基底神经节功能障碍导致肥胖症的身体不活动（2016）

可在网上29月2016

亮点

•肥胖与缺乏身体活动有关

•肥胖小鼠的纹状体D2R结合较少，这可能解释了它们的不活动性

•恢复G._i iMSNs中的信号传导拯救了肥胖小鼠的体力活动水平

•身体不活动比体重增加更重要

总结

肥胖与身体不活动有关，这加剧了体重增加的健康后果。然而，调解这种关联的机制是未知的。我们假设多巴胺信号传导的缺陷导致肥胖症的身体不活动。为了研究这一点，我们量化了瘦和肥胖小鼠中多巴胺信号传导的多个方面。我们发现D2型受体（D2R）在纹状体中的结合，但不是D1型受体结合或多巴胺水平，在肥胖小鼠中减少。从纹状体中型多刺神经元基因上去除D2R足以减少瘦小鼠的运动活动，而恢复G_i 这些神经元中的信号传导增加了肥胖小鼠的活性。令人惊讶的是，尽管具有低D2R的小鼠活性较低，但它们比对照小鼠更不易受饮食诱导的体重增加的影响。我们得出结论，纹状体D2R信号传导的缺陷导致肥胖症的身体不活动，但是不活动比肥胖的原因更重要。

图形概要

图选项

关键词

肥胖;
多巴胺;
体力活动;
行使;
D2;
纹状体;
肥胖;
减肥

介绍

肥胖与缺乏身体活动有关（布朗森等，2005 和 Ekkekakis等，2016），它加重了II型糖尿病和心血管疾病的负面健康影响（de Rezende等人，2014年和 Sharma等人，2015年）。这种关联的基础机制尚不清楚，这一事实反映在缺乏改变肥胖人群体力活动水平的有效干预措施上（Ekkekakis等，2016）。有趣的是，肥胖与纹状体多巴胺（DA）信号的改变有关，这导致肥胖的奖赏功能障碍的假设（Blum等人，2011年, 肯尼，2011 和 Volkow和Wise，2005）。尽管纹状体DA与运动输出密切相关，但很少有研究调查饮食诱导的多巴胺能改变如何导致身体不活动。我们假设纹状体DA信号传导在肥胖症中受损并且这导致身体不活动。了解身体不活动的生物学原因可能会导致有效的干预措施，以增加肥胖个体的活动，从而改善健康状况。

纹状体DA严重参与运动控制。这在帕金森病等运动障碍中很明显，帕金森病的特点是中脑多巴胺能神经元死亡，导致纹状体DA丢失（Hornykiewicz，2010）。由DA调制的两组纹状体投射神经元被称为直接和间接途径中型多刺神经元（dMSN和iMSN）（Alexander和Crutcher，1990, 德龙，1990 和 Gerfen等，1990）。 dMSN表达G_s- 耦合D1受体（D1R）并投射到苍白球和苍白球的内部区域，而iMSN表达G_i-Doupled D2R并投射到苍白球（GPe）的外部部分（Gerfen等，1990, Le Moine和Bloch，1995 和 Levey等，1993）。从iMSN遗传消除D2R，或iMSN的光遗传学刺激，足以减少运动（Kravitz等，2010 和 Lemos等人，2016年）。基于D2R功能障碍与肥胖之间的联系，我们假设肥胖动物改变了iMSN输出，导致身体不活动。

在这里，我们检查了精益和饮食诱导的肥胖小鼠中DA信号传导的多个方面。 D2R结合在肥胖小鼠中减少，而D1R结合和细胞外DA水平保持不变。肥胖小鼠也表现出纹状体射击的破坏并且运动减少。从iMSN基因上消除D2R降低了瘦小鼠的活动，同时恢复了G_i iMSNs中的信号传导增加了肥胖小鼠的活动。这些结果证实iMSN中的D2R信号传导可以双向调节身体活动。然后我们询问具有低D2R信号传导的小鼠是否由于其低活性而更容易在高脂肪饮食中体重增加。为此，我们检测了小鼠以及遗传消除纹状体D2R的小鼠中D2R结合的自然变异的体重增加。尽管具有低水平D2R的小鼠具有低水平的身体活动，但是它们以与具有完整D2R的小鼠相同的速率增加体重。这反对身体活动和体重增加之间的强烈因果关系。我们得出结论，D2R信号传导的损伤导致肥胖的身体不活动，但不活动并不一定导致体重增加。

成果

饮食诱导的肥胖与身体不活动有关

C57BL6 / J雄性小鼠（3-4个月）用标准食物（瘦，n = 8）或高脂饮食（肥胖，n = 8）喂养18周（图S1一种）。从第2周开始一直持续到第18周，肥胖小鼠的体重和脂肪量明显高于瘦小鼠（p <0.0001；数字1A和 S1B）。精益质量没有显着改变（图S1C）。我们每隔2周测量一次活动水平，持续18周（Ethovision； Noldus Information Technologies）。从第4周开始一直持续到第18周，肥胖小鼠的活动低于瘦小鼠（p <0.0001；数字1B和1C）。在第18周，肥胖小鼠的运动时间较少（p = 0.005），运动的时间较少（p = 0.0003），运动时的速度较慢（p = 0.0002; 图1D）相对于瘦小鼠。饲养和梳理没有显着改变（图1D）。肥胖的小鼠在使用家用笼式滚轮时的跑动也少于瘦小鼠（p = 0.0005；图1E）。我们测试了运动缺陷是否与肥胖组的体重增加相关。虽然体重增加与高脂肪饮食的热量摄入相关（图1F），它与开放场地中的运动水平或高脂肪饮食期间消耗的能量无关（数字1G和1H）。有趣的是，当我们在实验的第一周检查食物摄入量时，这些相关性仍然存在（数字1I-1K），表明高脂肪饮食摄入的初始水平（但不是运动或能量消耗）可预测后期体重增加。

图1。

慢性高脂饮食导致身体不适应

（A）喂养高脂肪饮食的小鼠比从2周开始喂养标准食物的小鼠重量更多并持续到18周（F）_(18,252) = 62.43，p <0.0001）。

（B和C）（B）开放野外活动的示例性轨迹图，显示（C）肥胖小鼠与瘦小鼠相比，在4周开始并且持续至18周（F），其体力活动减少。_(10,140) = 4.83，p <0.0001）。

（D）高脂饮食18周后，肥胖小鼠的运动时间减少了（t₍₁₄₎ = 3.32，p = 0.005），运动频率降低（t₍₁₄₎ = 4.74，p = 0.0003），移动时速度降低（t₍₁₄₎ = 4.69，p = 0.0002）。肥胖小鼠也表现出饲养减少的趋势（p = 0.07）。

（E）当在家笼中使用跑轮时，肥胖小鼠相对于瘦小鼠的轮转较少（t₍₁₄₎ = 4.55，p = 0.0005）。

（F–H）在实验过程中，总体重增加与（F）能量摄入显着相关（r = 0.74，p = 0.04），但与（G）能量消耗无关（r = 0.52，p = 0.19）也不是（H）开场速度（r = 0.19，p = 0.65）。

（IK）总体重增加与（I）第一周的平均能量摄入量（r = 0.88，p = 0.004）显着相关，但与（J）能量消耗（r = -0.19，p = 0.66）却不相关。，也不是（K）开场速度（r = 0.36，p = 0.38）。

统计分析。（A和C）双向重复测量ANOVA，然后使用Benjamini-Hochberg错误发现率进行事后t检验; （D和E）未配对的学生t检验; （F-H）线性回归; ^*p <0.05， ^**p <0.01， ^***相对于瘦肉，p ＜0.0001。（IK）线性回归； ^***与瘦小鼠相比，p <0.001。

图选项

肥胖与多巴胺D2R结合的减少有关

为了确定身体不活动的潜在机制，我们量化了瘦和肥胖小鼠中DA信号传导的多个方面。与啮齿动物的先前报道一致，D2R样受体结合（通过放射自显影与 ³与肥胖小鼠相比，肥胖小鼠中的H-哌隆（以下称为D2R结合）更低（p <0.0001；数字2A和2B），这一发现在所有三个纹状体细分中均显着（背囊：p = 0.004；背外侧：p <0.0001；腹侧：p <0.001；腹侧：p <XNUMX；数字S2A和S2B）。然而，在瘦或肥胖组中，D2R的结合与体脂无关（两者均p> 0.55； p> XNUMX）。图2C），提示尽管D2R结合和脂肪储存都被慢性高脂肪饮食改变，但这些变量可能彼此之间不存在因果关系。

图2。

高脂饮食受损的纹状体多巴胺D2R结合

（A）通过测量的纹状体D2R结合的图像 ³H-spiperone放射自显影。

（B）相对于瘦小鼠，纹状体D2R结合在肥胖中降低（t₍₂₅₎ = 5.02，p <0.0001）。

（C）在瘦（p = 2）或肥胖的小鼠（p = 0.95）中，纹状体D0.56R结合与体脂百分比不相关。

（D-F）（D）纹状体D1R结合（t₍₂₄₎ = 1.31，p = 0.20），（E）多巴胺总含量（DA; t₍₁₃₎ = 0.85，p = 0.41）和（F）酪氨酸羟化酶（TH）密度（t₍₁₄₎ = 0.48，p = 0.64）在饮食组之间没有差异。

统计分析。个别小鼠的平均值； n = 8-19只小鼠/组；学生t检验（B和D–F）或线性回归（C）； ^*p ＜0.01。

图选项

我们试图确定肥胖介导的D2R结合减少的机制。为此，我们寻找差异 Drd2 mRNA（通过原位杂交），发现在所有三个纹状体细分中均未改变（背体：p = 0.92；背外侧：p = 0.90；腹侧：p = 0.34；图S2C）。我们进行了蛋白质印迹以定量总D2R蛋白水平，并注意到50-kDa或70-kDa条带没有变化，认为代表了D2R的不同糖基化状态（p> 0.95，数字S2D和S2E）（约翰逊和肯尼，2010）。最后，我们评估了瘦小鼠和肥胖小鼠代谢功能障碍的标志物，看看它们是否与之前报道的D2R降低有关（Dunn等人，2012年）。肥胖小鼠具有较高的空腹胆固醇（p <0.0001），瘦素（p <0.0001），葡萄糖（p = 0.0002），胰岛素（p = 0.001）和基于抵抗力的稳态模型评估（HOMA-IR）（p <0.001），但不包括甘油三酸酯或游离脂肪酸（数字S1d-S1J）。然而，这些因素中没有一个与肥胖小鼠中的D2R结合相关（数据未显示）。

D1R样结合（通过放射自显影与 ³H-SCH23390（此后称为D1R结合）在肥胖和瘦小鼠之间没有差异（p = 0.20； p = XNUMX）。图2D）。通过纹状体组织冲头的高效液相色谱（HPLC）测量，纹状体DA含量也没有差异（p = 0.41; 图2E）或酪氨酸羟化酶免疫标记（p = 0.64; 图2F）。鉴于肥胖小鼠基础DA差异的多种报道（Carlin等人，2013年, 戴维斯等人，2008年, Vucetic等，2012 和 Wang等，2014），我们使用无净通量微透析（新小鼠，每组n = 6）进一步探讨了这一点。我们再次观察到细胞外DA（p = 0.99）或其两种代谢物3,4-二羟基苯基乙酸（DOPAC）（p = 0.85）和高香草酸（HVA）（p = 0.68，图S3），用这种方法，表明在这些实验中肥胖与细胞外DA调的减少无关。

运动相关的纹状体射击在肥胖小鼠中被破坏

我们进行了体内电生理学，以研究减少的纹状体D2R结合如何改变纹状体神经元输出，从而有助于运动的减少。我们从瘦和肥胖小鼠的背侧纹状体记录（每组n = 3只小鼠，组织学图3F）。尽管肥胖小鼠的整体移动速度较慢，但这些组之间的执行运动速度没有差异（p = 0.55； p = XNUMX）。图3A），让我们比较瘦和肥胖小鼠之间与运动有关的放电。瘦小鼠和肥胖小鼠的基础多单位增高率没有差异（瘦小鼠为2.1±0.4 Hz；肥胖小鼠为2.0±0.7 Hz； p = 0.93）。但是，运动激活的单元（图3B）在肥胖小鼠中显着降低（p <0.0001; 图3C）。这不依赖于我们对“运动激活”单位的统计定义，因为我们还观察到肥胖和瘦小鼠中所有记录单位的平均响应周围运动的尖峰减少（ANOVA相互作用，p <0.0002；数字3D和3E）。我们得出结论，纹状体中的总尖峰率没有差异，但是在肥胖小鼠中，运动周围的尖峰的组织被破坏。

图3。

在肥胖小鼠中，纹状体中与运动相关的射击被破坏

（A）运动事件在瘦和肥胖小鼠中具有相似的速度。

（B）纹状体神经元中运动激活和非响应激发的实例。

（C）在肥胖小鼠中，运动激活神经元的患病率较低（p = 0.002）。

（D）所有记录的神经元的平均运动相关的发射。

（E）运动相关的射击在饮食暴露后显着降低（饮食×运动相互作用，F_(1,171) = 14.77，p <0.0002）。

（F）示意图（改编自富兰克林和Paxinos，1997）说明在瘦瘦的肥胖小鼠（每只n = 3）中的电极阵列位置。

统计分析。（C）Fisher精确检验。（D和E）双向重复测量方差分析。

图选项

抑制肥胖小鼠iMSN输出恢复活动水平

为了测试减少iMSN的输出是否会增加肥胖小鼠的运动，我们使用Cre重组酶（Cre）依赖策略来表达抑制性G_i- 在肥胖小鼠的iMSNs中由设计药物（KOR-DREADD）专门激活的偶联修饰的κ阿片受体设计者受体（图4一个）。虽然腺苷2A受体Cre（A2A-Cre）小鼠先前已经过免疫染色验证，证明Cre表达对纹状体iMSN具有特异性（Cui等，2013 和 Lemos等人，2016年），我们使用双荧光原位杂交技术对该品系进行了额外的验证。几乎所有神经元（计数的98.7个神经元中的0.6％±1,301％）都表达了 CRE 和 Drd2 mRNA，但很少（1.3％±0.6％）表达 CRE or Drd2 mRNA，但不是两者，证实A2A-Cre系列忠实地靶向iMSNs（图S4).

图4。

DREADD介导的肥胖小鼠iMSN恢复体力活动的抑制作用

（A）KOR-DREADD表达的照片和示意图（改编自富兰克林和Paxinos，1997）说明A2A-Cre小鼠中所有KOR-DREADD的病毒注射部位; 不透明度表示在给定位置表达病毒的小鼠数。

（B）与DMSO相比，当注射SalB时，肥胖小鼠移动得更多（t₍₇₎ = 3.056，p = 0.02）。

（C-G）在施用SalB后，相对于施用DMSO时，肥胖小鼠显示（C）运动频率，（D）平均运动持续时间和（E）运动速度的非显着变化。（F）Sal-B给药增加了饲养频率（t₍₇₎ = 3.116，p = 0.02），但（G）并未显着改变修饰频率。

（H）与DMSO相比，当注射SalB时，瘦小鼠移动得更多（t₍₉₎ = 3.3，p = 0.01）。

（I）SalB不会影响未表达KOR-DREADD的野生型小鼠的运动（p = 0.77）。

统计分析。（B–I）配对学生的t检验；个别小鼠的意思; n = 6-10只小鼠/组。

图选项

注射KOR-DREADD激动剂salvinorin-B（SalB）可增加表达KOR-DREADD的肥胖小鼠的行进距离（p = 0.02；图4B）。 SalB也增加了饲养频率（p = 0.02；图4F）并引起频率增加的趋势（t₍₇₎ = 1.64，p = 0.12），而不是运动的持续时间或速度（数字4C–4E）。 SalB的注射也增加了瘦小鼠的运动（p = 0.01; 图4H），但在不表达KOR-DREADD的野生型小鼠中则没有（p = 0.73; 图4一世）。我们得出结论，减少iMSN的输出足以增加瘦动物和肥胖动物的运动水平。

较低的D2R水平不会使动物易于获得未来的体重增加

最后，我们检查了D2R信号传导中预先存在的差异是否可能使个体小鼠易患饮食诱导的肥胖症。为了解决这个问题，我们进行了微正电子发射断层扫描（micro-PET） ¹⁸F-fallypride确定高脂饮食暴露前的基线D2R可用性（图5一个）。我们注意到D2R在小鼠中的结合潜力存在高水平的差异，正如其他人所表明的那样（Constantinescu等人，2011年）。 D2R可用性的个体差异与开放区域的运动呈正相关（p = 0.045；图5B），与D2R在运动中的作用一致。经过微型PET扫描后，将动物维持高脂饮食18周，以测试低D2Rs的小鼠是否更容易因饮食引起的体重增加。令人惊讶的是，我们发现了一种趋势积极在整个实验中，初始D2R可用性与体重增加之间的关系（p = 0.10；图5C）。虽然这种相关性并不显着，但它认为低D2R可用性或低物理不活动使动物更容易受到体重增加的假设。这也与我们的研究结果一致，即整个实验中的基底开放场活动和开放场活动都与体重增加无关（数字1F-1K）。

图5。

基础D2R绑定未预测未来的体重增加

（A）使用的纹状体和小脑中的D2R微PET可用性曲线的实例 ¹⁸F-fallypride。

（B和C）（B）与基础开放视野运动相关的结合电位（r = 0.56，p = 0.045），（C）与高脂饮食诱导的体重增加呈正相关（r = 0.50，p = 0.10，n = 12–14只小鼠）。

（D）具有完整D2R（上图）和iMSN-的小鼠中具有代表性的D2R放射自显影Drd2-KO小鼠（下）。

（E和F）（E）iMSN-Drd2-KO小鼠在露天场地的体力活动减少（t₍₈₎ = 2.99，p = 0.02）和（F）在家用笼轮上（p = 0.01，n = 5-19只小鼠/组）。

（G）iMSN-Drd2-KO老鼠和 Drd2-floxed同窝对照在高脂肪饮食中获得相似的体重（F_(5,70) = 1.417，p = 0.23； n = 6-10只小鼠/组）。

（H–J）（H）iMSN-D0.60R-KO之间的标准化能量摄入（p = 0.47），（I）能量消耗（p = 0.17）或（J）RER（p = 2）没有显着差异。小鼠和同窝对照。

统计分析。（B和C）线性回归; （E，F和H-J）未配对的学生t检验; （G）双向重复测量方差分析， ^*p ＜0.05。

图选项

为了进一步探索预先存在的活动水平差异和体重增加之间的关系，我们利用遗传小鼠模型，有针对性地删除 Drd2 来自iMSNs的基因（iMSN-Drd2-KO）但保留了其他细胞类型的表达（ Dobbs等人，2016年和 Lemos等人，2016年）。如前所述，iMSN-Drd2-KO小鼠在开放视野中的移动少于同窝仔对照（p = 0.02; 图5E）和家用笼式滚轮（p = 0.01; 图5F）。与上述实验一致，iMSN-Drd2放高脂饮食时，-KO小鼠的体重没有增加超过其同窝仔对照的重量（p = 0.23；图5G）。为了更仔细地检查它们的能量利用率，我们进行了间接量热实验来比较iMSN-Drd2-KO小鼠同窝对照。我们没有发现能量摄入（p = 0.60），能量消耗（p = 0.47）或呼吸交换率（RER）（CO比₂ 生产到O.₂ 消费[VCO₂/ VO₂]，p = 0.17）在iMSN-Drd2-KO小鼠及其同窝对照之间，表明IMSN-Drd2-KO小鼠运动的减少并未转化为能量利用的变化（数字5H-5J）。最后，我们探讨了纹状体D2R的较小减少（例如在我们的肥胖小鼠中观察到的那些）可以调节运动和体重增加的程度。为此，我们使用鼠标线导致纹状体30％-40％减少 Drd2 mRNA（iMSN-Drd2-Het）（ Lemos等人，2016年）。这些小鼠还表现出运动减少，表明D2R的部分敲低足以产生运动缺陷（p = 0.04； p = XNUMX； p = XNUMX）。图S5一种）。与iMSN-Drd2-KO小鼠相似，iMSN-Drd2-het小鼠对高脂饮食诱导的体重增加并不更敏感（p = 0.89; 图S5B）。我们得出结论，纹状体D2R的改变足以改变小鼠的运动，但不能改变热量平衡或体重。

讨论

肥胖与身体不活动有关，通常认为这会导致体重增加。此外，假设肥胖增加导致肥胖人群的活动水平低（Ekkekakis和Lind，2006 和 Westerterp，1999），虽然这个想法很难直接测试。有趣的是，通过饮食减肥的人（de Boer等，1986, de Groot等，1989, 马丁等人，2007年和雷德曼等，2009）或减肥手术（Berglind等，2015, Berglind等，2016, 邦德等人，2010年和拉米雷斯·马雷罗（Ramirez-Marrero）等人，2014年) 不要增加他们的活动水平，反对肥胖的重量导致他们的不活动。在这里，我们调查了饮食诱导的肥胖症通过纹状体DA传播缺陷导致身体不活动的假设。与以前的工作一致，我们发现慢性高脂饮食会降低纹状体D2R的结合（Hajnal等，2008, Huang等，2006, Narayanaswami等，2013, van de Giessen等人，2012年和 van de Giessen等人，2013年）。我们还观察到肥胖小鼠中运动相关的纹状体神经元放电缺陷。用G抑制iMSN_i-dsoupled DREADD在肥胖小鼠中获救，证明当基底神经节输出恢复时，肥胖过度的小鼠可以正常运动. 然而，令人惊讶的是，基础D2R测量和体力活动都没有与体重增加相关，这是我们在多个实验中观察到的一点。这与大鼠的研究形成对比，这可能反映了物种或实验差异（Michaelides等，2012）。我们得出结论，D2R的减少和随后的身体不活动是肥胖的结果，但不一定与小鼠体重进一步增加有因果关系。

改变的D2R信号传导和肥胖之间的联系首先在人类中被发现并且最初被其他人复制（de Weijer等，2011, 凯斯勒（Kessler）等人，2014年, Volkow等，2008 和 Wang等，2001）。然而，最近的工作使这一发现受到质疑（卡拉瓦乔等人，2015年, Cosgrove等人，2015年, Dunn等人，2012年, 郭等人，2014, Karlsson等人，2015年, Karlsson等人，2016年, 斯蒂尔等人，2010年和 Tuominen等人，2015年). 虽然需要进一步的研究来了解临床研究中观察到的差异，但它们可能反映了临床研究和PET成像所固有的复杂性。例如，许多研究中使用的放射性配体raclopride可被内源性DA置换，因此基础DA基调的差异会影响结合。 (Horstmann等人，2015年）。此外，D2R水平与肥胖之间的关系可能是非线性的，因此D2R的变化可能在肥胖水平不同的患者中发生不同（Horstmann等人，2015年）。最后，睡眠持续时间等因素（Wiers等，2016）和咖啡因摄入量（Volkow等，2015）也可以影响D2R结合，并且在大多数临床研究中不报告或控制。这些变异来源可以在动物研究中得到缓解，这些研究描绘了D2R mRNA减少的一致情况（Mathes等人，2010年和 Zhang等，2015），蛋白质（亚当斯等人，2015年和约翰逊和肯尼，2010）和受体结合（Hajnal等，2008, Huang等，2006, Narayanaswami等，2013, van de Giessen等人，2012年和 van de Giessen等人，2013年）在肥胖的啮齿动物中。我们的工作通过报告肥胖小鼠的DA信号传导的其他方面保持不变来扩展这一文献，甚至是那些D2R减少的小鼠。另外，鉴于我们观察到D2R结合的减少 ³H-spiperone，但总D2R蛋白质没有变化 Drd2 mRNA，我们认为D2R的改变可能涉及翻译后的变化，如受体内化。 虽然我们的数据表明减少D2R结合足以减少肥胖中的身体活动，但身体活动受许多因素影响，包括遗传和环境 ( 鲍曼等人，2012年）。我们认为D2R不太可能是与肥胖症中缺乏身体活动相关的唯一神经系统改变。例如，生长素释放肽，瘦蛋白和胰岛素等循环激素的变化会对多巴胺能神经元起作用，并可能影响活动（Murray等人，2014年）。最后，尽管我们没有观察到D1R的变化，但我们不能排除直接途径神经元的神经元放电变化，这也可能影响身体活动。

尚不清楚D2R可用性的变化是否会使个体体重增加。人类与 Drd2 Taq1A等位基因降低了D2R的可用性并增加了肥胖的风险（ Blum等人，1996年, Carpenter等，2013, Noble等，1991, Stice等，2008 和汤普森（Thompson）等人，1997年）。此外，全球缺失D2R的小鼠更容易在高脂肪饮食中增加体重，这归因于缺乏身体活动（Beeler等，2015）。相反，纹状体D2R中的个体变异（天然或遗传诱导）与我们研究中的活动水平相关，但都与体重增加无关。我们的研究中一个重要的区别是我们的遗传模型仅从iMSN中删除了D2R。此外，仔细测量食物摄入量和能量消耗显示，操纵这些神经元上的D2R并未改变能量平衡。因此，证明全球D2R功能与能量平衡之间联系的研究可能正在观察D2R对其他细胞类型的影响。我们的实验支持这样的结论：身体不活动是肥胖的结果，但其本身不足以引起体重变化。

尽管有越来越多的证据表明身体活动与心血管健康的改善和其他几种慢性疾病的风险降低有关，但肥胖个体的身体活动仍然很低（Ekkekakis等，2016）。缺乏对增加身体活动水平的有效干预反映在缺乏对肥胖个体的身体不活动的细胞和分子机制的理解上。在这里，我们将身体不活动与基底神经节功能的变化联系起来，为肥胖个体缺乏身体活动提供生物学解释。

实验步骤

主题和饮食

在所有研究中，将小鼠单独饲养在标准条件下（光照/黑暗周期为12小时，21–22°C），可以随意获取食物和水。向小鼠提供标准的日常饮食（5001啮齿类动物饮食； 3.00 kcal / g，其中29％的能量来自蛋白质，13％的脂肪和56％的碳水化合物； LabDiet）或高脂饮食（D12492； 5.24 kcal / g， 20％的能量来自蛋白质，60％的脂肪和20％的碳水化合物； Research Diets）。所有程序均按照国家糖尿病与消化及肾脏疾病研究所动物护理和使用委员会的指导进行。

转基因条件敲除iMSN-Drd2-KO小鼠通过交叉表达Cre的小鼠产生，所述小鼠由腺苷2A受体基因的调节元件驱动（Adora2a）（B6.FVB（Cg）-Tg（Adora2a-Cre）KG139Gsat / Mmucd; GENSAT; 036158-UCD）携带条件的小鼠 Drd2 无效等位基因B6.129S4（FVB） - Drd2^{tm1.1Mrub / J}，JAX020631（贝洛（Bello）等人，2011年).

身体成分和能量消耗计算

每隔一周使用测量身体组成 ¹H-NMR光谱（EchoMRI-100H; Echo Medical Systems）。能源支出使用能量平衡计算确定（郭等人，2009 和 Ravussin等，2013):

Energyexpenditure = Metabolizableenergyintake-（Δfatmass+Δfat-freemass）。

打开MathJax

开场活动

在PhenoTyper笼子（30×30 cm； Noldus IT）中进行了野外测试，并在整个测试过程中使用了EthoVision视频分析软件（版本11； Noldus IT）来跟踪小鼠。

家庭笼子轮子运行

每72周（饮食诱发的肥胖症实验）或连续（iMSN-Drd2-KO实验）。

血液测量

来自处死动物的眼静脉血用于在4-hr禁食后分析血清代谢物和激素。

多巴胺受体放射自显影

在纹状体的水平（距前reg的-0.22、0.14、0.62和1.18毫米，覆盖纹状体的整个范围）处将右半切面冷冻切片成12毫米切片。解冻玻片，并在测定缓冲液（20 mM HEPES，154 mM NaCl和0.1％牛血清白蛋白[BSA]； pH 7.4）中于20°C孵育37分钟。通过将载玻片在含有1 nM tri标记的SCH-1.5（Perkin-Elmer）和23390 nM酮色林的测定缓冲液中于100°C孵育60分钟来评估D37R结合。通过将载玻片与2 pM ium标记的spiperone（Perkin-Elmer）和600 nM酮色林在100°C孵育100分钟来评估D37R结合。与合适的放射性配体一起温育后，将载玻片在洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl，4 mM NaCl）中于10°C洗涤两次，每次154分钟，然后浸入水（0°C）中并干燥过夜。然后将载玻片在荧光成像板上曝光7天（D1R结合）或11天（D2R结合），然后使用磷光成像仪（Cyclone； Perkin-Elmer）显影。为了进行分析，使用Optiquant图像分析软件（Perkin-Elmer）概述并分析了感兴趣的区域。

Western Blotting

将Western印迹与小鼠抗D2DR抗体（1：500; Santa Cruz; sc-5303）或小鼠抗GAPDH抗体（1：1,000; Santa Cruz; sc-32233）一起孵育，之后用山羊抗小鼠IgG-孵育。 HRP（1：1,000; Santa Cruz; sc-2005）。使用增强的化学发光蛋白质印迹检测试剂（Bio-Rad）产生化学发光信号，并用Chemidoc成像系统（Bio-Rad）显现。

原位杂交

RNAscope多重荧光测定试剂盒用于原位杂交（Advanced Cell Diagnostics）。简而言之，将福尔马林固定的切片在乙醇中脱水，然后暴露于蛋白酶中。然后将切片与RNAscope寡核苷酸探针杂交 Drd2。探针杂交后，根据RNAscope方案将载玻片与信号放大器一起温育。然后用RNAscope洗涤缓冲液洗涤载玻片。最后，用DAPI复染剂安装载玻片。

高效液相色谱 - 电化学检测

如前所述，使用具有电化学检测的反相高效液相色谱（HPLC-EC）处理左半切以检测DA。Kilpatrick等，1986).

酪氨酸羟化酶免疫组化

将载玻片固定的切片固定在10％中性福尔马林缓冲液中，在0.1 M TBS（pH 7.5）中漂洗，并在含有3％正常驴血清，0.3％Triton X-100和兔抗酪氨酸羟化酶抗体的一抗溶液中孵育（1：1,000; Millipore; MAB152）在23°C过夜。第二天，将组织切片在TBS中冲洗，并在包含3％正常驴血清，0.3％Triton X-100和与Alexa Fluor 555（Millipore; AQ132F）偶联的山羊抗兔的二抗溶液中孵育。对于每只小鼠，分析了两个纹状体切片，除了四只小鼠（两只HFD，两个Chow）外，由于组织或图像质量差，只分析了一个切片。

微型PET

给小鼠注射 ¹⁸在异氟烷麻醉下，通过尾静脉在体积为2.5μL时具有0.34±130 mCi / nmol的比活的F-氟吡格雷。进行微型PET扫描2小时，在此期间获取25帧进行分析。的时间活动曲线 ¹⁸使用AFNI软件提取感兴趣区域（ROI）中的F-fallypride（https://afni.nimh.nih.gov/afni）使用自定义MATLAB脚本（以小脑作为参考组织）将动力学参数拟合到四室模型中以确定D2R结合潜力（Lammertsma和Hume，1996).

体内电生理学

记录是从一个电极阵列中进行的，该电极阵列包含单侧植入背侧纹状体的32条特氟隆涂层钨丝（直径35 mm）（前/后[A / P]：+ 0.8；内侧/外侧[M / L]：+ 1.5 ；背/腹[D / V]：每前：−2.6 mm），并用商业软件（Offline Sorter和Neuroexplorer； Plexon）进行处理。

立体定向病毒载体注射

通过异氟烷暴露对小鼠进行短暂麻醉。深度麻醉后，沿中线做一个切口，露出颅骨，进行双侧开颅手术（A / P：+0.5； M / L：每个前b±1.5 mm）。将含有抑制性KOR-DREADD的病毒载体（Syn-DIO-hKORD-IRES-mCit-WPRE; 0.5μL）双向注入背侧纹状体（D / V，距头骨顶部-2.8 mm）中并表达实验前9周。

无净通量微透析和多巴胺分析

小鼠背侧纹状体基底细胞外DA，DOPAC和HVA的测量采用无网通量微透析方法进行。套管植入后2周，以立体定位方式植入单侧18 mm探针（1 kDa膜截止），并以1μL/ min的速度连续灌注人工脑脊液（aCSF）4小时（请参见样本收集）（请参见补充实验程序）。通过透析探针在aCSF中随机灌注六种不同浓度的DA（0、2.5、5、10、20和40 nM）进行无净通量实验，以测量细胞外DA水平。将每种DA浓度灌注30分钟，然后在2μL10 mM HCl加2.5 mM EDTA中收集100×1分钟的样品，以防止儿茶酚胺降解并在-80°C冷冻。对于神经化学分析，使用与安培检测偶联的等度HPLC系统（HPLC-EC; BASi LC-4C）。分析中仅包括具有正确探针放置的小鼠（图S3E）。

统计报表

使用GraphPad Prism（版本6.07； GraphPad软件）进行统计分析。除非另有说明，否则使用两尾学生t检验。否则，在适当时并按照说明使用两尾配对t检验，单向重复测量方差分析或双向重复测量方差分析。方差分析后进行t检验以进行事后比较。在适当的情况下，认为结果的显着性水平为p <0.05，或由Bejamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正确定的α。

作者贡献

DMF，KD，TJO，MS，AK，IPSSGRAA，MR，KDH和AVK设计了实验。 DMF，KD，TJO，MS和AVK进行并分析了行为实验。 IP进行了蛋白质印迹实验。 DMF和AVK执行并分析了体内电生理数据。 DMF，J.-SL，JG和AVK进行并分析了微型PET实验。 DMF，KD，TJO和AVK撰写了手稿。所有作者都讨论了结果并评论了手稿。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院校内研究计划，国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）的支持。我们要感谢NIDDK的小鼠新陈代谢核心评估血清代谢物和激素，Andres Buonanno在设计多巴胺微透析实验方面的帮助，以及Judith Walters博士，Kristin Dupre博士和Claire Delaville博士对HPLC的帮助多巴胺组织含量分析。我们还要感谢Scott Young博士使用他的实验室设备和协助研究。还要感谢AVK实验室成员Marc Reitman和Nick Ryba对实验设计和仔细阅读手稿的意见。

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