李宝,
& 玛格丽特·赖斯
自然通讯
6,
文章编号:
8543
DOI:10.1038 / ncomms9543
收到
02 June 2015
已接受
02 September 2015
发布时间
抽象
胰岛素激活下丘脑中的胰岛素受体(InsRs)以在饭后发出饱腹感。 然而,导致胰岛素水平长期升高的肥胖发病率上升意味着胰岛素也可能在调节动机和奖励的大脑中心起作用。 我们在这里报道胰岛素可以通过间接机制放大伏隔核(NAc)和尾状壳核中的动作电位依赖性多巴胺(DA)释放,所述间接机制涉及表达InsR的纹状体胆碱能中间神经元。 此外,在大鼠中的两种不同的慢性饮食操作,食物限制(FR)和致肥胖(OB)饮食,相反地改变了纹状体DA释放到胰岛素的敏感性,具有增强的FR反应性,但是OB中的反应性丧失。 行为研究表明,NAc壳中的完整胰岛素水平对于获得对配对葡萄糖溶液的风味的偏好是必需的。 总之,这些数据意味着纹状体胰岛素信号传导增强DA释放以影响食物选择。
介绍
已确定的是,餐后期间和餐后血浆胰岛素的持续增加会激活下丘脑中的胰岛素受体(InsRs),这会给食欲回路提供负面反馈,进一步减少进食1, 2, 3。 脑胰岛素主要来自胰腺β细胞,在血脑屏障处从血浆到脑的主动转运4, 5, 6, 7, 8虽然有越来越多的证据表明神经元胰岛素的合成和释放1, 9。 值得注意的是,InsRs的表达并不局限于下丘脑,尽管下丘脑外InsRs的功能仍未得到解决1, 2, 3。 鉴于肥胖和II型糖尿病的发病率不断上升,其中胰岛素的循环水平不断升高,大脑胰岛素转运和受体敏感性降低3, 8, 10, 11,了解调节动机和奖励的大脑区域胰岛素的功能至关重要。 特别感兴趣的脑区包括伏隔核(NAc),其介导食物和药物的奖赏效果12, 13和尾壳核(CPu),它在基于习惯的行为和渴望中发挥作用13。 InsR在这些区域中表达,最高密度出现在NAc中3, 14; InsRs也由中脑中的多巴胺(DA)神经元表达,包括腹侧被盖区(VTA)和黑质致密区(SNc)中的神经元。15。 脑胰岛素水平与血浆胰岛素浓度和身体肥胖成正比6, 7, 8导致这样的假设,即胰岛素可能在这些大脑区域的InsRs中起作用以影响食物奖励3, 16, 17.
以前的研究纹状体突触体,异种细胞,脑片和 体内 已经表明胰岛素激活InsRs导致DA转运蛋白(DAT)DA摄取增加18, 19, 20, 21, 22, 23。 该过程涉及PI3激酶信号传导途径19, 20,并导致DAT插入质膜19。 循环胰岛素水平动态调节纹状体DAT活性,降低DA摄取和DAT表面表达,见于糖尿病动物模型和食物限制(FR)后20, 21。 已显示胰岛素依赖性DAT活性增加可降低诱发的细胞外DA浓度([DA])o)在VTA中23,反映了DA释放与吸收之间平衡的转变。 与胰岛素在饱腹感中确定的作用一致,VTA中的胰岛素急性显微注射可降低食物奖励23, 24而在VTA和SNc DA神经元中缺乏InsRs的小鼠显示食物摄入量增加并变得肥胖25。 虽然胰岛素可以诱导长期抑制VTA DA神经元的兴奋性输入24再次与饱腹感的作用一致,胰岛素暴露也可以通过降低DA释放和自身受体介导的抑制来增加DA神经元放电率25。 因此很难预测胰岛素对纹状体DA释放的净效应。 实际上,胰岛素对纹状体DA释放影响的研究结果 体外 片19 以及NAc局部显微注射胰岛素对食物奖励的影响26 看似矛盾。 为了解决这个问题,我们评估了NAc和CPu的完整微环境中的轴突DA释放和摄取 体外 使用快速扫描循环伏安法(FCV)的纹状体切片,并确定NAc中胰岛素信号传导对奖赏行为的影响 体内.
我们的研究表明胰岛素在NAc和CPu中的主要作用是增强DA释放,尽管DA摄取同时增加。 这种DA释放的动态调节涉及纹状体胆碱能中间神经元(ChI)的兴奋性的胰岛素依赖性增加,其通过激活烟碱乙酰胆碱(ACh)受体(nAChR)导致DA释放增强。 胰岛素对ChIs和DA释放的影响由InsRs介导。 值得注意的是,胰岛素对DA释放的影响在FR大鼠的切片中被扩增,但在致肥胖(OB)饮食的大鼠中减弱。 这些数据显示了DA释放的扩增 体外 胰岛素切片导致胰岛素可能作为奖励信号的预测 体内。 实际上,平行行为研究证明了在风味偏好调节中胰岛素在NAc壳中的作用。 总之,这些发现表明胰岛素作为可影响食物选择的奖励信号的新作用
成果
作用于InsRs的胰岛素增加诱发的纹状体DA释放
本地诱发的初步检查[DA]o 用FCV监控 体外 大鼠纹状体切片 随意 (AL)对食物和水的获取揭示了意外的发现,即在一系列生理相关浓度下急性应用胰岛素1, 4 增加单脉冲诱发[DA]o (图1a-c),用胰岛素EC50 2-12 nM的值(效应半数最大值)图1b)。 诱发增加[DA]o 特别令人惊讶的是,这伴随着最大速率的显着增加(V最大)在每个次区域进行DAT介导的摄取(表1),这会导致诱发的竞争性减少[DA]o,如前所述22, 23。 相反,我们发现诱发[DA]o 通过20 nM胰岛素最大限度地扩增55-30%; 比例效应最大的区域是NAc壳,它是具有最高InsR表达的纹状体亚区1, 14。 在相同条件下暴露于30 nM胰岛素的切片显示纹状体DA含量没有变化(补充图1a),暗示胰岛素改变动态释放调节,而不是简单地上调DA合成。 值得注意的是,胰岛素对诱发的影响[DA]o 在超生理浓度≥100nM时丢失(图1b)。 这不是DAT活动超过释放的结果,因为胰岛素的作用 V最大 在这些浓度下也会丢失(表1)。 总体而言,这些数据表明,在完整的纹状体微环境中,胰岛素对诱发的主要作用[DA]o 尽管DA摄取量同时增加,但仍会增加释放量。
因为胰岛素也可以作用于胰岛素样生长因子1受体(IGF-1Rs),尽管浓度超过100 nM(参考文献1)。 1),我们试图证实胰岛素对诱发的增强作用[DA]o 是InsR依赖。 事实证明是这种情况,因为细胞内InsR抑制剂羟基-2-萘基甲基膦酸(HNMPA)和InsR拮抗剂S961阻止了这种效应,但是IGF-1Rs,鬼臼苦素的选择性抑制剂没有阻止这种效果。24 (PPP; 图.1c,d 和 补充图1b,c)。 然后,我们检查了PI3激酶的参与,其启动了负责DAT的胰岛素依赖性调节的信号传导途径19。 在浓度为1μM时,单独的P13K抑制剂LY249002对峰诱发的[DA]没有影响。o or V最大 (n=每种药物的29-76位点(NAc核心), P> 0.05,单向方差分析(ANOVA); 数据未显示),但尚未预防胰岛素对诱发的[DA]的影响o 在所有纹状分区域(图1d 和 补充图1b,c).
InsRs对DA轴突和ChIs的定位
观察到的增加 V最大 对于具有生理水平的胰岛素的DA摄取意味着在DA轴突上存在InsR,在各种纹状体制剂中的先前结果也是如此18, 19, 20, 21, 22。 尽管已证实InsRs在中脑DA神经元上的功能性表达15, 23, 24, 25,有关纹状体DA轴突的InsR表达尚未见报道。 我们使用免疫组织化学解决了这个问 整个纹状体的致密InsR免疫反应性限制了对DA轴突的InsR定位的定量评估,其通过DA合成酶,酪氨酸羟化酶(TH)的免疫反应性鉴定。 因此,我们采用了先前报告的方案27,其中包括在正常图像视图中计数与TH +轮廓重叠的InsR puncta,并在InsR图像仅旋转90°后再次计数。 如果InsR和TH +谱的明显重叠是非特异性的,则该程序应该给出统计学上相似的计数,无论是正常还是90°异相。 然而,该分析显示InsR puncta与TH +曲线14±9%的重叠减少(n= 42字段, P<0.01,配对两尾 t-测试; 数据未显示),确认InsR存在于DA轴突上。 然而,更有趣的是,纹状体的InsR免疫标记揭示了通过共同免疫标记胆碱乙酰转移酶(ChAT)(ACh合成所需的主要酶)鉴定为纹状体ChI的大细胞体上的不同InsR表达。 使用电生理学标准28 在初步的全细胞记录研究中鉴定ChIs,用生物胞素填充几个神经元,然后进行免疫组织化学处理; 所有这些(4 / 4)对InsR和ChAT都是免疫阳性的(图2a)。 随后对NAc中InsR和ChAT共定位的评估证实,几乎所有ChAT +神经元均表达InsR(96%; n=来自两只大鼠的四个切片中的27 / 28神经元)。
胰岛素增加ChI兴奋性
为了测试InsRs对纹状体ChI的功能,我们使用全细胞电流钳记录检查了胰岛素对Ch1兴奋性的影响。 使用一系列3-s去极化电流脉冲评估ChI兴奋性,以引出可靠地表现出尖峰频率适应的一系列动作电位(图2b),通常在电流脉冲结束时失去尖峰。 引人注目的是,胰岛素(30 nM)减弱了尖峰频率适应,导致动作电位数随时间逐渐增加(图2c),最大增加(图2d,e)通常见于20和50 min之间的胰岛素暴露。 在没有胰岛素的情况下,对照ChI显示诱发动作电位的数量没有变化(P> 0.05,配对两尾 t-测试; 数据未显示); 当与在相同时间间隔内监测的对照神经元相比时,暴露于胰岛素的神经元显示出诱发动作电位数量的显着更大的变化(对照 n=来自四个神经元的12刺激对,胰岛素 n=来自七个神经元的21刺激对, F1,25= 5.63, P<0.05,混合测量双向方差分析; 数据未显示)。 HNMPA阻止了胰岛素对增加动作电位数量的作用,但IGF-1R选择抑制剂PPP并未阻止胰岛素的作用(图2e),证明胰岛素增加的Ch1兴奋性是InsR介导的。
诱发胰岛素增强[DA]o 需要nAChRs和ACh
以前的研究表明,ChIs和ACh通过DA轴突上的nAChRs有效调节纹状体DA的释放。29, 30, 31, 32, 33, 34。 在急性胰岛素暴露中,ChIs的丰富InsR表达和ChI兴奋性的增强表明这些神经元可能是胰岛素的新靶点,可导致DA释放增强。 为了测试这一点,我们检测了胰岛素在mecamylamine(一种非选择性nAChR拮抗剂)或二氢-β-红霉素(DHβE)存在下的作用,二甲基-β-红霉素(DHβE)是一种富含β2亚基的β2亚基(βXNUMX*)nAChRs的选择性拮抗剂。 DA轴突35。 诱发[DA]o 在这些拮抗剂存在下很容易检测到,即使两种药物都降低了单脉冲诱发的振幅[DA]o (如先前报道的,通过NAc核心中的13-26%)29, 30, 31, 32。 为了支持ACh和nAChRs的作用,胰岛素对诱发的作用[DA]o 美卡拉明或DHβE预防了图2f)。 为了证实纹状体ACh信号传导参与胰岛素增强的DA释放,我们检测了胰岛素的作用 体外 来自小鼠的纹状体切片,其中ChAT表达在前脑结构中被遗传消融(前脑 ChAT的 KO小鼠),包括纹状体32。 尽管在这些小鼠中ChIs是完整的,但是ACh合成被废除,这导致减少但仍然容易检测到的单脉冲诱发[DA]o,如前所述32。 在对照杂合子同窝中,胰岛素(30 nM)增加诱发[DA]o 在NAc shell和core以及CPu中的37-90%(图2g),超过大鼠纹状体中的扩增(例如, 图。 1)。 然而,胰岛素对诱发[DA]的影响o 整个前脑纹状体复合体缺失 ChAT的 KO小鼠,证明胰岛素介导的DA释放增强需要纹状体ACh,但不能共同释放来自ChI的发射体,如谷氨酸36.
胰岛素对诱发的影响[DA]o 是饮食依赖
血浆和脑胰岛素浓度与身体肥胖成正比6, 7, 8,并可能导致大脑对胰岛素敏感性的代偿性变化。 因此,我们使用来自维持慢性FR或OB饮食的大鼠的纹状体切片与AL对照来测试饮食影响胰岛素促进DA释放的能力的假设。 正如预期的那样,血浆胰岛素水平与体重相关,FR中胰岛素水平低于AL或OB大鼠(图3a 和 表2)。 尽管循环胰岛素存在这些差异,但峰值诱发[DA]o 在NAc的外壳和核心中,CPu明显较低 体外 来自两个饮食组的纹状体切片与AL相比(图3b 和 补充图2 a,b),暗示除胰岛素之外的因素控制绝对诱发[DA]o。 纹状体DA含量在饮食组之间没有差异,表明释放调节的变化而不是DA合成(补充图2c)。 与动态调节的变化一致,纹状体DA释放到胰岛素的敏感性显着地依赖于饮食。 在FR大鼠中,胰岛素浓度≤1nM,对AL没有影响(图1b),诱发增加[DA]o (图3c),反映了EC增加的胰岛素敏感性50 FR纹状体(0.4-0.6 nM)中的值比AL中的值低约一个数量级(比较 无花果1b 和 3c)。 与之形成鲜明对比的是,OB纹状体中胰岛素的作用丧失了; 甚至30 nM胰岛素,对AL纹状体有最大作用(图1b),对OB没有影响(图3c).
这些数据意味着纹状体InsR敏感性与身体肥胖之间存在反比关系。 然而,另外,这些依赖于饮食的差异可能反映了nAChR敏感性的改变。 因此,我们确定了每个饮食组对NAc核心中尼古丁的浓度反应。 尼古丁导致nAChR脱敏,可通过比较[DA]的比例来量化o 通过100 Hz的短脉冲五脉冲诱发单脉冲诱发[DA]o (5 p:1 p比率)作为nAChR活化/脱敏的指标30, 31。 使用这种方法,我们发现饮食组之间在NAc核心中nAChR敏感性没有差异(补充图3a-c)。 此外,控制5 p:1 p比率在NAc核心的饮食组之间没有差异(补充图3d)或CPu(未示出),暗示饮食不改变nAChR依赖性DA释放调节。 因此,纹状体InsR敏感性似乎在FR对AL大鼠中增强,但在OB大鼠中不存在,在生理浓度的胰岛素处失去对纹状体DA释放的调节。
NAc壳胰岛素调节条件性风味偏好
食物偏好由摄入前和摄入后因素产生; 每种机制都没有完全解决,但目前的证据都暗示NAc DA信号传导37, 38。 鉴于血浆和脑脊液(CSF)胰岛素水平在外周血糖升高后迅速上升6并且可以在血浆胰岛素升高的5 min内检测到纹状体中胰岛素的增加7,合理地假设在进餐期间外周胰岛素释放可以增强NAc DA释放并有助于后摄入奖励机制。 我们采用了先前描述的风味偏好协议37 在大鼠中使用糖精加糖的葡萄糖溶液来检验通过在NAc中局部施用胰岛素抗体(InsAb)来阻断内源性胰岛素作用的假设将降低对配对风味的偏好。 Insab在阻断胰岛素作用方面的功效进行了测试 细胞/组织 测定DA摄入纹状体突触体。 胰岛素(30 nM)引起显着增加 V最大 来自NAc或CPu的突触体(补充图4),与我们一致 V最大 纹状体切片的数据(表1和以前的研究18, 19, 20, 21, 22, 23。 在没有胰岛素的情况下,InsAb和对照抗体免疫球蛋白G(IgG)均未改变 V最大 用于DA摄取与对照。 在存在IgG的情况下,胰岛素仍然导致显着增加 V最大; 然而,胰岛素的作用 V最大 在InsAb面前丢失了补充图4).
为了最小化组织损伤并保持组织靶标的敏感性,测试了两组受试者,其中我们用模拟显微注射程序交替NAc内显微注射,而不是使用单组受试者并将一种调味溶液与InsAb配对,另一组与车辆。 因此,在一瓶调理期间,实验组接受了InsAb微注射与两种口味中的一种配对,并在交替疗程中,模拟显微注射与其他口味搭配(图4a, 剩下)。 对照组接受模拟显微注射,交替显示磷酸盐缓冲盐水(PBS)或IgG的显微注射。 两种调味溶液在调理期间都含有葡萄糖。 在对照微注射组中没有预期风味之间的差异偏好,而在InsAb-显微注射组中预期优选转向模拟显微注射配对风味。
在单瓶调理期间,与第三次和第四次输注期间的载体相比,InsAb显微注射显着降低了消耗量(图4b)。 相比之下,在所有四次模拟注射过程中,两组都消耗了相同体积的溶液(F3,111= 0.127, P>0.05,混合双向ANOVA)(图4b)。 在总共八次调理期后,在两瓶测试中评估风味偏好,其中大鼠同时获得两种调味溶液(图4a)。 统计分析显示风味与调理期间接受的显微注射治疗之间存在显着的相互作用(图4c)。 与模拟配对风味相比,InsAb组消耗的InsAb配对风味显着减少(图4c),而车辆组显示没有风味偏好(图4c),暗示完整的胰岛素信号传导有助于选择甜的热量溶液。 与载体相比,InsAb显微注射的大鼠显着减少了输注配对的风味,并显着增加了模拟注射配对的风味(图4c)。 显微注射IgG(t(9)= 0.792。 P>0.05,受保护 t- 测试)或PBS(t(9)= 0.442。 P>0.05,受保护 t - 试验)对风味偏好没有影响(数据未显示),反对InsAb显微注射的非特异性作用降低消费或风味偏好的可能性。 还应该注意的是,InsAb组在测试时的偏好并不是对新颖性较小的偏好,因为InsAb组的会话和会话类型(实际输注与模拟输注)之间没有相互作用(F3,54= 1.584, P> 0.05,双向ANOVA)。 也就是说,与InsAb输液配对的风味相比,InsAb组没有消耗更多的模拟输液配对的风味。 相反,治疗组之间的差异仅在输注条件治疗期间出现。 总体而言,这些数据表明,NAc中的胰岛素在增强对发出血糖负荷信号的风味的偏爱中起作用。
讨论
我们在此报道胰岛素通过InsRs调节Ch1兴奋性以nAChR依赖性方式扩增纹状体DA释放。 我们的研究结果表明,胰岛素可以作为一种奖励信号,除了它在信号饱腹感中的既定作用。 值得注意的是,胰岛素对DA释放的影响受饮食调节,FR后对胰岛素的敏感性显着增加,但对OB饮食的胰岛素增强调节完全丧失。 这些变化似乎反映了与循环胰岛素水平呈负相关的InsR敏感性变化,因为发现血浆胰岛素水平与饮食有关,但nAChR敏感性则不然。 最后,我们对行为动物的风味偏好研究暗示NAc壳中的胰岛素信号传导会影响食物偏好,这不仅暗示了胰岛素在食物相关学习中的作用,而且还证实了其作为奖励信号的作用。
净[DA]o 通过DAT反映了DA释放与DA摄取之间的平衡。 以前的证据表明胰岛素可以调节DAT活性18, 19, 20, 21, 22, 23 导致预测胰岛素增加应引起诱发的净减少[DA]o 通过增加DA吸收。 然而,我们发现在纹状体中,胰岛素的作用比这更复杂。 虽然胰岛素暴露确实增加 V最大 对于DAT,胰岛素的主要作用是DA释放,而不是DA摄取,诱发[DA]持续增加o 穿过NAc壳和核心以及CPu中的生理范围的胰岛素浓度。 虽然诱发的增加[DA]o 确实恢复到超生理浓度的100 nM的对照水平, V最大 也没有控制,取消了对DAT的主要影响作为解释。 相反,对摄取和释放的影响的丧失暗示InsR的脱敏或高胰岛素浓度下游信号传导途径的下调。 实际上,InsR在外周组织中胰岛素结合后经历快速内吞作用和降解1,短期暴露于高水平胰岛素或高热量饮食后出现神经元InsR敏感性丧失的新证据10, 11, 39.
这里报道的胰岛素增强纹状体DA释放的主要作用与最近另外两个的结果形成对比 体外 切片研究。 首先,胰岛素导致电诱发溢出减少[3来自纹状体切片的H] DA虽然增加[3当DAT被抑制时,检测到H] DA溢出22。 鉴于已发布[3H] DA必须在整个组织中逃避DAT介导的摄取,以在超融合溶液中检测,该方案对DAT调节特别敏感。 我们的结果显示胰岛素通过ChIs和nAChR激活增强DA释放,除了增强DAT介导的摄取外,还可以解释胰岛素增强的看似矛盾的增加[3当DAT上的竞争效果被阻止时,看到H] DA溢出22。 第二项研究使用FCV直接检测VTA中的体细胞树突状DA释放,但也发现胰岛素对DA摄取的主要影响,反映在诱发减少[DA]o (参考文献。 23)。 许多因素的差异,从局部微电路到体细胞树突与轴突DA释放机制40,可以促成这种区域差异。 然而,如下面进一步讨论的,胰岛素的区域依赖性作用可能是互补的,而不是相互矛盾的。
以前,已经假设DA信号传导的胰岛素依赖性调节的任何作用是通过DA神经元上的InsR的直接激活来介导的。 我们在这里显示InsRs也在纹状体ChIs上表达,并且胰岛素调节Ch1兴奋性以扩增纹状体DA释放,这可能在胰岛素对饮食的影响中起关键作用。 纹状体ChIs接收来自丘脑的层内核的神经元的投射,其响应于显着的感觉刺激而表现出爆发射击并且有助于驱动ChI中的突发 - 暂停尖峰模式,这对于引导注意力,强化和联想学习是重要的。41。 因此,InsRs上的胰岛素对纹状体ChI的作用可以增强感觉食物线索对纹状体对丘脑射击的反应性的影响,有助于增加对摄取的膳食的奖赏价值的感知。 通过ChI激活直接促进纹状体DA释放已经导致了这样的建议:刺激ChIs的因素将作为DA释放的触发因素具有特权作用33。 我们的数据为此提供了第一个支持证据,胰岛素增强的ChI兴奋性和ACh信号传导驱动DA释放的动态增加。
在存在胰岛素的情况下升高的DA释放也反对ACh信号传导的增强,其导致nAChR脱敏或毒蕈碱性ACh受体(mAChR)激活,其中任一种都可以抑制单脉冲诱发的[DA]。o (参 29, 30, 31, 42)。 因此,这里报道的机制不同于mAChR的ACh活化,其与厌恶和饱腹感有关43.
单脉冲诱发[DA]o FR和OB大鼠均低于AL大鼠; 虽然这些结果与以前的报告一致44, 45, 46,我们的研究提供了在恒定时间范围内对两个饮食组中三个纹状体亚区域的第一次系统比较。 DA释放中与饮食有关的变化的机制尚未阐明,并且超出了本研究的范围。 然而,鉴于FR和OB饮食可使血浆胰岛素水平发生相反的变化,因此不太可能降低诱发因素[DA]o 在两组中都是饮食依赖性胰岛素水平的结果。
另一方面,InsR对饮食和随后的饮食依赖性血浆胰岛素水平的敏感性的变化提供了对FR中胰岛素敏感性增加和OB中对胰岛素反应性丧失的最可能的解释。 没有证据表明FR或OB大鼠与AL相比,nAChR敏感性改变的替代解释。 虽然我们的研究结果是首次表明纹状体InsR对FR的敏感性增加18,体重减轻可伴随着脑脊液中胰岛素水平的降低7,这将有助于提高FR释放对胰岛素的敏感性。 相反,OB大鼠胰岛素反应性的丧失与之前因体重增加或OB饮食引起的脑InsR敏感性降低的证据一致。3, 10, 11.
我们的全球洞察力 体外 切片数据支持胰岛素可能发出奖励和饱腹感的假设。 我们通过在风味偏好调节期间在NAc壳中阻断内源性胰岛素与双侧InsAb显微注射的作用来测试该假设。 与奖赏中的作用一致,阻断胰岛素的作用降低了对配对的含葡萄糖的溶液的风味的偏好,而不是与完整的胰岛素信号传导相关的风味。 在一瓶调理期间阻断NAc壳中的胰岛素也降低了配对溶液的消耗,而模拟或对照显微注射对消耗没有影响。 这些数据表明NAc壳中的胰岛素在食物偏好中起作用。 以前的研究表明,NAc中的完整DA信号传导对于获得风味调节是必需的37, 38,确认NAc DA在调节营养液的增强作用中的作用。 从这个角度来看,对完整胰岛素可用性的葡萄糖溶液的偏好反对胰岛素对NAc壳中DAT介导的DA摄取的主要影响,因为预计这会降低[DA]。o 因此减少对照配对风味的消耗。 我们的结果也与以前的研究结果一致,其中NAc壳中微量注射胰岛素增加了动物进行口服蔗糖自我给药的时间,蔗糖消耗量增加了临界值。26这与DA摄取增加的预期结果相反。 总体而言,这些行为数据与胰岛素对纹状体ChI和增强的DA释放的预测影响一致。 然而,这些结果并不排除纹状微电路的其他元素参与监测行为,因为整个纹状体中广泛存在InsR表达。1, 14.
这里报告的研究提供了第一个证据,即胰岛素在传递热量值方面发挥作用,因此影响膳食的有益效果,这对胰岛素在体重不足和肥胖受试者中的影响具有重要意义。 一些研究表明食物的摄入后效应,无论味觉转导途径是否完整47,增加NAc DA释放和行为的积极强化37, 47。 因此,吸收后胰岛素反应可以编码膳食的血糖产量并且有助于加强食物偏好和能够消费的行为。 然而,循环胰岛素水平和中心InsR敏感性的极端变化可能在异常和适应性行为中起作用。 例如,低血容量血症和FR受试者InsR敏感性的代偿性上调可能是他们暴饮暴食的一个因素48。 相反,在OB大鼠中反映的II型糖尿病或肥胖的中枢胰岛素不敏感,可能导致摄入后的奖励感降低,推动摄入具有高血糖指数的食物作为补偿49, 50。 因此,纹状体胰岛素敏感性的增加或减少可能导致病理性进食,导致暴食和/或肥胖。
总体而言,我们的研究结果揭示了胰岛素作为奖励信号的新作用。 这种作用与其作为饱腹感信号的已知功能形成对比,包括近期发现微量注射到VTA中的胰岛素可以减少享乐喂养和对与食物奖励相关的线索的偏好23, 24。 这提出了一个问题,即如何协调这些DA依赖性功能中看似相反的胰岛素作用。 答案可能是这些影响是互补的,而不是相互矛盾的。 目前的结果表明,纹状体中的胰岛素传达摄入的膳食的奖励值。 信号饱足的双重作用可以简单地允许胰岛素用于结束膳食的重要目的,同时建立其营养的记忆并因此奖励品质,从而加强摄取行为的重复。
方法
动物处理
动物程序符合NIH指南并经纽约大学医学院动物护理和使用委员会批准。 所有动物都在12光照下:黑暗周期,从06开始照明:00至18:00; 体外 在08:00和12:00之间制备切片。 在AL大鼠和小鼠中进行机制研究 体外 来自成对饲养的动物的切片,而大鼠单独饲养用于所有饮食组比较和行为研究。
大鼠饮食疗法
成年雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic)在开始持续8-10天的饮食方案时为21-30周。 将大鼠半随机分配至饮食组:按初始体重对受试者进行分级,然后将每个连续的三个大鼠随机分配到饮食组中。 在FR或OB饮食中,AL大鼠与配对大鼠同时自由进入大鼠食物。 所有大鼠都可以自由饮水。 食物限制如前所述实施51; 简言之,大鼠每天接受40-50%的AL摄入标准大鼠食物直至体重减少20%,之后滴定食物以维持该重量。 OB大鼠可以自由获取大鼠食物和巧克力确保,一种高度可口的液体,具有中等高脂肪和糖52.
前脑 ChAT的 淘汰老鼠
具有条件性floxed等位基因的小鼠 ChAT的 (ChAT的FLOX与...交叉 Nkx2.1CRE 转基因系产生小鼠,其中ACh合成的消融仅限于前脑32。 对照的非突变转基因同窝小鼠; 他们的基因型Cre+;ChAT的FLOX / + 和克里斯 - ;ChAT的FLOX / FLOX 被称为“杂合子”。 用于切片研究的成年雄性小鼠具有 随意 进入食物和水。
离体 切片制备和生理解决方案
用50 mg kg对大鼠或小鼠进行深度麻醉 - 1 戊巴比妥(腹膜内(ip))和断头。 对于伏安法,在含有(以mM计):NaCl的冰冷HEPES缓冲人工CSF(aCSF)中的Leica VT300S振动刀片切片机(Leica Microsystems; Bannockburn,IL)上切割冠状前脑切片(400-1200-μm厚度)。 (120); 碳酸氢钠3 (20); 葡萄糖(10); HEPES酸(6.7); KCl(5); HEPES钠盐(3.3); 氯化钙2 (2); 和MgSO4 (2),用95%O平衡2/ 5%CO2。 然后在实验前将切片在室温下保持在该溶液中1 h30, 32, 53。 对于电生理学,在麻醉后,用含有(以mM计)的冰冷溶液经心脏灌注大鼠:蔗糖(225); KCl(2.5); 氯化钙2 (0.5); 氯化镁2 (7); 碳酸氢钠3 (28); 氢化钠2PO4 (1.25); 葡萄糖(7); 抗坏血酸(1); 和丙酮酸(3),并用95%O平衡2/ 5%CO2。 在该溶液中切割切片,然后转移到含有(以mM计):NaCl(125)的改良的aCSF中的回收室中; KCl(2.5); 氢化钠2PO4 (1.25); 碳酸氢钠3 (25); 氯化镁2(1); 氯化钙2 (2); 葡萄糖(25); 抗坏血酸(1); 丙酮酸(3); 和 MYO- 肌醇(4),用95%O平衡2/ 5%CO2; 该溶液最初在34℃,然后逐渐冷却至室温54。 所有伏安法和生理学实验均在32°C的浸没式记录室中进行,其以1.5 ml min灌注。 - 1 含有aCSF(以mM计):NaCl(124); KCl(3.7); 碳酸氢钠3 (26); 氯化钙2 (2.4); 硫酸镁4 (1.3); KH2PO4 (1.3); 和葡萄糖(10),以及牛血清白蛋白(BSA,0.05-0.1 mg ml) - 1用95%O平衡2/ 5%CO2; 在实验之前,使切片在该环境中平衡30 min。
快速扫描循环伏安法
在脑切片中使用FCV进行诱发的DA释放研究32, 53 从雄性大鼠或 ChAT的 前脑敲除小鼠和杂合子对照(5-8周)。 研究 ChAT的 敲除小鼠是不知情的,但是大鼠饮食组具有明显的表型,其排除了致盲。 使用Millar Voltammeter进行伏安测量(可通过特殊要求获得St Bartholomew博士和伦敦大学皇家伦敦医学和牙科学院的Julian Miller博士)。 传统的三角波形用于FCV,扫描范围为-0.7至+ 1.3 V(相对于Ag / AgCl),扫描速率为800 V s - 1,采样间隔为100 ms30, 32, 53。 使用由Clampex 1200软件(Molecular Devices)控制的DigiData 7.0B A / D板获取数据。 使用同心刺激电极诱发DA释放; 刺激脉冲幅度为0.4-0.6 mA,持续时间为100μs30, 32, 53。 局部单脉冲刺激用于NAc核心和CPu; 然而,使用短暂的高频脉冲序列(100 Hz的五个脉冲)来放大诱发[DA]o 在NAc shell中。 两种刺激范式都引发了DA释放,即动作电位和Ca.2+ 依赖性,不受同时释放的谷氨酸和GABA的影响42, 55,并由同时发布的ACh促成29, 30, 31, 32, 33, 34。 量化诱发[DA]o在aCSF中的每次实验后以及在给定实验期间使用的每种药物存在下,用32℃下已知浓度的DA校准电极。53.
伏安法实验评估胰岛素对诱发的影响[DA]o 使用两种方案中的任何一种获得。 通过监测诱发[DA]进行初步实验以确定胰岛素(Sigma,I5523)作用的时间过程。o 每个5 min在一个站点中。 一致性诱发后应用胰岛素[DA]o 获得(通常是4-5测量); 50-60 min后胰岛素的作用最大,然后诱发[DA]o 在实验期间保持在该水平(通常为90 min胰岛素总暴露量; 图1c)。 随后,通过记录诱发评估胰岛素的作用[DA]o 在对照条件下(aCSF或aCSF加药物)的三个纹状体亚区中的每一个的切片中的4-5离散位点(来自前囟的+ 1.5 mm)并且在最大胰岛素作用时(在60-80 min上取样),然后这些样本是每个子区域的平均值。 切片制备后胰岛素的作用随时间减少; 尽量减少时间 体外 并且为了优化动物使用,通常,同时在记录室中测试来自给定动物的两个切片。 用于挑战胰岛素作用的药物通过超融合aCSF在胰岛素前施用15 min,包括HNMPA三乙酰氧基甲酯(HNMPA-AM)3; Enzo Life Sciences),S961(Novo Nordisk),LY294002(Sigma),鬼臼毒素(PPP; Tocris),美卡拉明(Tocris)和DHβE(Tocris)。 如结果所述,通过比较峰值[DA]的比率来测试饮食组中烟碱性ACh受体的可能改变的敏感性。o 由5 p(100 Hz)引起的1 p诱发的诱发(5 p:1 p比率)30, 31 在存在0-500 nM尼古丁(Sigma)的NAc核心中。
的测定 V 最大 来自诱发[DA]o 纹状体切片中的瞬变
为了评估胰岛素诱导的DAT介导的DA摄取的变化,诱发下降期的初始部分[DA]o 将曲线拟合到Michaelis-Menten方程中以进行提取 V最大 (最大摄取率常数)56. Km (与DAT对DA的亲和力成反比)固定在0.2μM,并且已知在纹状体亚区域相似57 并且不受胰岛素的影响(见 补充图4 字幕)。
全细胞记录
从29-至35-日龄雄性大鼠制备脑切片; 记录条件与DA释放研究中使用的相同。 全细胞电流钳记录使用常规方法54。 使用具有红外差分干涉对比光学器件和×51水浸物镜的Olympus BX40WI显微镜(Olympus America,Center Valley,PA)使纹状体ChIs可视化。 移液管溶液含有(以mM计):葡萄糖酸钾(129); KCl(11); HEPES(10); 氯化镁2 (2); EGTA(1); 娜2-ATP(2); 娜3-GTP(0.3); 用KOH调节至pH 7.2-7.3。 对于要评估ChAT免疫反应性的记录神经元,将0.3%生物胞素包括在移液管溶液中并且短暂记录神经元(~5 min)以最小化细胞内内容物的稀释。 移液管电阻为~3-5MΩ。 使用Axopatch 200B放大器(Molecular Devices,Sunnyvale CA)获得记录,并以2 kHz低通滤波。 通过建立的电生理学标准鉴定ChI28; 大多数人最初都处于积极的活动状态,但修补后活动量有所减少。 然而,对电流注射的响应性通常是稳健且随时间一致的,因此用于研究胰岛素对Ch1兴奋性的影响(参见结果)。 在检查InsR和IGF-1R在该反应中的作用的实验中,在修补ChI之前,应用HNMPA或PPP至少20分钟。 通常在暴露~16分钟后观察到单独的胰岛素的最大效应,尽管在一些细胞中,直到50分钟或更长时间内增加不是最大的。 此外,在PPP中记录的六个神经元中的四个中,胰岛素在恢复到并超过起始尖峰数之前引起尖峰数的初始减少。 因此,在所有实验中,通过比较穗数的最大影响与在施用胰岛素之前立即引起的穗数来量化胰岛素的作用。 达到峰值效应的时间的明显差异可以反映许多因素,包括切片中记录的细胞的深度。 在可比较的时间点,在没有胰岛素的情况下,也在ChI中记录诱发的动作电位。
高效液相色谱
使用具有电化学检测的高效液相色谱法测定大鼠纹状体切片的DA含量(400-μm厚度)58。 将切片对在30℃下在aCSF中平衡32 min,然后将一对切片在60℃下在aCSF中孵育另外的32 min,同时将另一个切片在具有10或30 nM胰岛素的CSF中孵育。 对于饮食组比较,在恢复后的30-60 min之间收集纹状体组织。 温育后,小心地从切片中取出过量的aCSF,称重纹状体组织样品(7-10 mg),在干冰上冷冻,然后储存,然后在-80℃保存。 在分析当天,将样品在冰冷,洗脱液中进行超声处理,用氩气脱氧58,在微量离心机中旋转2 min,将上清液直接注入HPLC柱(BAS,West Lafayette,IN); 检测器是玻璃碳电极,设定在0.7 V对Ag / AgCl。
免疫组化
对于免疫组织化学标记,用戊巴比妥钠麻醉大鼠(50 mg kg - 1,ip),然后用PBS(在154 mM磷酸盐缓冲液中的10 mM NaCl,pH 7.2)经心脏灌注,然后在该PBS中用4%多聚甲醛灌注; 除去脑,切割冠状切片(20μm)并常规处理27, 59。 使用配备有Spot软件(Diagnostic Instruments Inc.)控制的数码相机的尼康PM 800共聚焦显微镜和使用×100物镜(数值孔径= 1.4)或使用×510的Zeiss LSM 63共聚焦显微镜获得免疫荧光图像。物镜(数值孔径= 1.2)。 激光是氩(488 nm),He / Ne(543 nm)和He / Ne(633 nm)。 通过共聚焦显微镜软件选择适合每种激光的滤光片。 针孔尺寸随所用物镜和截面厚度的变化而变化 z - 堆积生成; 我们选择了软件指示的最佳针孔值(通常为30μm)。 使用解卷积软件(AutoQuant Imaging)分析数字文件,使用Adobe Photoshop 7.0处理最终图像。 调整所有图像的亮度和对比度; 对图像的所有部分均匀地进行了这样的调整。 使用两种TH抗体鉴定纹状体DA轴突:多克隆AB152兔抗-TH(1:800)和单克隆MAB318小鼠抗-TH(1:500)(均来自Chemicon)。 使用三种InsR抗体:sc-57342和sc-09(1:100; Santa Cruz)和PP5(来自辉瑞的礼物)。 之前已经证明了每种方法的特异性60, 61在相应的阻断肽存在下,通过抗体sc-57342或PP5不存在免疫标记,在本研究中证实了这一点。 ChAT抗体是AB144(1:200; Millipore),生物素来自Vector(1:200)。 使用的二抗是驴抗兔Alexa 488(Invitrogen),或驴抗兔Cy2(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME),驴抗山羊Cy3(Jackson)和驴抗小鼠Cy5(Jackson)。
为了评估InsRs在TH +轴突中的共定位,我们使用前面描述的方法来鉴定Kir6.2的存在,KirXNUMX是ATP敏感性K的成孔亚基。+ DA轴突中的通道27。 代表InsR的Puncta分布在整个调整的图像中,表明与TH免疫反应性的叠加可能在某种程度上偶然发生。 为了测试这个假设,我们计算了来自两只大鼠的三个NAc免疫标记切片中42独立区域中的InsR / TH叠加。 然后将InsR数字文件顺时针旋转90°并重复计数; 旋转减少了在大多数领域与TH共定位的InsR puncta的数量(见结果)。 旋转叠加数量的减少27 表明在与DA轴突相关的每个纹状体区域中InsR斑点的比例。
血糖和胰岛素ELISA
在断头时收集躯干血用于切片研究。 立即用标准血糖监测仪测定血糖。 对于胰岛素,在含EDTA的管中收集另外的血液并在1,500下离心g 对于15分钟; 收集上清液(血浆)并在-80℃下储存直至用ALPCO大鼠胰岛素ELISA试剂盒处理。
套管放置和组织学验证
将最初称重350-425 g的41只成年雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic和Charles River)用氯胺酮麻醉(100 mg kg) - 1,ip)和甲苯噻嗪(10 mg kg - 1,ip)和立体定位植入两个长期留置引导插管(26测量仪),双侧2.0 mm背侧放置在NAc内侧壳的输注部位62 (前囟前方1.6 mm;矢状缝侧面2.1 mm,尖端朝向中线8°,5.8 mm腹侧至颅骨表面)。 大鼠给予巴胺(2.0 mg kg - 1,皮下)作为麻醉后恢复和术后早晨的术后镇痛药。 手术后一周,将大鼠置于FR(如上所述)并保持其手术后恢复体重的80%用于研究的剩余部分。 在完成行为测试后,在组织学上确定插管位置。 用CO杀死每只大鼠2,断头并取出大脑,并在10%福尔马林缓冲液中固定> 48小时。 将冷冻的冠状切片(厚度为40μm)在Reichert-Jung低温恒温器上切割,解冻后安装在涂明胶的载玻片上,并用甲酚紫染色。 仅当两个套管都在内侧NAc壳内时,才使用给定大鼠的数据62 (包括壳/核心或壳/嗅结节边界)(补充图5); 基于这些标准,将两只大鼠排除在最终分析之外。
风味偏好调节预曝光
大鼠在水中以30-h间隔接受一次过夜(在家笼中)和六次0.2-min-每天预暴露(在测试室中)至48%糖精钠(Sigma)的水。 然后大鼠在5%不加糖的葡萄或樱桃Kool-Aid(卡夫食品)中在水中接受两次0.2-min-每天暴露于0.05%糖精钠的过程。 对于第一次Kool-Aid预曝光期,一半的大鼠接受樱桃味的溶液,另一半接受葡萄味的溶液。 在第二次Kool-Aid预曝光期间,味道被逆转,以确保所有大鼠对每种味道进行取样。 测量所有暴露前会话的摄入量。 测试室是带有新鲜床上用品的透明塑料笼。 对于所有暴露前期,大鼠可以在腔室的两侧获得相同的溶液。 除了隔夜暴露前会议,所有会议都在行为程序室进行,在任何培训或测试之前都有30-min适应期。
单瓶调理
以往的研究表明,将InsAb微量注射到腹内侧下丘脑可以阻断胰岛素对摄食行为和胰高血糖素分泌的影响63, 64。 在这里,我们使用这种方法来评估胰岛素在加强食物选择中的可能作用。 基于平均暴露前摄入量将大鼠半随机分配到两组,对照组或实验组(InsAb)。 在对照组中,大鼠接受载体(显微注射PBS; 137 mM NaCl和2.7 mM磷酸盐缓冲液中的10 mM KCl)或IgG(Abcam ab81032;0.5μgμl) - 1 在服用两种调味溶液中的一种之前,在NAc壳中显微注射,并在消耗其它调味溶液之前进行模拟显微注射。 在实验组中,大鼠接受NAc壳显微注射InsAb(Abcam ab46707;0.5μl1μgμl) - 1 在暴露于一种风味溶液之前,在PBS中,如前所述),并在暴露于另一种之前模拟显微注射。 使用两组在液体显微注射和模拟显微注射之间交替的受试者,使得微注射的总数限制为四,从而最小化可能的组织损伤和显微注射部位的灵敏度损失。65。 对于液体显微注射,将对照溶液或InsAb加载到两个30-cm长度的PE-50管中,管的一端连接到充满蒸馏水的5μlHamilton注射器,另一端连接到31-gauge注射器插管,其延长2.0 mm超出植入指南。 0.5μl输注体积通过90以0.005μl的速率递送 - 1; 将注射器留在~60 s的位置以留出扩散时间,然后用管心针替换注射器。
在完成显微注射或模拟显微注射的2 min内将大鼠直接转移至行为室。 调理溶液含有0.2%糖精钠,0.05%不加糖的葡萄或樱桃Kool-Aid和0.8%葡萄糖。 解决方案访问限制为每个会话30分钟。 在每组中,半随机分配和平衡具有饮用通道的室的成对风味和侧面。 显微注射之间的间隔至少为72 h,在输注和模拟会话之间交替进行总共八次调节。
双瓶偏好测试
在最后一次调理后48小时,将大鼠放入测试室中,同时获得两种调理风味; 溶液是0.2%葡萄或樱桃Kool-Aid中的0.05%糖精钠,不含葡萄糖。 测试发生在2天(每天60分钟)。 包含模拟配对或输注配对溶液的饮用管的位置交替进行,以确保测试每只大鼠在笼子两侧的每种溶液的消耗。 每个调味溶液的摄入量在两个测试日内取平均值以确定偏好。
[3H] DA在纹状体突触体中的摄取以评估InsAb功效
纹状体突触体21, 66 从AL大鼠(雄性,350-400 g)制备NAc(壳和核)并分别解剖和制备CPu。 将来自每个区域的组织在15体积的冰冷的0.32 M蔗糖溶液中在玻璃均化器中用马达驱动的Teflon研杵均化; 在漂洗和离心后,将最终的沉淀重新悬浮在冰冷的0.32 M蔗糖中21, 66。 在开始之前[3H] DA摄取测定66将总体积为180μl摄取缓冲液的突触体等分试样在15℃下在30℃下在30 nM胰岛素存在或不存在下,在载体(PBS)或InsAb(最终稀释度1:500)中孵育1 min。 ,IgG(最终稀释度500:122)或载体。 摄取缓冲液含有(以mM计):NaCl(XNUMX); 娜2HPO4 (3); 氢化钠2PO4 (15); KCl(5); 硫酸镁4 (1.2); 葡萄糖(10),CaCl2 (1); 尼拉酰胺(0.01); 托酚酮(0.1); 和抗坏血酸(0.001),pH 7.4。 吸收[3通过将20μl的每种突触体悬浮液快速分配到具有不同浓度的DA(96-0.003μM)和[1.0-XNUMXμM]的XNUMX-孔板中来启动H] DA。3H] DA(5 nM); 在5℃的平板振荡器中25 min后,通过冷,快速真空过滤终止吸收66。 将每孔的计数转换为皮摩尔,然后校正为每分钟总蛋白质mg。 所有测定一式三份进行并重复至少4次; V最大 和 Km 使用Biosoft Kell Radlig软件(Cambridge,UK)计算。
统计分析
数据以平均值±sem给出; 使用配对或未配对的学生评估显着性 t - 除非另有说明,否则 - 测试或方差分析。 对于伏安法数据, n 鉴于纹状体亚区域内的位点间差异大于动物间或片间间的变异性,是记录位点的数量30, 32, 55, 56; 记录每个数据集的动物编号。 EC50 胰岛素和尼古丁对峰值诱发的影响[DA]o 使用Prism 6.0(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)计算。 对于电生理学数据,使用配对评估统计学显着性 t - 在Prism 6.0中进行测试或Wilcoxon测试,或在SAS 9.3(SAS Institute Inc.,Cary,NC)中进行混合双向ANOVA测试。 为了评估风味偏好调节中的胰岛素参与,使用与所用载体治疗相同的方案完成了两项完整研究。 在第一项研究中,10大鼠接受PBS的载体输注,并且9接受InsAB的输注。 在第二项研究中,10大鼠接受IgG和10的载体输注,其接受InsAb的输注。 在输注调节期间,两种载体组(PBS或IgG)之间没有显着差异(F19= 0.619,混合双向ANOVA),重复测量输液调节时间)或测试时(F19= 0.012,双向混合ANOVA,重复测量风味)。 因此,将两个实验组合用于分析。 对于该分析,使用2×4混合ANOVA(在输注 - 调节日重复测量)来确定调节期间显微注射治疗的效果,然后保护 t - 测试(一只尾巴确定哪种调理会议显微注射治疗减少摄入量)。 模拟调节会议完成了相同的分析。 为了确定在两瓶风味偏好测试期间调理处理的效果,使用混合双向ANOVA(重复测量风味)分析数据,然后保护 t- 测试(一个测试InsAb会降低偏好的假设)。
其他信息
如何引用这篇文章: 马萨诸塞州斯托弗 等。 胰岛素通过激活胆碱能中间神经元来增强纹状体多巴胺的释放,从而发出奖励。 纳特。 COMMUN。 6:8543 doi:10.1038 / ncomms9543(2015)。
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致谢
这些研究得到NIH资助DA033811(MER,KDC和MEAR),NS036362(MER),DA03956(KDC)和NARSAD独立研究者奖(KDC)的支持。 S961是Novo Nordisk的Lauge Schaffer博士赠送的慷慨礼物。 PP5抗体是辉瑞公司的慷慨捐赠。 我们感谢纽约大学医学院的Charles Nicholson博士提取的软件 V最大 来自FCV数据的价值。