Sci Rep。 2018; 8：2766。
在线发布2018 Feb 9。 DOI： 10.1038/s41598-018-21046-0
PMCID：PMC5807356
抽象
发出可口食物供应信号的线索获得了加强食物寻求和消费的能力。 目前的研究采用行为，药理和分析技术的组合来探讨巴甫洛夫激励动机在提示强化喂养中的作用。 我们表明，与蔗糖溶液（CS +）配对的提示可以转移其对饲料的控制以刺激新容器中的蔗糖消耗，并且这种效果取决于D1多巴胺受体的激活，已知其调节其他形式的提示动机。行为但不适口味。 蔗糖舔行为的微观结构分析表明，CS +倾向于增加大鼠参与舔行为活动的频率，而不会对那些舔食的持续时间产生可靠影响，这一措施与蔗糖适口性相关。 此外，我们发现CS +引起的发病频率增加的个体差异与测试时的总蔗糖摄入量相关，支持了这一过程与有意识的饮食行为失调有关的观点。 因此，目前的研究（1）证明了多巴胺依赖的巴甫洛夫激励动机过程可以调节提示强化喂养，（2）为解析这一行为方面提供了一种实验和分析方法。
介绍
提示可口食物供应的环境线索可以引发强烈的食物渴望1–3 在没有饥饿的情况下促进进食，这种效应在啮齿动物中观察到4,5 和人类6–9。 这种行为影响被认为在暴饮暴食和肥胖中起重要作用10–13，可以使用提示强化喂养（CPF）任务进行研究。 在一项典型的CPF研究中，饥饿的动物进行巴甫洛夫式调理，包括条件刺激（CS +;例如听觉音调）和少量可口的食物或液体（例如蔗糖溶液）之间的重复配对，它们从杯子中消耗位于实验室的固定位置。 接下来，他们可以不受限制地访问他们的维护食物，以确保他们在测试之前完全满足。 然后将动物放回室中并允许从杯中自由消耗蔗糖，同时以非连续方式间歇地呈现CS +。 在这样的条件下，相对于具有未配对刺激（CS-）的会话，动物在CS +测试期间的食物消耗显示出明显的升高。
虽然这些发现表明外部线索可以独立于生理饥饿来促进喂养，但这种影响背后的心理过程尚未确定。 一种可能性是与可口的食物消费相关的线索获得对喂养的反射性或习惯性控制（即，基于刺激 - 反应）。 如果这是调节CPF的主要机制，那么CS +应该通过引发在巴甫洛夫条件下建立的特定摄食行为来刺激消费。 这个 反应学习 当在训练和测试中固定食物来源时，视图似乎是合理的，如上述例子中所示。 尽管这种情况适用于大多数CPF示范，但也有报告称食物相关线索可以触发新地点的喂食14–16，表明他们可以间接控制喂养。 一种可能的解释是，这种线索通过相同的巴甫洛夫激励动机过程加强了喂养，使他们能够引出和激发器乐性的寻求食物的行为17,18。 这 动机的看法 预测CS +会引发搜寻食物的冲动，这也会导致食物随时可供食用。 或者，有证据表明可口食物的信号可以增强对味觉刺激的享乐评价19–21，有可能提示通过使食物更加美味来加强喂养。 虽然这种享乐观点在机制上与动机观点截然不同，但这些观点并不相互排斥，可能解释了CPF的不同方面10,22.
区分CPF的动机和享乐说法的一种方法是确定食物配对线索如何影响饲喂的微观结构。 当允许啮齿动物自由消耗蔗糖溶液或其他可口的液体时，它们参与由不活动时段分开的不同持续时间的舔食。 而这些舔食的平均持续时间提供了可靠和选择性的流体适口性测量23,24，据信这些发作的频率由动机过程控制25–28。 因此，如果CS +通过增强蔗糖适口性来刺激喂养，那么该提示应该增加舔食的持续时间，但不一定是频率。 相比之下，动机观点预测CS +应该触发蔗糖寻求和消费，即使动物专注于其他活动，导致更频繁但不一定更长的舔食。
目前的研究使用两种CPF方案研究了CS +递送对蔗糖舔微结构的影响，其中一种方法是蔗糖总是在同一位置可用（实验1），另一种是在培养和测试中改变来源（实验2和3），允许我们评估CS +的间接影响。 我们评估食物配对线索对反应的反应独立（广义）影响的方法是在巴甫洛夫到工具转移（PIT）任务之后建模的，该任务被广泛用于研究奖励配对线索的激励动机影响。奖励寻求行为18,29,30。 我们还采用了PIT研究中常用的Pavlovian调节和测试参数，以便于与该文献进行比较。 鉴于多巴胺D1受体活性对于PIT的表达和其他提示动机行为的测量至关重要31–33 但是对于喂养行为的享乐方面来说相对不重要25,28,34，我们还评估了D1受体阻断对提示增强的蔗糖舔（实验3）的影响，作为动机在这种效应中作用的进一步探讨。 最后，我们分析了来自这些实验的蔗糖舔数据的微观结构，以测试CPF是否选择性地与蔗糖舔的发作的频率或持续时间的增加相关联，如分别通过CPF的激励和享乐观察所预测的。
成果
提示强化喂养，提示信号食物来源
在我们的第一个实验中，我们应用了传统的响应一致性CPF设计，其中消耗蔗糖所需的特定响应在训练和测试阶段是相同的。 对饥饿的大鼠进行巴甫洛夫调节的10 d，以建立CS +作为在腔室一侧的食物杯上的蔗糖可用性的提示。 在调理的最后一天，在CS +（23.72±2.79每分钟）与试验间间隔[18.27±3.25每分钟; 配对样本 t-测试， t（15）= 3.13， p = 0.007]。 CS−期间的进杯次数（每分钟8.60±1.91）与审判间隔[10.69±2.00每分钟； 配对样本 t-测试， t（15）= - 1.60， p = 0.130]。
然后在食物状态下给大鼠进行两次CPF测试以表征CS +对蔗糖舔的影响。 在每次测试中，大鼠可以自由获取2％或20％蔗糖溶液，这使我们能够评估蔗糖适口性对CPF的影响。 数字 1a 显示在CS试验期间观察到的舔的总数作为CS期，CS类型和蔗糖浓度的函数。 使用广义线性混合效应模型（补充表）分析数据 S1）。 重要的是，存在显着的CS Period×CS Type交互， t（116）= 12.70， p <0.001。 进一步的分析（跨浓度崩溃）显示CS +试验的显着增加， p <0.001，但不是CS−试验， p = 0.118，表明相对于CS前水平，CS +在增加蔗糖舔食方面比CS-更有效。 我们的分析还发现，这种提示选择性受到蔗糖浓度的显着影响（3向相互作用， p <0.001）。 具体而言，尽管CS +在2％和20％的条件下都能有效提高蔗糖舔， ps <0.001，在2％的测试中，CS−对舔率没有明显影响， p = 0.309，但在20％的测试中引起了适度但显着的提高， p = 0.039。 因此，尽管食物配对的提示通常在控制进食方面更有效，但是当允许大鼠在测试中食用高度可口的蔗糖溶液时，未配对的提示似乎产生了类似的影响。
将提示强化饲喂转移到新的食物来源
因为在实验1的训练和测试期间蔗糖是在相同来源获得的，所以不清楚观察到的CPF效果是否取决于CS +对（1）的能力 激励 寻找并消耗蔗糖的大鼠或（2）直接引发特异性 条件反射或 习惯。 实验2通过测试将蔗糖递送到食物杯中的CS +是否可以促使蔗糖从测试室的相对侧的喷口中舔出，与PIT中观察到的行为现象相比，更加直接地关注前一假设。
用实验1中使用的相同巴甫洛夫调节程序训练大鼠，在巴甫洛夫调理的最后一天产生特定于线索的预期接近行为。 在CS +（18.71±1.73每分钟）相对于试验间间隔[12.49±0.98每分钟; 配对样本 t-测试， t（15）= 3.02， p = 0.009]。 CS-（9.41±0.98每分钟）与审判间隔[8.44±0.88每分钟； 配对样本 t-测试， t（15）= 0.98， p = 0.341]。
鉴于当用1％蔗糖测试大鼠时，CS +对实验2中蔗糖舔的影响稍微明显一些，我们在新的来源上进行蔗糖初始测试（喷口，食物杯由不透明的面板覆盖 - 见 方法）专注于这种情况。 然而，在该测试中，蔗糖舔在CS +（328.1±84.8舔）和前CS +时期之间没有显着差异[245.6±45.9舔; 配对样本 t-测试， t（15）= 1.07， p = 0.300]。 为了进一步阻止反应竞争并增强从壶嘴饮用蔗糖，在没有CS的情况下，在缺乏食物的情况下，给大鼠进行了另外5次训练以从壶嘴舔食20％蔗糖。 然后，用家常食物对大鼠充分吃饱，并进行两次CPF测试，并在金属嘴处提供蔗糖。 在测试期间，大鼠可以在单独的测试中连续使用2％或20％的蔗糖溶液（受试者内，顺序平衡）。
数字 1b 表明在这一轮测试中，CS +在新地点促进蔗糖饮用是有效的，尽管该提示从未与这种行为直接相关。 混合效应模型分析（补充表 S2）发现了一个重要的CS Type×CS Period交互， t（120）= 15.16， p <0.001，表明CS +在将蔗糖舔舔提高到基线水平方面更为有效（CS与CS之前的时期， p <0.001）比CS-（CS与CS之前的时期相比， p = 0.097），如实验1所示。蔗糖浓度并未显着影响该效果的提示选择性（3向相互作用， p = 0.319）。 重要的是，相对于CS +之前的时期，CS-之前的舔rates率似乎有所提高，但成对样本 t- 测试表明，这种差异在2％条件下没有统计学意义， t（15）= 1.66， p = 0.118，或在20％的条件下， t（15）= 1.56， p = 0.139。 考虑到训练和测试期间使用的伪随机试验结构，这是可以预期的，因为这种结构可以防止系统的（试验间）结转效应，并避免预期将来的试验类型（或时间安排）。 还值得注意的是，当实验3中这些相同的动物的CS-之前和CS +之前的舔rates率具有更高的可比性时，它们在舔showed中表现出相似的CS +特异性升高（见图。 1c，车辆）。
对D1型多巴胺受体的依赖性
实验2的结果表明，CS +通过触发从未与该提示直接相关的进食行为获得了增强蔗糖消耗的能力，这与PIT样的动机影响一致。 鉴于D1型多巴胺受体在巴甫洛夫激励动机中的重要性31–33，实验3检查了这些受体的阻断活性是否会破坏CPF的表达。 在用SCH-2（20 mg / kg），选择性D23390拮抗剂或载体预处理后，对实验0.04中使用的相同大鼠进行最后一对CPF测试（1％蔗糖）。 测试结果如图1所示。 1c （也是补充表 S3).
分析显示药物治疗的主要影响， t（120）= - 2.15， p = 0.034，因为SCH-23390通常抑制了蔗糖舔。 重要的是，我们发现了显着的药物×CS期×CS类型相互作用， t（120）= - 20.91， p <0.001，表明SCH-23390特异性破坏了CPF的表达。 确实，进一步的分析表明，尽管在媒介物测试中CS +显着增加了蔗糖舔食，使其超过CS +前的水平， p <0.001，在SCH-23390测试中CS +没有影响， p = 0.982。 与实验1中观察到的线索概括相似，在两种药物条件下，CS-引起的蔗糖舔食均略有增加， ps≤0.049。 因此，通过SCH-1施用的D23390型多巴胺受体拮抗作用显着损害CS +诱发的摄食，这与CPF的激励动机说明一致。
蔗糖配对线索和蔗糖浓度对饲喂效果的微观结构分析
实验2和3的结果表明，这里使用的新型PIT类协议支持CPF的激励动机形式，因为线索能够在与提示信号通知的食物源分开的位置激励进食行为。 为了进一步测试这个问题，我们检查了CS +对蔗糖饮用的兴奋作用是否与舔行为的微观结构组织的特定变化有关。 如上所述，舔食持续时间随流体适口性而变化23,24，老鼠参与新的舔舔的频率被认为反映了一个单独的动机过程25–28。 我们改变蔗糖浓度以操纵其适口性，如先前的报道23,35。 尽管高和低蔗糖浓度在热量含量方面也不同，但广泛的研究表明，回合持续时间测量是对感觉奖励影响的敏感和选择性测量，并且与消化后的卡路里处理无关。35–38。 因此，诱导激励动机的CS +应该增加发作频率，而通过使蔗糖更可口来增加摄入的CS +应该促进更长的发作持续时间。
确保足够的统计力量39，我们在上述所有非药物测试条件下折叠数据（实验2和实验20的1％和2％测试，以及实验3的载体条件）。 组合数据如图1所示。 2，分别绘制为总舔（a），回合频率（b）和回合持续时间（c）。 数字 2d 图2显示了在测试时可获得2％和20％蔗糖的前CS +和CS +期间两只代表性大鼠舔行为的光栅图。 根据CPF的动机解释，这些大鼠在CS +期间比在CS +前期期间更倾向于进行更多的蔗糖舔。 相比之下，当大鼠消耗更可口的20％蔗糖溶液时比在消耗2％蔗糖时更长的持续时间趋于更长，这种效果在前CS +和CS +期间是明显的。 因此，发作持续时间不受蔗糖配对线索的强烈影响。 的确，图中所示的模式。 2d 通过组合数据集的广义线性混合效应模型证实了这一点（见图2）。 2a-C 和补充表 S4）。 二次混合效应分析显示，“实验”的分类因子（1，2，3）在频率或持续时间上没有显着调节CS期间×CS型相互作用， ps≥0.293，允许我们将这些数据组合起来用于后续分析。 有趣的是，CS +激发舔行为的能力也反映在启动舔舔的显着更快的延迟上40–42 在CS +与CS-开始之后[广义线性混合效应模型（响应分布=γ，链接函数= log）; t（306）= - 2.71， p = 0.007]，尽管延迟的原始差异相对较小（CS +：1.16秒±0.47； CS-：2.79秒±0.79）。
CS期效应的中介分析
鉴于此类调查结果，我们进行了统计调解分析43 关于组合数据（图 2）确定CS +诱发的蔗糖饮用是否优先与发作频率或持续时间的变化相关。 数字 3a 显示此分析的多中介模型结构（CS期间）。 总体效果显着（总计; c）CS期间对舔行为的影响， t（156）= 4.11， p <0.001， c = 5.22 [2.71，7.73]，因为CS +期间的舔舔次数多于CS +之前的时期。 然后，我们测试了CS +是否类似地影响了舔舔的微观结构，并发现了提示信号引起的发作频率明显升高（M2), t（156）= 3.27， p = 0.001， a2 = 0.70 [0.28，1.12]，但不是持续时间（M1), t（141）= 1.89， p = 0.061， a1 = 0.34 [-0.02，0.69]。 因此，在小组水平上，CS +对发作频率的影响而非对发作持续时间的影响，更类似于其对舔舔的影响。
如果CS +对舔的影响是由其对发作频率的影响所介导的，则（1）这些指标应该是相关的，并且（2）CS +对发作频率的影响应当考虑CS +对总舔量测量的影响。 对第一次预测的评估发现，忽略CS周期，发作频率和发作持续时间与总舔量显着相关， ps <0.001，这不足为奇，因为这些微观结构措施与总舔舔具有内在联系。 但是，我们对第二个预测的评估更具启发性。 我们构建了一个多重中介模型，以检查这些微观结构指标是否通过将回合频率和回合持续时间包括为固定效应以及CS周期来解释总舔食指标中CS +相关的方差。 换句话说，我们询问相对于上述简单（简化）模型中的强度，控制这些舔力运动措施的方差是否削弱了CS +效果。 与调解一致，我们发现 直接 CS期对舔的影响（c'）并不重要， t（139）= 0.90， p = 0.370， c'= 0.41 [-0.49，1.30]，控制bout频率和持续时间。 然后我们估计了CS +对舔过这些潜在介质的影响，并发现回合频率对舔舔有显着的间接影响， a2b2 = 2.90 [1.18，4.76]，但不是持续时间， a1b1 ＝ 1.71 [-0.09，3.35]。 因此，这些数据表明，CS +诱导的舔elevation抬高主要是由发作频率的增加而不是发作持续时间的增加来驱动的，这与CPF的动机而非享乐主义说法是一致的。
蔗糖浓度效应的中介分析
我们对组合数据进行了第二次中介分析（图。 2）确认蔗糖适口性（浓度）与发作持续时间的选择性增加有关（图2）。 3b， 浓度）。 简化模型（对于频率或持续时间没有固定效应）发现浓度对总舔的总影响不显着， t（156）= 0.42， p = 0.678， c = 0.57 [−2.13，3.27]，表明测试时蔗糖舔食的总体水平与蔗糖浓度没有很大关系。 这是可以预料的，因为在最初的2-3分钟食用过程中，蔗糖适口性对舔食的影响最为明显44，在我们测试阶段的第一个CS前期之前。 然而，蔗糖浓度确实对疼痛持续时间有显着影响（M1), t（141）= 5.20， p <0.001， a1 = 0.88 [0.54，1.21]，其中20％的蔗糖比2％的蔗糖支持更长的喝酒时间。 有趣的是，蔗糖浓度对发作频率有明显的抑制作用（M2), t（156）= - 3.84， p <0.001， a2 = −0.83 [−1.26，-0.40]，因为当喝更多可口的溶液时，老鼠倾向于减少发作次数。 因此，发作持续时间与浓度有关的增加被发作频率的减少所抵消。 与此相符的是，我们的完整调解模型（包括回合持续时间和频率的固定影响）表明，浓度对舔s没有直接影响， t（139）= 0.45， p = 0.650， c'= 0.23 [-0.76，1.22]。 然而，回合频率存在显着的间接但相反的影响， a2b2 = −3.49 [−5.50，-1.58]和回合持续时间， a1b1 总舔舔行为= 4.46 [2.96，5.95]。
CS期和浓度对舔微结构影响的个体差异
调解模型显示，发病频率和持续时间在调节CS +和蔗糖浓度对群体水平舔的影响方面起着不同的作用，但没有解决这些影响如何在个体大鼠中表达，这可能对理解个体很重要。暴饮暴食的脆弱性。 鉴于调解分析的结果，我们预测个体大鼠在CS +期间相对于基线显示出发病频率的净增加，但是不会显示出持续时间的任何一致或可靠的变化。 此外，相对于20％测试，预测个体大鼠在食用2％蔗糖时显示更长但不太频繁的舔食。 图。 3c和d 分别显示了CS周期（CS + – CS +之前）和蔗糖浓度（20％–2％）对发作频率和持续时间的影响的个体差异（对图XNUMX中组合数据集的分析）。 2）。 CS +增加67％大鼠的发作频率（图2）。 3c），大约相等数量的这些大鼠也显示出发作持续时间（34％）的增加（33％）。 假设在四个象限中均匀分布的数据点，卡方拟合优度检验显示出显着的分布不对称性χ2（3）= 10.91， p = 0.012。 实际上，Δ的均值频率 分布明显大于0， t（66）= 4.80， p <0.001，而平均值Δ时间长度 分布与0没有显着差异， t（66）= 1.80， p = 0.076。 关于集中效应（图 3d），大多数大鼠（58％）表现出更长的时间 和 使用20％与2％蔗糖相比频率较低，卡方拟合优度检验证实数据在象限中均匀分布，χ2（3）= 31.85， p <0.001。 确实，我们发现Δ的均值频率 分布明显少于0， t（51）= - 4.22， p <0.001，而平均值Δ时间长度 分布明显大于0， t（51）= 4.18， p <0.001。
蔗糖消耗的微观结构预测因子
图中的数据。 3c 表明CS +对发作频率的影响存在相当大的差异，并且一些大鼠对这种动机影响特别敏感。 虽然这些大鼠有可能通过在没有CS +的情况下少喝酒来控制其总蔗糖摄入量，但是对组合数据集的进一步分析（图2）。 2）确认这些CS +触发的发作频率增加与暴饮暴食有关。 具体而言，我们发现表现出正Δ的大鼠频率 在CS +试验期间得分（子组Freq↑，Dur↓和Freq↑，Dur↑图。 3C）比未服用的大鼠消耗更多的蔗糖（亚组Freq↓，Dur↓和Freq↓，Dur↑）， t（63）= 2.27， p = 0.026（图 4a）。 Δ时保持这种关系频率 被视为连续变量， t（63）= 2.19， p = 0.032（图 4b），并且不依赖于蔗糖浓度，浓度×Δ频率， t（63）= 0.64， p = 0.528。
讨论
我们发现，提示信号蔗糖可用性的提示能够增强大鼠的蔗糖摄入，无论该提示是否也表示获得蔗糖所需的特定作用（实验1）或没有（实验2和3）。 后一发现特别令人感兴趣，因为它不太可能依赖于预先存在的条件性喂养反应（或刺激 - 反应习惯）的执行，而是建议这种线索获得情感和/或动机特性，使其能够灵活地转移他们对喂养行为的控制。 这种促进食物消费的趋势即使在已经确定的饲喂程序不易获得的情况下也因此似乎提供了巴甫洛夫过程的有用且有选择性的动物模型，该模型支持对人类引起的食物渴望和暴饮暴食。1–3。 虽然之前有报道称食物配对刺激可以以独立于反应的方式促进喂养14–16大多数CPF实验在培训和测试阶段保持食物来源固定，因此仅提供有关此影响背后的心理过程性质的有限信息。 目前的研究使用PIT任务模拟的程序证明了食物配对线索对摄食行为的广泛兴奋性影响，该程序被广泛用于研究食物配对线索对寻求食物行为的广义动机影响。 例如，如在PIT中，当前任务可用于评估提示获得推广到新位置的动机属性的趋势。 我们还借用了PIT常用的训练和测试参数（例如，提示持续时间，试验间隔和强化时间表），便于跨研究进行比较。 因此，这种方法可以为将来调查巴甫洛夫控制器乐与完成行为的心理和/或生物过程的潜在差异提供更大的实验控制。
目前的研究发现D1多巴胺受体的激活对于这种反应独立形式的CPF的表达至关重要，这有助于支持激励动机解释，考虑到一般多巴胺信号传导的重要性，以及D1受体激活特别是在巴甫洛夫的表达中到工具转移18,29–32,45,46。 有证据表明多巴胺对于处理食物刺激的快感特性相对不重要25,28,34，D1拮抗剂似乎不太可能通过破坏CS +在测试时改变蔗糖适口性的能力而发挥作用。 这种动机解释也得到了我们的微观结构舔分析的支持，该分析发现这些提示主要通过引发更多的舔舔来增加喂养，而不是通过延长这些发作的持续时间。 相反，bout持续时间随着蔗糖的适口性而变化，这已经很好地确定了23,24,26,27。 有趣的是，我们的统计调解分析显示，尽管大鼠在舔20％与2％蔗糖时进行较长的发作，但它们也显示出发作频率的代偿性降低。 因此，这种对适口性的操纵似乎影响了大鼠在不影响其整体摄食水平的情况下对其蔗糖摄入量进行图案化的方式。 相比之下，在使用CS +的试验期间没有明显的这种补偿效应，这似乎解释了在具有该提示的试验中观察到的舔行为的净增加。 此外，在CS +试验期间显示发作频率增加的大鼠也显示出总蔗糖摄入量增加。 这些发现表明食物配对线索（1）可以调节摄食行为，并且（2）在驱动暴饮暴食方面比操纵蔗糖适口性更有效，至少在这里测试的条件下。
目前的结果还揭示了多巴胺在缺乏明确的食物搭配线索的情况下调节摄食行为的作用。 以前的研究表明全身给予D1多巴胺拮抗剂 SCH23390 禁止显示 uncued 通过降低发作频率而不改变发作持续时间来消耗蔗糖25,26，这类似于多巴胺缺乏小鼠表现出的舔舔模式47。 尽管在这种情况下控制发作频率的心理机制尚不清楚，但有人认为，与喂养相关的语境和/或内感觉提示能够暗中激发新的食物寻求和消费。25,26。 我们的结果通过证明新的舔食可以通过明确的食物配对提示引发这种解释的合理性提供了一些支持，并且这种效果还取决于D1多巴胺受体的激活。
如其他地方所述5,10以前关于多巴胺在CPF中的作用的研究相对较少。 然而，一项早期研究发现非特异性多巴胺受体拮抗剂α-氟哌噻嗪的使用减弱了CS +诱发的食物寻求，但完整地保留了提示增加食物消耗的能力。48这似乎与我们的发现不一致，即D1拮抗作用会破坏提示诱导的蔗糖舔。 两项研究中存在许多程序差异，可以解释这种明显的差异。 例如，我们对D1多巴胺传递的选择性操作可能更有效地破坏CS +对食物摄入的影响。 此外，在此前的研究中48使用独特的巴甫洛夫调节程序对食物剥夺的大鼠进行训练并在其家笼中进行测试，其中使用提示来指示在一天中间歇分布的喂食期。 后来，即使大鼠在非感染状态下进行测试，该提示也被证明可有效促进喂养。 该培训的性质和程度以及在培训和测试阶段所需的喂养反应不变的事实表明，该CPF方案可能鼓励在测试期间使用习惯性（刺激 - 反应）喂养反应。 鉴于过度训练会使诱发食物的食物对多巴胺信号传导的操纵变得不敏感49这可能是这种潜在的以习惯为基础的CPF形式对多巴胺的依赖程度低于此处所述的动机形式。
尽管多巴胺在CPF中的作用还有待确定，但已知这种行为现象依赖于生长素释放肽。50–52 和黑色素浓缩激素53 神经肽系统，从根本上涉及调节两种摄食行为10 和多巴胺信号传导54–56。 有趣的是，ghrelin的食欲刺激作用取决于这种激素调节中脑边缘多巴胺信号的能力。57–60。 例如，通过共同施用D1多巴胺受体拮抗剂SCH-23390，可以抑制生长素释放肽增强食物寻求和消费而不影响食物适口性（舔食持续时间）的趋势。60。 根据这些发现，人们可能会认为生长素释放肽和多巴胺之间的类似相互作用可能是食物配对线索对喂养的动机影响的基础。
虽然目前的研究结果表明，食物搭配的线索可以通过激发新的喂养来刺激暴饮暴食，但这些线索也可能通过其他过程影响喂养。 在我们的控制转移方法中隐含的是认识到喂养提示可以通过直接引发特定的喂养行为来触发摄入。 此外，尽管CS +在目前的研究中没有可靠地改变持续时间，但最近采用更常规的CPF方案和固定食物来源的研究确实发现喂食提示可以延长舔53。 与此一致，之前有报道称与可口食物相关的线索可以增加对味觉刺激的食欲性口面反应的表达。19–21品味享乐或“喜欢”的另一种衡量标准。 因此，食物提示可能通过多种途径促进摄食，通过引起渴望，通过触发特定的喂养反应，和/或通过使食物味道更好10。 这些过程可能成为提示强化暴饮暴食的明显脆弱性的基础，也许可以解释个体对这种效应易感性的差异1,61,62。 目前的研究结果表明，有效的方法是选择性地解析大鼠CPF的动机成分。
方法
主题和装置
成年雄性Long Evans大鼠（N = 32只大鼠；实验16为n = 1，实验16和2为n = 3），在抵达时重370–400 g，成对放置在温度和湿度下的透明塑料笼中控制的饲养箱。 老鼠有 随意 在整个实验过程中，在他们的家笼中获取水。 如下所述，在实验的某些阶段期间将大鼠置于食物限制时间表上。 畜牧和实验程序经UC Irvine机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合国家研究委员会关于实验动物护理和使用的指南。
行为程序在相同的室（ENV-007，Med Associates，St Albans，VT，USA）中进行，容纳在声音和光衰减的小室中。 蔗糖溶液可以通过注射泵输送到凹进的塑料杯中，该塑料杯位于每个腔室的一个端壁中心，2.5 cm位于不锈钢网格地板上方。 位于食物容器入口处的光束检测器用于监测与蔗糖消耗相关的头部入口，以及在Pavlovian调节期间的条件接近响应。 在某些测试阶段（实验2和3）中，蔗糖溶液可以通过将位于~0.5 cm的重力进料金属饮用嘴舔入位于与食物杯相对的端壁上的1.3 cm孔中而获得。 在测试期间使用接触式舔计装置（ENV-250B，Med Associates，St Albans，VT，USA）连续记录来自食物杯和金属喷口的单独舔。 在所有会话期间，当从金属喷口获得蔗糖时，将白色不透明有机玻璃板定位在容纳食品杯的端壁的前面。 室内灯（3 W，24 V）提供照明，风扇提供通风和背景噪音。
巴甫洛夫的空调
在进行杂志训练的85 d之前，将大鼠置于食物限制时间表上以使其体重维持在其自由进食体重的约2％，其中他们在每个中接受60递送的20％蔗糖溶液（0.1 ml）。每日会议（1 h）。 然后大鼠接受巴甫洛夫条件下的10 d。 每个每日调节会话包括一系列6演示的2-min音频提示（CS +; 80-dB白噪声或10-Hz点击器），试验以可变3-min间隔（范围2-4）分隔。 在每次CS +试验期间，根据0.1-sec随机时间表将2％蔗糖溶液（w / v）的20 ml等分试样（在30秒递送）递送到食物杯中，得到每次试验平均四次蔗糖递送。 。 在调理的最后一天，给予大鼠第二阶段，其中以与CS +相同的方式呈现替代线索（CS-;替代性听觉刺激）但不与蔗糖溶液配对。 通过比较CS起始和第一次蔗糖递送期间的杯子接近率（光束断裂）来测量预期行为（以避免检测到无条件的进食行为），这与杯子接近期间的杯子接近率进行了对比。试验间隔。 然后给所有大鼠5天 随意 在进行额外测试之前，在最后一次巴甫洛夫调理后获得维持饮食。
提示强化喂养测试
实验1
该实验评估了CS +对来自培养期间使用的相同食物杯的蔗糖溶液消耗的影响，使得对该提示的条件反应（即，杯子方法）与在测试时获得蔗糖所需的行为相容。 在Pavlovian调理期间恢复体重减轻后，大鼠接受了一对CPF测试，这些测试由48 h分开，在此期间大鼠在他们的家中保持不受干扰。 在每次CPF期间（总持续时间为86分钟），每当大鼠越过光束时（杯子接近），通过用2ml蔗糖重新填充该杯子，在食品杯中连续地获得20％或0.1％蔗糖溶液。 然而，为了防止杯子过满，只有在最后一次蔗糖递送后至少已经过4并且如果大鼠在干预期间进行了至少五次舔，则仅施用蔗糖递送。 在该会话的过程中，每个2-min听觉刺激以伪随机顺序（ABBABAAB）非连续地呈现4次，由固定的8-min间隔分开。 第一次试验在会议开始后开始8分钟，以便在评估提示的行为影响之前诱导饱腹感。 试验顺序与巴甫洛夫训练条件相抵消，因此第一个CS呈现的是一半受试者的CS +和剩余一半受试者的CS-。 蔗糖浓度测试的顺序也是平衡的，每种条件的一半首先接受2％测试，第二次接受20％测试，一半接受相反的排列（即，所有动物在单独的测试中接受两种浓度）。
实验2
在该实验中，我们研究了CS +对来自与Pavlovian调节期间使用的杯子不同来源的蔗糖溶液的消耗的影响，使得对该提示的条件反应与在测试时消耗蔗糖所需的行为不相容。 我们进行的第一次测试仅包括2％蔗糖条件。 在让Pavlovian调理期间让老鼠恢复体重减轻后，他们每天进行两次治疗（86最小持续时间），他们可以从位于小孔内的金属喷口（通过瓶子重力进料）无限制地接触2％蔗糖溶液。食物杯对面的端壁。 将白色有机玻璃面板放置在容纳食物杯的壁的前面，在进行鲸鱼喷射（包括随后的CPF测试）的过程中，以阻止动物在该位置搜索蔗糖。 这些疗程旨在让老鼠在没有听觉线索的情况下体验从新来源饮用蔗糖。 在第二天，如实验1中所述，大鼠接受单次CPF测试，除了2％蔗糖在金属喷口处而不是在杯子处连续可用。
因为在第一次测试中几乎没有证据表明CPF，可能是由于CS +诱发食物杯和喷口接近行为之间的反应竞争，我们给大鼠额外的喷口训练（在没有CS +的情况下）加强蔗糖寻求鲸鱼喷水和劝阻当壶嘴可用时（因为它被面板覆盖），食物杯接近。 因此，在给予5 d额外的喷口训练课程之前，将大鼠放回食物限制时间表（与Pavlovian调理阶段相同），这些训练中的每一个由10 min进入20％蔗糖溶液组成。 然后给大鼠4 d 随意 进入家庭食物，让他们在这个阶段恢复体重减轻。 接下来，在接受使用CS +和CS-的Pavlovian再训练期之前，大鼠急性食物剥夺（20 h），如在初始训练的最后一天（即，在CS +试验期间将20％蔗糖递送到食物杯中）。 请注意，在这些以及随后的所有巴甫洛夫再训练期间，喷嘴都从腔室中移除。 然后给予大鼠~20小时 随意 在使用与第一次测试相同的金属喷口进行两次CPF测试之前进入家庭食物，除了在两次单独的测试中给予大鼠2％或20％（如实验1）。
实验3
在用喷口进行最后一轮测试期间发现更多实质性CPF证据后，对来自实验2的大鼠进行了额外的测试，以评估这种效应对D1多巴胺受体的多巴胺信号传导的依赖性。 首先给大鼠进行10-min喷管再训练，其中给予20％蔗糖溶液。 因为大鼠在返回时迅速恢复正常体重 随意 在急性20-h食物剥夺后的家庭食物，我们使用这个程序确保大鼠在这个喷口再训练期间以及随后的巴甫洛夫再训练期间（CS +和CS-会话，如前所述）饥饿，这是在每天的前一天进行的。两次最终的CPF测试。 给大鼠至少20小时 随意 每次测试会议之前的家庭食物访问。 在最后一轮CPF测试期间，大鼠在两个测试期间都能连续接触来自喷口的20％蔗糖。 在每次测试前15分钟，给予大鼠腹腔注射（1 ml / kg）无菌盐水或SCH-23390（选择性D1多巴胺受体拮抗剂），使用已知足以抑制蔗糖消耗的剂量（0.04 mg / kg）25,34,63。 在两种药物条件下测试大鼠，平衡测试顺序。
数据分析
主要的相关测量是单独的舔lick，在所有CPF会话期间，使用接触舔仪以10毫秒的分辨率记录了舔。 在极少的情况下，我们在舔仪测量中检测到由大鼠（爪子或嘴巴）和蔗糖（或金属嘴）之间持续接触引起的伪影。 这些伪影采取了高频舔ometer仪响应（> 20 Hz）的形式。 假设大鼠表现出最大的舔食频率<10 Hz64，我们排除了在最后一次（非伪影）舔的0.05秒内发生的所有潜在的舔响应，对应于20-Hz截止频率。 在给定该标准的情况下排除至少20％的舔响应的会话从分析中完全移除（来自实验1中的1大鼠的1会话）。
舔行为
对于每个会话，我们确定了不同时期类型的舔舔总数（Pre-CS +，CS +，Pre-CS-，CS-）。 因为我们的主要依赖度量（总舔）是计数变量，所以使用具有泊松响应分布和对数链接函数的广义线性混合效应模型分析这些数据。 65–68. 该统计方法允许参数估计作为条件（固定效应）和个体（随机效应）的函数。 在实验1和2中，固定效应结构包括总截距，CS周期（Pre，CS）×CS类型（CS-，CS +）×浓度（2％，20％）之间的三向交互，以及所有低阶主效应和相互作用。 对于实验3，替代药物（载体，SCH）进行浓缩以适应实验设计的变化。 这些变量都是受试者内部的变量，被视为分类预测因子和效应编码。 随机效应模型选择涉及确定最小化Akaike信息标准的模型 69同时还要确保每个参数的数据点数不低于10 70,71。 使用这些标准，跨越实验的最佳随机效应结构包括受试者不相关的截距调整CS周期，CS类型和浓度（或药物）72。 所有统计分析均在MATLAB（The Math Works; Natick，MA）中进行。 所有测试的alpha级别是0.05。 由于所有预测因子都是绝对的，因此效应大小由非标准化回归系数表示 73，报告为 b 文本和模型输出表。 使用事后进行事后相互作用的事后分析 F- 使用the的综合分析中的简单效果的测试 coefTest 在MATLAB中的功能。
舔行为的微观结构分析
个别舔被分类为开始或继续舔回合。 一个回合划分为多个连续舔，其中插入间隔（ILI）不超过1 s74。 当至少1从最后一次舔过时，下一次舔被指定为新回合的开始。 通过首先将会话划分为前CS和CS周期来计算发作频率和持续时间，如上面分析中的总舔。 在那些时期，每个舔前面至少1 s的时期被指定为回合。 每个回合的持续时间计算为该回合中第一次和最后一次舔之间的时间间隔。 孤立发生的个别舔不算作回合的一部分。 为随后的中介分析最大化样本量39，bout频率和发作持续时间数据在实验中崩溃，以评估CS期，CS类型和浓度对这些微观结构测量的一般影响。 来自实验23390中的SCH-3条件的数据未包括在这些分析中。
这些数据通过广义线性混合效应模型进行分析，该模型结合了CS周期×CS类型×浓度的固定效应结构（以及所有低阶相互作用和主效应）和针对CS周期调整的受试者不相关截距的随机效应结构，CS类型和浓度。 如在总舔行为的分析中，从分析中移除来自实验1的一只大鼠的一次会话。 由于频率数据的计数类型性质，回合频率分析采用具有对数链接函数的泊松响应分布。 回合持续时间分析采用具有对数链接函数的伽马响应分布，因为回合持续时间是在0和+∞之间界定的连续度量。 为了进行比较，对实验中的总舔塌进行相同的分析，其中分析假设具有对数链接函数的泊松响应分布，如在各个实验总舔分析中那样。 为了确保关键的CS周期×CS类型相互作用不依赖于每只大鼠在哪个实验中，第二系列模型在回合频率和回合持续时间上运行，与刚刚描述的分析相同但具有额外的固定效应预测因子实验×CS周期×CS类型。 实验是一个绝对因素。 最后，作为动机舔的确认措施40–42，我们使用具有伽马响应分布和对数链接函数的广义线性混合效应模型分析了CS发作后第一次舔的潜伏期（n = 310）。 该模型包括CS类型×集中度的固定效应结构（以及所有低阶相互作用和主效应）和针对CS类型，浓度和CS类型×集中度调整的副对象截距的随机效应结构。
关于发作频率和发作持续时间的中介分析
两个多重调解模型43,75,76 进行以确定CS期（Pre，CS）和浓度（2％，20％）对CPF的作用（或缺乏）是否由发作频率和/或发作持续时间显着介导。 在CS Period Model中，变量 X 是CS期（Pre，CS），结果变量 Y 是那个时期舔的总数，调解员的频率是多少（M1）和回合持续时间（M2）。 在浓度模型中，变量 X 是蔗糖浓度。 因为诱发舔诱饵主要用于CS +试验（见 成果），仅分析了CS +试验。 对于每只大鼠和每个测试期，针对前CS +和CS +期确定每次发作的平均舔和发作次数以及平均持续时间。 这些分析包括来自实验1和2的所有大鼠（每个实验的16大鼠×2实验×2浓度×2 CS周期= 128数据点）和来自实验3的车辆状况数据（16大鼠×2 CS周期= 32数据点） 。 如在总舔行为的分析中，从分析中移除来自实验1的一只大鼠的一个会话，留下总共158数据点。 很少，老鼠在会话期间的前CS +或CS +期间没有舔（9 / 158; 9.5％）。 在这些情况下，舔食和发作的平均数量被编码为“0”，并且平均发作持续时间的值被留作空单元格。 假设按列表删除运行相同的模型（即，删除其中bout持续时间为空单元格的行），保持类似的模式。 因为这些分析涉及一般线性模型（即，简单或多元线性回归），所以回合频率和总舔数据是平方根变换，并且回合持续时间数据被对数变换以校正正偏斜。 间接效应的显着性由95％百分位引导和10,000迭代确定。 报告回归系数与传统的中介分析报告相对应（例如， c'=直接影响 X on Y)43,75.
提示频率和持续时间的线索诱发变化的个体差异
前述分析使我们能够在组水平上评估CS +对舔micro微观结构的影响。 我们还表征了这种效应表达中的个体差异。 对于每只大鼠，计算出发作频率和发作持续时间测量的两个差异分数。 与CS期间模型平行，从CS +期间（即CS + – CS-pre之前）的回合频率值中减去CS +之前的回合频率。 对于浓度模型，从2％测试期间的相应值（即20％–20％）中减去2％蔗糖测试期间的测试频率。 这些计算产生了描述回合频率（Δ频率）。 对于持续时间（即，Δ）进行这些相同的计算时间长度）。 因此，对于每对Pre-CS + / CS +和2％/ 20％数据点，确定了发作频率和发作持续时间的变化。 通过单样本将这些分布的平均值与0进行比较 t-test（α= 0.05）来评估分布变化，远离一般变化。 这些数据点中的每一个都通过频率和持续时间的增加和/或减少来分类，并且由双变量散点图表示（例如，在CS +发作时的发作持续时间中的发作频率/减少的增加），允许确定数据的比例每个2×2象限中的点（回合频率/持续时间×增加/减少）。 差异分数等于零的数据点被归类为减少（即，不是增加）。 卡方（χ2）CS周期和浓度数据的拟合优度检验确定这些数据点的分布是否与这四个类别中均匀分布的数据不同（α= 0.05）。 为了确定每个实验的四个象限中这些数据点的分布是否大致相等，对CS周期和浓度数据进行简单的相关分析，以评估每个实验中每个象限的数据点数之间的关系。相应的预期数据点数，由每个象限的总比例估算。
蔗糖消耗的微观结构预测因子
进行最后一系列的广义线性混合效应分析以确定在整个测试期间消耗的蔗糖溶液的总体积是否由该大鼠从前CS +到CS +期间的发作频率和持续时间的变化预测。 分析包括来自所有非药物条件的数据（即，实验2和20的1％和2％蔗糖测试，以及来自实验3的载体条件）。 分析假设具有对数链接功能的伽玛响应分布。 如上所述，第一分析回归消耗的总蔗糖溶液（mL）对2×2分类组的增加/减少的主要影响和相互作用如上所述。 第二个分析回归总蔗糖消耗对Δ的连续值的主要影响和相互作用频率 和蔗糖浓度。
数据可用性
在当前实验期间分析的数据集可在相应的作者的合理要求下获得。
电子辅助材料
致谢
NIH向AGO授予AG045380，DK098709，DA029035和MH106972支持的研究。 资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。
作者贡献
SBO构思并设计了实验; BH和ATL进行了实验; ATM和SBO分析了这些数据。 所有作者都撰写了文章并审阅了手稿。
利益争夺
作者声明没有竞争利益。
脚注
电子辅助材料
补充资料 本文附带10.1038 / s41598-018-21046-0。
出版商的说明： Springer Nature在发布的地图和机构隶属关系的管辖权要求方面保持中立。
参考资料
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