解码控制强迫蔗糖寻求的神经回路（2015）（BINGE机制）

为了识别在体内向VTA提供单突触输入的LH神经元并观察其在自由移动行为期间的活动，我们使用了双重病毒策略在向VTA提供单突触输入的LH神经元中选择性表达Channelrhodopsin-2（ChR2）（数字1A和 S1）。 我们注射了腺相关病毒载体（AAV₅）将带有Cre重组酶依赖性双重倒置开放阅读框（DIO）构建体中的ChR2-eYFP携带到LH中以感染当地的躯体细胞，并将带有Cre重组酶的逆行旅行的单纯疱疹病毒（HSV）注入VTA中。 随后的重组允许视黄素和荧光团在LH神经元中选择性表达，从而向VTA提供单突触输入。 为了证实我们的方法，我们在含有LH的水平脑切片中进行了离体全细胞膜片钳记录，并从表达ChR2-eYFP的神经元以及ChR2-eYFP阴性的邻近LH神经元进行了记录（图1B）。 从光脉冲开始到动作电位峰值之间的光诱发尖峰潜伏期为3–8 ms（图1C）。 我们还发现，记录的所有非表达（ChR2阴性）细胞均未显示出对光刺激的兴奋性反应（n = 14； n = XNUMX）。 图1C），尽管它们接近表达ChR2的细胞。

为了在体内进行光遗传学介导的光识别，在寻求蔗糖的过程中，将光极植入LH中以记录神经元活性。 在同一记录会话中，我们提供了几种光刺激模式，以识别表达ChR2的LH-VTA神经元（数字1D和 S1）。 我们检查了所有LH神经元的兴奋性光响应潜伏期的分布，显示出响应于光照的发射率的时间锁定变化并且观察到双峰分布（图1E）。 我们在体内录音期间观察到大量神经元，潜伏期为3–8 ms。 这与我们离体记录时在表达ChR2的LH-VTA神经元中发现的潜伏时间范围相同。 我们将这些单位称为“类型1”单位（数字1C，1E和1F）。 此外，还有一群细胞具有约100 ms的光响应潜伏期（数字1E和1G），我们将这些称为“Type 2”单元。 我们还观察到响应LH-VTA神经元光刺激而被抑制的神经元（图S2），我们将这些称为“Type 3”单元。 我们比较了1型和2型以及未显示光响应的那些动作电位持续时间（从峰到谷测量）和平均点火率（图1H）。 1型动作电位持续时间的分布（图1I）和2型（图1J）单元显示大多数类型1单元的动作电位持续时间小于500μs（84％； n = 16/19，二项式分布，p = 0.002）。

尽管1型单位符合分类为ChR2表达的标准标准（Cohen等人，2012; Zhang等人，2013），但尚不清楚2型单位较长的潜伏期光反应是否表示可表达ChR2的神经元光刺激的速度变慢，或者这种影响是否是由于网络活动引起的。 鉴于表达ChR2的（1型）LH神经元直接投射到VTA，一种可能性是2型神经元正在接受VTA的反馈（图1K）。 另一种可能性是2型神经元被1型神经元的轴突侧支激活（图1L）。 为了区分这两种可能的电路模型，我们在LH中结合光电识别来抑制VTA。

基于我们的电路模型，我们预计远端抑制对表达ChR2的LH神经元的光响应没有影响。 然而，如果光响应但非表达，LH神经元依赖于来自VTA的反馈来引发对光照的时间锁定响应（图1K），我们期望在VTA抑制时这些神经元中的光响应衰减。 我们如上所述在LH-VTA细胞中表达了ChR2，但这次也在VTA中表达了增强的halorhodopsin 3.0（NpHR），并且除了LH中的optrode之外还在VTA中植入了光纤（图2一个）。 我们在LH中为所有三个时期提供了相同的蓝光照明模式，但在第二时期也用黄光照射了VTA（图2一个）。

1型单位对LH中蓝光照射的光响应不受VTA光抑制的影响，这与2 LH-VTA神经元中的ChR1表达一致（图2B）。 相反，大多数2型单位（87％； n = 13/15，二项分布，p = 0.004）显示出对LTA中传递VTA神经元光抑制的蓝光脉冲的光响应显着衰减。 VTA光抑制过程中1型和2型单位的反应显着不同（卡方= 7.64，p = 0.0057； 数字2B和2C）。 这些差异也可以在个别时期的最大Z分数中看出（图2D）和黄色ON时期归一化为黄色OFF时代（图2E）。 这些数据表明2型LH神经元从VTA接收（直接或间接）输入（图1K）而不是通过局部轴突侧枝（图1L）。

在LH-VTA环中鉴定出这两种不同类型的LH神经元后，我们想要在蔗糖自我管理任务中检查自然发生的神经活动（图3一种）。 对小鼠进行了鼻息反应的训练，以预测在相邻端口的蔗糖释放（如Tye等人，2008年）。 为了使我们能够区分对鼻子和提示的神经反应，提示和蔗糖按部分强化时间表进行运送，其中50％的鼻子与提示和蔗糖运送配对。

1型单位显示对蔗糖端口进入的阶段性反应，如代表性的1型单位所示（图3B），以及所有1型单位的人口数据（图3C）。 然而，2型单元的阶段性反应主要反映了对奖励预测线索的反应（数字3D和3E）。 对于每个任务组件，将显示所有记录的神经元（n = 198，分为类型1、2、3和无响应单位）的归一化触发方式：鼻烟与提示配对，在没有提示的情况下使用鼻提示，以及蔗糖端口条目（图3F）。 所有显示出与任务相关的阶段性活动变化的类型1单位（74％; n = 14/19）都被蔗糖端口进入阶段性地激发或抑制，少数也显示出对奖励预测性提示的阶段性抑制（数字3B，3C和3G）。 相比之下，2型单元更加异构，任务响应神经元选择性地编码提示（35％），选择性地编码蔗糖端口（26％），或者提示和端口条目（12％; 数字3D，3E和3H）。 为了说明1型和2型对任务相关事件的响应强度，我们根据Z得分在三维图上绘制每个细胞（图3一世）。 为了显示在定性水平上发射到多个任务相关事件的相位变化的分布，我们绘制了属于给定类别的每个光响应类型的单元格数量（图3J）

鉴于VTA在奖励预测错误中的作用已明确定义（例如，响应意外丢失奖励而DA神经元放电的阶段性减少和响应意外传递奖励的阶段性激励）（Schultz等， （1997），我们调查了LH神经元是否会编码蔗糖奖励的意外遗漏。 为此，我们在训练有素的动物中，在相同的线索奖励任务中记录了光响应神经元的神经活动，但在线索发生后，随机省略了30％的蔗糖释放量（图4一个）。

大多数类型1单位（88％； n = 15/17，二项分布，p = 0.001）对奖励遗漏不敏感（数字4B和4D），而很大一部分2型单元（67％； n = 12/18）显示出对奖励性和奖励性缺失试验的明显不同（数字4C和4D）。 我们得出结论，LH-VTA（1型）神经元编码进入端口的动作，因为这些端口进入响应即使在奖励遗漏时也是持久的（图4D），与类型2单位（卡方= 10.9804，p = 0.0009）相反。

为了确定类型1对端口输入的响应是否真正编码条件响应（CR），而不是一般的寻求奖励或探索行为，我们记录了尚未获得任务的未经训练的小鼠。 在没有任务的小鼠中，我们在没有预测线索（无法预测的奖励传递）的情况下将蔗糖送到港口，并发现1型单位没有显示对港口进入的阶段性反应（数字4E，4F和4I），与1神经元编码CR的模型一致（图4J）

接下来，为了确定类型2单位活动是否与奖励预测错误样响应曲线一致，我们还在训练有素的动物中记录这些神经元在不可预测的奖励传递期间（图4G）。 我们发现，一部分2型单位对未预测的蔗糖释放有反应（50％； XNUMX％ 数字4G-4I）。 总之，2型单元的子集对意外的奖励遗漏很敏感（数字4C和4D）和不可预知的奖励交付（数字4G-4I），与奖励预测错误一样的响应曲线一致。

如上所示，1型单位代表CR的神经相关性。 重要的是，射击率的增加在CR之前开始，一直持续到CR完成（数字3B，3C和 4B）。 为了确定LH-VTA途径的激活是否可以促进CR，我们想要测试LH-VTA激活在面对负面后果时驱动CR的能力。 在野生型小鼠中，我们在LH细胞体中单独表达ChR2-eYFP或eYFP，并在VTA上植入光纤（数字5A和 S4）。 相反，为了测试LH-VTA途径在介导CR或进食相关行为中的作用，我们在LH细胞中仅双边表达了NpHR-eYFP或eYFP，并在VTA上方植入了光纤（数字5A和 S4).

我们设计了一项巴甫洛夫调节任务，在这项任务中，缺乏食物的老鼠必须穿过冲击网格才能获得蔗糖奖励（图5B）。 在第一个“基线”时代（休克网格关闭），我们验证了每只鼠标都已经获得了巴甫洛夫式条件进近任务。 在第二个（“电击”）时期，电击格每秒传递轻微的脚部电击。 最后，在第三个时期（“ Shock + Light”），我们继续传递脚部电击，但还在表达ChR10的小鼠和匹配的eYFP对照小鼠的黄光（恒定）下，在VTA中用蓝光（2 Hz）照亮LH末端表达NpHR的小鼠及其eYFP对照（图5B）。

我们在Shock + Light时期观察到每个提示的端口条目数量显着增加，并且相对于eYFP小鼠，ChR2小鼠的差异评分（Shock + Light epoch - Shock-only epoch）显着更高（图5C和 电影S1）。 相比之下，LH-VTA途径的光抑制导致每个提示的端口进入显着减少，并且NpHR小鼠相对于eYFP小鼠的差异得分（图5D和 电影S2）。 在会议期间的灭绝实验中，提示没有遵循蔗糖分娩的提示呈现出类似的趋势（图S4).

重要的是，我们想确定我们获得的蔗糖寻求的变化是由喂养相关行为的变化还是对疼痛的敏感性引起的。 我们观察到LH-VTA投射的光活化显着增加了ChR2组喂食良好小鼠的时间（图5E）。 然而，LH-VTA途径的光抑制没有显着减少摄食（图5F），尽管这些动物被剥夺了食物以增强我们检测相对于基线时期的减少的能力（与 图5E）。 在ChR2中都没有（图5G）也不是NpHR组（图5H）我们是否观察到从热水中抽出尾巴的潜伏期有所不同（Ben-Bassat等人，1959年，Grotto和Sulman，1967年），表明操纵LH-VTA投影不会改变镇痛作用。

为了研究引发这些效应的LH输入到VTA的快速传播成分的组成，我们在急性切片制备中从VTA神经元进行了全细胞膜片钳记录，同时光学激活了表达ChR2-eYFP的LH输入（数字6A和 S5）。 考虑到VTA内部存在公认的异质性，包括〜65％DA神经元，〜30％GABA神经元和〜5％谷氨酸神经元（Margolis等人，2006; Nair-Roberts等人，2008; Yamaguchi等人等（2007年），我们在记录细胞的同时向细胞中添加了生物胞素，以便使用酪氨酸羟化酶的事后免疫组织化学（TH； 图6B），除了记录超极化激活的阳离子电流（I_h）和映射单元格位置（数字6B和 S5).

首先，我们在表达ChR2的LH输入的光刺激期间记录了电流钳，并观察到23神经元的27显示出对LH输入的光刺激的时间锁定响应（图6C）。 在VTA中采样的大多数DA神经元从LH（56％）接受净激发输入，而另一个子集显示净抑制（30％; 图6C）。 这些DA神经元的空间分布映射到含有VTA的水平切片的图谱上（图6D）。

为了建立LH输入对VTA DA神经元的单突触贡献，我们使用了ChR2辅助电路作图，其中在河豚毒素（TTX）和4-氨基吡啶的存在下进行电压钳记录（4AP; Petreanu等，2007）。 。 与我们从电流钳记录中观察到的结果一致，我们观察到，大多数记录的VTA DA神经元仅从LH接受兴奋性单突触输入（67％），而VTA DA神经元仅接受抑制性单突触输入（11％），或者两者（22％; 数字6E和 S6).

我们通过注射Cre依赖性荧光团（AAV）鉴定了VTA GABA神经元₅-DIO-mCherry）插入VGAT :: Cre小鼠的VTA中，并利用mCherry表达来指导VTA GABA神经元的记录（n = 24； 图6F）。 百分之四十六的VTA GABA神经元以净激发响应，而54％响应净抑制，对表达ChR2的LH输入进行光刺激（图6G）。 这些细胞的空间分布如图所示 图6H.在检查来自LH的单突触输入（如上所述）后，我们发现18％的采样GABA神经元仅接受兴奋性输入，而9％仅接受抑制性输入（图6一世）。 但是，相对于VTA DA神经元，我们发现更多的VTA GABA神经元同时接受了兴奋性AMPAR介导的和抑制性GABA_A来自LH的R介导的单突触输入（73％;卡方= 5.0505，p = 0.0246; 数字6我和 S6).

鉴于我们的离体记录提供了支持从GABA能和谷氨酸能LH预测到VTA的可靠输入的证据，我们接下来分别探讨了每种成分的作用。 为此，我们使用了在表达囊泡谷氨酸转运蛋白2（VGLUT2）或囊泡GABA转运蛋白（VGAT）的神经元中表达Cre重组酶的转基因小鼠品系。 我们注入了AAV₅-DIO-ChR2-eYFP或AAV₅-DIO-eYFP进入VGLUT2 :: Cre和VGAT :: Cre小鼠的LH并在VTA上植入光纤（图S7）。 然后对这些动物进行每种行为测定 图5.

我们没有发现LH中表达ChR2或eYFP的小鼠每个提示的端口条目数有任何可检测的差异^过剩-VTA投影（图7A）或在LH中^GABA-VTA投影（图7B）。 然而，通过视频分析，我们注意到LH中的异常啃咬行为^GABA-VTA：ChR2组在蓝光照射下（见 电影S3 和 S4）。 在LH^过剩-VTA小鼠，尽管与eYFP组相比，ChR2组的光刺激有减少的趋势，但这并没有统计学意义（图7C）。 相比之下，我们观察到在LH照射时饲喂小鼠的时间大幅度增加^GABA-VTA：相对于对照的ChR2组（图7D和 电影S3）。 在两组动物中，尾部撤回试验中都没有光刺激的效果（数字7E和7F）。

在喂食任务期间，正如我们在蔗糖寻找任务期间所做的那样，我们再次注意到异常的与饲料相关的运动序列并非针对食物。 我们在LH拍摄了一只代表性的老鼠^GABA-VTA：ChR2组在一个空的透明腔室中，并在20 Hz的光刺激下，观察到不寻常的刺激性运动序列，例如舔和empty地板或空的空间（电影S4）。 我们在野生型LH-VTA的喂养任务中量化了这些“啃咬”行为（图7G），LH^过剩-VTA（图7H）和LH^GABA-VTA（图7I）小组并表明LH^GABA-VTA：ChR2小鼠比野生型或LH啃得更多^过剩-VTA：与其各自的eYFP组相比，光刺激时的ChR2小鼠（图7J） 我们考虑了异常的与喂养有关的行为是否可能与较低频率的适当定向喂养分开。 但是，当我们测试LH时^GABA-VTA：ChR2组具有5 Hz和10 Hz的蓝光，我们观察到刺激频率与摄食和咬食之间的比例关系（图7K）。

该LH投影到VTA已探索与电刺激碰撞研究（Bielajew和Shizgal，1986），长期以来一直推测发挥奖励处理（霍贝尔和泰特鲍姆，1962，马尔古莱斯和奥兹，1962）的作用，但查明这角色一直是个挑战。 在这里，我们将详细分析LH-VTA循环的各个组成部分如何处理奖励相关任务的不同方面。

通过使用光遗传学介导的光标记（图1），我们已经确定了两个独立的LH神经元群：向VTA发送投射的细胞（1型）和从VTA接收反馈的细胞（2型; 图2尽管这些人群不需要相互排斥，因为LH神经元可能同时向VTA发送和接收来自VTA的输入。 有趣的是，我们发现相对较少的光响应神经元落在包含这两个群体的双峰分布之外（数字S2B和 1E）。 鉴于此，结合2型光响应的较长等待时间延迟（约100毫秒），我们推测可能存在一条有助于2型神经元活动的主要途径。 此外，由于DA结合G蛋白偶联受体，其动力学比大多数谷氨酸能突触要慢（Girault和Greengard，2004年），并且可以解释这种100 ms潜伏期的光响应单位簇。 VTA也可能通过兴奋性中间区域（如杏仁核）通过其他远端区域提供间接反馈，或者通过伏隔核（NAc）或纹状体终末床核（BNST）提供抑制作用。

有趣的是，虽然类型1单位的光刺激引起类型2单位的兴奋反应，但是类型1和2单位显示出不同的行为编码特性。 例如，选择性编码奖励预测提示的类型1和类型2单元的数量显着不同（n = 0/19类型1与n = 12/34类型2，卡方= 8.67，p = 0.003） 。 这种自相矛盾的响应模式可能是由于在中间电路元件（例如VTA）上的计算过程引起的，该过程可能在行为任务期间发挥积极作用，而在光电标记过程中却不起作用。 此外，动物的行为状态可能会影响如何处理这些数据。

我们的奖励遗漏实验使我们能够区分CR的LH神经编码和无条件刺激的消耗（US）。 在这些实验中，2型单元的子集响应于奖励预测线索（CS）和美国，并且当省略预期奖励时也显示出发射率的降低。 此外，2型单元的子集也会在意外奖励传递时显示相位激励（数字4G和4H）。 这些数据让人想起VTA中的DA神经元编码奖励预测错误的方式（Cohen等，2012； Schultz等，1997）。 我们推测，VTA神经元可能会将奖励预测错误信号传输到LH神经元的子集，该子集的位置很好，可以整合这些信号以确定适当的行为输出。 具体而言，左脑与其他多个大脑区域牢固地相互连接（Berthoud和Münzberg，2011），并因果关系与诸如睡眠/唤醒和饥饿/饱腹之类的体内稳态相关（Carter等，2009; Jennings等。 ，2013）。

强迫性寻求奖励行为主要是在吸毒成瘾的背景下进行讨论的，其中强迫性寻求毒品的经典范例是研究面对负面后果（如足部震动）寻求毒品行为持续的程度（Belin等，2008； Pelloux等，2007； Vanderschuren和Everitt，2004）。 我们对寻求蔗糖的任务进行了调整，使我们能够研究LH-VTA途径的激活是否足以促进强迫性蔗糖的寻找。 鉴于药物奖励与自然奖励之间的显着区别是，药物奖励对于生存不是必需的，因此，关于哪些行为会构成强迫性的寻求蔗糖或食物的行为存在争议。 对我们数据的另一种解释是，激活LH-VTA途径只会增加动机驱动力或寻求食欲增强剂的冲动。 随着近几十年来肥胖率的增加（Mietus-Snyder和Lustig，2008），强迫性暴饮暴食和糖瘾是对人类健康的主要威胁（Avena，2007）。 LH-VTA途径激活后，处于饱足状态（完全进食）的小鼠的进食行为让人联想到在被诊断为强迫性暴饮暴食症（或暴饮暴食症）（DSM-V）的人类中所见的进食行为。

有人提出，重复的行为会导致习惯的形成，这些习惯本身会导致强迫性的奖励寻求成瘾的特征（Everitt和Robbins，2005）。 我们发现LH-VTA神经元仅在调节后编码端口进入，这表明该途径选择性地编码条件反应，而不仅仅是动机。 这与我们的观察结果一致，即光学激活这一预测可以促进面对消极后果的强迫性奖励（图5C），以及在没有需要的情况下（如在小鼠中所见， 图5E）。 我们的发现进一步证实了这种解释，即LH-VTA途径的光抑制选择性地减少了强迫蔗糖寻求（图5D）但不减少食物受限小鼠的进食（图5F）。 治疗强迫性暴食或暴食症的最大挑战之一是一般会损害喂养行为的风险。 从翻译的角度来看，我们可能已经确定了一种特定的神经回路作为强迫暴饮暴食或糖成瘾治疗干预的潜在目标，而不会牺牲自然摄食行为。

我们显示，除了谷氨酸能LH-VTA组分（Kempadoo等，2013）外，投影中还有重要的GABA能组分（Leinninger等，2009），并且LH神经元直接突触到DA和VTA中的GABA神经元（图6）。 然而，对VTA DA和GABA神经元的兴奋性/抑制性输入的平衡存在差异。

虽然我们使用免疫组织化学处理来验证VTA神经元的身份，但我们也测量了I_h，一种超极化激活的内向整流非特异性阳离子电流（Lacey等，1989，Ungless and Grace，2012）。 该电流的存在已广泛用于电生理研究中以鉴定DA神经元，但已显示仅存在于DA神经元的亚群中（由投影靶标定）（Lammel等，2011）。 尽管Fields及其同事先前曾在评论中提出“ LH神经元突触到PTA的VTA投影上，而不是NAc的突触”（Fields等人，2007年），但我们的数据表明这一争议重新开始有待进一步调查。 即使我们确实观察到了DA神经元的一个子集，该子集从LH受到净刺激，并且拥有非常小的I_h （与mPFC或NAc内侧壳突出的DA神经元一致），我们还观察到DA神经元的子集接受净兴奋性输入并显示大I_h （与突出到NAc侧壳的DA神经元的特征一致; 图S5; Lammel等，2011）。 相反，接受净抑制输入的VTA DA神经元显示出非常小的I_h 或缺少这种电流，这与LH将主要抑制性输入发送到投射到mPFC或NAc内侧壳层的VTA DA神经元的观点相一致。 我们还显示LH输入可以在内侧和外侧VTA中观察到，这表明LH向具有不同投影目标的VTA神经元提供了输入，因为众所周知VTA投影目标在某种程度上对应于沿内侧-外侧轴的空间位置（ Lammel等，2008）。

LH-VTA途径在促进奖赏中的作用先前已归因于VTA中的谷氨酸能传递（Kempadoo等，2013），因为通常认为CaMKIIα启动子对兴奋性投射神经元具有选择性。 但是，我们的数据清楚地表明，在CaMKIIα启动子的控制下表达ChR2也靶向LH中的GABA能投射神经元（图6).

由LH的光刺激引起的行为^GABA-VTA途径疯狂，误导和适应不良（电影S4）。 一种解释是激活LH^GABA-VTA途径向鼠标发送信号，导致识别食欲增强物。 另一种解释是LH^GABA-VTA途径可能驱动激励突显或强烈的“缺乏”，与条件性方法的信号一致，但是在非生理水平上产生这种异常的与喂养相关的行为（Berridge和Robinson，2003）。 与此一致，有可能激活LH^GABA-VTA投影实际上会产生强烈的渴望感，或者渴望进食。 但是，我们的实验表明LH的激活^GABA-VTA不会增加强迫性蔗糖寻求，但这可能是由于过度啃咬和异常的食欲行为集中在测试室中的非食物物体上。 尽管在该操作期间难以确定小鼠的经验，但显然适当指导的与喂养相关的行为需要LH-VTA途径的GABA能和谷氨酸能组分的协调激活。

光遗传学和药物遗传学操作是建立因果关系的有力工具，但它们并未揭示神经回路元件的内源性生理特性。 我们的研究统一了有关突触连接，自然发生的内源性功能以及LH-VTA途径的因果作用的信息，为如何将信息集成到该电路中提供了新的洞察力。 除遗传标记外，这些结果强调了通过连接检查神经元功能作用的重要性。 LH-VTA神经元选择性地编码奖励寻求的动作但不编码环境刺激，而奖励刺激和奖励预测线索由VTA下游的离散LH神经元群编码。 此外，我们已经确定了一个与强迫蔗糖寻找和摄食行为有因果关系的具体预测。 LH-VTA预测的异质性对于在驾驶动机和调节适当指导的食欲行为之间提供适应性平衡是必要的。 这些发现提供了与病理状况相关的见解，例如强迫性暴食症，糖成瘾和肥胖症