锰增强磁共振成像，用于绘制与自由采食大鼠摄入零食相关的全脑活动模式（2013）

介绍

与热量过度营养相关的食管过多症严重影响工业社会肥胖和肥胖相关并发症的发生 [1]。 而稳态性饮食过多是由调节饥饿和饱腹感的稳态系统的干扰引起的，而特征性饮食过多则与饱腹感无关。 [1]。 然而，超越饥饿和食物摄入的生理调节的机制尚未完全阐明。 在某些条件下，食物摄入可能以过度补偿食欲的稳态控制的方式激活大脑奖励系统 [2]。 由此产生的特征性饮食过度增生受多种因素的影响，如消费者的情绪状态，心理健康状况或睡眠剥夺 [1]。 另外，分子食物组成和能量密度似乎是诱发快感性食欲过盛的重要因素。 有充分证据表明，“可口的食物”可能会诱发人类和动物的食欲过盛 [3], [4]。 例如，暴食人类的食物通常涉及富含脂肪或糖类的食物，或两者兼而有之 [5].

饥饿状态下的食物摄入强烈触发大脑中的复杂奖励系统，包括腹侧纹状体中的伏隔核和腹侧苍白球，中脑腹侧被盖区，前额皮质，海马和杏仁核 [6]。 这些激活模式很可能与多巴胺释放有关，例如在伏核或背侧纹状体中 [7], [8], [9]，在药物成瘾中也被激活的过程 [10]。 然而，在稳态条件下，饱腹感信号触发脑结构，例如尾部脑干，下丘脑，特别是弓状核或孤束核，这限制了食物摄入，例如通过降低其奖励值 [6], [11]。 已经观察到某些类型的食物，例如高脂肪或食堂饮食，诱导增加的食物和/或能量摄入，最终导致肥胖。 例如，自由采食的大鼠，在限制进入食堂饮食的情况下，在进入期间产生类似暴食的喂养行为 [10]。 因此，可以假设一些食物成分可以否决饱腹感调节，从而导致食物摄入而不依赖于饥饿。

有趣的是，研究表明，在小鼠中，最初脂肪引起的食物和卡路里摄入量的增加在两周后得到补偿。 [12]。 因此，有人提出长期摄入高脂肪饮食会降低食物的奖赏效果，导致喂养方式失调，最终导致超重 [13].

为了应对作为工业社会肥胖的主要贡献者的特征性饮食过度及其对医疗保健系统的影响，重要的是要理解由与享乐狂饮事件相关的某些类型的食物引发的脑过程。 应用非侵入性全脑成像技术（如功能磁共振成像（MRI））分析食物摄入对大脑活动的影响，其经典的刺激驱动方法受限于食物摄入和MRI的必要同步。 为了监测对大脑活动的长期影响，已采用锰增强MRI（MEMRI）。 造影剂锰在活化的脑结构中累积并反映神经元活动的积分量度 [14], [15], [16]。 MEMRI允许从MRI测量中解耦脑活动分析。 为此目的，MnCl₂ 在MRI测量之前注射。 锰离子（Mn²⁺）具有与钙离子相似的离子半径和相同的电荷（Ca.²⁺）。 因此，Mn²⁺ 通过电压门控钙通道转运到可兴奋的细胞中。 与Ca相反²⁺然而，Mn²⁺ 随着它们的活动成比例地累积在细胞中，并且由于其顺磁性，可以随后通过MRI记录。 因此，可以记录与在MRI测量之前发生的事件相关联的大脑活动。 因此，该技术的主要优点是可以解开刺激（进食）和MRI测量。 另外，Mn²⁺ 可通过轴突运输重新定位到其他大脑区域。 Mn的主要缺点²⁺然而，它的细胞毒性可能会严重影响自然行为并限制其在行为研究中的应用。 结果表明，皮下注射MnCl₂ 在足以用于MRI分析的浓度下，导致运动表现和食物摄入以及体重减轻的持续降低 [17]。 然而，最近，渗透泵被引入MEMRI研究。 氯化锰₂ 通过渗透泵给药，渗透泵在长达7天的时间内缓慢且连续地释放溶液，避免对运动活动产生不利影响，但为MRI分析提供足够的锰积累 [17].

本研究测试了渗透泵辅助MEMRI分析的可用性，以扫描与食物摄取相关的全脑活动。 该方法用于揭示自由采食的大鼠中薯片摄入的特定脑激活模式。

材料和方法

1。 道德声明

本研究严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南的建议进行。 该方案得到了埃尔兰根 - 纽伦堡大学动物实验伦理委员会（Regierung Mittelfranken，许可证号：54-2532.1-28 / 12）的批准。 所有手术和MRI实验均在异氟烷麻醉下进行，并且尽一切努力使痛苦最小化。

2。 实验设计与行为分析

将雄性Wistar大鼠（初始重量257±21 g，保持在12 / 12 h暗/光循环，购自Charles River，Sulzfeld，Germany）随机分成两组（每组四个笼，每笼四只动物）。 除了标准食物颗粒外，每组都接受一种不同的食物（Altromin 1326，Altromin，Lage，Germany）。 小吃食品组（n = 16，初始体重258±28 g）接受薯片（没有添加味道化合物或味道增强剂的商业无味盐渍薯片，特别是没有谷氨酸钠，由食品加工机压碎）和标准食品组（初始体重256±21 g）分别接受粉状标准食物（Altromin 1321，n = 16）。 在整个研究过程中随意提供标准食物颗粒，测试食物（分别为碎马铃薯片或粉状标准食物）在训练阶段随意提供，锰阶段另外提供标准食物颗粒（见 图1 用于实验设计）。 对于训练，测试食物在两天的食物分配器中呈现，其在笼子的右侧和左侧包含相同的测试食物，持续七天（训练阶段），然后是七个中间天（中间阶段），没有测试食物。 随后，渗透泵充满氯化锰（MnCl 2₂植入了，详见下文。 在滴注期间（7天，标准食物组：163±5 h，零食组166±4 h）和MnCl积累₂ 在大鼠脑（锰期）中，动物可以随意获得训练阶段熟悉的测试食物。 由于在研究的所有阶段都可以随意获得标准食物颗粒和自来水，因此动物在研究期间的任何时间都不会禁食。 在此期间的MnCl后，通过MEMRI扫描活性脑结构₂ 管理_. 在不同阶段期间，通过食物分配器的差重称重每天两次测量摄取食物的量。 通过将测试食物的卡路里值乘以摄入量来确定能量摄入量。 食物摄入量与大鼠的初始体重呈正相关。 然而，两种类型的测试食物的相关性相似，并且两组的初始体重分布没有显着差异。

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图1。 学习规划。

通过锰增强磁共振成像监测食物成分对全脑活动模式影响的研究设计概述。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.g001

另外，通过评估由网箱上方的网络摄像头记录的图片（每10秒一张图片）通过定义的“计数”来量化与测试食物相关的运动活动。 一个“计数”被定义为“一只大鼠在一张照片上显示食物分配器附近的运动活动”。 学生t检验用于评估每天24 h期间不同组中大鼠的运动活性的显着差异，其中7天为1小时的箱，作为每组4只笼（16动物）的平均值。

3。 渗透泵的制备和植入

微型渗透泵（Alzet®，型号2001，Durect Corporation，Cupertino，CA，USA）用于造影剂的应用（200μL的1 M MnCl溶液）₂，分子生物学，BioReagent，Sigma Aldrich，Schnelldorf，德国）据 [17]。 为了在MRI中使用，将不锈钢流动缓和剂替换为PEEK TM微医用管（Scientific Commodities，Lake Havasu City，AZ，USA）。 在植入之前，将填充的渗透泵在等渗盐水中孵育12 h。 在注射七天的过程中，MnCl₂ 释放的流速为1μLh ^{- 1}.

在锰相的第一天下午（见 图1），渗透泵被植入。 为此目的，在医用空气中用异氟烷（最初为15％和5％维持，Baxter Deutschland，Unterschleißheim，德国）将动物麻醉1.5分钟的最大时间，并将填充的泵植入背部皮下组织中。 然后，用组织胶（Histoacryl，B.Braun Petzold，Melsungen，Germany）封闭小切口。

4。 MRI测量

在锰相七天后，记录MRI。 在植入渗透泵后，用异氟烷（最初在医用空气中5％）163±5 h（标准食物组）和166±4 h（零食组）麻醉动物。 每只动物的麻醉持续时间最长为50分钟。 麻醉诱导后，将动物置于磁共振断层造影仪内的支架上（Bruker BioSpec 47 / 40，200 mT / m，正交表面脑线圈）。 通过在摇篮中循环的温水将动物的体温保持在37℃恒定。 通过表面线圈正下方的“鼻口面罩”确保大鼠头部的固定和连续的异氟醚麻醉。 在测量期间通过固定在大鼠胸部下方的呼吸传感器监测动物的重要功能。 保持呼吸速率恒定在约60 min ^{- 1}，将异氟烷浓度调节在1％和2％之间的范围内。

使用改进的驱动平衡傅里叶变换（MDEFT）序列进行测量：重复时间4 s，回波时间5.2 ms，反转时间1000 ms，具有四个段和256×128×32的采集矩阵，零后重建矩阵填充256×256×64，分辨率为109×109×440μm，视场27.90×27.90×28.16 mm和两个平均值，导致17 min的测量时间重复两次。

5。 数据处理

5.1图像注册和预处理。

为了研究大脑解剖/功能的差异，必须将所有数据集转移到共同的坐标系中。 目标是在不消除相关差异的情况下匹配解剖结构。 这是使用非参数非刚性配准方案实现的，该方案计算模板体积T的变形场，指示每个体素的平移向量，使得变形模板体积与参考体积R的相似性。是最大的。

该配准方法优化了能量函数，该能量函数包括在当前变换下测量两个数据集的相似性的数据项（这里是互信息），以及限制允许变形的正则化项。 在我们的例子中，变形的平滑性通过变形场的曲率的正规化来确保，如下所述 [18]。 使用所采用的非刚性注册组件的定制实现来完成注册 [19].

首先，属于一组的所有数据集非刚性地登记在该组的随机选择的参考体积上，并且计算分组平均体积和方差体积。 然后，所有分组平均体积随后非刚性地登记到其中一个体积，并且相应的变形场应用于分组方差体积。 最后，计算总体平均体积和方差体积。 通过基于体素的形态测定分析（VBM），可以确定两个食物组之间的显着（t-统计）不同的活化脑区域。 在登记的数据集上使用体素统计还允许消除图像中的基本组织对比，这在两组中是相同的。

5.2用于结构特定分析的灰度值处理。

基于这些预先登记的数据集的灰度值分析在MagnAN（BioCom GbR，Uttenreuth，Germany）中进行。 基于表面的配准将每个MEMRI灰度值数据集调整为来自的数字大鼠脑图谱 [20]。 接下来，为了补偿较小的个体形状差异，对于由大脑轮廓和脑室系统引导的每个数据集，逐个切片地精细调整图谱载玻片。 数字地图集由166预先选择的不同脑结构组成。 腹侧被盖区（VTA）是评估的最小结构之一，但对获得的结果具有高度影响。 它的体积为0.7914 mm³ 每个半球，即152体素。 在每个空间维度中，VTA采样超过4体素。 因此，可以避免在我们的分析中可能导致重大混淆问题的部分体积效应。 在各个数据集上确定这些区域的平均灰度值。 为了标准化每个个体的灰度值，通过将每个单个脑结构的灰度值与所有图谱结构的平均灰度值之间的差除以所有图谱结构的灰度值的标准偏差来计算z分数。 学生t检验用于评估两个不同组之间大脑结构的显着差异。 组合分析方法允许获得显着的不同区域（VBM）以及相应的图谱区域内的活动上调和下调（基于区域）。

结果与讨论

1。 休闲食品（薯片）日粮对卡路里摄入量和运动能力的影响

本研究调查了与标准食物相比摄入零食（薯片）相关的特定大脑活动模式。 MEMRI记录了与特定测试食物摄入量相关的大脑活动，这可以在7天的食物摄入期间整合大脑活动 (图1).

另外，记录了依赖于测试食物的食物摄取和运动活动。 在训练阶段，用标准食物喂养的大鼠显示出比用薯片喂养的大鼠更低的活性，特别是在12 / 12 h暗/光循环的黑暗时期。 马铃薯片摄入引起更高的活动，在训练阶段的10时间点24之间存在显着差异 (图2A).

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图2。 在获取零食（薯片）或标准食物期间与喂养相关的运动活动。

在训练阶段（A）获取零食（薯片）或标准食物期间大鼠的喂养相关运动活动和在MnCl期间的锰阶段₂ 申请（B）。 数据表示为每组16天中7只动物的平均值。 *** p <0.001，** p <0.01，p * <0.05。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.g002

2。 渗透泵辅助MEMRI在饮食相关全脑活动模式分析中的应用

为了分析活跃的脑模式，应用渗透泵辅助的MEMRI。 而单剂量的MnCl₂ 导致注射后最大积累24 h，通过渗透泵在大脑中锰积累三天后达到平台 [17]。 获得的Mn累积浓度²⁺ 对于功能映射而言，足以产生与通过单剂量注入MnCl获得的相似的信噪比₂，但在这些条件下运动活动不受影响 [17]。 一般Mn的差异²⁺ 由于脑结构对Mn的渗透性不同而导致分布²⁺ 两组都应该相同。 各组之间的Z-Score差异用于评估测试食物相关的大脑活动而不是绝对z-得分值。 因此，可以通过单次MRI测量记录在锰相的七天期间活跃的脑区域 (图1)。 在我们的案例中，渗透泵辅助MEMRI提供了测试食物诱导的全脑活动的综合视图。

与训练阶段相比，本研究记录了锰阶段的总运动活动有所减少 (图2B)。 这可能是由于植入和相关的应激，锰的细胞毒性或与测试食物有关的习惯效应。 然而，与对照相比，用薯片喂养的大鼠显示出明显更高的活性，并且在四个时间点显着增加活性。 这种行为类似于训练阶段。 否则，与训练阶段相比，在锰阶段期间摄入的食物量没有显着改变，涉及12 h光和12 h暗循环。 与训练和锰相中的标准食物相比，12 h黑暗循环期间零食的摄入量略有增加 (图3A)。 与标准食物相比，这导致通过薯片获得更高的能量摄入。 在12 h光照期间差异不显着，但在训练阶段和锰阶段的12 h暗期期间差异非常显着 (图3B)。 因此，得出结论是MnCl₂ 渗透泵给药是一种合适的方法，用于绘制特定于不同摄入食物的大脑中的活动模式。

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图3。 通过零食（薯片）和标准食物摄取食物和能量。

食物（A）和能量（B）通过零食（SF，薯片）和标准食物（STD）摄取在训练阶段（TP）的自由采食的大鼠在MnCl之前和之前的锰相（MnP）₂ 泵渗透7 d。 每小时的食物摄入量是通过差分称量来确定的，能量摄入量是在12小时的光照和12小时的黑暗周期中分别将摄入的食物量与能量含量相乘。 显示了每组中16只动物的平均值±SD。 *** p <0.001，** p <0.01，p * <0.05，ns不显着。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.g003

在z分数归一化之后，一方面通过VBM方法分析了图像数据，这导致了-纯粹由数据驱动-大脑活动区域明显不同。 (图4)。 另一方面，使用数字图谱的附加的基于区域的分析使得可以确定每个标记的图谱结构的上调和下调。

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图4。 与标准食物或零食（薯片）相比，脑中的锰积累显着不同。

在（A）中，重建的平均修改的驱动平衡傅里叶变换（MDEFT）数据集的切片与来自Paxinos图谱的相应图谱切片（Bregma-5.28 mm）的叠加显示具有标记的最小分析区域（VTA）之一黄色 部分（B），（C）和（D）显示自由采食大鼠的脑中锰积累显着不同，其具有MEMRI记录的标准食物（STD）或零食（SF，薯片）的额外途径。 与摄入标准食物相比，由于摄入零食而显着提高活动的脑区域标记为红色，大脑区域在摄入标准食物后显示出显着更高的活性，与摄入的零食相比显示为蓝色。 通过体素统计分析处理数据。 结果显示在轴向（B），水平（C）和矢状（D）视图中。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.g004

当比较标准食物和零食（薯片）时，在80脑区检测到显着不同的z分数 (表1, 2, 3, 4)。 总的来说，两种不同的数据分析策略都可以产生可比较的结果。 对于选定的脑结构，描绘了与标准食物相比摄入马铃薯片后最相关的脑结构的差异MEMRI激活（图5).

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图5。 与快餐食品（薯片）相比的活化差异与代表性脑结构中的标准食物相关。

统计因运动电路（尾状壳核蛋白：CPu），边缘系统（扣带皮层：CgCx），奖励系统（壳状区域）的代表性脑部结构中零食（马铃薯片）与标准食物的摄入而引起的激活差异伏特核的AcbSh，伏特核的核心区域：AcbC和睡眠/苏醒节律（被盖核：Teg）在参考图集的左栏中显示。 中间一栏显示了覆盖在相应的标准T2加权MRI解剖结构和图集标签上的VBM分析的显着差异。 右列显示了零食相对于标准食品v（MEMRI灰度值）的分数变化*** p <0.001，** p <0.01。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.g005

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表1。 锰在脑结构中的积累与食物摄入有关。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.t001

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表2。 锰在脑结构中的积累与奖赏和成瘾有关。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.t002

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表3。 脑结构中锰的积累与睡眠有关。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.t003

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表4。 脑结构中的锰积累与运动活动有关。

DOI：10.1371 / journal.pone.0055354.t004

达到的最终注册质量如下所示 图4A 和 图5.

3。 零食（马铃薯片）摄入量对奖赏和饱腹感的影响

在本研究中，摄取薯片导致了各种不同的结构特异性活性变化，这些变化归纳于此 表1, 2, 3, 4。 伏隔核（右侧和左侧（R + L）），腹侧苍白球（R + L）和背内侧下丘脑（R）以及前室旁丘脑核的核心和外壳的活动显着增加。 同时，与饲喂标准食物的动物相比，摄入薯片的大鼠中的弓状核（L）和孤束核（R）失活。 最近Harrold等人总结了调节食物摄入和食欲的中枢机制。 和肯尼 [4], [21]：食物摄入的稳态调节主要是由反映能量不足的信号引起的 [21]。 相反，享乐食物的摄入量似乎是由于奖励机制过度补偿食物摄入的稳态下调所致。 [21].

孤束核负责处理反映正在进行的食物摄入的外周信号，例如胃扩张或门静脉葡萄糖水平导致脑区域（例如伏隔核）失活，最终导致能量摄入下调 [4], [22]。 通过“可口食物”使孤束核失活可能是由于该脑区对饱腹感相关肠道激素的敏感性降低所致。 [4]。 类似于孤束核，弓状下丘脑核由反映营养状况的外周信号激活。 它与其他大脑区域相连，例如副神经核和背内侧下丘脑核，它们都控制食物摄入量 [21], [23], [24]。 因此，可以假设在本研究中观察到的孤束核孤立核，弓状核，背内侧下丘脑和前列腺丘脑核的活动变化反映了中枢饱和回路的失活，最终导致卡路里摄入超过能量需求。

另外，已经观察到与马铃薯片摄入相关的伏隔核的强烈激活。 伏隔核是奖励系统的关键结构，其例如通过奖励药物而被激活 [9]。 在食物摄入的情况下，伏隔核的激活导致诱导享乐食物摄入的有益信号。 此外，在以前归因于一般奖励系统或成瘾的区域，即前肢皮层（R + L），记录了薯片消费时的活化显着增加。 [25], [26]，背侧下颌骨（R + L） [27]，纹状体的床核（L） [28]，中丘脑丘脑（R + L） [26], [29]，扣带皮层（R + L） [26]，尾状/壳状（腹侧纹状体）（R + L） [26] 和岛屿皮层（R + L） [30]。 Mediodorsal丘脑和岛叶皮质也与嗅觉或嗅觉与其他感觉输入的整合有关 [31]。 尾状核和岛叶也与药物和食物渴望有关 [32]。 与标准食物相比，与奖励和成瘾相关的进一步大脑结构显示，在摄入零食后活性显着降低：中缝 [33]，椎间核 [34]，腹侧被盖区（R + L） [35], [36]和腹侧下托（R + L） [37].

这些结果表明，薯片的消耗与特征奖励回路的激活有关，并且与平衡饱和回路的失活有关。 两个回路也是相连的，主要是丘脑的室旁核，它作为能量平衡和奖励之间的界面。 [38]。 因此，当可获得诸如薯片的小吃食品时，观察到的活化模式可导致更高的能量摄入。

现在需要进一步的研究来揭示薯片的分子成分，能量密度的作用以及导致能量摄取的稳态控制失调的外周和中枢机制。

4。 零食（马铃薯片）摄入量对其他与食物摄入相关的脑结构的影响

此外，在食用零食（薯片）后，观察到这些脑结构的强烈活化，这些活动先前与食物摄入，食欲行为和食物控制有关，例如下肢皮质（R + L） [36], [39]，下丘脑外侧（R） [36]和隔垫（R + L） [40].

大脑结构中缝核和侧枝旁核（R）也与食物摄入有关，与标准食物相比，食用薯片后活性显着降低 [41]。 外侧臂旁核与热量调节，摄入奖励，喂养中的认知加工有关 [42]，还要摄入钠和水 [43]。 因此，与标准食物相比，该结构的活性降低可能与薯片的较高盐含量有关。 结果表明，由于其分子组成，例如导致更高的能量密度，薯片可以激活与奖励相关的脑结构和与标准食物不同的食物摄入控制。 这种效果最终可能调节食物的质量和数量，或者更确切地说是能量摄入。

5。 休闲食品（马铃薯片）摄入量对运动活动和睡眠相关脑结构的影响

此外，与运动和活动相关的六个脑结构显示出显着更高的Mn²⁺ 与标准食物相比，大鼠获得薯片的积累：初级运动皮层（R + L），次级运动皮层（R + L）以及尾状壳核（R + L） [44]。 饲喂薯片的动物运动区活动显着升高与行为研究结果非常吻合，表明该组运动活动较高。 (图2A和B.)。 在食物摄入之前，运动活动的增加已经联系起来。 因此，例如，它表明，ghrelin诱导了啮齿类动物的有益食物和运动活动的摄入，这可能与刺激寻求食物的行为有关。 [45], [46].

最后，摄入薯片与睡眠相关的大脑结构显着失活有关，即外侧网状核（R） [47]，parvicellular网状核（R + L） [47]，侧副paragigantocellular核（R + L） [48]，巨细胞核（R + L） [49], [50]，脑桥网状核口（R + L） [51] 和被盖核（R + L） [52]。 食物成分对睡眠行为的影响尚不完全清楚。 已经表明，长期（六周）摄入高脂肪饮食导致睡眠发作的频率和持续时间增加。 然而，这种效应与发展中的肥胖相关，而不是与能量摄入本身相关 [53]。 另一方面，一些研究表明，长期应用高脂肪饮食会导致小鼠昼夜休息期间食物摄入量增加 [12], [54]。 昼夜食物摄入量的增加很可能与睡眠行为的变化有关，从而与睡眠相关的脑结构活动的调节有关。 然而，在这里应用的短期喂养条件下，零食不会引起体重的显着增加，也不会引起昼夜喂养模式的转变。 因此，我们推测睡眠相关脑结构的失活与运动和食物寻求活动的增加有关，这可能抑制睡眠。

结论

总之，MEMRI和随后通过VBM以及基于感兴趣区域的方法对活化的脑结构的分析显示出类似的特异性激活。 许多脑结构的失活取决于摄入的食物。 与自由采食的大鼠相比，与标准食物相比，零食（薯片）的摄入诱导了在食物摄入，奖励/成瘾以及活动和运动之前与之相关的脑结构中的激活模式的显着差异。 脑运动活动结构的增加与动物行为一致：几天的活动曲线显示动物的较高水平的运动活动与马铃薯片的摄入相关。 在脑结构中记录的活动减少，这对于睡眠 - 觉醒 - 节律的调节是重要的，尤其是REM睡眠。

观察到的与食物摄入相关的大脑活动模式的变化可能是由小吃食品的分子组成引起的，例如导致更高的能量密度。 另外，零食的卡路里供应可以诱导大脑活动模式的调节。 现在需要进一步研究以通过引入具有对照匹配的卡路里摄入的零食组或通过测试限定的零食组分对大脑活动模式的影响来揭示观察到的变化的触发因素。