Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29，2014; 111（17）：6455-6460。
在线发布Apr 15，2014。 DOI： 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID：PMC4036004
神经
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意义
腹侧被盖区（VTA）中的多巴胺（DA）神经元主要通过瞬时沉默对厌恶刺激作出反应。 尚不清楚这种反应是否直接诱导行为小鼠的厌恶反应。 我们通过光遗传学控制VTA中的DA神经元来检验这个问题，并发现DA神经元的失活导致厌恶反应和学习。 VTA DA神经元的主要输出核伏隔核（NAc）被认为是这种反应的原因，因此我们通过使用敲除D1或D2受体来检查NAc中哪些基本途径对这种行为至关重要，并发现D2受体特异性途径对这种行为至关重要。
抽象
来自腹侧被盖区（VTA）的多巴胺（DA）传输对于控制奖励和厌恶行为至关重要。 DA神经元的瞬时沉默是对厌恶刺激的反应之一，但其对厌恶反应和学习的后果和神经机制在很大程度上仍然难以捉摸。 这里， 我们报道VTA DA神经元的光遗传失活迅速下调DA水平并诱导伏隔核中神经活动的上调（NAc））由Fos表达评估。 Ť他对DA神经元放电的光遗传学抑制立即引起对先前偏爱的黑暗房间的厌恶反应，并导致对光遗传学条件的厌恶学习。 重要的是，这种地方厌恶被多巴胺D2受体的敲除所取消，而不是被NAc中的D1受体敲除。. 因此，VTA中DA神经元的沉默对于诱导厌恶反应和通过NAc中的多巴胺D2受体进行学习是必不可少的。
中脑边缘多巴胺能系统不仅在广泛的动机和学习中起关键作用（1–3但其功能障碍也与严重的神经精神疾病有关，如帕金森病，精神分裂症和药物成瘾中所例证的。 腹侧被盖区域（VTA）中的多巴胺（DA）神经元通过相位激发对奖励刺激做出反应，并且该射击的主要功能被理论化为编码“奖励预测误差”，即预测奖励与预测奖励之间的值的差异。实际奖励（4). 与对奖励刺激的反应相反，他们对厌恶刺激的反应远非同源; 即，一些DA神经元响应于厌恶刺激而被激活，而大多数其他DA神经元通过瞬时抑制它们的发射而起作用 (5–9）。 事实上，最近的研究表明，GABA能神经元的光遗传激活和DA神经元的失活抑制了奖赏消耗并诱发了厌恶反应（10, 11）。 然而，在VTA中DA神经元的失活以及如何控制行为反应以抑制奖励消耗和诱导厌恶行为时，神经回路中的哪些机制对于获得厌恶学习是必不可少的，这在很大程度上仍然是难以捉摸的。
累积的证据表明，响应正面和负面刺激的动机和认知学习主要受包括基底神经节在内的神经回路的调节（12），从中脑接受大量的多巴胺能投射。 在纹状体中，两个基本神经回路由指定的中型多刺神经元（MSN）构成，每个神经回路表达不同类型的DA受体（13).
- 一个回路是直接通路，由直接投射到基底神经节输出核的MSN，黑质网状（SNr）和主要表达多巴胺D1受体（D1Rs）组成。.
- 另一种是间接途径，由间接通过苍白球到SNr并主要表达多巴胺D2受体（D2R）的MSN组成。
来自中脑的DA信号通过D1R和D2R以相反的方式动态调制这两条平行路径，这种调制应该有助于激励学习（3, 14).
- 至于奖励刺激，由奖励信号诱导的上调DA水平被认为激活D1R，因此主要促进伏隔核（NAc）中的直接途径。.
- 另一方面，响应厌恶刺激的DA神经元激发的抑制降低了NAc中的DA水平; 并且该反应应该通过激活的D2R特异性地促进间接途径中的信号传递.
虽然使用药理学策略和可逆性神经传递阻滞（RNB）方法的研究支持了这种NAc调节机制（15, 16），仍然不知道DA神经元放电的抑制是否足以促进间接途径的活动并随后诱导回避行为。 在本研究中，我们通过光遗传学操作膜超极化Arch蛋白选择性地灭活VTA中的DA神经元来解决这个问题（17并明确证明VTA中DA神经元的抑制随后降低了NAc中的DA水平并诱导了厌恶反应和学习。 此外，我们研究了该反应的调节机制，并且公开了这种厌恶反应由NAc中的D2R特异性控制。
成果
DA神经元的光遗传失活阻断了暗室偏好。
为了选择性地灭活DA神经元的发射，我们注射了一种Cre诱导的腺相关病毒构建体编码Arch-eGFP [AAV-double-floxed倒置开放阅读框架（DIO）-Arch]（17）单侧进入成年酪氨酸羟化酶（TH）-Cre小鼠的VTA（18）和野生型（WT）同窝仔并在VTA上方放置一根光纤（图.S1 A 和 C）。 手术后两周，Arch-eGFP在VTA中被严格检测到（图.S1B）。 我们通过电生理学记录测试了Arch蛋白的超极化效应，并测量了注射AAV-DIO-Arch的TH-Cre小鼠的VTA光学刺激的效果。 来自麻醉的TH-Cre小鼠的VTA的体内电生理学记录显示，假定的DA神经元的光学刺激抑制了它们的发射（图.S2），表明光学刺激足以使表达Arch的DA细胞的膜电位超极化，从而抑制它们的自发放电。
通过使用这些小鼠，我们接下来检查了VTA中DA神经元的光学失活是否可以作为行为学习的厌恶信号。 小鼠具有偏爱黑暗环境的天生倾向（19）。 我们设计了一种行为仪器，老鼠可以自由探索黑暗的房间，打开明亮的空间（图。 1A）。 适应后，WT小鼠优先在黑暗的房间中保持在黑暗的房间内有或没有光刺激（图.S1D），确保光学刺激本身对他们的黑暗房间偏好行为没有影响。 我们安排了动物的行为实验，以测试DA神经元光学灭活对其行为的影响（图.S1E）。 在适应和预试验后，当它们停留在暗室中时，通过光学刺激VTA中的DA神经元来调节小鼠。 即使在第一次5分钟调理期间，TH-Cre小鼠仍然离开先前优选的暗室，并在整个调理过程中连续避开暗室（图。 1B）。 即使在后测中没有接受光刺激，TH-Cre小鼠也没有逆转他们对黑暗房间的避免（图。 1C）。 这些数据表明DA神经元的超极化不仅诱发了瞬时厌恶行为，而且还作为逆境学习对暗室的信号，并且还证明DA神经元的失活在瞬时厌恶行为和长期厌恶学习中起到了因果作用。
NAc中DA水平的光遗传学下调。
我们接下来研究了VTA中DA神经元的失活是否实际上改变了其主要靶向区域NA的DA浓度。 我们通过快速扫描循环伏安法（FSCV）在麻醉的TH-Cre小鼠中测量了NAc中的DA水平，所述小鼠已经用AAV-DIO-Arch注射到他们的VTA中。 通过VTA的电刺激迅速提高NAc中的DA水平，并且通过同时光学刺激VTA显着降低诱发的DA释放（图.S3）。 然后，我们测试了VTA的光学刺激是否可以降低NAc中的强直性DA水平。 在相同的实验设置中，我们观察到NAC中的DA水平被VTA的光学刺激的20瞬时降低（图。 2），这与报告的针对厌恶刺激的FSCV反应一致（20）。 这些数据表明，在行为实验期间，VTA的光学刺激足以使VTA DA神经元失活并降低NAc中的DA水平。
通过VTA中DA神经元的光学失活上调Fos基因表达。
由VTA中DA神经元的条件性失活引起的行为改变表明，光学刺激直接改变了神经活动并导致行为表现的转变。 因此，我们接下来通过检查即时早期基因Fos的表达，研究了DA神经元条件失活导致神经活动升高的区域。 在暗室测试中进行调节后不久，通过定量原位杂交分析快速处理小鼠以确定Fos表达的量（图。 3 和 图.S4）。 NAc是从VTA接收大量多巴胺能投射的区域，显示TH-Cre小鼠中Fos表达量显着增加（图。 3）。 在光学刺激的对侧也检测到这种上调，这可能是由于该侧有少量病毒感染引起的。 然而，在同侧的上调比在光学刺激的对侧更高，这表明DA神经元的光学失活直接上调了NAc的神经活动。 在包括隔膜，纹状体周围区域，基底外侧杏仁核（BLA）和外侧下丘脑在内的其他脑区也观察到Fos表达增加，但在外侧缰核或内侧前额叶皮质中未观察到（mPFC; 图.S4）。 这些结果表明，通过DA神经元的光学失活激活的区域不限于VTA DA神经元的直接靶区域，而是包括可以以神经回路依赖性方式间接激活的区域。 这一观察结果表明，DA神经元的光学失活改变了整个电路的神经元活动，不仅可以引起厌恶反应，还可以触发其他几种大脑功能，如焦虑，恐惧和压力反应（21).
通过D2R进行DA信号传递对于光遗传诱导条件性位置厌恶至关重要。
来自VTA的大多数多巴胺能信号通过DA受体D1R和D2R传递给NAc中的MSN。 D1R几乎仅在物质P（由Tac1基因编码）中表达，表达MSN，D2R主要在脑啡肽（由Penk基因编码）中表达 - 表达MSN; 每种类型的MSN分别构成NAc中的直接和间接途径（3）。 由于D2R（nM指令）对DA的亲和力远高于D1R（μM指令）（22, 23），DA水平的降低被认为导致G的失活i-Doupled D2R但对D1R没有明显影响（3, 24因此，特别是在间接途径中上调神经活动。 此外，在表达Penk-或Drd2（D2R）的细胞中比在表达Tac1-或Drd1a（D1R）的细胞中更显着地观察到Fos活化（图.S5）。 基于这些观察，我们假设通过D2R的DA信号传导可能在观察到的厌恶条件反射中起主要作用。
为了验证这个假设，我们进行了三室条件性地方厌恶（CPA）测试（图.S6）。 我们准备了一个行为仪器，其中包含两个具有几乎相同情况的腔室和一个小走廊。 CPA测试中的这种无偏的环境条件使我们能够进一步检查VTA DA神经元的失活是否能够诱导厌恶反应和学习，以及阻止暗室偏好。 当允许动物在整个装置周围自由移动时，大多数动物在预测试中没有任何典型的行为差异而停留在两个腔室中。 然后通过将光学刺激与一个固定室配对来进行光学调节。 即使任何一个腔室用于调理，TH-Cre小鼠也会在调理期间和后期测试中持续且显着地避免停留在光学调节腔室中（图.S6 B–E）。 统计分析证实，与WT小鼠的停留时间相比，后测试中光学调节室中TH-Cre小鼠的停留时间显着减少（图.S6F).
然后，我们试图通过特异性抑制NAc中的每种DA受体来指定参与这种厌恶行为的DA受体亚型（图。 4 和 图.S7）。 我们设计并验证了含有对每种DA受体特异的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体，其具有mCherry的组成型表达。 将慢病毒注射到NAc中三周后，mCherry的强烈表达局限于NAc（图。 4B）。 通过定量实时PCR分析证实了每种受体的mRNA表达的有效敲低（图S7A）。 通过蛋白质印迹测量蛋白质水平还显示，每种慢病毒的注射选择性地降低其靶蛋白质产物而不影响DA受体的另一亚型的表达（图。 4C 和 图.S7 B–G）。 与对照病毒的水平相比，表达shD1R和shD2R的慢病毒分别将其靶蛋白水平降低至46.2±1.1％和38.4±4.9％（图。 4C）。 这些结果证实了表达对D1R和D2R特异性的shRNA的慢病毒载体选择性地并且充分地抑制了它们的靶RNA并且下调了各蛋白质产物的量。 我们还证实，在VTA中未检测到病毒介导的mCherry表达，排除了慢病毒介导的shRNA直接影响VTA的可能性。
使用这些含有shRNA的慢病毒，我们测试了哪种类型的DA受体是由DA神经元的光遗传失活诱导的厌恶行为的原因。 我们将含有shRNA的慢病毒或对照慢病毒与AAV-DIO-Arch一起注射到双侧NAc中，进入TH-Cre小鼠的左侧VTA。 光纤也插在VTA上方（图。 4A）。 当在手术后三周进行三室CPA测试时，注射lenti：shD1R-mCherry的TH-Cre小鼠仍然显示出针对光学刺激配对腔室的明显CPA，与注射了TH-Cre小鼠的TH-Cre小鼠相比。控制慢病毒（lenti：mCherry）。 相比之下，注射lenti：shD2R-mCherry的TH-Cre小鼠在调理期间未能显示出明显的CPA（图。 4D）。 注射了lenti：shD2R-mCherry的TH-Cre小鼠的独有学习缺陷通过后测试中的厌恶学习进一步证实（图。 4E）。 这些结果表明，由DA神经元失活调节的位置的厌恶行为是通过D2R特异性诱发的，而不是通过NAN中的D1R诱发的。
讨论
在纹状体中，研究表明G的激活s耦合的D1R有助于其发射，同时激活Gi- 耦合D2R会降低点火效率 (25). Ac根据DA受体表达的特异性，DA神经元的阶段性激发主要通过D1R激活直接途径，而DA神经元激发的短暂减少主要通过D2R促进间接途径能力 (3, 26). 基于这种调节机制，已经提出响应于厌恶刺激的DA神经元的沉默主要通过间接途径处理并导致厌恶行为。 (3）。 最近的研究表明，阻断间接途径的突触传递会损害电击引起的厌恶行为（15并且这种损伤是由D2R介导的信号传递的抑制引起的（16）。 一世另外，间接途径中表达D2R的MSN的光遗传学上调引起行为回避 (27）。 然而，由于DA神经元在厌恶刺激下表现出增强和抑制的发射，并且因为在大脑中同时处理其他与休克相关的感觉信息，因此DA神经元的沉默是否会直接引发厌恶反应和学习仍有待澄清，以及该反应是否通过间接途径中表达D2R的MSN进行调节。
在这项研究中，我们在两个行为测试中使用了DA神经元激发的光遗传学控制：暗室偏好测试和三室CPA测试。 我们的光遗传学操作显示有效抑制VTA中的DA神经元发射和NAc中DA水平的下调。 我们仅在动物停留在条件室期间对DA神经元发射的精确光遗传失活明确引起厌恶反应和学习，证明瞬时DA沉默直接引起被动回避行为。 此外，这项调查已经阐明D2R介导的信号处理是诱导这种厌恶反应和学习的关键决定因素。
虽然我们的数据证明D1R在引发CPA的行为实验中没有影响，但是一些研究已经证明，DA神经元的相位激发是恐惧反应和厌恶学习所必需的（28, 29）。 这种差异是由于实验设置; 也就是说，我们的光致发作方法排除了通过激活的DA神经元发出信号以诱发厌恶行为的可能性，表明失活的DA神经元足以诱导厌恶行为和学习。 由厌恶刺激引起的激活DA射击的功能和信号处理将对这里研究的厌恶行为产生不同的贡献，并且需要在将来澄清。
DA神经元也投射到其他各个区域，包括mPFC，杏仁核和海马体。 最近的一项研究表明 在VTA中投射到DA神经元的侧缰神经元的光遗传激活能够诱导厌恶行为，并且这些DA神经元主要且特异性地靶向mPFC。 (30虽然他们的光遗传学调节与我们目前的研究不同，因为他们的光遗传学刺激在整个调理期延长了。 据报道，mPFC的多巴胺能输入不仅受到厌恶刺激，还受到慢性应激的激活（31, 32），有可能他们连续激活mPFC投射DA神经元将被视为来自高压力环境的信号; 并且，由于压力调节的积累，动物将对调节室表现出厌恶行为。 相比之下，我们仅在动物停留在调节室时才抑制DA神经元的放电。 我们使用定时匹配条件的行为实验结果表明DA信号的突然抑制将被视为突然的厌恶输入，这导致它们的快速厌恶反应。
DA神经元也投射到杏仁核，这个区域在很大程度上促成了恐惧反应。 实际上，向杏仁核发出的DA信号与恐惧反应和恐惧记忆的获得有关 (33, 34）。 在我们的研究中，标记VTA中的DA神经元确定了一组投射到BLA的DA神经元，但这些投射的程度远低于投射到NAc的程度。 虽然我们不能排除杏仁核预测的DA信号传导对我们观察到的厌恶行为的微妙影响，但我们对DA神经元的光遗传失活的主要影响应该在NAc上，因为我们在NAc中特异性敲除D2R的实验显着减少厌恶行为。 针对靶特异性DA信号传导的未来研究需要阐明DA神经元的电路范围修饰对厌恶刺激和恐惧条件反射的影响。
材料和方法
主题。
酪氨酸羟化酶:: IRES-Cre（TH-Cre）敲入小鼠（EM：00254）（18）来自欧洲小鼠突变档案。 所有实验动物已经与C57BL / 6J菌株回交超过10代。 将小鼠与C57BL / 6J WT小鼠交配，并用标准12-h light / 12-h黑暗循环饲养，随意给予食物和水。 CRE+ 和克里斯 - 来自相同窝的小鼠（3-6 mo年龄）用于实验。 所有动物实验均由大阪生物科学研究所的动物委员会根据动物实验指南批准。
行为测试。
在所有行为测试期间，将小鼠与光纤连接并允许在整个装置周围移动。 监测小鼠的移动，使得即使在他们的头上连接光纤时，它们也可以在没有任何障碍的情况下四处移动。 通过悬挂在行为装置上的摄像机检测鼠标的位置，并使用Labview软件通过定制程序进行分析。
暗室偏好测试。
测试中使用的定制行为装置由暗室（15×9.5 cm）和明亮的开放空间（15×11 cm）组成。 黑暗的房间有墙壁，地板和屋顶，它们都是黑色的，有一个入口（4.5厘米长）到开阔的明亮空间。 开放的明亮空间形状像椭圆形，有金属网格地板和没有屋顶的清晰墙壁。 在测试之前，所有小鼠在该装置中习惯于10 min。 测试包括三个阶段：在1的早期半部分（预测试：5分钟），允许小鼠探索整个装置。 从1的后半段到4天（调节：总共35分钟），当小鼠在暗室中时，它们接受光学刺激。 在5日，在没有光学刺激的情况下测试暗室偏好（后测：5 min; 图.S1E).
三腔CPA测试。
在测试中使用的定制的三室条件位置偏好/ CPA装置由两个室（10×17 cm）和连接走廊组成。 测试包括三个会话。 第1天（预测试：15分钟）：允许小鼠自由探索整个装置。 在一个腔室中比在另一个腔室中停留1.5倍的小鼠被排除在测试之外。 天2和3（条件：每个15 min）：当小鼠停留在光配对室中时，小鼠接受光刺激。 光配对室的选择是平衡的。 日4（后测：15 min）：测试在与预测试相同的条件下进行（图.S6A).
在调理期间，当小鼠在暗室或光配对室中连续停留在30上以避免过热时，对30停止光学刺激。 在所有行为测试中，激光功率被控制在光纤尖端处约为5 mW。
体内快速扫描循环伏安法。
使用先前研究中描述的方法进行FSCV实验（35–37）。 如下所述，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠 SI材料与方法 并放置在立体定位框架中。 用于刺激表达Arch的神经元的光纤位于刺激电极附近。 然后将刺激的光极置于VTA中（来自前囟：前 - 后，-3.2 mm;侧，0.5 mm;和背 - 腹，3.5 mm）并以0.25-mm间隔降低。 用于伏安记录的碳纤维微电极（长度为300μm）降低至NAc（来自前囟：前 - 后，1.0 mm;横向，1.0 mm;和背 - 腹，3.5 mm）。 通过对碳纤维微电极施加三角波形（-100 V至+ 0.4 V至-1.3 V对Ag / AgCl，0.4 V / s），每400 ms进行伏安测量。 定制的恒电位仪用于波形隔离和电流放大。 通过使用24脉冲刺激（100μA，5 ms持续时间，30 Hz）通过DA神经元的电刺激诱发DA释放。 在电刺激开始之前，对532s开始5应用DA神经元的光学刺激（10 nm，光纤尖端的〜5 mW功率）。 在具有已知浓度的DA（0.2μM，0.5μM和1.0μM）的溶液中校准碳纤维微电极。 使用Labview和Matlab软件通过定制程序分析所有伏安数据。 通过主成分分析，通过使用从电VTA刺激获得的模板DA波形来分离多巴胺信号，解决了通过光学刺激降低DA水平（35, 36).
致谢
我们感谢E. Boyden的Arch构造，R。Matsui对慢病毒生产和纯化的技术建议，以及Y. Hayashi对数据分析编程的技术建议。 这项工作得到了教育，文化，体育，科学和教育部的研究资助22220005（到SN），23120011（到SY和SN），24700339（到TD）和25871080（到SY）的支持。日本技术和武田科学基金会（SN）的资助。
参考资料
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