Nat Neurosci。 作者手稿; 可在PMC 2016 Jan 15中找到。
以最终编辑形式发布为：
Nat Neurosci。 2014 May; 17（5）：704-709。
在线发布2014 Apr 6。 DOI： 10.1038 / nn.3694
PMCID：PMC4714770
NIHMSID：NIHMS574802
Ingo Willuhn,1,2,3,* 劳伦·布尔格诺,1,2 Peter A. Groblewski,2 和 保罗EM菲利普斯1,2
可在以下位置获得发布者对本文的最终编辑版本： Nat Neurosci
见评论“相位多巴胺信号丢失：一种新的成瘾标记“中 Nat Neurosci，第17页的第644卷。
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抽象
药物成瘾是一种以药物使用不断增加为特征的神经精神疾病。 腹内侧纹状体（VMS）中的多巴胺神经传递介导滥用药物的急性增强作用，但随着长期使用，背外侧纹状体（DLS）被认为可以控制药物寻求。 我们测量了可卡因自我给药方案期间纹状体多巴胺的释放，该方案产生了大鼠服用药物的升级。 令人惊讶的是，我们发现随着可卡因摄入量的增加，两个地区的阶段性多巴胺减少; 随着VMS中多巴胺的减少与升高的速率显着相关。 以补充VMS中多巴胺信号传导的剂量给予多巴胺前体L-DOPA逆转升级，从而证明减少的多巴胺传递和过量药物使用之间的因果关系。 因此，这些数据一起提供了对长期使用后出现的过量药物摄入的机理和治疗见解。
引言
药物滥用与纹状体中多巴胺的释放密切相关1,2。 然而，多巴胺神经传递中与药物使用相关的变化在持续时间和次区域方面有所不同3–5。 由许多滥用药物（包括可卡因）刺激的腹内侧纹状体（VMS）中多巴胺细胞外浓度的缓慢增加6，假设反映药物的补强性质7因为动物调节它们的可卡因自我给药速率以维持高水平的环境多巴胺浓度8。 在VMS内，已经报道了多巴胺信号在伏核的核心和壳亚区域中的重叠推定作用，但重点是用于介导主要药物奖赏的壳和作为条件强化的基质的核心。1。 实际上，伏隔核中的相位多巴胺释放持续几秒钟，其条件是呈现与药物重复配对的环境刺激物。9–12 并且能够控制药物的寻求和服用9。 在纹状体（背外侧纹状体，DLS）的感觉运动方面也发现了通过多巴胺释放对这种条件刺激的编码。13，一个纹状分区域，与习惯性和强迫性药物寻求的发展有关14–16。 因此，药物服用超过娱乐用途的进展被认为反映了不同纹状体亚区域中多巴胺信号传导的参与1,17，在确定的寻药行为的发展过程中，重点是从边缘（VMS）转向感觉运动（DLS）纹状体1,18。 然而，目前尚不清楚药物相关作用的编码或相位多巴胺的刺激是否随着温和的吸毒行为的增加而改变。
被认为最能模拟从中度吸毒成瘾过渡到成瘾的啮齿动物范例采用长期获取药物的方式19,20，例如将访问权限从一个（短访问，ShA）扩展到每天六小时（长访问，LgA），持续数周21。 这种药物自我给药方案能够产生升级21 和强迫性药物寻求22，以及表征人类物质依赖性的其他主要症状23。 在这里，我们测试了LgA如何影响先前在稳定的ShA药物使用期间表征的纹状体中的阶段性多巴胺信号传导的区域动态。13 更好地理解药物使用升级的神经生物学机制。
成果
具有留置静脉内导管的雄性Wistar大鼠在每日ShA期间被训练为自我施用可卡因，并且在获得之后将切换至LgA会话在配备有两个鼻子端口的腔室中。 进入活动端口的鼻子引发可卡因输注（0.5 mg / kg /输注）和20-s在固定间隔（FI）20加固计划中呈现浅色刺激。 在刺激呈现期间（20-s超时），第二个（不活动的）鼻捅端口或活动端口中的响应没有编程后果。 出于报告的目的，在超时期限之外的活动端口中的鼻子戳响应（即，引发可卡因输注的那些）被称为“活跃的鼻子戳”和在超时期限之外的非活动端口中的那些响应为“不活动”。鼻子戳“。 活动鼻捅的数量显着超过了不活动的鼻捅（鼻捅端口的主要影响： F（1，23） = 383.226， P <0.001； 图。 1）每周（P <0.001）。 从ShA转换为LgA后，可卡因的摄入量随时间显着增加（一周的主要影响： F（3，69） = 25.504， P <0.001； 图。 1），正如许多其他人一致报道的那样24.
为了评估多巴胺传播的长期动态，纵向神经化学记录同时在VMS伏隔核和长期植入微传感器的DLS中进行。25 使用快速扫描循环伏安法（见 补充图1 用于电极放置的组织学验证）。 在LgA的第一周，我们观察到活动反应后VMS中细胞外多巴胺浓度的短暂增加（P <0.001； 图2a）。 这种激活模式在LgA期间下降，其中第三周多巴胺释放明显小于第一周（P <0.001）和秒（P = 0.030）周（周的主要影响： F(2,72) = 10.230， P <0.001； 图2b）。 DLS中的阶段多巴胺释放在第二周出现（P = 0.006; 图2c）但在LgA的第三周缺席（周的主要影响： F(2,51) = 3.474， P = 0.039; 活跃的戳×周互动： F(2,51) = 4.021， P = 0.024; 图.2c，d）。 这些数据表明VMS和DLS中的相位多巴胺信号在药物摄取的不同阶段依次出现，类似于我们报道的ShA方案。13。 然而，在LgA过程中，这一信号在两个区域均有所减少，在此期间，已知静脉注射可卡因的药代动力学不会发生变化。26,27.
为了测试多巴胺信号丢失与药物消耗升高之间的关系，我们利用个体差异，在LgA方案期间将药物自我给药升级，将动物分成两组，取决于它们是否表现出基于线性的显着升级。 LgA会议期间药物消费量的回归与否（图3a，b）。 对这种动物分离的验证表明，非升级动物在LgA三周的过程中没有显着增加活跃的鼻尖（周的主要影响： F(2,18) = 0.633， P = 0.542; 图3b，左），而升级的大鼠显着增加他们的摄入量（周的主要影响： F(2,26) = 14.826， P <0.001； 图3b， 对; 摄入×周互动： F(2,44) = 4.674， P = 0.014）在第三个LgA周期间比非升级的动物制造更活跃的鼻子戳（t(22) = 2.307， P = 0.031; 图3b）。 值得注意的是，升级的动物显示出获得可卡因的动力增加，正如渐进比例任务所证明的那样（P = 0.028; 补充图2）。 在升高的大鼠中，VMS中多巴胺释放显着下降（周的主要影响： F(2,51) = 15.507， P <0.001； 图3c，对，和 补充图3a）。 然而，VMS多巴胺释放在非升级大鼠中是稳定的（周的主要影响： F(2,18) = 0.057， P = 0.945; 图3c，左和 补充图4a与升级的大鼠相比，第三周显着更多的阶段性多巴胺（摄入的主要影响： F(1,69) = 6.444， P = 0。 013; 图3d， 剩下; 摄入×周互动： F(1,70) = 4.303， P = 0.042）。 在自我给药的整个6小时内，升高的和未升级的大鼠之间的多巴胺释放的这种差异是明显的（t(43) = 2.599， P = 0.013）。 重要的是，这种差异不是由于升级动物的多巴胺功能普遍下降所致，因为非偶然的，实验者诱导的可卡因输注后多巴胺的释放在非升级和升级的动物之间没有差异（P = 0。 605; 补充图5a).
与非升级大鼠的VMS中维持的相位多巴胺释放相反，我们之前报道过，每天每次只有一个小时的可卡因进入受限（ShA）三周的动物多巴胺释放减少13。 因此，我们对从这些ShA大鼠获得的数据进行了额外的分析，以允许详细表征多巴胺功能与经历过ShA或LgA可卡因自我给药的动物的药物摄入之间的关系。 虽然在ShA期间动物的平均药物消耗没有显着升级，但是与动物亚组（6的16）在ShA可卡因自我给药三周内表现出药物摄入显着升高存在个体差异。 有趣的是，在维持稳定药物消耗（即没有表现出显着升级）的动物组中，ShA可卡因自我给药第3周的VMS阶段性多巴胺与第3周的非升级动物没有显着差异。 LgA（P = 0.741; 补充图5b）。 药物摄入量增加的ShA动物表现出较低的药物消耗率（32.7±3.9与第一小时的43.9±3.1输注，P = 0.017）和较少的多巴胺释放减弱（P = 0.049; 补充图5b）比在LgA条件下升高摄入量的动物。 尽管如此，与非升高对应物（P = 0.094）相比，VMS多巴胺降低的趋势不明显，并且ShA和LgA升高的大鼠之间多巴胺释放没有显着的相互作用（没有摄入×方案相互作用： F(1,57) = 0.111 P = 0.740; 补充图5b）。 鉴于这些个体差异，我们对所有ShA和LgA大鼠进行回归分析，以测试多巴胺水平与升高程度之间的直接关系，并发现显着的负相关（ShA和LgA大鼠合并在一起; r = -0.628 ， P = 0.005）在3周内具有最低多巴胺释放的动物中最大的升级（图3e， 剩下）。 因此，VMS中多巴胺信号传导的减弱预示着LgA和ShA药物进入方案中药物自我给药的升级。 这些数据强调，与多巴胺释放变化相关的相关方面是动物是否升级，而不是它们接触过的自我给药方案。 本身。 同样地，我们发现在所有大鼠中，升级是可卡因动机增加的重要预测因子（P = 0.037， 补充图6a），但按照累进比率表（LgA / ShA方案）进行评估P = 0.340， 补充图6b).
与VMS相反，DLS中反应 - 偶然多巴胺释放在升级和未升级的LgA动物之间没有差异（摄入的主要影响： F(1,48) = 0.472， P = 0。 496; 图3d，对，和 补充图 3b 和 4b），接受ShA或LgA可卡因自我给药的动物的升级斜率和多巴胺释放之间也没有显着的关系（r = -0.112， P = 0.649; 图3e， 对）。 因此，尽管VMS中的多巴胺与药物摄取的升级相关，但在DLS中未观察到类似的相关性，DLS是一种与延长药物自我管理广泛相关的大脑区域。1,14,16,18.
鉴于神经化学与行为之间的这种挑衅性相关性，我们假设相位多巴胺信号传导的下降是引起药物服用升级的原因，类似于多巴胺受体拮抗剂产生的药物摄入增加28–30，所以恢复它会导致升级的逆转（图4a）。 因此，我们治疗升级的动物（P = 0.024; 图4b）在会话开始前用L-DOPA增加相位多巴胺释放31。 L-DOPA剂量依赖性（0，10，30和90 mg / kg，静脉注射）降低可卡因摄入量（L-DOPA的主要作用： F(3,53) = 5.053， P = 0.004; 图4b），30 mg / kg使摄入量恢复到预先升级的水平。 重要的是，30 mg / kg剂量的L-DOPA足以完全恢复VMS中的阶段性多巴胺信号传导（见 补充图7 在吸毒过程中（记录网站）F(2,8) = 6.316， P = 0.023; 图4c），对整个六小时的自我管理也观察到一种效果（F(2,8) = 7.610， P = 0.0141）。 因此，VMS中相位多巴胺的释放量预测了可卡因自我给药期间的药物摄入量（r = -0.525， P = 0.046; 图4d）。 L-DOPA的这种行为影响不能通过对可卡因的药理学反应的变化来解释，因为在偶然药物输注后VMS多巴胺的缓慢浓度变化没有被L-DOPA治疗改变，并且事实上，前者之间没有差异。升级，升级和升级的L-DOPA治疗状态（F(2,8) = 0.020， P = 0.980; 补充图8）。 此外，当L-DOPA局部注入VMS时，也观察到L-DOPA对药物消耗的影响（见 补充图9 对于在会话之前升高的大鼠的输注部位（t(7) = 6.517， P <0.001； 图4e）。 总之，这组研究表明，在药物获取之前施用单剂量的L-DOPA可有效恢复多巴胺信号传导并使可卡因使用正常化至预升级状态。
我们接下来测试了L-DOPA的使用是否有效减少长期给药方案中升级的药物消耗，与临床应用更相关。 首先，我们进行了实验，在诱导升级期间连续几天引入重复输注L-DOPA。 训练动物以稳定地自我施用可卡因，然后转换为LgA或保持在ShA上，在此期间每次注射L-DOPA（30 mg / kg，静脉注射）或生理盐水两周（图5a）。 L-DOPA以特定方案的方式显着影响药物摄入（治疗的主要影响： F(1,53) = 9.297， P = 0.004; 方案的主要作用： F(1,53) = 5.968， P = 0.018; 图5a）LgA动物的可卡因摄入量减少（P = 0.004），但不是ShA动物（P = 0.170; 图5a），并且对不活动的鼻子戳（LgA， P = 0.202; 沙 P = 0.101; 数据未显示）。 因此，L-DOPA治疗有效地防止LgA期间药物消耗的升级。 但是，治疗停止后，这种效果并不持久（P = 0.789; 图5a）。 其次，我们连续几天在动物中反复给予L-DOPA，并确定逐渐增加的药物消耗。 训练动物以稳定地自我施用可卡因，随后将其转换为LgA，或者在ShA上保持三周。 然后在第三周自我给药期之前用L-DOPA或盐水处理这些动物（图5b）。 与受ShA训练的动物相比，受过LgA训练的动物在前两周显示可卡因使用显着增加（方案的主要影响： F(1,51) = 15.706， P <0.001; 数据未显示）。 L-DOPA治疗产生了方案特异性作用（治疗的主要作用： F(1,51) = 5.303， P = 0.025; 方案的主要作用： F(1,51) = 11.884， P = 0.001; 图5b），减少LgA动物的可卡因摄入量（P = 0.048），但不是ShA动物（P = 0.210; 图5b）不影响无效响应（LgA， P = 0.641; 沙 P = 0.664）。 重要的是，当动物被分组为升级和非升级而不是ShA和LgA（升级的动物，L-DOPA）对活跃的鼻子戳的不同影响更加强大。 P = 0.005; 非升级动物， P = 0.421; 图5c），表明L-DOPA优先减少升级的可卡因摄入，而不是影响药物消耗 本身，一种在数天内开发的相互作用（摄入×治疗（日1）相互作用： F(1,51) = 0.562， P = 0.457; 但摄入量×治疗（日5）相互作用： F(1,51) = 4.091， P = 0.048）。 重要的是，在自我给药的所有六个小时内，也观察到升级和非升级亚群之间的这些差异以及急性和慢性给予的L-DOPA的降低作用（补充图10）。 总之，这些研究结果表明，动物的相位多巴胺释放减少，其可卡因摄入量增加，并且通过重复施用多巴胺前体L-DOPA来恢复它，防止并逆转这种升高，提供证据表明多巴胺减少会导致药物自我给药的升级。
讨论
在本研究中，我们研究了药物摄入升级过程中VMS和DLS中的多相多巴胺释放，这一现象模拟了药物依赖的关键诊断标准。21,23。 我们的研究结果表明升高与VMS和DLS中多巴胺信号传导减少有关，VMS中多巴胺的减少与升高速率显着相关。 这种效应似乎对于阶段性多巴胺具有选择性，因为在目前的研究中，在先前使用相同方案的大鼠的工作中没有观察到相似的变化。27 或非人类灵长类动物的相关自我管理范式32,33。 有许多报告称停药期间的多巴胺功能降低（在最后一次自我给药期间的18小时和7天之间进行测试），这与对可卡因的敏感性降低有关34–37。 虽然我们观察到ShA和LgA大鼠之间多巴胺对可卡因反应的类似减少（补充图5a），这种效应似乎与升级无关，因为对于非偶然可卡因的神经化学反应在升级的大鼠和没有升高的大鼠之间没有差异（没有摄入×方案相互作用： F(1,34) = 1.964 P = 0.170; 补充图5a）。 同样，在可卡因的药理作用之后，强直多巴胺浓度达到90秒后的峰值变化（可能是由于可卡因的药理作用）在同一动物中的升级前和升级状态之间没有差异（补充图8）。 因此，我们观察到的预测药物摄入升高的多巴胺传递的唯一方面是在活跃的鼻子戳后立即发生的阶段性反应，这是主要针对药物相关线索的条件反应。9,11,13。 这种神经化学反应在使药物摄入量增加的动物中减少，这使人联想到正常的学习过程，其中由奖励相关刺激引起的VMS中的多巴胺释放减少，因为刺激在时间上被预测38,39。 然而，自我施用期间多巴胺释放的减弱在学习过程中发生的时间远远超过在获得既定药物治疗之后很长时间的应急学习。 此外，在不增加药物摄入量的动物中，即使这些动物表现出渐近的辨别性器官行为，也不会发生相位多巴胺释放的减弱。
从表面上看，我们观察到随着药物使用的进展，多巴胺释放下降似乎与几种当代成瘾理论不一致。 专注于药物诱导的激励致敏过程的理论假设VMS多巴胺系统反复接触滥用药物后反应性增强，这些药物介导对药物和提示暴露的敏感反应40，一种在LgA之后特别强大的现象41。 关于药物成瘾中异常学习和习惯形成的作用的概念表明，DLS中出现的多巴胺信号传递越来越多地控制着药物寻求1,14,16。 此外，突出的成瘾计算模型特别暗示增加的多巴胺信号传导与药物相关的线索作为成瘾的驱动力42,43。 相反，我们的研究结果似乎更符合Dackis和Gold提出的成瘾多巴胺耗竭假说44，以及相关的对手 - 过程理论21 强调药物滥用导致的奖励相关过程的抑制。 已经假设这种抑制引起药物使用的补偿性自我调节以维持药物中毒的优选水平21。 具体而言，人和动物通过增加响应来补偿降低的单位剂量的可卡因45,46。 该过程受VMS中多巴胺传递的调节8 因此，降低多巴胺传递（例如，通过多巴胺受体拮抗作用）引起药物消耗速率的增加28,29。 因此，我们在LgA期间观察到的多巴胺信号传导的减少可以刺激药物摄入的补偿性上调以实现优选的中毒水平。 为了支持这一假设，VMS中多巴胺的减少在表现出更多药物摄取升高的动物中最为明显。
因此，我们推断恢复多巴胺传递会减弱升级。 实际上，L-DOPA给药在预防和逆转药物摄入的升级方面都是有效的。 值得注意的是，L-DOPA对药物使用的影响在终止治疗后并不持久，这表明它不能阻止潜在的神经适应。 因此，我们的数据表明升级是通过一种过程介导的，该过程通过药物摄取过程中相位多巴胺的减少来表现。 这些研究结果为L-DOPA在精神兴奋剂滥用的临床治疗中的应用提供了机制信息，该策略在最近的少数临床试验中具有一些有希望但总体上混合的结果。47。 具体而言，由于L-DOPA减少了逐步增加的药物使用而没有产生禁欲，我们建议它更适合减少危害的方法，特别是允许成瘾者在进入行为治疗计划时重新获得对其药物使用的一定程度的控制。 总体而言，我们的研究结果显示，在长期药物进入期间发生的阶段性多巴胺释放减少，从而调节从娱乐性药物转向不受控制的药物使用。
方法
动物
来自Charles River（Hollister，CA，USA）的成年雄性Wistar大鼠在300g和400g之间称重，单独饲养并保持在12-h light / 12-h黑暗循环（在0700上点亮），温度和湿度控制与食物和随意提供水。 所有动物使用均由华盛顿大学动物护理和使用委员会批准，并且外科手术在无菌条件下进行。 对于伏安法实验，50动物进行了手术，其中29在整个实验中保持导管通畅，具有至少一个功能和组织学验证的电极，并通过行为标准（见下文）。 对于药理学实验，28大鼠的32进行了导管植入，保持静脉导管通畅并用于该研究。 基于ShA预实验训练期间的自我施用率，将动物平衡为实验组。 样本量与先前出版物中报告的样本量相似13.
立体定向手术
将大鼠用异氟烷麻醉，置于立体定位框架中，与非甾体抗炎咔洛芬（5 mg / kg，皮下）一起施用，并置于等温垫上以维持体温。 用酒精和聚维酮碘擦拭头皮，用利多卡因（0.5 mg / kg）和布比卡因（0.5 mg / kg）的混合物洗澡，并切开以暴露颅骨。 在颅骨上钻孔并且硬脑膜被清除用于靶向DLS（1.2-mm前部，3.1-mm侧部和4.8-mm腹部到前囟）48并且伏核的伏隔核（1.3-mm前部，1.3-mm侧部和7.2-mm腹侧至前囟门）。 一个内部制造的碳纤维微电极25 将其置于VMS中，将另一个置于DLS中，并将Ag / AgCl参比电极植入前脑的单独部分。 在一组不同的动物中，引导套管（26 gauge; Plastics One，Roanoke，VA，USA）被相同长度的“假”套管闭塞，双侧植入以靶向VMS。 用螺钉固定在颅骨上的颅骨塑料水泥固定电极和导管。 手术后，给大鼠施用长效非甾体抗炎卡洛芬（5 mg / kg，皮下注射）并置于等温垫上以保持体温直至走动。 在一周后的单独手术中，所有动物都植入静脉内导管。
植入静脉导管
用异氟烷麻醉大鼠，给予非甾体类抗炎卡洛芬（5 mg / kg，皮下注射），并置于等温垫上以维持体温。 导管由外径为0.6 mm的硅橡胶管制成，并在一端连接到“轮毂”（距静脉插入；美国弗吉尼亚州，Plastics One），用于连接输液泵。 将导管从肩部之间的背面皮下推到身体前方，然后通过皮下推入，并通过导管近端附近的硅橡胶珠将其锚定到右颈静脉中。 通过在负压下将血液吸入导管，可以验证导管的最佳位置。 然后用一块缝合在周围组织上的特氟龙网固定住针座，并切开切口，使针座从大鼠的背部突出。 然后用肝素溶液（80 U / ml，在盐水中）冲洗导管，并用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和肝素（1000 U / ml）的粘性溶液填充。 导管套上盖有一条短的卷曲聚乙烯管，PVP溶液保留在导管中以确保通畅。 手术后，让大鼠恢复至少五天。
可卡因自我管理
在0900和1700 hr之间进行自我管理会议。 大鼠学习在模块化操作室（Med Associates，VT，USA）中自我管理可卡因（Sigma，St.Louis，MO，USA），该室配备有位于相邻面板上的两个鼻子反应装置（带有集成提示灯的端口）相同的墙壁，房屋灯和扬声器，以提供纯音和白噪声刺激。 操作室被容纳在声音衰减的外室内。 训练大鼠（3-4个月）以根据FI20加强方案的操作性反应获得可卡因。 活动端口中的鼻子戳（动物之间的平衡侧）导致立即静脉输注可卡因（0.5 mg / kg超过约10秒）与20秒显示视听刺激（照射鼻子内的光）戳口和音调;条件刺激，CS）。 在CS呈现期间，施加20秒超时，在此期间鼻子戳不会导致进一步的药物输注或任何其他程序化后果。 会议期间的药物可用性表现为白噪声和房屋照明。 为了控制响应特异性，监测了第二个（非活动）端口的鼻子，但从未加强。 在两次连续的会议中，每次会议有五个或更多主动反应的标准进行预训练，以便纳入研究，每天给大鼠每天一小时获取可卡因（短期访问; ShA）一周，然后六天每天小时（长期访问; LgA）三周（每周五天）。 达到标准的会话数量在两到五个动物之间不同。 来自先前报道的对照组的行为结果13 用于比较来自经历LgA可卡因自我施用的大鼠的行为数据与在相同天数的ShA方案下训练的大鼠的基线。
在FI20可卡因自我给药的三个ShA或LgA周之后，一部分大鼠接受进行性比率测试。 这些会议与FI20会议相同，只是在本次会议期间要求动物对连续输注的可卡因进行越来越多的操作性反应。 每项试验的操作要求（T）是1.4的向下舍入整数(T - 1） 杠杆按下，从1杠杆按下开始（即1，1，1，2，3，5，7，10，14，20，28，40，56，79，111，155，217，304，426） 。 这项工作要求变得如此之高，最终动物停止响应并达到“断点”。 断点在操作上被定义为在30分钟之前获得的输注总数，在此期间没有获得输注。
L-DOPA / Benserazide给药
L-DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸）与外周作用的DOPA脱羧酶抑制剂Benserazide组合给予，以减少L-DOPA的外周分解（均来自Sigma，St.Louis，MO，USA）。 将两种药物溶解在盐水中并以1 ml / kg体重的体积静脉内输注。 L-DOPA在会话开始前30分钟以0，10，30或90 mg / kg施用，而Benserazide以2 mg / kg持续给予，而不管施用的L-DOPA剂量如何。 在第一组研究（剂量反应）中，大鼠在一天内用L-DOPA治疗（图。 4）。 所用的L-DOPA剂量均未抑制一般表现或引起运动障碍。 为了避免重复L-DOPA给药的潜在混淆效应，在“L-DOPA疗程”之后没有L-DOPA治疗的大鼠进行训练。 在第二组研究中，动物在每次自我给药之前用这些L-DOPA治疗长达两周（图。 5）。 在第三组研究中，大鼠在LgA期间表现出逐渐升级的可卡因自我给药，双侧输注L-DOPA（25-50μg溶于0.5μlACSF进入每个半球;0.25μl/ min; Sigma，St。审查了路易斯，密苏里州，美国）和ACSF对VMS的吸毒行为。 在输注日，将假套管替换为33-gauge输注套管，其在引导套管之外突出1.0mm。 在会议开始前十分钟给予输注。 在输注之后，将套管放置就位两分钟，然后移除以允许药物扩散。
伏安测量和分析
对于在实验期间通过快速扫描循环伏安法检测多巴胺（在每周两次会话期间进行记录），将长期植入的碳纤维微传感器连接到头戴式伏安放大器，与PC驱动的数据采集和分析系统连接（National Instruments，TX，USA）通过安装在测试室上方的电旋转装置（Med Associates，VT，USA）。 每100 ms重复伏安扫描，以获得10 Hz的采样率。 在每次伏安扫描期间，碳纤维电极的电位从-0.4 V对Ag / AgCl线性上升到+ 1.3 V（阳极扫描）和后退（阴极扫描），400 V / s（8.5-ms总扫描时间） ）并在扫描之间保持-0.4 V. 当多巴胺存在于电极表面时，它在阳极扫描期间被氧化形成多巴胺-o-醌（在约+ 0.7 V处检测到峰值反应），其在阴极扫描中被还原为多巴胺（在大约-0.3 V）。 随后的电子通量被测量为电流，并且与经历电解的分子的数量成正比。 伏安数据以0.025-2,000 Hz进行带通滤波。 从每次扫描中获得的减去背景的时间分辨电流提供了分析物的化学特征，可以从其他物质中分离多巴胺49。 通过使用标准训练集的化学计量学分析从伏安信号中分离出多巴胺25 基于长期植入电极检测到的电刺激多巴胺释放。 基于电极的平均植入后敏感性估计多巴胺浓度25。 在分析平均浓度之前，在试验运行平均值内用5点平滑所有数据。 在操作性反应（响应后）或CS的非偶然呈现后，多巴胺的浓度在7秒内（观察到的相位信号的大致持续时间）取平均值，并与操作前两秒内的平均浓度进行比较。回应（基线）。 在第二周和第三周进行的每次记录会话期间非连续地呈现CS（每次会话两次，每次20秒），但在第一周期间不是为了避免干扰药物输送和提示之间的联合调节这个协会可能还在发展的地方。
统计分析
个体电化学信号在自我给药期间平均，然后跨动物和数周，以增加统计学效力。 使用多变量ANOVA与响应，脑区域，可卡因摄入和周作为因子比较信号。 为了与电化学数据进行比较，行为数据也被分类为数周。 对于L-DOPA实验，使用药物治疗，训练方案，可卡因摄入的多变量ANOVA分析相应药物治疗（无治疗，L-DOPA剂量或媒介物）的行为数据（连续几天施用的平均天数）。和周作为因素。 如果出现重大的主要影响或相互作用，则进行事后分析 P 根据Holm-Bonferroni校正方法调整值以进行多次测试50。 使用Prism（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）制备图。 使用SPSS，版本17.0（Chicago，IL，USA）和Prism进行统计学分析。 数据适用于参数统计分析。 没有对实验条件盲目地进行数据收集和分析。
记录站点的组织学验证
在实验完成后，通过腹膜内注射氯胺酮（100 mg / kg）和甲苯噻嗪（20 mg / kg）麻醉动物。 在具有电极植入物的动物中，在用盐水进行心脏灌注之后用300％ - 对甲醛进行标记，用电解损伤（4 V）标记记录部位。 取出脑并在多聚甲醛中后固定24小时，然后在异戊烷浴中快速冷冻，在低温恒温器（50-μm冠状切片，-20°C）上切片，并用甲酚紫染色以帮助可视化解剖结构和电极诱导的病变或输注部位。
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致谢
我们感谢Scott Ng-Evans，Christina Akers Sanford，Chad Zietz，Nicole Murray和Daniel Hadidi的技术支持，以及Monica Arnold和Jeremy Clark的有用反馈。 这项工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）Grant WI 3643 / 1-1（IW），酒精与药物研究所（PEMP）和华盛顿大学教务长奖（PEMP）以及国家研究所的支持。 of Health授予T32-DA027858（LMB），F32-DA033004（PAG），P01-DA015916（PEMP），R21-DA021793（PEMP）和R01-DA027858（PEMP）。
参考资料
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