光遗传学揭示了在可卡因诱导的行为致敏中表达多巴胺D2受体的累积中型多刺神经元的作用（2014）

Front Behav Neurosci。 2014; 8：336。

在线发布Oct 13，2014。 DOI：  10.3389 / fnbeh.2014.00336

PMCID：PMC4195370

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抽象

已经提出伏隔核（NAc）内持久的药物诱导的适应性有助于药物介导的成瘾行为。 在这里，我们使用光遗传学方法来检查表达多巴胺D2受体（D2Rs）的NAc中型多刺神经元（MSNs）在可卡因诱导的行为致敏中的作用。 将编码通道视紫红质-2（ChR2）的腺相关病毒载体递送到D2R-Cre转基因小鼠的NAc中。 这使我们能够在NAc中选择性地光刺激D2R-MSN。 D2R-MSN形成局部抑制电路，因为D2R-MSN的光刺激诱发了相邻MSN中的抑制性突触后电流（IPSCs）。 NAc D2R-MSN的光刺激 体内 既不影响可卡因诱导的行为致敏的起始和表达。 然而，在药物戒断期间的光刺激减弱了可卡因诱导的行为致敏的表达。 这些结果表明，NAc的D2R-MSNs在戒断诱导的可塑性中起关键作用，并且可能在停止滥用药物后导致复发。

关键词： 光遗传学，中型多刺神经元，多巴胺D2受体，可卡因，药物成瘾

介绍

多巴胺（DA）信号传导与奖励期望和目标导向行为相关（Wise， 2004; Goto和Grace， 2005; 贝里奇， 2007）。 多巴胺能障碍的众所周知的病理之一是吸毒成瘾（Robinson和Berridge， 1993, 2003）。 在反复暴露于成瘾物质后，DA中脑边缘通路的分子和细胞水平发生适应性变化; 这些可能导致药物依赖，这是一种慢性复发性疾病，尽管其严重的负面后果，强迫性寻药和吸毒行为仍然存在（Thomas等， 2008; 白金南， 2013）。 因此，在中脑边缘多巴胺能系统中发生的修饰的表征是理解药物成瘾的关键。

多巴胺D1受体（D1R）和D2受体（D2R）在纹状体的中型多刺神经元（MSN）中高度表达。 有人提出，腹侧纹状体中持久的药物诱导的适应性，更广为人知的伏隔核（NAc），有助于成瘾的发展以及寻求药物和复发行为（Lobo和Nestler， 2011; 史密斯等人， 2013）。 来自腹侧被盖区的多巴胺能细胞体主要支配NAc。 NAc中超过95％的细胞是MSNs，它接收来自四个主要大脑区域的兴奋性输入：前额皮质，海马腹侧下丘脑，基底外侧杏仁核和丘脑（Sesack和Grace， 2010; Lüscher和Malenka， 2011）。 NAc内的MSN可分为两个主要亚群：表达D1R并直接投射到中脑DA区域的直接途径MSN，以及表达D2R并投射到腹侧苍白球的间接途径MSN（Kreitzer和Malenka， 2008; Sesack和Grace， 2010; Lüscher和Malenka， 2011; 史密斯等人， 2013）。 因为MSN是GABA能，MSNs神经元的激活会抑制它们的下游靶点，这些靶点也是GABA能的（Chevalier和Deniau， 1990）。 因此，激活D1R-MSNs会刺激中脑DA神经元，从而有助于调节奖赏相关行为（Lüscher和Malenka， 2011; Bocklisch等人， 2013).

最近使用以细胞类型特异性方式表达Cre重组酶的基因工程小鼠的研究揭示了D1R-MSN和D2R-MSN在可卡因成瘾行为中的不同作用。 此类小鼠能够对特定毒素，光遗传学探针或DREADD（由设计药物专门激活的设计者受体）进行遗传靶向，以选择性地操作D1R-MSN或D2R-MSN。 这种方法已经引起了一些关于MSNs在成瘾行为中的作用的共识：D1R-MSNs显然促进了成瘾行为，而D2R-MSNs则没有建议药物诱导成瘾行为的特定作用（或抑制作用）。 （Hikida等， 2010; Lobo等人， 2010; Ferguson等人， 2011; 博克等人， 2013）。 可卡因暴露显然诱导MSN群体中突触修饰和基因表达的改变（Lobo等， 2010; Lobo和Nestler， 2011; Grueter等人， 2013）。 尽管看起来D1R-MSNs和D2R-MSNs在可卡因介导的成瘾行为中起着相反的作用，但D2R-MSNs的确切作用尚不清楚。

以前已经证明，D2R敲除（KO）小鼠显示正常的可卡因介导的行为致敏和可卡因寻求行为，由于缺乏D2R而导致的敏感性仅略有下降（Baik等， 1995; Chausmer等人， 2002; Sim等人， 2013）。 然而，在药物戒断期间暴露于压力会抑制D2R KO小鼠中可卡因诱导的行为致敏以及可卡因寻求和复发行为的表达（Sim等， 2013）。 在NAc中D2R的特异性敲除不影响基础运动活性，也不影响可卡因诱导的行为致敏，但确实赋予应激抑制可卡因诱导的行为致敏表达的能力（Sim等， 2013）。 这些发现强烈表明，NAc中D2R的阻断不会阻止可卡因介导的行为致敏。 相反，NAc中的D2R似乎在戒断过程中对应激触发的突触修饰的调节中起着独特的作用，导致可卡因寻求和复发行为的增加（Sim等， 2013).

在这里，我们使用光遗传学进一步评估NAc D2R-MSNs在可卡因诱导的行为致敏中的作用。 使用脑切片，我们发现D2R-MSN的光刺激激活NAc内涉及相邻MSN的局部抑制电路。 NAc D2R-MSNs的光刺激 体内 既不影响可卡因诱导的行为致敏的起始也不表达。 然而，在药物戒断期间重复激活NAc D2R-MSN减弱了可卡因诱导的成瘾行为。 我们的研究结果表明，NAc的D2R-MSNs在戒断诱导的可塑性中发挥关键作用，并可能在停止滥用药物后导致复发。

材料和方法

小鼠

从MMRRC（突变小鼠区域资源中心，B2.FVB（Cg）-Tg（Drd57-cre）ER6Gsat / Mmucd）获得C6B1 / 2背景上的D44-Cre BAC转基因小鼠。 在行为实验中，缺乏D2-Cre转基因的同窝小鼠用作D2-Cre小鼠的对照。 在恒定的温度和湿度条件下，在12-h光，12-h暗计划中，将小鼠维持在无特定病原体的屏障设施中。 根据韩国大学和KIST的机构动物护理和使用委员会批准的标准进行动物护理和处理。

病毒载体制备

pAAV-EF1a-DIO-hChR2（H134R）-EYFP-WPRE由Karl Deisseroth（斯坦福大学）慷慨提供。 为了制备AAV，将HEK293T细胞在含有抗生素和FBS的DMEM培养基中培养。 在转染前一天，将来自90-cm培养皿的超过10％汇合的四个平板接种到五个15-cm培养皿上，并孵育18-22 h或直至60至70％汇合。 使用jetPEI转染试剂（QBiogene），用pAAV-DIO-ChR293-EYFP，pAAV-DJ和pHelper转染HEK2T细胞。 将DNA / DMEM / PEI混合物涡旋并在室温下孵育20 min。 温育后，将转染混合物加入每个15 cm培养皿中。 转染后收获转染的细胞48 h，并在0.5℃下用6750％脱氧胆酸钠（Sigma; D50）和1014单位/ ml的benzonase核酸酶（Sigma; E37）孵育1 h。 通过以3000×g离心15 min除去细胞碎片后，将上清液通过0.45 mm PVDF过滤器（Millipore）过滤。 使用HiTrap肝素亲和柱（GE Healthcare）进行AAV-DJ颗粒的纯化。 对于AAV的浓度，使用具有15分子量截止值的Amicon ultra-100,000离心过滤器单元。 将浓缩的病毒等分并冷冻以在-80℃下储存。 最终的病毒浓度为3~6×1012 每个AAV的病毒颗粒/ ml。

立体定向注射和光纤放置

通过每克体重腹腔注射1.6 µl的Zoletil和0.05 µl的甲苯噻嗪（Rompun，Bayer）麻醉动物，并将其置于立体定位仪（David Kopf Instruments，Tujunga，CA）中。 为了注射病毒，使用31号注射器针头以2 ul / min的速率以0°（AP +1.7； ML±1.3； DV -4.5）的角度将0.1 µl病毒双向注入NAc。 注射后将针头留在原处10分钟，然后缓慢拔出。 用于植入的光纤套管由氧化锆套圈（直径1.25 mm，长4.5 mm）和光纤的扁平尖端（直径200 µm）组成。 注射病毒后，立即将光纤套管植入NAc中以照射D2-MSN。 光纤套管的植入坐标是用于靶向NAc的0°角（AP +1.7； ML±1.35； DV -4.2）。 为了帮助固定光纤，将两个螺钉固定在头骨中光纤插管植入部位的后部。 为了将光纤套管固定在颅骨上，将C＆B Superbond（Sun Medical）应用于套管底部周围的颅骨表面。 C＆B Superbond硬化后，将套管从固定器上松开，并在套管和螺钉周围涂抹牙科用水泥（Poly-F，Dentsply）。 为了封闭套管部位周围的切口，使用了Vetbond组织粘合剂（3 M，7003449）。 植入后，连续5天给小鼠皮下注射抗生素（Enrofloxacin，12 mg / kg，q 5 h）和镇痛（Carprofen，24 mg / kg，q 3 h）。

体内 光刺激

使用套管将200μm接插线连接到可长期植入的光纤的外部。 光纤通过FC / PC适配器连接到蓝色激光二极管（473 nm，MBL-III 473-150 mW），并通过刺激器（BNC 575）产生光脉冲。 对于表达ChR2的神经元的光刺激，刺激范例是20 Hz频率，5 ms脉冲持续时间和2-5 mW的光功率。 使用具有S100C光传感器的功率计（PM121D）测量从接插线发射的光功率。

行为分析

使用2-11周龄的雄性D13-Cre小鼠进行行为实验，除了进行5-6周龄的电生理学分析的小鼠。 年龄匹配的D2-Cre和Cre阴性对照小鼠注射病毒并单独饲养并使其适应笼子直至进行行为测试。 对于每次操作，在实验开始之前将小鼠转移至实验室60 min以允许适应和减少应力（实验室的亮度为70 lux）。 在实验之间用70％乙醇清洁每个实验装置以除去任何潜在的气味提示。

可卡因致敏

为了开始可卡因致敏，小鼠习惯于注射盐水（ip）连续3天，然后注射生理盐水或可卡因（15 mg kg） - 1，ip）连续5天。 用溶于盐水（0.9％NaCl）或盐水的可卡因盐酸盐（Johnson Mattney，Edinburgh，UK）腹膜内（ip）注射小鼠，用30 G针。 在每次注射后，立即在开放场室中测试小鼠的30 min的水平运动活性。 用于测量光刺激对致敏的起始和表达的影响（图2） （图 5），5），在家庭笼中的3 min期间，通过双光纤跳线将小鼠双侧蓝光照射到NAc上，持续4个30分钟。 从位于小鼠头骨上的光纤插管移除贴片线，并给予小鼠至少10 min休息。 然后给小鼠注射可卡因或盐水（coc 1d-coc 5d）。 在引发致敏后，在没有注射盐水的情况下取出可卡因14天。 在此撤回期间，未应用光刺激。 然后通过注射攻击剂量的药物（10 mg kg）确定对可卡因的行为致敏的表达。 - 1，ip）照片刺激后的NAc，如图所示 Figure5A.5A。 测量可卡因戒断期间光刺激的效果（图 （Figure6），6如上所述，对小鼠进行相同的致敏方案（图1） Figure5）5）除了给予光刺激外。 在开始可卡因致敏后，在1天的总停药期间，每天对14 h施加光刺激至NAc。 停药14天后，所有组小鼠均注射可卡因的攻击剂量，（10 mg kg） - 1).

图1 

伏隔核中中型多刺神经元的选择性光刺激。 （一个） 通过递送AAV-DIO-ChR2-EYFP病毒载体在NAc D2R神经元中选择性表达ChR2。 比例尺：背景图，1 mm：插入，200μm。 （B） 共聚焦图像 ...
图2 

D2RCre-MSN的光刺激驱动局部抑制电路。 （一个） 活NAc切片的共聚焦图像，显示不表达ChR2的染料填充神经元和表达ChR2并且可以被光刺激的相邻细胞（箭头）。 （B） IPSC ...
图3 

NAc细胞的特性。 （一个） 神经元的双光子荧光图像充满Alexa 594。 （A1） 显示来自ChR2 + / AP组的神经元，而 （A3） 显示来自ChR2- / IPSC组的神经元。 （A2） 和 （A4） 是来自的高倍率图像 ...
图4 

NAN中D2-MSNs的体内光遗传激活对基础运动活动的影响. （A） 使用AAV-DIO-ChR2-EYFP在NAc注射的D2 Cre小鼠的矢状图，然后双侧植入光纤套管。 473 nm蓝光刺激 ...
图5 

D2-MSN活化过程对可卡因致敏的影响。 （一个） 在启动过程中对D2-MSNs进行光刺激并对可卡因致敏的实验方案。 蓝光照明（2~5 mW，5 ms，20 Hz）已交付四个 ...
图6 

D2-MSN在戒断过程中对重复可卡因暴露的影响。 （一个） D2-MSNs在撤回可卡因期间光刺激的实验方案。 蓝光照明（2~5 mW，5 ms，20 Hz）交付8个3分钟 ...

免疫荧光和共聚焦激光显微镜

对于免疫荧光，用Zoletil（Virbac，1.6μl/ g，腹膜内）和0.05μl/ g Rompun（Bayer）麻醉小鼠，并用过滤灭菌的0.1 M PBS灌注，然后使用4％多聚甲醛/ PBS溶液（Sigma）固定。 然后取出脑并用如上所述的冰冷固定剂对4 h进行后固定。 然后将脑在30％蔗糖/ 0.1 M PBS中脱水，持续2天。 然后将脑冷冻并在低温恒温器（Leica CM 40，Germany）上制备1900-μm厚的连续冠状切片。 将切片（40μm）在含有1％正常山羊血清和0.1％Triton X-5的0.2 M PBS中封闭100 h，并与兔多克隆抗-D2R（1：500，Millipore，AB5084P）在4℃下孵育过夜。 用含有0.2％Triton X-100的PBS洗涤后，将样品在室温下与Alexa Fluor 1山羊抗兔IgG（568：1; Molecular Probes，Eugene，OR，USA）和500μl/ ml 0.2孵育4 h， 6-二脒基-2-苯基 - 吲哚HCl（DAPI; Sigma，St.Louis，MO，USA）在含有1％正常山羊血清和0.2％Triton X-100的PBS中。 作为阴性对照，将样品与DAPI和仅第二抗体一起温育。 在C1 Plan Apo×40 / 1.4水共聚焦激光扫描系统（LSM 700，Zeiss，Berlin，Germany）上检查切片。

伏隔核切片中的电生理学和光刺激

在病毒注射后的几周，将小鼠用于4实验，以实现ChR2-EYFP的最佳表达。 然后将小鼠麻醉并断头以制备急性脑切片。 迅速取出大脑，立即置于含有（以mM计）250蔗糖，26 NaHCO的冰冷切割液中。3，10 D-葡萄糖，3肌醇，2.5 KCl，2丙酮酸钠，1.25 NaH2PO4，0.5抗坏血酸，1犬尿喹啉酸和7 MgCl2 用95％O鼓泡2/ 5％CO2 （pH = 7.4）。 使用振动切片机（Leica VT 250 S）制备含有NAc的冠状脑切片（1200μm厚），然后在含有（以mM计）的气体人工脑脊液（ACSF）中孵育：11 D-葡萄糖，125 NaCl，25 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，2.5 KCl，1.25 MgCl2 和2.5 CaCl2 在录制前34°C为1 h。 然后将切片转移到浸入式记录室中，其中O.2 - 饱和ACSF溶液持续超融合。 使用配备有2X水浸透镜和红外DIC光学器件的1000-光子显微镜（Olympus FV25 MPE，Tokyo，Japan）使NAc和VTA中的细胞可视化。 使用Multiclamp 700B放大器和Digidata 1440A数字转换器（Molecular Devices，LLC）从NAc细胞获得全细胞膜片钳记录。 使用pCLAMP 10.2软件对数据进行取样，并使用Clampfit 10.2软件（Molecular Devices，LLC）进一步分析。 在3-5MΩ之间电阻的贴片电极填充含有（以mM计）的内部溶液：130 K-葡萄糖酸盐，2 NaCl，2 MgCl2，20 HEPES，4 Na2ATP，0.4 Na3GTP，0.5 EGTA和10 Na2–磷酸肌酸，使用7.3 N KOH将pH调节至1。 在一个实验子集中，将Bicuculline（10 µM）浸入脑切片以阻断GABA受体。

通过LED光源（2±460 nm，UHP-Mic-LED-27，Prizmatix）对表达ChR460-EYFP的NAc细胞进行光刺激。 来自LED的蓝光进一步过滤并通过配备有激发滤光器（470-495 nm）的滤光片立方体衰减; 闪烁的光（10 ms持续时间，0.0366-0.354 mW / mm2）通过25X物镜以5-40 Hz的频率将其递送至脑切片。 在一部分实验中，响应于2持续时间的闪光，在表达ChR2的细胞中测量光电流。

统计分析

数据以平均值±sem表示，并用双尾学生进行分析 t- 测试，或双向方差分析，然后是Bonferroni 事后 测试。 一个 P<0.05的值被认为具有统计学意义。

成果

伏隔核中中型多刺神经元的选择性光刺激

为了确定NAc D2R-MSNs在可卡因介导的成瘾行为中的作用，我们使用光遗传学方法来刺激NAc D2R神经元。 为了通过光选择性地控制NAN中D2R-MSN的活性，将编码AAV-DIO-ChR2-EYFP的病毒载体立体定位注射到D2R-Cre BAC转基因小鼠的NAc中。 病毒注射后4周，在NAc中观察到ChR2-EYFP的强烈表达（图 （Figure1A）.1A）。 通过免疫荧光共聚焦分析证实了ChR2在D2R-MSN中表达的特异性：YFP标记的ChR2的表达与NAc中的D2R共定位（图 （Figure1B），1B），表明ChR2在NAc中表达D2R的神经元中表达。

虽然这种方法已用于其他研究（例如，Lobo等， 2010），病毒注射程序的细节因实验室而异，因此在我们的特定实验条件下记录光遗传学控制非常重要。 我们通过在NAc切片中从MSN进行全细胞膜片钳记录来评估ChR2的功能性表达。 通过以下方法鉴定MSN：（1）相对超极化的静息膜电位（RMP），通常比-80 mV更负; （2）响应施加的电流脉冲的常规AP发射模式; （3）在电流脉冲期间发射第一个AP的长延迟; （4）由超极化激活的阳离子电流引起的超极化期间没有电压“下垂”（Ih）; 和（5）细胞体相对较小（Chang和Kitai， 1985; 奥唐纳和格蕾丝， 1993; Le Moine和Bloch， 1996; Taverna等人， 2008）。 在整个视场（470 mm）上施加蓝光（0.78 nm）2）将MSN电压钳位在-69 mV的保持电位。 一些MSN表达ChR2，在其体细胞中显示为YFP荧光（图中的箭头） 1C1，C3）。 这种神经元表现出大量的光电流，更明亮的光刺激引起更大的光电流（图 （Figure1D）.1D）。 峰值光电流幅度与光强之间的关系（图 （Figure1E）1E）具有0.054±0.0023 mW / mm的半最大光灵敏度2 最大峰值幅度为1.16±0.16 nA（平均值±sem， n 4）。

在电流钳状态下，表达ChR2的MSN可靠地响应光脉冲序列（10 ms持续时间;图 Figure1F）.1F）。 在这些条件下，光强度大于0.1 mW / mm2 足以唤起AP（图 （Figure1G，1G, n = 5）。 在光刺激频率高达20 Hz时可靠地诱发AP，而在40 Hz时，光诱导的反应总和导致持续的去极化，其在诱发AP方面效果较差（图 1F，G).

D2R-MSN的光刺激驱动局部抑制电路

为了研究D2R-MSNs活性对NAc局部电路的影响，我们在ChR2阴性MSNs中测量突触后反应，同时测量ChR2阴性MSN中的突触后反应（图 （Figure2A）.2A）。 神经元如图所示 Figure2A2A 没有表达ChR2，如EYFP荧光的缺失以及没有像图中所示的短潜伏光电流所表明的那样 Figure1D.1D。 然而，当突触后MSN被保持为-69 mV的电位时，在10±9.0 ms的潜伏期之后，0.42 ms持续时间闪烁引起向外电流（图 （Figure2B，2B, n = 15）。 为了确定这些反应的性质，突触后膜电位在-99 mV至-39 mV之间变化，同时应用闪光（图 （Figure2C）.2C）。 光诱导反应随膜电位而变化（图 （Figure2D，2D, n = 6）并在-81±3.4 mV处反转其极性。 鉴于在我们的离子条件下氯离子的平衡电位为-80 mV，光诱导的外向电流可能是由于突触后GABA介导的氯离子通量。A 受体。 为了测试这种可能性，GABAA 将受体拮抗剂荷包牡丹碱（10μM）加入外部溶液中。 这种药物完全阻断了光诱导的反应（图 （Figure2B），2B），证实光诱导的反应是GABA能抑制性突触后电流（IPSCs）。

基于它们对光刺激的响应，我们记录的MSN可以被分类为4组之一：（1）细胞表达足够量的ChR2以响应光刺激（ChR2 + / AP）激发AP，如上所述; 表达少量ChR2的（2）细胞，其响应于光（ChR2 + / No AP）显示出亚阈值去极化; （3）沉默细胞，其不表达ChR2但接受来自表达ChR2（ChR2- / IPSC）的突触前MSN的光诱导的IPSCs; 和（4）ChR2阴性细胞，其响应于其他MSN（ChR2- / No IPSC）的光刺激而未显示出IPSCs。 图中显示了每个类别中细胞的相对比例 Figure2E2E (n = 53）。 总的来说，将近一半的细胞（45.3％）表达ChR2（组的总和（1）和（2））。 我们记录的MSN中没有一个在光刺激下表现出光电流和IPSCs; 这表明D2R阳性MSN不支配NAc内该相同细胞群的其他成员。

这种对光响应的分类表明，ChR2 + /无AP细胞（组2）和ChR2- /无IPSC细胞（组4）的光刺激不会产生任何可能有助于电路活动的电信号。 因此，为了定义光刺激对电路功能的影响，我们详细描述了ChR2 + / AP MSN（组1）的性质，其在NAc被光刺激时将产生AP，以及ChR2- / IPSC细胞（组3），其中是ChR2 + / AP MSN的突触后因为它们接收光诱导的IPSCs。 NAc中的ChR2 + / AP和ChR2- / IPSC细胞均被鉴定为多刺神经元（图 （Figure3A）.3A）。 在这两组中，神经元的形态学或电生理学特性没有显着差异。 例如，这两组神经元的体系大小相似（图 （Figure3B）.3B）。 此外，他们的RMP（-83.0±1.7对比-85.0±1.8 mV;平均值±sem; n = 10，图 Figure3C）3C）和输入电阻（113±15与133±13MΩ， n = 6，图 Figure3D）3D）也没有什么不同（p > 0.05两尾学生 t- 测试他们的AP发射模式以响应电流脉冲（图 3E，F）也类似（p > 0.05两尾学生 t-测试， n = 6）。 总之，NAc中D2R-MSNs的光刺激激活突触后神经元的局部抑制电路，突触后神经元与D2R-MSN非常相似但不表达D2R。

在可卡因诱导的行为致敏中，NAc D2R-MSN的光遗传学刺激

我们接下来检查了行为的后果 体内 NAc D2R-MSNs的光刺激。 因为背部纹状体中D2R-MSNs的光刺激会降低运动活性（Kravitz等， 2010），我们开始通过表征伏隔核D2R-MSN激活对基础运动活动的影响。 为此目的，将D2R-Cre小鼠双侧注射到NAc（D2-Cre（+）NAc-ChR2）中的DIO-AAV-ChR2-EYFP病毒。 然后用蓝光（2 nm，473 ms脉冲持续时间，5 Hz）通过光纤传递给NAc，对D20R-MSN进行光刺激。 当小鼠被保持在运动活动记录室中时，在3 min会话期间的四个50-min持续时间期间应用光刺激（图 （Figure4A）.4A）。 同时，作为对照，非Cre WT同窝小鼠类似地注射病毒并接受类似的蓝光照射。 与对照D2R-Cre（ - ）NAc-ChR2小鼠相比，D2-Cre（+）NAc-ChR2小鼠显示出相当或略微升高的基础运动活性水平（图 4B，C）。 D2-Cre（+）NAc-ChR2小鼠中D2R-MSNs的光刺激引起运动活性的显着降低，其在光刺激停止后恢复（图 （Figure4B）.4B）。 在对照D2R-Cre（ - ）NAc-ChR2小鼠中没有观察到这种效应（图 4B，C），表明光刺激的效果是由ChR2的激活引起的，而不是可能的非特异性效应，如脑组织的加热。 因此，我们的数据表明，NAN中D2R-MSNs的光刺激引起运动活性的降低。

这些结果确立了我们控制NAc内D2R-MSN活性的能力 体内。 我们接下来使用这种能力来检查D2R-MSN活性对重复给予可卡因的行为致敏的影响。 行为致敏是指允许最初暴露于精神兴奋剂（例如可卡因）以增强后续药物暴露以刺激运动活动的能力的过程。 这个过程可分为初始阶段和表达阶段：起始描述诱发行为致敏的直接神经事件（Vanderschuren和Kalivas， 2000; Sim等人， 2013虽然已知表达是一种长期存在的行为可塑性形式，在停药后仍然存在（Vanderschuren和Kalivas， 2000; Sim等人， 2013）。 因此，我们在反复腹膜内（ip）注射可卡因期间检查了可卡因诱导的行为致敏，同时在这些阶段中使用光遗传学来控制NAc中D2R-MSN的活性。

在3天适应盐水注射后，在15连续几天给小鼠注射可卡因（5 mg / kg），并在每次注射后记录30 min的运动反应（图 （Figure5A）.5A）。 在可卡因注射之前的30最小会话期间递送光刺激，在3最小时段内散布5最小照明时间，其中光被关闭（图 （Figure5A）.5A）。 鉴于NAc中D2R-MSNs的光刺激降低了基础运动活性（图2） （Figure4），4），在施用可卡因之前立即递送光刺激，以避免可能干扰对可卡因注射的行为反应。

对照重复的可卡因注射，对照D2-Cre（ - ）NAc-ChR2小鼠和D2-Cre（+）NAc-ChR2小鼠均表现出明显的运动活性增加（图 （Figure5B），5B），表明致敏的开始。 NAc中D2R-MSN的光刺激似乎不影响行为致敏的开始，因为可卡因诱导的行为致敏在D2-Cre（+）NAc-ChR2小鼠和对照D2-Cre（ - ）NAc-ChR2小鼠中相似。

通过在15天重复注射可卡因（5 mg / kg）诱导行为致敏后，将药物撤销14天，并通过用较低剂量的可卡因（10 mg）攻击小鼠来检查致敏表达程度。 /公斤）。 致敏表达是一种持久的行为可塑性形式，在停药后仍然存在（Steketee和Kalivas， 2011; Sim等人， 2013）。 为了检查D2R-MSNs在致敏表达中的作用，在给予可卡因之前立即对NAc进行了光刺激（图 （Figure5A）5A）和致敏作用是由可卡因注射诱导的运动活动量。

在可卡因预处理的小鼠组中--D2-Cre（ - ）NAc-ChR2小鼠（D2-Cre（ - ）:: coc-coc）和D2-Cre（+）NAc-ChR2（D2-Cre（+）： ：coc-coc） - 致敏表达发生（图 （Figure5C）.5C）。 可卡因刺激的运动变化的时间过程在两组之间也相似（图 （Figure5C），5C），两组之间没有观察到显着差异。 总之，这两个光刺激实验表明，NAc中D2R-MSN的激活不影响可卡因诱导的行为致敏的起始或表达。

药物戒断期间NAc D2R-MSNs的光刺激

反复吸入可卡因后停药期间的慢性应激导致D2R依赖性适应机制的选择性募集，该机制控制应激诱导的可卡因寻找和复发行为的增加以及NAc中突触可塑性的变化（Sim等， 2013）。 这表明戒毒所涉及的机制不同于涉及药物致敏的机制。 因此，我们接下来检查了可卡因戒断过程中NAc中D2R-MSNs的光刺激是否会影响可卡因诱导的行为致敏的表达。

通过如上重复注射可卡因诱导行为致敏后，将D2-Cre（ - ）和D2-Cre（+）小鼠细分为两组，用于14天停药期：一组每天进行蓝光刺激。 NAC为1 h（3 min×8次），而另一组则不是（图 （Figure6A）.6A）。 在可卡因戒断过程中对NAc中D2R-MSNs的反复光刺激不影响D2-Cre（ - ）:: coc-coc小鼠的致敏表达（图 （Figure6B）.6B）。 相比之下，在D2-Cre（+）:: coc-coc小鼠中，通过在停药期间重复的光刺激显着减弱了致敏的表达（图 （Figure6B），6B虽然可卡因诱导的运动刺激的时间过程没有受到影响（图 （Figure6C）.6C）。 因此，药物戒断期间NAc的D2R-MSNs的光刺激减少了可卡因诱导的行为致敏的表达（可卡因×光刺激相互作用） F(1,18) = 11.08， P = 0.0037，图 Figure6B）.6B）。 这些数据表明，在停药期间D2R-NAc MSN的激活会影响可卡因寻求和复发行为。

讨论

大量证据表明，可卡因诱导的行为致敏与包括腹侧被盖区，前额叶皮质和伏隔核（NAc）在内的中脑皮层系统中增强的多巴胺能传递有关。 特别是，行为致敏的表达阶段的特征是停止药物后持续的药物过度反应，这与一系列适应机制有关（Kalivas和Duffy， 1990; 罗宾逊和贝里奇， 1993; Kalivas等人， 1998）这可能导致强迫性药物渴望（罗宾逊和贝里奇， 1993; Kalivas等人， 1998; Steketee和Kalivas， 2011）。 有人提出，可卡因诱导的NAc内分子，细胞和行为可塑性的改变，与MSNs中的DA受体信号传导相关，可以调节药物介导的成瘾行为（Lobo等， 2010; 施密特和皮尔斯， 2010; Ferguson等人， 2011; Pascoli等人， 2011; Bocklisch等人， 2013; Grueter等人， 2013).

最近使用有​​条件表达Cre重组酶的基因工程小鼠的研究揭示了D1R-MSNs或D2R-MSNs在可卡因成瘾行为中的作用。 在重复使用可卡因1天后，NAc的D6R-MSN的光遗传激活增加了运动活性，而D2R-MSN的激活据报道没有效果（Lobo等， 2010）。 这些数据表明，反复接触可卡因可增强NAc的D1R-MSN的输出。 用破伤风毒素抑制表达D1R的MSN（Hikida等， 2010）减少可卡因条件性位置偏爱（CPP），而在D2R-MSNs中消除突触传递后未观察到可卡因CPP的改变（Hikida等， 2010）。 背侧纹状体中D1R-MSNs的光遗传激活诱导持续增强，而刺激表达D2受体的神经元诱导短暂的惩罚（Kravitz等， 2012）。 最近的一项研究还报道，通过化学方法抑制D2R-MSNs增强了获得可卡因的动机，而D2R-MSNs的光遗传激活抑制了可卡因自我给药（Bock等， 2013）。 另一方面，Bocklisch等人。 （2013）报道NAc的D1R-MSNs投射到VTA，特别是VTA内的GABAergic神经元，而D2R-MSNs不直接投射到VTA。 该电路意味着D1R-MSNs的光遗传激活会抑制DA神经元，最终会增强可卡因诱导的成瘾行为（Bocklisch等， 2013).

尽管这两个MSN群体的组织看似简单，但MSN接收多个输入并具有与其他大脑区域不同的输出，以及在MSN和其他类型的中间神经元之间形成局部电路的事实，由此产生的D1R-的输出MSN和D2R-MSN可以产生复杂且不同的分子，细胞和行为后果。

以前已经证明，D2R有助于药物戒断过程中诱导的突触修饰，这些可以增强对可卡因寻求的复发，而不影响最初的药物获取或寻求药物（Sim等， 2013）。 我们目前的数据表明，NAN中D2R-MSNs的光刺激引起基础运动活性的降低。 Lobo等人。 （2010）当MSN亚型被激活时，检测到运动没有变化，但是他们只检查总运动活动而不是检查基础运动活动对光刺激的即时反应。 Kravitz等。 （2010）还发现D2R-MSNs在背侧纹状体中的光遗传学活化也降低了运动活性。 因此，我们的数据首次证明基因运动活动受到NAc的D2R-MSNs的光刺激的抑制，并且首先系统地检查这些神经元的光刺激期间基础运动活动的时间过程。

在本研究中，我们观察到NAc中D2R-MSN的光遗传激活不影响行为致敏的起始或表达。 然而，在药物戒断期间对D2R-MSN的光刺激减弱了可卡因诱导的致敏的表达。 因此，我们的数据表明D2R-MSN在撤回期间特异性地招募一些信号，其继续改变基因表达或其他形式的信号传导，从而触发突触可塑性的改变，导致可卡因诱导的行为致敏的改变。 这些MSN如何采用能够在成瘾相关行为中产生明显后果的细胞类特异性适应性尚不清楚。 格鲁特等人。 （2013）表明NAc中的ΔFosB以细胞类型和亚区特异性方式差异调节突触特性和奖赏相关行为。 最近，钱德拉等人。 （2013据报道，重复的ChR2激活D1R-MSNs而不是D2R-MSNs导致Tiam1基因的下调，这是一种参与肌动蛋白细胞骨架重排的蛋白质，类似于可卡因的作用。 因此，为了理解产生药物诱导行为的持久影响的机制，描绘细胞选择性诱导这些MSN中的分子事件将是重要的，所述MSN控制对重复药物暴露的突触适应。

与重复药物暴露相关，已经建议戒断起重要作用，因为在最终暴露于可卡因后仅几周就会出现一些变化。 这表明禁欲是可塑性发展的重要中介（罗宾逊和贝里奇， 2003; Boudreau和Wolf， 2005; Boudreau等人， 2007; Kourrich等人， 2007）。 这些观察结果提出了戒断本身可能是NAc变化的触发因素，这些变化受D2R依赖性信号传导的控制。 我们的结果显示，在药物戒断期间激活NAN中的D2R-MSN会影响可卡因诱导的行为致敏，这为这一想法提供了强有力的支持。

先前已经表明，在药物戒断期间反复接触压力会抑制D2R KO小鼠中可卡因诱导的行为致敏以及可卡因寻求和复发行为的表达（Sim等， 2013）。 因此有趣的是，在药物戒断期间D2R-MSN的光刺激也减弱了致敏的表达。 应用诱导的谷氨酸能突触的突触可塑性在D2R KO小鼠的NAc中发生改变（Sim等， 2013）。 虽然尚不清楚D2R MSN的光刺激或撤退期间的慢性应激是否引起突触可塑性的类似改变，但我们目前的研究结果支持NAN的D2R-MSNs在退缩诱导的可塑性中起关键作用的假设，并且可能有助于停止滥用药物后复发。 需要进一步研究以找出D2R MSN在药物戒断期间参与的功能性神经回路，并分析和比较D2R-MSNs光刺激和慢性应激对该特定回路中突触可塑性的影响。

表达D2R的MSN的另一个可能的作用可能是抑制来自NAc的D1R-MSN的输出。 先前的研究表明，尽管MSN将长轴突投射到远端目标，但是轴突侧枝与相邻多刺投射神经元的树突树之间发生了广泛的重叠（Grofová， 1975; 普雷斯顿等人， 1980; 威尔逊和格罗夫斯， 1980）。 这可以指示NAc内MSN的可能的本地突触连接。 来自成对的多刺投射神经元的细胞内记录已经确定了大鼠纹状体中MSN之间的功能抑制性连接（Czubayko和Plenz， 2002; Tunstall等人， 2002; Koos等人， 2004; Gustafson等人， 2006）。 据报道，由纹状体中MSN的复发侧支轴突形成的突触不是随机的，D2R-MSN与其他D2R-MSN和D1R-MSNs形成突触连接，而D1R-MSN几乎完全形成与其他突触连接的突触连接。 D1R-MSNs（Taverna等， 2008）。 尽管已经报道了由累积MSN之间的局部复发性轴索侧枝的GABAergic互连（Taverna等， 2004），目前尚不清楚D2R-MSN是否随机形成局部微电路，或者它们是否与NA中的微电路有关，优先连接在纹状体中。 我们的数据表明，表达ChR2的NAc中的D2R-MSN与表达D1R的相邻MSN形成突触连接，然后D2R-MSN对D1-MSNs施加抑制性接触以调节D1R介导的成瘾行为的促进。

总之，我们已经证明NAc D2R-MSN的光遗传学激活改变了可卡因成瘾期间发生的戒断诱导的可塑性。 鉴于在撤回期间D2R依赖性信号传导的活性似乎是可卡因诱导的行为致敏表达的关键调节因子，我们提出D2R-MSNs是长期适应寻求药物和复发的重要介质。 鉴定D2R依赖性信号传导的分子底物，以及在重复药物暴露下使用的NAc D2R-MSN的特异性电路的鉴定，应该为药物复发的治疗干预提供新的靶标。

利益冲突声明

作者声明，研究是在没有任何可被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）资助，由科学，信息通信技术和未来规划科学研究计划资助（Ja-Hyun Baik;资助编号2013M3C7A1056101）和生物医学技术开发计划（Ja-Hyun Baik;资助编号2013M3A9D5072550）和由科学，ICT和未来规划部资助的韩国国家研究基金会（NRF）的世界级研究所（WCI）计划（致George J. Augustine） ; WCI 2009-003），以及韩国大学格兰特（Ja-Hyun Baik）和新加坡国家研究基金会（致George J. Augustine）的CRP资助。

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