多巴胺通过促进伏核中的诱发诱发激发来激发寻求奖励（2014）

介绍

从腹侧被盖区域（VTA）到NAc的多巴胺投射是促进寻求奖励行为的神经回路的重要组成部分（Nicola，2007）。 如果通过实验减少NAc多巴胺功能，动物不太可能努力获得奖励（Salamone和Correa，2012）往往无法回应奖励预测线索（Di Ciano等，2001; Yun等人，2004; Nicola，2007, 2010; 桑德斯和罗宾逊，2012）。 这些缺陷是由于奖励寻求的特定组成部分的损害：启动接近行为的延迟增加，而接近的速度，找到目标和执行获得奖励所需的必要操作行为的能力，以及消费奖励不受影响（Nicola，2010）。 多巴胺必须通过影响NAc神经元的活动来促进进近，但这种影响的性质仍不清楚。 通过奖励预测线索激发或抑制大比例的NAc神经元（Nicola等，2004a; Roitman等，2005; Ambroggi等人，2008, 2011; McGinty等人，2013），并且在开始提示进入行为之前开始激发并预测启动运动的潜伏期（McGinty等人，2013）。 因此，这种活性具有多巴胺依赖性信号所需的特征，这种信号可促进特征性接近，但是否这样做是未知的。

两种结构中的神经元将谷氨酸能传入传递给NAc，BLA和背侧内侧PFC（Brog等，1993），被奖励预测线索激发（Schoenbaum等，1998; Ambroggi等人，2008），以及这些结构中的任何一种的可逆灭活（Ambroggi等人，2008; Ishikawa等，2008）或VTA（Yun等人，2004）减少NAc中线索诱发激发的幅度。 这些观察结果表明NAc线索诱发的激发是由谷氨酸能输入驱动的，但是没有NAc多巴胺，即使这些强烈的兴奋性输入也不足以驱动线索诱发的激发增加。 但是，这个结论很脆弱。 许多NAc神经元被线索抑制（Nicola等，2004a; Ambroggi等人，2011并且不知道激发或抑制是否对激活接近行为更重要。 此外，VTA失活可以通过几种不依赖多巴胺的机制减少辨别刺激（DS）诱发的激发：BLA和PFC中的线索编码减少，从VTA接收投射（Swanson，1982）; 减少投射到NAc的GABA能VTA神经元的射击（Van Bockstaele和Pickel，1995）; 或减少多巴胺能神经元释放谷氨酸（Stuber等，2010）。 最后，因为VTA失活不仅降低了NAc DS诱发的射击，而且降低了DS诱发的进近行为（Yun等人，2004），DS激励可能是次要的，而不是目标导向运动的必要条件。

为了直接测试NAc多巴胺在线索诱发射击中的作用，我们设计了一种用于表现啮齿动物的新型探针：围绕中心注射套管的圆形电极阵列，其允许同时记录单位射击活动和输注多巴胺受体拮抗剂。进入记录神经元周围的细胞外空间（du Hoffmann等，2011）。 这种安排使我们能够建立多巴胺受体激活，NAc神经元放电和寻求奖励行为之间的联系：如果阻断NAc多巴胺受体抑制线索诱发信号和开始接近，这将提供强有力的证据表明神经元反应取决于内源性多巴胺，这种信号是接近行为所必需的。

材料和方法

动物。

从Charles River获得15只雄性Long-Evan大鼠（抵达时为275-300 g）并单独饲养。 在它们到达后一周，每天处理大鼠几分钟以使3 d使它们适应实验者。 适应后，将大鼠置于每天13 g大鼠食物的限制饮食中。 随意 在手术后为7 d提供食物，之后将动物放回限制饮食。 动物程序与美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南一致，并得到阿尔伯特爱因斯坦医学院的机构动物护理和使用委员会的批准。

操作室。

所有行为实验和行为训练都在定制的树脂玻璃室（40 cm square，60 cm high）中进行。 它们位于作为法拉第笼子的金属柜内; 机柜内衬有声学泡沫，并通过专用扬声器连续播放白噪声，以最大限度地减少室内外部噪音的可听性。 操作室在一面墙上配备了一个奖励容器，在其两侧都有可伸缩的杠杆。 穿过容器前部的光束用于测量容器进入和退出时间。 行为控制系统（Med Associates）的时间分辨率为1 ms。

DS任务。

按照类似于之前使用的程序对动物进行DS任务培训（Nicola等，2004a,b; Ambroggi等人，2008, 2011; Nicola，2010; McGinty等人，2013）。 一次给出两个提示，即奖励预测DS或中性刺激（NS）。 听觉提示由警笛声（在4 ms内从8到400 kHz的频率循环）和间歇声（6 kHz音打开40 ms，关闭50 ms）组成； 将特定音调分配给DS或NS的大鼠随机分配。 从平均30 s和最大150 s的截断指数分布中随机选择间隔时间（ITI）。 NS持续显示10 s； 记录了NS期间的压杆操作，但没有程序性后果。 在训练开始时，将“活动”和“无效”杆随机分配给每只大鼠的左右杆，并且随后没有变化。 DS期间，主动杆上的杆响应终止了提示，随后的第一次容器进入导致将10％的蔗糖奖励输送到位于容器中的井中。 在10秒钟后终止对动物无反应的DS表现。 记录了ITI（提示提示之间）期间的响应以及非活动杆上的响应，但未产生奖励。 对动物进行DS任务训练，直到在80小时的训练中它们对> 20％的DS和<2％的NS做出反应。

空心微电极阵列。

在初始训练后，给大鼠植入插管微阵列，所述插管微阵列由围绕中心显微注射导管的八个钨微丝电极组成。 如前所述，这些构造并安装在定制的微驱动器中（du Hoffmann等，2011）。 完全顺时针旋转驱动螺杆将电极和套管作为腹部300μm（不旋转探针）的单位移动，使我们能够记录同一动物中几个独特的神经元群体。

为了植入插管阵列，准备大鼠用于手术并如前所述置于立体定位仪器中（du Hoffmann等，2011; McGinty等人，2013）。 用异氟烷（0.5-3％）诱导并维持麻醉。 动物在手术前立即接受抗生素（Baytril），在手术后接受24 h。 将空心阵列双侧植入背侧NAc核心（1.4 mm前部和前囟侧部1.5 mm，以及头部6.5 mm腹侧）。 用骨螺钉和牙科丙烯酸将电极和微驱动器固定到颅骨上，并将导线插入器插入导管中，使得闭塞器的端部与导管的端部齐平。 手术后，用Neo-Predef治疗头皮以预防感染，并且在进行实验之前让动物在1周恢复。 对于术后镇痛，给动物施用10 mg / kg的非甾体抗炎药酮洛芬。

药品。

SCH23390和raclopride购自Sigma。 在测试日，通过将它们溶解在0.9％无菌盐水中来新鲜制备药物。 以每侧1.1μl盐水中的233390μgSCH0.55剂量和每侧6.4μl盐水中的0.8μgRclopride剂量施用药物。 SCH233390和raclopride分别注入12和17.5 min。 在试验性实验中，我们发现持续12 min的raclopride的双侧输注对DS响应比具有显着但短暂的影响。 因此，为了延长效果，我们增加了raclopride输注的持续时间，使得其药理作用的时间分布类似于SCH23390。 每次记录会议只进行一次双侧或单侧注射（每天一次）。 所有动物至少接受一次双侧注射一种拮抗剂，和一次（或几次）单侧拮抗剂注射。 在一些单侧拮抗剂实验中，我们同时输注生理盐水作为接受拮抗剂的半球对侧的载体对照。

显微注射和记录程序。

先前已经描述了用于同时显微注射和记录的装置（du Hoffmann等，2011）。 从头级引出的记录电缆端接在带有中央钻孔（Moog）的24通道电换向器中，该信号将信号传递到电生理记录系统。 将两个注射器安装在位于腔室外部的单个注射器泵中。 注射器的流体管线通向安装在换向器上方的双通道流体旋转接头（Instech Laboratories）。 流体管线从转环下降通过换向器的钻孔，沿着记录电缆运行，并终止于两个33号微型注射器。

在记录会议之前，将微型注射器注入药物溶液，然后插入动物的引导套管中。 微型注射器尖端超出引导套管0.5毫米，因此微型注射器尖端位于电极尖端下方，距离每个电极中心约670μm。 回填药物之前，在流体管线和微型注射器中注入矿物油，并标记油-水界面的高度，以利于 事后 确认注射了药物。 最后，将头部台连接到动物上，并将流体线牢固地固定到记录电缆上，以在实验期间将显微注射器保持在适当位置。 以这种方式制备的动物被允许执行DS任务至少45 min的基线期，在此期间记录神经活动; 然后，远程打开注射泵，将药物注入大脑。 注射不需要处理动物或打开腔室门，并且行为会话在基线，输注和输注后期间持续不间断。

用头级放大器（单位增益）记录神经电压信号，放大10,000倍，并使用商业硬件和软件（Plexon）数字化。 我们在379大鼠的38记录/注射期间从15神经元记录。 在38会话中，7由于在注射前基线期间的不良行为而被丢弃，或者因为没有可靠的神经元被隔离。 因此，我们的神经分析侧重于31记录/注射会话，其中我们从322记录了12大鼠中分离良好的神经元。 在每次记录/注射会话之后，携带电极阵列的微型驱动器推进〜150μm（微驱动螺杆的半圈）以使电极向腹侧移动以记录来自新的神经元群。 如果观察到很少（或没有）神经元，则阵列每隔一天进行一次，直到检测到神经元。

分析。

数据分为注射前，注射后和恢复时间段，分别定义为输注拮抗剂前的45 min，从注射结束开始的40 min，以及最后的33 min（2000 s）。每次会议（总共持续了2-3 h）。 注射后期对应于药物在双侧注射时具有最大行为影响的时间（图。 1C).

 

图1。

多巴胺受体拮抗剂对DS-cued接近行为的影响。 A，DS任务的原理图。 B所有行为会话的预注射期间DS（橙色）和NS（蓝色）响应比的中位数（点）和中间四分位数（垂直线） ...

使用主成分分析，使用离线分拣机（Plexon）离线进行单个单元的分离。 在随后的分析中，仅包含具有明确定义的波形（> 100μV）且明显不同于噪声水平（<20–50μV）的单元。 尖峰间隔分布和互相关图用于确保单个单元之间相互隔离以及与背景噪声良好隔离（Neural Explorer软件； Nex-Tech）。 在R软件环境中，使用自定义例程对已验证峰值的时间戳进行了分析。 在50毫秒的时间段内，围绕DS和NS构造的蠕动时间直方图用于量化和检测信号提示激发中的 数字2A, ，3,3, ，4,4, ，55A, ，66A, ，77A, ，88A及 and1010A-C。 为了确定神经元是否表现出显着的DS诱发激发，在每个线索之前计算10 s基线周期的泊松概率分布函数。 如果神经元在提示开始后在99和50之间的一个或多个50 ms区间中表现出高于基线发射速率分布的上200％置信区间的平均尖峰计数，则认为它是DS激发的。 对于在注射前基线期具有显着DS诱发激发的神经元，在每个期间的每个时期获得50 ms箱内平均时间锁定DS和NS发病的平均发放率，以及平均值和中位数（图 2C-ê, ，55A, ，66A, ，77A, ，88A, ，1010B,C）比较了跨神经元的放电率。 因为具有统计学上可检测的NS激发的神经元几乎也总是被DS激发[未显示，但先前报道过（Ambroggi等人，2011）]，我们分析了具有显着DS响应的所有神经元的NS反应。 除非另有说明，否则在神经元Wilcoxon内使用的所有统计比较均进行总和检验。

 

图2。

DS诱发激发预测随后的奖励寻求行为并编码与杠杆的接近度。 A，平均预注射周围事件时间直方图与145神经元的DS（橙色迹线）或NS（蓝色迹线）的开始对齐，具有显着的兴奋性 ...

 

图3。

示例神经元显示D1和D2拮抗剂降低DS诱发的激发。 栅格和相应的直方图显示了与DS起始对齐的四种不同DS激发的神经元的激发。 数据来自紧接在开始之前的最后一次40试验 ...

 

图4。

双侧多巴胺拮抗剂注射对线索诱发激发的影响预测了逐个试验的行为影响。 A, C，对大鼠潜伏期的神经元编码进行逐次试验分析，以显示相同神经元的杠杆 ...

 

图5。

DS诱发的激发需要D1受体激活。 A，Peri事件时间直方图与DS发作对齐，在预注射期具有显着的DS诱发激发的神经元。 痕迹和云表示平均±SEM射击率 ...

 

图6。

D2受体激活是DS诱发激发所必需的。 A，在raclopride注射前的时期内具有显着DS诱发激发的神经元的DS发作的围手术期时间直方图。 双侧减少了DS诱发的兴奋 ...

 

图7。

NS诱发的激发不需要D1受体激活。 A，Peri事件时间直方图与在注射前期具有显着DS诱发激发的神经元的NS发作对齐。 这些群体完全重叠，因此相同的神经元 ...

 

图8。

D2受体激活是NS诱发的激发所必需的。 A，Peri事件时间直方图与在注射前期具有显着DS诱发激发的神经元的NS发作对齐。 在双侧和同侧条件下NS激发减少 ...

 

图10。

盐水输注不影响DS或NS诱发的激发，并且维持基线放电率不需要D1和D2受体激活。 A，在盐水输注期间记录单个DS激发的神经元。 公约与那些相同 ...

针对 图4，我们确定了在一次试验的基础上，双侧拮抗剂注射对达到杠杆的潜伏期的影响是否与拮抗剂对DS诱发的兴奋程度的影响相关。 首先，对于所有记录的在双侧输注拮抗剂前均表现出明显DS兴奋的神经元，在每项试验中DS发作后100到400 ms内，我们计算出平均放电速率。 接下来，对于每个神经元，我们计算了Spearman等级相关系数，将DS诱发的兴奋的逐次试验幅度与大鼠达到相应试验的杠杆潜伏期进行了比较。 这些相关性绘制在图的直方图中 图4B,D。 所有DS试验都包括在此分析中; 如果动物未按下杠杆，则将10的潜伏期（提示呈现的最大长度）分配给该试验。 我们计算了如上定义的预注射周期的这些相关系数; 我们通过1000扩展了注射后期，以获得更广泛的样本潜伏期样本，其中动物在双侧输注后作出反应。 为了评估个体相关性的显着性，我们使用了双尾渐近 t-approximation因为确切 p 当排名数据中存在关联时，无法计算值。 然后我们使用配对的Wilcoxon检验来比较拮抗剂输注前后相关系数分布的中位数。

因为NAc神经元具有低基线放电率，置信区间的下限通常跨越零，所以抑制比激发更难以检测和量化。 因此，除了用于检测激发的上述程序之外，我们还使用接收器操作特性（ROC）分析，这是一种更灵敏的方法，用于量化在提示开始后连续50毫秒时间区间内的发射率的可能性。与10的预先基线中的射击率不同。 对于注射前和注射后期间，分别进行该分析。 对于每个箱，我们计算了ROC曲线下的面积（AUC）; 0.5的AUC值表示与预先发射没有差异，而接近0或1的值分别表示神经元被抑制或激发的可能性更大。 为了以无偏见的方式描绘整个记录神经元群体的推进后神经活动，计算50 ms箱的点火率和AUC值; 为了平滑数据，对于连续的AUC计算，这些箱被10 ms提前。 然后将平滑的AUC值绘制为具有10 ms分辨率的热图（每个值代表下一个50 ms中的AUC）。 数字5B, ，66B, ，77B, ，88B及 and1010D,E.

接下来，我们量化了在不重叠的50 ms区间中计算出的AUC值是否反映了发射方面的显着差异。 对于每个垃圾箱，我们首先从随机基线的先验基线发射速率和相应的后继垃圾箱的发射速率中随机生成了10,000个自举AUC值。 然后，我们确定了从引导值的分布中得出实际AUC值的两尾概率。 如果概率＜0.05，则我们认为垃圾箱中的射击与基准基线有显着差异。 最后，我们计算了每个单元格中具有较高放电率的神经元的数量，这些神经元的放电率显着大于或小于基准基线发射，并将这些值绘制为总人口的一部分（图 5C, ，66C, ，77C, ，88C, ，99B,D, ，1010F,G).

 

图9。

与奖励容器进入一致的神经活动不受同侧或对侧D1或D2拮抗剂注射的影响。 A, C，ROC AUC值的计算和显示如下所述 图5B，除了时间段更长（200毫秒）并对齐 ...

为了比较在注射前和注射后期间激发或抑制的神经元的比例，我们使用数据简化方法。 首先，我们计算了在线索开始后50和0之间的1 ms区间的分数，其中每个神经元表现出显着的激发或抑制。 接下来，我们用注射的Wilcoxon检验比较注射前和注射后期的这些分数。 在预注射和后注射期间未在任何区域中显示出显着调节的神经元被排除在该分析之外，并且未包括在显示重要区间的中值分数的图中（每个部分右侧的点和须图） 图 5C, ，66C, ，77C, ，88C, ，1010F,G）。 该程序消除了大量神经元的影响，DS后窗口和DS前基线之间的活动没有差异; 这个人群没什么兴趣，但是它贡献了大量的空值，这些空值使重要区间的中位数偏向0，并且模糊了输注后重要区间的分数的减少和增加。

对于进入奖励容器后发生的与消费有关的射击，进行了类似的分析。 动物倾向于在容器中停留> 5 s。 因此，为了捕获相对较长的时间间隔，我们使用200毫秒的bin（图。 9）。 比较在注射前和注射后期间激发的神经元比例的时间窗口是从0到1.5 s，而从0到5 s的抑制作用是时间窗口。 较短的分析窗口用于激励，因为它们往往更短暂。 使用针对R的pROC包对Albert Einstein College of Medicine高性能计算群进行ROC分析。

为了比较在任务事件之外发生的“基线”发射率，我们比较了每次DS预注射和后注射拮抗剂之前10s箱中的平均发射率。 此过程在功能上等同于基线点火率的随机采样，因为DS在行为会话期间的任何时间都以几乎相等的概率呈现。 神经元被分类为表现出显着的DS诱发激发（在药物输注之前）或之前，然后在这些组内用成对的Wilcoxon检验比较注射前和注射后期的基线放电率（图。 10H,I）。 我们还对DS激发的神经元进行线性拟合，并将该线的斜率与单位线（1的斜率）进行比较。

如果对来自同一主题的数据子集进行了多次比较（图 2C-ê, ，55A,C, ，66A,C, ，77A,C, ，88A,C, ，99B,D, ，1010B,C,F,G), p 价值是Bonferroni纠正; 即， p 将值乘以所进行的比较次数。 更正 p 如果，值被认为是重要的 p <0.05。 除以下因素外，所有校正均以3进行： 图2C-ê，其中因子是2。

视频跟踪。

在实验的子集中，使用高架摄像头（30帧/秒）和计算机跟踪系统（Cineplex； Plexon）测量大鼠的位置。 系统跟踪了 x 和 y 连接到记录头台的两个不同颜色的LED的位置。 如前所述（McGinty等人，2013），我们计算出一个形心，该形心描述了每个视频帧的LED位置之间的中心点。 线性插值填充了多达10个连续帧的丢失数据点； 在极少的情况下，如果缺少> 10帧，则会丢弃数据。 对于每个视频帧，我们计算了该帧中质心位置与时间窗口±200 ms之间的距离的SD。 这些SD测量值构成了该视频帧的运动指数（LI）。 对数转换的LIs是双峰分布的，一个较低的峰代表很少或没有运动的时期，一个较高的峰代表运动（Drai等人，2000）。 然后，我们将两个高斯函数拟合到LI的分布，并将移动阈值确定为这些函数重叠最少的点。

移动被定义为至少八个连续帧，LI高于运动阈值。 为了确定运动开始的时间，我们将分析限制在动物仍处于提示开始的DS试验中，然后计算提示开始与LI超过运动阈值的第一帧之间的潜伏期（图 1d-F, ，22B,D）。 如果在试验中未测量到明显的运动，则该试验的潜伏期定义为> 10 s（提示提示的时间， 图。 1D）。 当从分析中省略这些试验时，获得了类似的结果（数据未显示）。 然后将DS-cued运动潜伏期分布汇集在大鼠中，并将中位数与Wilcoxon检验进行比较。 为了量化DS引导杠杆指导运动的最大速度和平均速度的延迟，我们使用所有以杠杆按压结束的试验，即使大鼠在DS开始时移动（图。 1E,F).

组织学。

用Euthasol深度麻醉动物并用盐水和4％福尔马林心脏内灌注。 将直流电（15μA）通过阵列中的每个电极用于~30以产生损伤。 取出脑并储存在福尔马林中直至处理完毕。 在用低温恒温器切片之前，通过浸入30％蔗糖中将脑冷冻保护数天。 对Nissl物质染色切片（50μm）以显现插管和电极轨迹和损伤（图。 11).

 

图11。

拮抗剂注射部位的组织学重建。 图描绘了大鼠脑的两个冠状切片，其包含NAc的前后范围的大部分（来自前囟的0.8 mm-2.8 mm）。 黑点代表 ...

成果

我们以可变间隔向大鼠提供两种听觉刺激，平均30 s：奖励预测DS和NS（图。 1A; Nicola等，2004a,b; Ambroggi等人，2008, 2011; McGinty等人，2013）。 在DS期间的杠杆按压终止提示，并且在进入奖励容器时递送一滴蔗糖; 如果动物在10内没有反应，则在没有奖励递送的情况下终止提示并且开始间隔时间间隔。 在此间隔期间和NS期间的响应没有编程后果。 NSs总是10。 受过训练的动物，它对大多数DS有反应但很少有NSs（图。 1B），植入针对NAc核心的插管阵列。 在实验期间，动物首先执行45 min预注射期的任务，在此期间记录NAc神经活动。 接下来，将D1受体拮抗剂SCH23390或D2 / 3拮抗剂raclopride双侧或单侧注入NAc; 在整个输液过程中，动物留在腔室中，任务突发事件有效，并且之后至少持续75分钟。

与之前的研究一致（Yun等人，2004; Nicola，2010），任何一种拮抗剂向NAc核心的双侧输注显着降低了动物应答的DS的比例（图。 1C，深灰色痕迹）并增加启动运动的潜伏期，如通过会话子集中的视频跟踪所测量的（图。 1D，灰色虚线痕迹）。 相反，相同剂量的单侧输注对DS反应率没有影响（图。 1C，浅灰色痕迹），DS发作后开始运动的潜伏期（图。 1D，闪烁的浅橙色痕迹），以及在杠杆接近时达到杠杆或移动速度的延迟（图。 1E,F）。 这些行为数据表明，即使在两个半球中阻断D1或D2 / 3受体严重损害反应，单个半球中的NAc多巴胺也足以维持行为。 这种分离提供了关键的实验优势，因为它允许我们测试多巴胺拮抗剂对行为受损（双侧注射）和不注意（单侧注射）时神经活动的影响，从而排除任何观察到的变化可能造成的混淆在拮抗剂输注后的神经活动继发于行为的改变。

我们在322记录/注射期间在31大鼠的12 NAc神经元中记录。 通过DS呈现显着激发记录的神经元的大约45％。 这些激发表现出类似于先前报道的性质（Yun等人，2004; Nicola等，2004a; Ambroggi等人，2011; McGinty等人，2013; 莫里森和尼古拉，2014）：它们比NSs引起的更大（图。 2A）; 它们在提示开始后的短暂潜伏期开始（~120 ms）并且在开始杠杆指导运动之前发生（图。 2B）; 并且它们的大小与行为反应的概率，运动启动潜伏期和与杠杆的接近程度相关（McGinty等人，2013; 图。 2C-ê).

双侧输注D1or D2 / D3拮抗剂导致DS诱发激发的幅度急剧减少。 如两个示例神经元所示（图。 3A,C），这种效应在输注后的几分钟内最明显，对应于注射引起的线索诱发接近行为的最大减少（图。 3A,C，蓝色栅格和直方图）。 当行为效应恢复时，射击反应也恢复了（图。 3A,C，黑色栅格和直方图）。 这种结果模式在提示激发的神经元中是一致的（图 5A, ，66A，双边直方图和晶须图）。 支持这些激励设定杠杆运动的活力的假设，在注射前的提示诱发兴奋的幅度预测了动物到达杠杆的潜伏期（图。 4A,C， 剩下）。 在双侧D1或D2拮抗剂注射后，这些潜伏期显着转移到更高的值，通常很高，以至于在10的提示呈现中根本没有反应（图。 4A,C，左右延迟分布）。 引人注目的是，尽管对抗者减少了线索诱发的射击，但它继续预测了注射后和恢复期间行为反应的活力（图。 4A,C，右边的栅格图。 该观察结果表明该药物的行为和神经效应在逐个试验的基础上相关：由多巴胺拮抗剂引起的放电减少越多，达到杠杆的潜伏期越大，并且该概率越低。动物完全达到了杠杆。

为了评估这种逐个试验相关性的一致性，我们计算了每个线索激发的神经元，激励幅度和按压杠杆的潜伏期之间的Spearman等级相关性。 我们将10的潜伏期分配给没有响应的试验; 因此，这些试验中的潜伏期与最高等级相关。 （如果从分析中省略没有DS-cued杠杆反应的试验，则得到了类似的结果;未显示数据。）当我们将预注射期间的相关系数与联合后注射/恢复期的相关系数进行比较时，我们发现几乎所有系数在两个时期都是负数。 此外，拮抗剂要么对中位系数没有显着影响，要么将分布转向更负的值（图。 4B,D）。 因此，提示激发神经元的数量不仅可以可靠地预测行为反应潜伏期，而且拮抗剂在给定试验中引起的反应潜伏期的增加也可以通过拮抗剂对该试验中提示诱发的兴奋作用的影响而得到有力的预测。 这些结果提供了强有力的证据，证明内源性多巴胺在设定对线索的寻求奖励反应的活力方面起着因果作用：多巴胺会增加NAc神经元的线索诱发的兴奋性，进而引起杠杆的短时延方法。

对这些结果的另一种解释是，减少线索诱发的激发是行为反应减少的结果 - 也许是因为激励只是跟踪（或预期）行为反应，但不是因果关系。 如果是这种情况，那么以不影响行为的方式应用拮抗剂不应导致提示诱发的激发减少。 但是，如两个示例神经元所示（图。 3B,D），单侧注射D1or D2 / D3拮抗剂显着降低了线索诱发激发的程度，即使单侧注射没有改变行为表现。 当在注射的NAc中记录的线索诱发激发的平均值时获得了类似的结果（图 5A, ，66A，同侧直方图）; 此外，平均数据显示，注射对侧NAc记录的神经元中的线索诱发激发未受影响（图 5A, ，66A，对侧直方图）。 为了排除在注射同侧引起的线索诱发激发减少的可能性是由于行为反应概率的微小差异，我们在排除动物没有杠杆按压反应的所有试验后重复分析; 获得了类似的结果（数据未显示; p 对于D0.05和D1拮抗剂，均<2（Wilcoxon）。 这些结果表明，拮抗剂诱导的提示诱发的兴奋的减少不太可能是行为表现受损的结果。

虽然线索诱发激发的时间特性在神经元之间非常相似，但是在线索发作后的抑制更加多样化，通常表现出较晚的发作和较少的刻板时间过程而不是激发（图 5B, ，66B）。 因此，关注于单个时间窗口的抑制（以及在一定程度上，激励）的分析可能错过信号的重要部分。 此外，标准统计检测方法不能始终如一地识别从非常低的基础放电率（包括许多NAc神经元的放电率）的降低。 为了避免这些问题，我们采取了一种更具包容性的方法来量化，对于每个记录的神经元中的50 ms postcue时间箱，ROC AUC表示箱中发射与预先确定基线之间的差异。 时间仓中AUC值的热图与DS起始对齐（图 5B, ，66B）证明D1和D2拮抗剂双侧和同侧（但不是对侧）注射后DS诱发的兴奋减少在几乎每个线索激发的神经元中都很明显，并且在激发的整个时间过程中发生。 相反，DS发作后的抑制没有降低。 为了量化这些影响，我们通过计算自助p值来确定每个AUC值是否与基线显示出显着差异，该自助p值表示从随机改组基线和后救箱发射率产生的AUC分布中采样AUC的可能性（参见材料和方法）。 如显示神经元的显着比例的图表所示（p <0.05）与DS发作对齐的每个单元格的激发或抑制（图 5C, ，66C在每个柱中的左图中，通过双侧和同侧注射拮抗剂来降低激发的分数，但不抑制。 通过比较整个1后DS窗口中显着激发和抑制区域的比例，统计证实了这种解释（图 5C, ，66C，点图）。 因此，通过D1和D2拮抗剂注射减少DS发作后的激发，但抑制不是。

实际上，在某些类型的注射后，显示出显着抑制的神经元数量增加（图 5B,C, ，66B,C）。 这些紧急抑制不太可能导致双侧拮抗剂输注的行为影响，因为它们不一致（例如，它们发生在双侧和对侧之后，但不是同侧D1拮抗剂注射和同侧后，但不是双侧D2拮抗剂注射），因此他们没有解释拮抗剂的行为影响。 此外，这些晚期抑制在DS发病后最突出~600 ms，在对照条件下，目标导向行为已经开始~50％的时间（图。 2B）。 因此，紧急抑制不太可能促成拮抗剂诱导的接近起始潜伏期的增加或响应概率的降低。 有趣的是，绝大多数突发抑制发生在DS激发的神经元中，通常在激发结束时（双侧D1拮抗剂：14 / 17神经元，82％;同侧D2拮抗剂：11 / 16神经元，69％; 图 5B,C, ，66B,C，与它们被拮抗剂诱导的兴奋性反应减少所揭示的可能性一致，并支持DS激发神经元的放电是引发接近行为的原因的假设。

NS演示文稿，很少引起杠杆压力响应（图。 1B），在由DS激发的相同神经元中引起小而一致的激发（图。 2A）。 令人惊讶的是，D1拮抗剂并没有减少NS诱发的兴奋，图。 7A）或兴奋神经元的数量（图。 7B,C）。 相比之下，D2拮抗剂注射减少了NS诱发激发的数量和数量（图。 8）。 两种拮抗剂均未降低NS诱发的抑制作用（图 7B,C, ，88B,C）。 因此，在这些条件下，D1受体激活需要NAc神经元响应显着的奖赏预测刺激而产生大幅度激发，而D2受体激活是对奖赏预测和中性刺激的反应所必需的。

我们考虑了双侧输注后减少寻求奖励行为可能是由于与强化相关的神经过程中断或奖励的享乐处理的可能性。 这些过程可能涉及在消耗蔗糖过程中被抑制或激发的NAc神经元亚群（Nicola等，2004b; Roitman等，2005; Taha和Fields，2005）。 由于动物在单侧拮抗剂输注后继续获得奖励，因此我们能够确定与奖励消耗有关的神经元活动是否取决于多巴胺受体的激活。 我们检查了动物进入奖励容器后5 s内的射击，通常是奖励消耗发生的时间段（Nicola，2010）。 使用ROC分析，我们将此窗口内的200 ms箱中的点火与10的预定基线进行了比较; 得到的AUC值的热图显示对于注射的同侧或对侧的拮抗剂注射几乎没有影响（图。 9A,C）。 激动和抑制神经元的比例不受拮抗剂的影响（图。 9B,D），强烈建议消费相关的激发和抑制不依赖于多巴胺。 当我们使用50 ms箱进行相同的分析时，获得了类似的结果（数据未显示）。

为了排除观察到的结果是由于除拮抗剂之外的某些因素（例如，由注射或药物载体的某些组分引起的物理干扰）的可能性，我们在一些实验中注射盐水。 如神经元示例所示（图。 10A）和通过提示激发神经元的平均激发（图。 10B），盐水注射不改变DS诱发的激发; NS诱发的兴奋也没有受到影响（图。 10C）。 此外，注射生理盐水不会影响DS或NS发病后显示出显着兴奋和抑制的神经元的比例（图。 10d-G).

最后，我们通过贡献NAc神经元的基线激发率来询问多巴胺受体激活是否可以允许线索进近行为。 与此假设不一致，D1或D2拮抗剂对DS激发或其他NAc神经元的基线激发率没有显着影响（图。 10H,I).

讨论

这些研究结果提示了一种机制，即NAc多巴胺促进环境刺激引起的寻求奖励的行为：多巴胺受体激活有助于提示诱发激发，这反过来促进了对奖励相关对象的短期延迟启动。 双侧多巴胺拮抗剂注射均增加引发运动的潜伏期的观察结果强烈支持这一结论（图。 1D）并减少线索诱发激励的幅度（图 33 –6）。 减少线索诱发的兴奋不能是行为受损的结果，因为单侧注射并没有改变DS提示的行为（图。 1C-F），但深度减少注射组织中的DS诱发激发（图 3B,D, ，5,5, ，6）.6）。 这些激发是NAc中的主要神经反应（发生在记录神经元的45％中），并且它们都在运动开始之前（图。 2B）并预测运动起始潜伏期，在较短潜伏期的试验中更大的射击（图。 2D）（McGinty等人，2013; 莫里森和尼古拉，2014）。 因此，诱发诱发的激发既是多巴胺依赖性的，也是追求有力回报所必需的。

我们的研究结果表明，在NAc中，提示诱发激发并且没有其他形式的神经活动可能是神经回路中的关键信号，其设定了目标导向运动的潜伏期。 该结论源于观察到拮抗剂减少了线索诱发的兴奋而没有减少线索诱发的抑制，奖励消耗相关的发射或基线发射率。 此外，双侧注射拮抗剂对减少兴奋最有效的试验是那些引起最大行为障碍的试验（图。 4），强烈反对神经元编码中其他一些未发现的变化导致行为影响的可能性。 因此，我们的数据将NAc中的多巴胺受体激活，提示诱发的兴奋程度以及动物寻求奖励的潜伏期牢固地联系在一起。

以前的工作表明，减少NAc线索诱发激发和抑制的VTA失活也阻止了动物表现出线索进近行为（Yun等人，2004）。 然而，该研究并未消除这些变化是间接电路效应的可能性。 在这里，我们证明记录的神经元局部的多巴胺受体是线索诱发激发所必需的，消除了拮抗剂作用是由NAc上游的多巴胺作用引起的可能性。 相反，即使通过VTA失活减少了线索诱发的抑制作用（Yun等人，2004），它们没有通过局部多巴胺拮抗剂注射减少，因此这些抑制不太可能是NAc内多巴胺直接作用的结果。

D1和D2拮抗剂对DS诱发的进近行为和DS诱发的射击的影响非常相似。 这些观察结果与一系列NAc显微注射实验一致，其中D1和D2拮抗剂在与我们相似的剂量下产生几乎无法区分的行为效应（Hiroi和White，1991; Ozer等，1997; Koch等，2000; Eiler等，2006; Pezze等，2007; Lex和Hauber，2008; 廖，2008; Nicola，2010; Shin等人，2010; Haghparast等，2012）。 这些结果，以及观察效果所需的注射剂中的拮抗剂浓度（mm）与药物对其靶标的亲和力（nm）之间的对比，使人质疑药物作用是否具有特异性。 尽管由于药物的扩散，代谢和氧化，受体的有效浓度可能显着低于注射浓度，但这些过程的组合效力和时间过程是未知的。 因此，一种形式可能性是SCH23390和raclopride的行为和电生理学效应都是两种药物结合一种或多种完全不受多巴胺结合的受体的结果。 有几个因素反对这种可能性。 Cue诱发的进近行为不仅被SCH23390和raclopride阻断，而且还通过将广谱多巴胺受体拮抗剂flupenthixol注射到NAc中（Di Ciano等，2001; 桑德斯和罗宾逊，2012），通过灭活VTA（Yun等人，2004）和6-羟基多巴胺对NAc的损伤（Parkinson等，2002），选择性杀死儿茶酚胺类纤维。 此外，NAc注射多巴胺再摄取阻滞剂，D1或D2受体激动剂，或多巴胺释放剂安非他明增加了线索进近的可能性（Wyvell和Berridge，2000; Nicola等人，2005; du Hoffmann和Nicola，2013）。 最后，VTA多巴胺神经元的光遗传自我刺激（毫无疑问通过多巴胺神经元激活维持的行为）通过注射SCH23390或raclopride进入NAc，其剂量与此处使用的剂量相似（Steinberg等，2014）。 很难想象一个简单的机制可以解释这些结果中的每一个，而不是通过阻止内源性多巴胺的影响来假定SCH23390和raclopride阻断方法。

另一种可能性是拮抗剂不仅结合其靶受体，还结合脱靶多巴胺受体。 在浓度为10μm或更低时，raclopride不结合D1样受体（Hall等，1986）; 较高的浓度尚未经过测试。 因此，即使在我们和其他人使用的mm注射浓度下，特别是在考虑扩散，代谢和氧化后，raclopride也可能对D2 / D3受体具有特异性。 对D23390样受体的SCH2结合常数的估计范围在1和5μm之间（Bourne，2001; Mottola等，2002）; 尽管这些值表明SCH23390以注射浓度结合D2 / D3受体，但SCH23390阻断多巴胺激活D2样受体的功能尚不清楚。 我们观察到raclopride减少了NS诱发的激发，而SCH23390并不支持药物作用于不同受体的观点，但没有明确证明其特异性。 然而，即使一种或两种药物阻断两种受体类型以减少DS诱发的激发，这与我们的结论完全一致，即DS诱发的激发需要激活至少一种形式的多巴胺受体。 因此，虽然药物特异性的问题仍然没有得到解决，但这个问题只是略微削弱了我们的主要结论，即多巴胺通过增加线索诱发的激发来促进提示方法。

事实上，如果药物确实具有特异性作用，我们的发现D1和D2 / D3拮抗剂各自在大多数提示激发的神经元中减少了线索诱发的激发，这表明这些受体的激活在同一神经元中协同激发。 尽管D1和D2受体存在于NAc中大部分隔离的神经元群体中（Albin等，1989; Gerfen等，1990），大量比例的表达D1受体的NAc核心和壳神经元也含有D3受体的mRNA（Le Moine和Bloch，1996），被D2拮抗剂阻断，包括raclopride。 D1和D3受体的共表达提供了一种潜在的机制，即多巴胺可通过D1或D2 / 3拮抗剂阻断的协同作用促进NAc神经元的激发（Schwartz等人，1998）。 或者（或另外），D1和D2（和/或D3）受体之间的相互作用可能发生在本地电路层（Goto和Grace，2005; Gerfen和Surmeier，2011）。 例如，多巴胺作用于D1受体，以减少GABA释放到NAc神经元上（Nicola和Malenka，1997; Hjelmstad，2004），这种效应可以促进激发与多刺神经元上D2 / D3受体的激活（Hopf等，2003）。 值得注意的是，这些机制认为多巴胺不直接激发NAc神经元，而是增加它们对谷氨酸能输入的兴奋性; 因此，他们可以解释为什么暗示诱发的兴奋不仅被多巴胺拮抗剂阻断，而且还被基底外侧杏仁核和前额皮质的失活所阻断（Ambroggi等人，2008; Ishikawa等，2008），两者都向NAc发送谷氨酸能投射（Brog等，1993).

SCH23390和raclopride效应之间的相似性和差异可能是两种对比神经机制的结果，包括阶段性和强直性多巴胺。 因为D1和D2 / D3拮抗剂都降低了DS诱发的激发，但同一神经元中发生的较小的NS诱发激发仅通过D2 / D3拮抗剂降低（图 8, ，9），9），似乎多巴胺通过激活D1受体促进刺激值的编码，但通过D2 / D3受体促进对所有线索（无论它们是否与有价值的结果相关）的激发反应。 这可能是由于通过奖励预测而非中性线索在NAc中引发的更大的相位多巴胺瞬变（Phillips等，2003; Roitman等，2004）。 因为D2 / 3受体对多巴胺的亲和力高于D1受体，所以小的NS诱发的多巴胺瞬变可能足以仅激活D2 / 3受体，而奖励预测性DS可将多巴胺浓度提高到足以激活D1受体的水平。 （格蕾丝，1991).

或者，线索诱发的激发的大小可以通过强直，而不是相位多巴胺来调节。 补品多巴胺水平可能反映不作为的机会成本（Niv等人，2007），从而树立了操作性能的活力。 因此，如果达到足够高的强直多巴胺水平，则足够的多巴胺受体可以被激活以促进诱发诱发的激发并减少奖赏寻求方法的潜伏期。 类似的机制也可能是众所周知的NAc多巴胺对执行需要高水平努力的不受约束的操作任务的贡献的基础（Salamone和Correa，2012），其中多巴胺破坏增加了接近操作数的潜伏期（Nicola，2010）。 当机会成本和多巴胺水平高时，隐含的外部线索（例如，看到杠杆）或内部线索（例如，由时间或饥饿引起）可以通过激励NAc神经元来触发接近。

总之，无论具体的药理学机制如何，我们的研究结果表明，NAc多巴胺通过将NAc神经元的激发提升为显着的环境刺激来促进寻求奖励的行为。 该激发的幅度设定受试者的潜伏期以启动接近反应。 通过这种机制，多巴胺可以调节提示奖励的活力和概率。

脚注

参考资料