级的可卡因摄入的大鼠中减少（本 - 沙哈尔 et al. 2004），在暴露于可卡因相关线索后，在整个纹状体中发现升高的cFos水平（Neisewander et al. 2000; Kufahl et al. 2009）。 与cFos相比，慢性可卡因自我给药后整个纹状体中ΔFosB的蛋白水平增加，并且这种积累可持续至少1天进入戒断期（PICH et al. 1997; 佩罗蒂 et al. 2008）。 然而，没有报道比较多种Fos家族蛋白对急性或慢性接触的静脉内可卡因给药的反应性的变化。 鉴于ΔFosB和cFos之间潜在的相互作用，差异性AP-1复合物形成对基因表达产生不同影响的能力，以及这些差异对可卡因介导行为的可能影响，确认其中的改变也很重要。当可卡因自愿给药时，也发现非偶然给药后发生的cFos，FosB和ΔFosB的表达，并确定这些改变在可卡因给药终止后可持续多长时间。 因此，在本研究中，我们比较了慢性静脉注射可卡因对可卡因给药和停药期间纹状体亚区域中ΔFosB，FosB和cFos表达的影响。 我们将发现的自我管理规定与在急性或慢性接触后通过非意志性输注接受相同数量和可卡因时间模式的动物中的调节进行比较。 鉴于FosB和ΔFosB是相同的剪接变体 FOSB 我们还比较了FosB和ΔFosB的mRNA调节与蛋白质水平的调节。

实验步骤

科目和手术

最初称重约250-300 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠在12 h光 - 暗循环（在7：00 AM上点亮）中在温度和湿度受控的环境中饲养。 给动物喂食物和水 随意 在任何时候，除了在蔗糖颗粒的杠杆压力训练（85 mg，BioServ）期间它们保持在其自由进食重量的45％时。 杠杆 - 压力训练在通风操作室（Med Associates，Georgia，VT）中进行，直到在100（FR3）固定比例增强计划下满足采集标准（1颗粒每次1连续会话）。 然后喂食动物 随意 手术前至少24小时。 对于手术，给予大鼠阿托品（0.04 mg / kg，皮下）以辅助呼吸，并且根据先前公布的程序，在戊巴比妥钠（50 mg / kg，IP）麻醉下将慢性留置导管插入右颈静脉（爱德华兹 et al. 2007a）。 手术后，给大鼠注射青霉素（200,000 IU / kg，肌内）以防止感染，并且每天用含有硫酸庆大霉素（0.2 mg / ml）的20 ml肝素化（0.33 IU / ml）抑菌生理盐水冲洗导管。 所有实验程序均按照国立卫生研究院进行 实验动物护理和使用指南，并获得了UT西南医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

仪器和自我管理程序

在1从手术中恢复后，将动物分成多个实验组/停药时间（图1A），如前所述，每天回到操作试验室（爱德华兹 et al. 2007b）。 未处理对照组中的大鼠单独饲养并且在其家笼中每天处理而不暴露于自我施用环境。 允许可卡因自我给药（CSA）组的大鼠在0.5每日50期间以固定比例1（FR1）加强方案自愿给予可卡因（4 mg / kg /6μl输注），进行18天/ wk，共计2.5天。 每个主动杠杆按压产生12.5的可卡因输注，其与主动杠杆上方的提示灯的照明相关联。 在可卡因输注期间，房屋灯被熄灭，并且在输液后还有一个额外的4超时时间，其中房屋灯仍然关闭。 记录输液和超时期间的杠杆响应，但没有任何后果。 在腔室中存在另外的无效杠杆，但是对该杠杆的响应没有结果。 慢性轭（CY）组中的大鼠与活跃的自我施用大鼠配对，并接受与其自我施用配偶体相同的量和时间模式的被动可卡因输注。 急性轭（AY）组的大鼠也与慢性CSA组的大鼠配对，但接受被动盐水输注而不是可卡因，直到自我给药的最后一天，当他们第一次接受单次无源可卡因输注时时间。 最后，与未处理的对照相比，允许Saline SA组自始至终自我给予盐水以识别与手术，测试或其他实验程序相关的潜在变化。 AY和CY组之间的比较用于鉴定cFos，FosB或ΔFosB对急性和慢性可卡因暴露的反应性的变化，同时比较CSA和CY组以鉴定cFos，FosB或ΔFosB表达的变化。特别是与可卡因的奖赏与药理作用有关。 在最后的24 h测试期后立即收集所有研究组的组织以比较可卡因诱导的cFos，FosB和ΔFosB的调节，并且对于组织收集的3 h或XNUMX的一些研究组确定可卡因诱导的变化的持久性。在最后的测试会议之后。 定量蛋白质印迹和RT-PCR程序用于解剖纹状体亚区域以避免与抗体交叉反应性相关的潜在问题并提高检测变化的灵敏度。

图1  

（A）描述可卡因给药和戒断（WD）方案的时间表。 实线表示在慢性可卡因自我给药（CSA）和慢性连体（CY）动物中静脉注射可卡因输注（0.5 mg / kg /输注） ...

组织收集

通过针对头部区域（5 kW，1.5 s，Murimachi Kikai，Tokyo，Japan）的微波照射处死大鼠。 快速解剖和冷冻脑，并且基于从以下坐标获得的坐标从14 mm冠状切片获得伏隔核（NAc）壳，NAc核和尾状壳核（CPu）的双侧组织穿孔（1.5规格）。 Paxinos和Watson（1998，插图 图1B）。 通过在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中超声处理使组织样品均质化。 然后将匀浆物煮沸5 min，置于冰上，随后由Lowry测定以确定蛋白质浓度。 然后将匀浆物等分到20μg样品中并在-80℃下储存直至使用。

西方印迹

将组织样品上样到12％聚丙烯酰胺凝胶上，通过在Tris /甘氨酸/十二烷基硫酸钠缓冲盐水溶液（TGS; Bio-Rad，Hercules，CA）中电泳分离。 分离后，将样品通过电泳（250 mA用于18 h）转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF; Amersham，Piscataway，NJ），随后在3％脱脂奶粉和1×Tris / Tween缓冲盐水溶液（TTBS; Bio）中封闭。 -Rad，Hercules，CA）在4°C过夜。 然后将膜在1：1000稀释的初级Fra抗体（由Michael Iadarola博士，National Institutes of Health，Bethesda，MD）在3％乳/ 1×TTBS溶液中在4℃下孵育过夜。膜洗涤在1×TTBS中（4次，每次15分钟），并在1×TTBS中孵育，该1×TTBS含有25000：1稀释的山羊抗兔二抗，其与辣根过氧化物酶（Bio-Rad，Hercules，CA）缀合，用于室内XNUMX h温度。 再次洗涤膜，然后使用Pierce Super Signal West Dura（Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL）在Hyperfilm（ECL plus; Amersham）上化学发光介导的检测进行显色。 cFos，FosB和ΔFosB蛋白条带的定位如图所示 图1C。 我们选择仅检查本研究中稳定表达的ΔFosB形式（即35-37 kDa），因为正是这些形式被认为会累积与慢性药物的使用并产生成瘾的神经可塑性（内斯特勒 et al. 2001）。 使用Scion Image（Frederick，MD）将绝对免疫反应性指定给条带，并使用扫描仪拍摄胶片的数字图像。 检测后，剥离膜并重新探测β-微管蛋白（1：200000，Cell Signaling，Danvers，MA）。 β-微管蛋白水平用作加载对照以标准化Fos相关蛋白的水平。

RT-PCR

定量RT-PCR（qRT-PCR）用于立即测定FosB和ΔFosBmRNA的变化以及施用可卡因后的24h。 通过快速断头对动物实施安乐死，如上所述分离NAc核心，NAc壳和CPu（格雷厄姆 et al. 2007; Bachtell et al. 2008）。 立即将单个样品在RNA-STAT-60（德克萨斯州Friendswood的IsoTex Diagnostics Inc.）中匀浆，并在干冰上冷冻，直到按照制造商的说明提取mRNA。 简要地，将氯仿添加到每个样品中，并在离心后分离水层。 在线性丙烯酰胺（Ambion，Austin，TX）存在下，用异丙醇沉淀总mRNA。 离心样品，用70％乙醇洗涤提取的mRNA沉淀，并重悬于DEPC水中。 用mRNA酶处理总mRNA（Ambion，Foster City，CA），并使用Superscript III（Invitrogen，Carlsbad，CA）用随机六聚体逆转录为cDNA。 用于扩增FosB，ΔFosB和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的引物序列为5'-GTGAGAGATTTGCCAGGGTC-3'和5'-AGAGAGAAGCCGTCAGGTTG-3'，5'-AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT-3'和5'-GCCGAGGACTTGAACTTC ′和3′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-5′和3′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-5′。 使用扩增曲线的二阶导数由三次重复反应计算循环阈值（cT）。 由于GAPDH不受可卡因调节，因此将FosB和ΔFosBcT值归一化为GAPDH cT值（ΔcT）。 如前所述（Applied Biosystems手册），使用ΔΔcT方法计算倍数变化。

统计分析

每种蛋白质的水平表示为每个大脑区域和时间点未经处理的对照组的变化百分比，并通过单向方差分析（ANOVA）比较研究组，显着性水平设置为p <0.05。 使用Fishers LSD测试进行事后比较，以观察总体效果。 使用线性回归评估可卡因摄入量与蛋白质水平变化之间的相关性。

成果

允许自愿施用可卡因的CSA组中的动物在SA的第三周（天13-18）表现出稳定的可卡因自我施用模式。 在SA的最后一周，CSA大鼠及其CY伴侣的平均每日可卡因摄入量为46.9（±1.8）mg / kg /天（范围：37-60 mg / kg /天）。 在最后的测试当天，0 h戒断（WD）组中的CSA大鼠自我给予44.5（±2.5）mg / kg可卡因（范围25.5-57.5 mg / kg），并且他们的CY接受相同量的可卡因和AY合作伙伴。

急性或慢性可卡因后纹状体亚区域ΔFosB蛋白的差异调节

在静脉注射可卡因的4小时后立即在纹状体亚区中发现ΔFosB蛋白的差异调节（0 h WD）。 在NAc壳中，与未处理的对照相比，只有慢性可卡因使CSA和CY组（45-61％）显着增加（图2A, F4,60 = 4.22， p = 0.005）。 在NAc核心中，AY组急性暴露后发现ΔFosB（41％）显着增加（图2B, F4,60 = 17.04， p <0.001），并且在长期服用可卡因后发现增加幅度更大（89-95％）。 与长期服用可卡因的NAc中ΔFosB的积累量相比，CPu在急性和慢性可卡因组中都显示出类似的ΔFosB增加（86-102％）（图2C, F4,78 = 19.09， p <0.001）。 在任何纹状体亚区域中，CSA组和CY组之间的ΔFosB增加均无差异，这表明调节与可卡因暴露有关，而与自愿可卡因消耗量无关。 慢性可卡因进入NAc外壳后，ΔFosB的调节持续至少24小时（F2,32 = 5.19， p = 0.02），NAc核心（F4,60 = 4.53， p = 0.02）和CPu（F2,34 = 12.13， p <0.001），但在3周后恢复到基线水平。 当将可卡因组与盐水SA组进行比较时，发现ΔFosB的增加类似，除了与盐水SA相比，AY动物的NAc外壳的较小增加达到了显着性，但与未经处理的对照组相比却没有。 但是，与未经治疗的对照组相比，在整个训练过程中自食盐水的动物中没有明显的ΔFosB调节，表明ΔFosB的调节归因于可卡因，而不是手术或测试程序的结果。

图2  

在可卡因给药后立即调节ΔFosB，在24 h和3周WD。 ΔFosB（35-37 kDa）的水平表示为来自未处理的家庭对照（对照）的平均值±SEM百分比变化。 生理盐水组织 ...

慢性可卡因对FosB蛋白调节的耐受性

与ΔFosB的调节相反，单次暴露于IV可卡因施用的4 h在所有3纹状体亚区中产生显着更大的FosB蛋白增加，但在慢性可卡因施用后产生该反应的显着耐受性。 在NAc壳中，在AY动物中施用急性可卡因260 h后，FosB立即增加（4％），但在CY和CSA组中长期给药后这些增加减少（至142-146％）（图3A, F4,77 = 23.16， p <0.001）。 在AY和CSA组中，长期服用可卡因后，在AY动物的CPu中发现了类似的FosB升高（295％），也降低了（135-159％）（图3C, F4,69 = 13.362， p <0.001）。 与其他脑区相比，在NAc核心中，急性可卡因给药在AY动物中产生的FosB增幅较小（164％）。 但是，这些增加仍然比CY和CSA组的慢性给药后产生的增加（109-112％）（图3B, F4,57 = 20.23， p <0.001）。 正如使用ΔFosB所发现的那样，通过长期控制可卡因的摄入量并不能调节慢性可卡因对FosB的调节。 然而，与ΔFosB相比，FosB蛋白的增加未能在24小时后在NAc壳和核中持续存在，尽管在CPu中仍然存在残留的增加（38-52％）（F2,32 = 3.590， p <0.05）。 在盐水自给动物中，FosB水平不受手术或测试程序的影响。

图3  

可卡因给药后立即对FosB的调节以及24 h和3周WD。 FosB的蛋白质水平（46-50 kDa）表示为来自未处理的家庭对照的平均值±SEM百分比变化（参见 图2 缩写图例） ...

慢性可卡因后ΔFosB和FosB mRNA诱导的衰减

急性接触静脉注射可卡因的4 h在NAc壳中的ΔFosBmRNA中产生类似的增加（11-16倍数）（F3,19 = 15.82， p <0.001），NAc核心（F3,19 = 13.275， p <0.001，并且CPu（F3,11 = 5.78， p =与盐水SA对照组相比（0.03），0 h WD， 图4A）。 然而，在NAc壳（3-4倍数），NAc核心（4倍数）和CPu（3倍数）中施用慢性可卡因后，CY和CSA组中的这种反应被强烈抑制。 尽管急性IV可卡因给药相对于ΔFosB产生更大的FosB蛋白增加，但在所有4纹状体亚区中，急性可卡因给药诱导FosB（9-11倍数）的mRNA增加相对低于ΔFosB（16-3倍数）的mRNA增加（图4B）。 在NAc壳中慢性可卡因后，这种反应几乎被废除了（F3,19 = 26.22， p <0.001）和CPu（F3,11 = 4.24， p <0.05），尽管在NAc核心的CY和CSA组中仍存在微小但显着的增加（2倍）（F3,19 = 11.10， p <0.001）。 与相同的盐水SA对照组相比，可卡因诱导的AY动物中ΔFosB和FosB的增加在WD 24小时后均未保留。 在WD时间0h时对FosB与ΔFosBmRNA水平的比率的进一步分析表明，可卡因的施用显着降低了NAc壳中FosB与ΔFosBmRNA的相对量（F3,19 = 4.79， p = 0.02），NAc核心（F3,19 = 4.49， p = 0.02）和CPu（F3,11 = 5.59， p = 0.03）由于ΔFosB同种型的形成更多，并且无论长期给药后两种mRNA中可卡因诱导的反应的实质耐受性如何（图4C）。 这些比例在可卡因是自我施用还是通过yoked输注被动接收方面没有显着差异，并且FosB：ΔFosB的相对比率在24h WD时间点在所有三个脑区域中恢复正常（数据未显示）。

图4  

在可卡因给药后和24 h WD后立即调节FosB和ΔFosB的mRNA。 ΔFosB（A），FosB（B）和FosB /ΔFosB转录物（C）的转录物的定量RT-PCR表示为平均值± ...

加强相关对NAc中可卡因诱导的cFos的耐受性

与对可卡因的药理学反应的FosB基因产物的调节相反，不管被动或意志给药，与通过被动轭合输注接受可卡因的动物相比，NAc亚区域中cFos的调节受可卡因自我施用的背景的强烈影响。 可卡因暴露增加了NAC壳和核心中的cFos蛋白水平（109-126％），在AY和CY组中急性或慢性给药（图5A-B）。 然而，当在自我管理的动物中以可应对的方式递送可卡因时，这种反应在NAc壳中减少（至55％）（F4,60 = 9.14， p <0.001），并且无法显着增加NAc核心中的cFos（F4,57 = 5.92， p <0.001）。 在CPu中，通过长期被动或自愿给予可卡因，可卡因诱发的cFos的耐受性逐渐增强（图5C在CY和CSA组中，AY动物的cFos诱导（164％）降低（至45-57％）（F4,67 = 13.29， p <0.001），类似于在所有3个纹状体亚区域诱导FosB蛋白的耐受性发展。 因此，可卡因诱导的cFos的增强相关耐受性特别发生在纹状体的中边缘。 在所有3个纹状体区域，自食盐水动物中均未发现cFos升高，并且在WD 24小时后仍未持续。

图5  

可卡因给药后立即调整cFos和24 h WD。 对照大鼠（对照组，盐水SA）中的cFos蛋白水平（52-58 kDa），在急性（AY）或慢性（CY）接受被动性可卡因可卡因的大鼠中，以及在接受过大鼠的大鼠中 ...

纹状体亚区域可卡因摄入量，cFos和ΔFosB的关系

由于可卡因自我管理的数量因个体动物及其合作伙伴而异，我们通过多元线性回归分析比较了可卡因摄入量与cFos，FosB和ΔFosB蛋白水平的诱导（见 补充表1 对于所有潜在相关的结果）。 通过被动输注接受急性可卡因给药的大鼠中可卡因摄入量和cFos水平之间存在显着相关性，并且这些关系在背侧和腹侧纹状体亚区域中不同。 在NAc核心中，急性静脉注射可卡因4后立即诱导cFos与可卡因摄入强烈和负相关，而在NAc壳中发现了类似但不显着的关系（图。 6）。 相反，cFos的诱导与CPu中的可卡因摄入呈正相关。 在任何纹状体亚区域，可卡因摄入量（主动或被动）与FosB或ΔFosB的蛋白质水平之间没有显着相关性。 然而，可卡因后NAc壳24 h中cFos和ΔFosB水平之间存在强烈的正相关，但仅限于通过自愿给药接受可卡因的动物（图。 7尽管事实上整体cFos水平在24 h WD没有改变。 类似的趋势（p ＜0.07）表明，在NAc核心和首次接受可卡因的动物的CPu（AY组）中，可卡因自我给药4小时后立即发现了cFos和ΔFosB蛋白水平之间的正相关。

图6  

急性可卡因（AY）后可卡因摄入量与cFos免疫反应性之间的区域特异性相关性。 在NAc核心（A）的最后一次会话中，cFos免疫反应性增加百分比与可卡因摄入呈负相关，且呈正相关 ...
图7  

自我给药动物的NAc壳中cFos和ΔFosB之间的显着相关性。 cNos免疫反应性增加百分比与可卡因自我施用24 h WD后ΔFosB免疫反应性正相关 ...

讨论

在本研究中，我们检查了急性和慢性静脉注射可卡因或慢性自我给药对NAc壳，NAc核心和CPu纹状体亚区中ΔFosB，FosB和cFos水平的调节的影响。 以前的研究一致发现ΔFosB仅在反复接触后增加，而不是在使用被动IP可卡因注射的急性可卡因给药后增加（希望 et al. 1994, 奈伊 et al. 1995; 陈 et al. 1995). 同样，我们发现慢性IV可卡因暴露增加了所检查的所有纹状体亚区域的ΔFosB，无论其是以意志还是被动方式给药。 然而，与以往研究的主要区别在于急性可卡因给药增加了NAc核心和CPu中的ΔFosB蛋白水平，并且在NAc壳中接近显着性 (p <0.1）。 这种差异的一种可能解释可能是可卡因暴露的剂量和/或持续时间，因为AY组的大鼠在单个4小时内接受了多次静脉可卡因输注，导致可卡因的总摄入量范围为25.5至57.5 mg / kg个体动物，其​​剂量远远超过单次推注IP注射通常使用的10-20 mg / kg的剂量（希望 et al. 1994; 李 et al. 2006）。 此外，可卡因通过更直接的IV给药途径给药，在整个疗程期间产生更高的可卡因和多巴胺峰值，而这些影响通常在注射IP后一小时内减弱（Bradberry，2002）。 因此，ΔFosB在单次急性暴露于可卡因后累积的能力可能取决于本研究中使用的可卡因刺激的强度和持续时间。 在任何情况下，ΔFosB在单次暴露于可卡因后可以累积的发现表明ΔFosB可以比先前想象的更快地发挥其作用，这可能是由于最初的自我给药狂欢。

有趣的是，在慢性可卡因给药过程中，ΔFosB积累量在背侧和腹侧纹状体区域之间不同。 在NAc核心中，在长期给药的最后一天（0 h WD）后立即发现的ΔFosB的量是急性给药后发现的量的两倍以上，并且NAc壳体中较小的ΔFosB增加仅在长期给药后达到显着性。 ，无论可卡因是自我管理还是被动yoked输液接收。 慢性可卡因给药的增加可能反映了高度稳定的ΔFosB蛋白的积累，因为它们在最后一次暴露后持续至少24小时。 相比之下，CPu中ΔFosB量的大量增加未能与急性或慢性暴露相区别，这可能反映了该脑区急性暴露所产生的上限。 然而，即使在CPu中，ΔFosB蛋白的积累可能有助于长期暴露后ΔFosB水平的持续增加，因为在所有具有长期施用的3脑区域中对于ΔFosB的可卡因诱导的mRNA具有显着的耐受性。

静脉注射可卡因的急性给药也增加了全长FosB蛋白水平，CPu和NAc外壳的增加量要大于NAc核心。 但是，FosB的mRNA在NAc壳中被诱导了近10倍，而在CPu和NAc核中被诱导了不到5倍。 可卡因在长期给药后诱导FosB的mRNA和蛋白的能力上产生了相当大的耐受性，尽管仍然存在较低的FosB蛋白诱导能力，并且可能与ΔFosB竞争AP-1结合伴侣。 由于相对较大的ΔFosB诱导作用，急性可卡因给药也降低了FosB /ΔFosBmRNA的相对比例，这与以前使用苯丙胺的报道一致（Alibhai et al. 2007）。 与先前使用重复苯丙胺处理的发现相反，长期施用后急性可卡因的FosB /ΔFosBmRNA相对比例的降低仍然存在，反映出ΔFosB的残余诱导比FosB相对更高。

甚至急性可卡因之后ΔFosB水平增加的事实使用更典型的人静脉内药物使用的模式和给药持续时间对成瘾过程具有重要意义。 因此，如果给予足够的剂量，ΔFosB可以促进AP-1与初始可卡因使用的结合活性。 然而，ΔFosB将与FosB和cFos竞争AP-1结合活性，导致下游基因表达和神经可塑性，当ΔFosB升高且cFos和FosB显着降低时，其不同于长期施用。 因此，ΔFosB在慢性可卡因给药后可能具有更大的作用，这是由于腹侧纹状体中更大的积累和对背侧和腹侧纹状体中AP-1结合配偶体的竞争减少。 鉴于ΔFosB的纹状体特异性过表达增加了可卡因的动机（科尔比 et al. 2003），初始可卡因暴露的ΔFosB的这种快速积累可能在成瘾过程的早期阶段使可卡因使用永久化。 此外，在急性暴露的整个纹状体中这种突出和广泛的ΔFosB表达将改变AP-1结合活性，其方式可通过早期参与背侧纹状体回路促进强迫性习惯的形成（Belin和Everitt，2008).

考虑到ΔFosB同种型的稳定性，在最后一次可卡因给药后的几小时内，ΔFosB水平保持显着升高24小时，与以前使用慢性静脉注射可卡因给药的研究一致（PICH et al. 1997; 佩罗蒂 et al. 2008）。 使用被动实验者给予IP可卡因注射的其他研究发现，ΔFosB积聚可持续1-2戒断数周（希望 et al. 1994; Brenhouse和Stellar，2006; 李 et al. 2006），但在停止服用可卡因后3周，我们没有发现这些变化的证据。 总之，这些研究表明，ΔFosB积累可在相对较短的戒断期（<3周）内持续，并直接有助于持续使用可卡因，但可能不会直接导致长时间戒断时复发的可能性更大。 然而，在小鼠中从重复的可卡因中撤出1天后，在含有D30受体的纹状体神经元中检测到ΔFosB免疫反应（李 et al. 2006）。 这种细胞特异性取样可能比本研究中使用的全组织分析对残留ΔFosB积累更敏感，或者ΔFosB变化仅在小鼠中比在大鼠中持续更长时间。 ΔFosB也可能诱导一系列转录事件，导致持久的形态变化，如含有D1的纹状体神经元中的树突棘形成（李 et al. 2006; 迷宫 et al. 2010）。 在这方面，包括Cdk5和NFκB在内的几种ΔFosB靶标在慢性可卡因后增加，这些因子可能通过神经元结构和/或功能的改变来改变伏隔核电路（昂 et al. 2001; Benavides和Bibb，2004; Nestler，2008）。 因此，戒断期间持续的ΔFosB积累可能不是其对未来吸毒或寻求行为的长期影响所必需的，而是可能代表一种“分子开关”，触发多个细胞过程，促进过渡到更多上瘾的生物状态（内斯特勒 et al. 2001).

T他目前的研究发现，可卡因介导的ΔFosB积累不受自我给药动物对可卡因摄入的意志控制的影响，这与以前使用免疫组化程序和多种滥用药物的研究一致 (佩罗蒂 et al. 2008; PICH et al. 1997）。 这表明可卡因诱导的ΔFosB和FosB的增加可能与对可卡因或单胺能受体信号传导的其他下游事件的药理学反应有关。 与ΔFosB相反， 我们发现，对可卡因诱导的cFos的耐受性的发展受到NAc中对可卡因摄入的意志控制的显着影响，但在CPu中没有。 因此，与急性输注相比，通过慢性输注被动地接受可卡因的动物对NAc中可卡因诱导的cFos的耐受性未能发生。。 这些发现与许多关于通过被动IP注射给予药物时NAc中对精神兴奋剂诱导的cFos耐受性的报道显着不同（希望 et al. 1994; 奈伊 et al. 1995; 陈 et al. 1995, 1997; Alibhai et al. 2007）。 鉴于对可卡因自我管理动物的cFos耐受性与多次IP注射的几项研究相似，慢性静脉内给药的耐受性缺乏可能与多次和不可预测的可卡因可卡因注射相关的压力有关（Goeders 1997）。 腹侧而不是背侧纹状体的耐受性丧失将与参与动机和情绪反应的边缘回路的选择性效应一致。 此外，虽然对自身给予可卡因的动物确实存在对cFos诱导的耐受性，但在最终自我给药期后，NAc壳中的cFos蛋白仍然显着增加~50％，并呈现趋势（p 核心中也发生了cFos的<0.1）增长。 如上所述，造成这种差异的原因可能反映了IP注射和多次IV输注之间的差异。 慢性可卡因自我给药后，NAc中残留的cFos诱导是一个新颖的发现，它迫使人们重新考虑其在成瘾过程中的作用，从而在慢性暴露后，含有cFos，ΔFosB和FosB的AP-4复合物都将在某种程度上共存。

鉴于最近有证据表明cFos在背侧纹状体中被ΔFosB积累直接下调（Renthal et al. 2008）有趣的是，CPu中可卡因诱导的cFos与急性可卡因暴露的ΔFosB增加相平行。 一种可能性是在急性给药时ΔFosB的累积在4 h期中发生得太迟以影响cFos诱导，而在慢性处理的动物中其在可卡因之后存在24 h阻碍了随后可卡因暴露的cFos的诱导。 该观点与急性可卡因给药的CPu（0.067 h WD）中cFos和ΔFosB水平之间的中度正相关的趋势（p = 0）一致。 这一观点也与急性yoked动物CPu中cFos诱导和可卡因摄入之间的强烈正相关一致。 这些发现表明，与ΔFosB类似，cFos反应可能反映了接受的可卡因剂量。 然而，在NAc中，ΔFosB与慢性可卡因给药的较大累积不能解释这些动物中cFos应答中缺乏耐受性。 此外，尽管在自我给药动物中对cFos诱导的耐受性是明显的，但24撤除后NAc壳中残余cFos和ΔFosB水平之间的强正相关性不支持腹侧纹状体中cFos和ΔFosB之间的负相互作用。 与CPu数据的另一个不同之处在于，在急性可卡因给药后，NAc核心中的cFos与可卡因摄入呈负相关而非正相关，这可能反映了在腹侧纹状体中较高剂量暴露时发生的会话内快速耐受。

总体而言，本研究的结果表明，cFos，FosB和ΔFosB在急性和慢性静脉注射可卡因后表现出不同的区域表达模式。 这些表达模式独特地依赖于药物暴露的持续时间和量，并且对可卡因诱导的cFos的耐受性高度依赖于可卡因自我给药。 结果还表明，ΔFosB可通过静脉注射积累急性和慢性可卡因，支持ΔFosB积累在早期过程中可能是重要的，这些过程促进可卡因寻求行为的增加并促进可卡因成瘾的发展。 最终，了解ΔFosB如何通过在可卡因使用和早期戒断期间对基因表达的相对短期影响间接影响戒断期间的持续药物渴望将是重要的。 确定各种下游靶标及其对神经元形态和/或功能的影响的努力将最终阐明ΔFosB和其他Fos相关抗原在成瘾行为表达中的作用。

补充材料

Supp表S1

补充表1.线性回归分析的整体相关结果。 左侧的三个面板包含可卡因摄入量与cFos（顶部面板），FosB（中间面板）或ΔFosB（下方面板）水平之间的相关性。 右边的三个面板包含cFos和ΔFosB（顶部面板），cFos和FosB（中间面板）以及FosB和ΔFosB（下面面板）之间的相关性。 显示了每个单独分析的相对大脑区域和WD时间点，以及相应的r值和p值。 * p <0.05， T0.1> p> 0.05。

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致谢

作者声明这项工作没有利益冲突。 这项工作得到了NIH资助DA 10460和DA 08227以及Wesley Gilliland生物医学研究教授的支持。

使用的缩写

  • 中央处理器
  • 尾状核
  • 伏隔核
  • 伏隔核
  • AY
  • 急性轭
  • CY
  • 慢性枷锁
  • CSA
  • 可卡因自我管理
  • WD
  • 退出
  • IV
  • 静脉
  • IP
  • 腹腔内。

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