延长高脂肪饮食可减少多巴胺再摄取而不改变DAT基因表达（2013）

  • Jackson J. Cone，
  • Elena H. Chartoff，
  • 大卫·N·波特，
  • Stephanie R. Ebner，
  • 米切尔F.罗伊特曼

抽象

饮食诱导的肥胖（DIO）的发展可以有效地改变多巴胺信号传导的多个方面，包括多巴胺转运蛋白（DAT）表达和多巴胺再摄取。 然而，饮食诱导的DAT表达和功能变化的时间过程以及这些变化是否依赖于DIO的发展仍未得到解决。 在这里，我们给大鼠喂食2或6周的高（HFD）或低（LFD）脂肪饮食。 饮食暴露后，用氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，并通过电刺激腹侧被盖区（VTA）中的多巴胺细胞体并使用快速扫描循环伏安法记录腹侧纹状体中多巴胺浓度的变化来评估纹状体DAT功能。 我们还量化了HFD对暴露于相同饮食方案后来自单独一组大鼠的纹状体细胞部分中膜相关DAT的影响。 值得注意的是，我们的治疗组没有一个体重不同。 我们发现在6后相对于LFD大鼠，HFD大鼠的多巴胺再摄取率不足，但在饮食暴露的2周没有。 另外，相对于LFD大鼠，HFD后可卡因的药理学攻击后诱发的多巴胺的增加在HFD中显着减弱。 蛋白质印迹分析显示饮食对总DAT蛋白没有影响。 然而，6周的HFD暴露显着降低了突触体膜相关部分中的50 kDa DAT同种型，但不是与回收内体相关的部分。 我们的数据提供了饮食诱导的多巴胺再摄取改变的进一步证据，与DAT产生的变化无关，并证明这种变化可以在没有DIO发展的情况下显现。 

引文： Cone JJ，Chartoff EH，Potter DN，Ebner SR，Roitman MF（2013）延长高脂肪饮食可减少多巴胺再摄取而不改变DAT基因表达。 PLoS ONE 8（3）：e58251。 DOI：10.1371 / journal.pone.0058251

责任编辑： Sidney Arthur Simon，美国杜克大学医学中心

收稿日期： 十月26，2012; 公认： 二月5，2013; 出版日期： 2013 年 3 月 13 日

版权： ©2013 Cone等。 这是一份根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用，分发和复制，前提是原始作者和来源被记入贷方。

资金： 所描述的项目得到了美国国立卫生研究院（NIH）的支持，即生物医学神经科学培训计划（JJC）的DA025634（MFR）和T32-MH067631。 国家研究资源中心和美国国立卫生研究院推进转化科学国家中心通过UL1RR029877（JJC）和芝加哥生物医学联合会在芝加哥社区信托基金（JJC）的Searle基金的支持下提供了额外的支持。 内容完全由作者负责，并不一定代表NIH或芝加哥生物医学联盟的官方观点。 资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称没有竞争利益存在。

介绍

超重和肥胖代表了美国和全世界人口中越来越大的比例 [1], [2]。 虽然肥胖的途径很多，但对健康体重的最大威胁之一可能是高度适口，热量密集的食物的流行和消费。 [3]。 实际上，食物的能量密度（千卡/克）有助于成年人的超重和肥胖 [4], [5]。 可口的食物会引起人类和非人类动物纹状体中多巴胺的释放 [6], [7], [8], [9] 食物中脂肪的主观评价与腹侧纹状体神经反应的强度呈正相关 [10]。 因此，多巴胺和纹状体似乎有助于对能量密集食物的偏好。 最近，研究表明饮食的差异可能导致纹状体电路和食物导向行为的同时变化 [11]。 然而，可能不太受重视的是越来越多的证据表明，摄入食物的差异，特别是脂肪，可以反馈和改变纹状体多巴胺信号。

纹状体多巴胺信号受若干因素调节，包括酪氨酸羟化酶，突触前和突触后多巴胺受体以及突触前多巴胺转运蛋白（DATs）产生的多巴胺，所有这些都与肥胖有关。 [12], [13]。 DAT数量或功能的改变可以改变释放的多巴胺的影响范围并因此改变纹状体功能 [14], [15]。 已经证明，针对摄入的食物释放的胰岛素会影响DAT功能 [16], [17]。 因此，DAT是饮食影响的可能候选者之一。

最近，已经探索了肥胖与DAT可用性之间的相关性以及饮食诱导的DAT功能的改变。 体重指数（BMI）与人纹状体中的DAT可用性负相关 [18]。 在高脂肪饮食（HFD）喂养的小鼠中，DAT结合和因此可用性降低 [19]。 HFD诱导的肥胖（DIO）与大鼠DAT对多巴胺再摄取率的降低有关 [20]。 总之，这些研究表明，通过HFD消耗建立的肥胖可以有效地影响多巴胺信号传导的关键突触前调节因子 - 尤其是DAT。 然而，饮食诱导的多巴胺信号传导改变的时间过程以及DIO的发展是否是改变显现的必要条件仍然未知。 我们通过唤起腹侧纹状体中的多巴胺释放并使用快速扫描循环伏安法量化其在大鼠中的再摄取速率来测定DAT功能。 为了确定DAT基因表达减少是否导致多巴胺再摄取减少，我们使用实时qRT-PCR测量了腹侧被盖区和黑质中的DAT mRNA。 此外，我们使用生化分馏程序和蛋白质印迹分析来测定粗突触体和内体膜中的纹状体DAT水平。 大鼠具有2或6周的高脂肪或低脂肪饮食，但所有测量均在不存在DIO的情况下进行。 我们的研究结果表明，长期摄入HFD，不依赖于DIO，可降低腹侧纹状体中多巴胺的再摄取率而不降低DAT表达。

材料和方法

道德声明

本研究严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。 该方案得到了芝加哥伊利诺伊大学动物护理委员会的批准。 所有手术均在尿烷麻醉下进行，并且尽一切努力使痛苦最小化。

主题

使用标准的雄性Sprague-Dawley大鼠（n = 67），大约2个月并且在到达时称重225-275 g。 将动物分别置于塑料笼（26.5×50×20 cm）中，温度 - （22°C）和湿度 - （30％）受控环境，在12：12 h光照：黑暗循环（在07：00点亮） H）。 大鼠适应了该设施一周 随意 获得标准的实验室食物和水。

食物摄入量和体重测量

适应后，将大鼠称重并随机分配至1组的4，其对初始体重进行平衡。 两组维持低脂肪饮食（LFD; Research Diets，New Brunswick，NJ; D12450B; 10％来自脂肪的千卡（3.85 kcal / g））。 其他2组维持在HFD（Research Diets; D12492; 60％来自脂肪的千卡（5.24 kcal / g））。 对于每种饮食，将大鼠维持2或6周（wks）。 因此，4组是：LFD-2 wk（n = 18），HFD-2 wk（n = 16），LFD-6 wk（n = 16）和HFD-6 wk（n = 17）。 所有团体都有 随意 获得水。 食物摄取和体重测量进行三次/周，并且对于进行伏安记录或DAT蛋白质/信息分析的大鼠分别报告数据。

手术程序和多巴胺测量

饮食接触后，准备了一部分体重无差异的大鼠进行伏安记录（LFD-2周（n = 8），HFD-2周（n = 6），LFD-6周（n = 6） ，以及在尿烷（6 g / kg）麻醉下进行的HFD-7 wk（n = 1.5）[如9,21]。 将导向插管（Bioanalytical Systems，West Lafayette，IL）放置在腹侧纹状体上方（前侧1.3 mm，距前reg外侧1.5 mm），在对侧皮层中植入氯化银线（Ag / AgCl）参比电极，用不锈钢螺钉和牙科用水泥固定在头骨上。 将包含碳纤维电极（CFE）的微操纵器插入引导套管，并将电极降低到腹侧纹状体中。 将CFE和参比电极连接至探头台，然后将CFE的电势从-0.4扫描至+1.3 V（vs。Ag / AgCl），然后从背面扫描（400 V / s； 10 Hz）。 然后将双极刺激电极（Plastics One，Roanoke，VA）逐渐降低到腹侧被盖区/黑质致密部（VTA / SNpc；后侧5.2 mm，侧向1.0 mm，距前reg部腹侧最初为7.0 mm），增量为0.2 mm。 。 在每次增量时，都会传送一系列电流脉冲（60个脉冲，每个脉冲4 ms，60 Hz，400 µA）。 当刺激电极位于VTA / SNpc中且CFE位于纹状体中时，刺激可靠地引起多巴胺释放-使用主成分分析从伏安数据中提取 [9], [22]; 在每次实验后，在流动注射系统中校准每个CFE后，将其转换成浓度 [23]。 刺激电极的位置被优化以最大限度地释放。 然后在开始实验之前使CFE平衡10 min。 通过电刺激VTA / SNpc（与上述相同的参数）诱发多巴胺释放，并且相对于刺激，从-5 s至10 s计算多巴胺浓度的所得变化。 刺激后立即给大鼠注射溶解在0.9％盐水中的可卡因盐酸盐（10 mg / kg ip），并且在10分钟后，重复刺激。 使用LabVIEW（National Instruments，Austin，TX，USA）编写的软件进行施加电压，数据采集和分析。 [22].

多巴胺再摄取

使用Demon Voltammetry Analysis Software（24; Wake Forest University，Winston-Salem NC）对多巴胺再摄取进行建模。 在这里，我们报告衰变常数tau作为我们衡量多巴胺再摄取率的指标。 Tau来自指数曲线拟合，其包含大部分多巴胺清除曲线并且与K高度相关（r = .9899）m，多巴胺对DAT的表观亲和力 [24]。 为了确定可卡因对峰值多巴胺浓度的影响，我们比较了给药前后获得的值（％变化）。

组织学

每次记录后，将不锈钢电极（AM Systems #571500，Sequim，WA）降低至与CFE相同的深度，并制作损伤（10μA，4 s）以标记记录位置。 取出脑并储存在10％福尔马林中。 光学显微镜用于识别通过纹状体的冠状切片（50μm）上的病变位置。 这里报告的所有记录都是在腹侧纹状体中进行的 [25].

纹状体组织的亚细胞分离

通过断头处死大鼠（LFD-2 wk，HFD-2 wk，LFD-6 wk和HFD-6 wk; n = 10 /组;体重没有差异）。 使用描述于中的方案进行生化分级分离 [26]，稍作修改。 快速取出脑，在异戊烷中冷冻，并在低温恒温器（HM505E，Microm，Walldorf，Germany，-20°C）上切片直至到达纹状体。 双边1-mm3 在15.2 ml冰冷的TEVP（20 mM Tris碱，0.8 mM NaF，10 mM Na）中对穿过腹侧纹状体（平均组织重量：5 mg）的穿孔进行均质化以用于1。3VO4，1 mM EDTA，1 mM EGTA，pH 7.4）+ 320 mM蔗糖缓冲液。 保存总匀浆（H）的100μl等分试样。 剩余的H以800×g离心10 min，4℃。 将沉淀（P1，细胞核和大碎片）重悬于0.2 ml TEVP缓冲液中并保存。 除去上清液（S1）并置于冰上的干净管中。 将S1在9200×g下以15℃离心4 min以产生沉淀（P2，粗突触体膜）和上清液（S2）。 将P2在TEVP + 35.6 mM蔗糖缓冲液中漂洗一次，然后重悬于0.25 ml的TEVP + 35.6 mM蔗糖缓冲液中，轻轻涡旋3并通过将样品保持在冰上30 min进行低渗透裂解。 收集上清液（S2）并以165,000×g离心2 h以产生沉淀（P3，光膜，再循环内体），将其重悬于TEVP（0.1 ml）中并保存。 将所有样品保持在-80℃直至聚丙烯酰胺凝胶电泳。

凝胶电泳和Western Blotting

使用Bio-Rad DC蛋白质检测试剂盒（加利福尼亚州赫尔克斯）确定蛋白质含量，并将每个样品的浓度调整为0.3 mg / ml蛋白质。 将NuPAGE LDS（十二烷基硫酸锂）样品缓冲液（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚）和50 mM二硫苏糖醇添加到每个样品中，然后在70°C加热10分钟。 为了每个部分上等量的蛋白质，将每个样本3 µg上样到NuPAGE Novex 4–12％Bis-Tris凝胶（Invitrogen）中，通过凝胶电泳进行分离。 随后将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）（PerkinElmer Life Sciences，波士顿，马萨诸塞州）。 在封闭缓冲液（PBS中的2％脱脂奶粉和5％Tween 0.02 [PBS-T]）中，将非特异性结合位点在室温下封闭20小时。 然后将印迹在第一抗体（1∶3000小鼠单克隆抗NR2B [＃05–920，密理博]，1∶5000兔抗DAT [＃AB2231，密理博]和1∶1000小鼠单克隆抗运铁蛋白受体（ TfR）[＃13–6800，Invitrogen]。将印迹切成3个部分：高（> 97 kDa），中等（46-97 kDa）和低（<46 kDa）重量，每个部分用识别出抗体的探针进行探测抗体的表观分子量为：NR2B，180 kDa； DAT，75、64和50 kDa； TrfR，95 kDa；在中等重量范围的DAT印迹上探测后，通过孵育剥离抗体用溶出缓冲液（62.5 mM Tris，2％SDS，100 mMβ-巯基乙醇，pH 6.8）在15°C下处理50分钟。随后将印迹重新封闭并用抗TfR进行探测。参见BluePlus 2（Invitrogen）运行染色的标准品进行分子量估算。

使用Carestream Molecular Imaging Software 5.0分析蛋白质免疫印迹。 确定每个频带的净强度（感兴趣的频带内的像素之和减去背景像素的总和）。 为了允许在印迹之间进行比较，将数据标准化为2和6周的LFD对照。 数据表示为与LFD±SEM相比的平均倍数诱导。

定量实时逆转录酶聚合酶链反应（qRT-PCR）

在收集用于蛋白质印迹分析的纹状体穿孔后，在切片机上对冷冻的脑进行冠状切片直至达到VTA / SN。 双边1-mm3 制备VTA和SN组织（平均组织重量= 15.0 mg），并使用PureLink RNA Mini Kit（Invitrogen）提取RNA。 在Agilent Bioanalyzer 6000上使用RNA 2100 Nano Chip（Agilent，Santa Clara，CA）评估RNA质量和数量。 所有样品的RNA完整性数（RIN）均超过7，表明质量高。 使用iScript cDNA合成试剂盒（BioRad）在ThermoHybaid iCycler（Thermo Scientific）中使用1微克总RNA合成cDNA。 特异于DAT的引物（Slc6a3;正向引物：GGAAGCTGGTCAGCCCCTGCTT，反向引物：GAATTGGCGCACCTCCCCTCTG），β-肌动蛋白（Nba;正向引物：AGGGAAATCGTGCGTGACAT;反向引物：AAGGAAGGCTGGAAGAGAGC）和TATA盒结合蛋白（Tbp;正向引物：ACCTAAAGACCATTGCACTTCGTGCC;反向引物） ：GCTCCTGTGCACACCATTTTCCC）基因（Genbank登录号NM_012694，NM_031144和NM_001004198）使用NCBI Primer-BLAST设计（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/并购自Integrated DNA Technologies（爱荷华州Coralville）。 熔解曲线分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了引物的特异性。 DAT，β-肌动蛋白和Tbp扩增子的长度分别为266，182和136碱基对。

使用Q-PCR试剂盒（iQ SybrGreen Supermix，BioRad）。 反应在MyiQ单色实时PCR检测系统（BioRad）上以20μl的体积进行，其中2μL的3μM正向和反向引物和4μLcDNA样品稀释1：10。 PCR循环条件为95℃，5 min; 对于40 s，94在15°C下循环，对于60 s，15°为72，对于15，84°C。 基于扩增子熔融温度，在15℃的读取温度下收集1.00 s的数据。 通过连续稀释（0.2，0.04，0.008和XNUMX倍）包含来自所有处理组的cDNA的相等混合物的主cDNA原液，产生每种引物组的标准稀释曲线。 日志10 将稀释值相对于标准曲线的阈值循环值作图。 MyiQ光学系统软件（BioRad）用于分析数据。 不含cDNA模板的样品和不含逆转录酶的cDNA反应样品分别作为基因组DNA污染和扩增的对照。 将报告的值标准化为每个样品的内标ß-肌动蛋白和Tbp的平均值。 数据表示为DAT /内标mRNA的平均相对水平mRNA±SEM。

统计分析

DAT表达在两个人的生命周期中动态变化 [27] 和老鼠 [28], [29]。 此外，随着年轻大鼠的成熟，多巴胺和对可卡因的行为反应也会发生变化 [30]。 因此，DAT的测量值可能随着年龄的变化而共同变化，并且禁止在2周和6周围组之间进行有意义的比较。 因此，使用Student's非配对t检验分别比较2和6 wk组的食物摄取，体重，峰值多巴胺浓度，tau，％变化和相对基因表达的组平均值。 对于蛋白质印迹分析，使用双向重复测量ANOVA（dietXfraction）分别比较2和6 wk组的归一化DAT条带强度的组差异。 所有统计分析均在Graph Pad 5（Prism Inc.）中进行。

成果

HFD促进脂肪消耗增加

在饮食暴露开始之前，2中的初始体重没有差异（LFD：275.22 +/- 4.1 g; HFD：280.87 +/- 4.8 g; p = 0.37）或6周（LFD：287.31 +/- 4.9 g; HFD：289.44 +/- 5.1 g; 6周 p = 0.97）组。 尽管食用了组成完全不同的饮食，但我们发现2周或6周后饮食组之间的体重没有差异（图1a-b; 两个ns）。 2和6饮食暴露后，各组之间消耗的总kcals也没有差异（图1c-d; NS）。 然而，HFD大鼠从脂肪中消耗了更多的kcals（图1e-f; 2 wks：t（32）= 25.59; 6 wks：t（31）= 27.54; p两种饮食持续时间均<0.0001）。

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图1。 食物摄入量和体重测量值。

HFD和LFD在最终体重方面没有差异（A-B）或消耗的总卡路里（光盘）遵循饮食暴露的2或6周。 （E-F在2周和6周条件下，HFD大鼠比LFD大鼠消耗更多的脂肪千卡（***）p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g001

延长的HFD降低DA再摄取率

伏度记录在腹侧纹状体中进行（图2). 图3 图1显示了在饮食的6周围从大鼠获得的多巴胺浓度的代表性电诱发变化。 在基线时，诱发多巴胺的大小在饮食组和饮食持续时间之间没有差异（图4a-b，两个ns）。 然而，个别实例的检查表明饮食暴露后6周围饮食组之间多巴胺浓度峰值后的衰退率不同（图3 例如a-b）。 衰变速率主要是由于DAT的多巴胺清除率 [31]，我们建模为单相指数来确定tau。 2饮食暴露后饮食组之间没有差异（图4c）。 然而，在6饮食暴露后，相对于LFD-6 wk，HFD-6 wk大鼠的tau显着增加（图4d; t（11）= 2.668; p<0.05）。 因此，与食用LFD的动物相比，6周的HFD降低了腹侧纹状体中多巴胺清除的速率。

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图2。 用于再摄取分析的记录位点的组织学验证。

用LFD喂养的大鼠的记录位点用灰色三角形编码，用HFD大鼠用黑色圆圈编码。 数字表示前囟前方的距离。 图改编自Paxinos和Watson 2006。

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g002

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图3。 VTA / SNc的电刺激引起多巴胺浓度的相位峰值。

饮食暴露6周后获得的数据的代表性实例。 a) 背景扣除的彩色图显示在VTA / SNc的电刺激（STIM）之前（-5至0相对于起始）和之后（相对于起始的0.1至10）电刺激（STIM）之间电极的不同电位下的电流变化。 时间是横坐标，电极电位是纵坐标，电流变化以假色编码。 多巴胺[通过其氧化（+ 0.6 V;绿色）和还原（-0.2 V;蓝色）特征鉴定]响应于该LFD-6 wk大鼠中的刺激而瞬时增加。 b) 与a）相同，除了HFD-6 wk大鼠。 c) 从a）中的颜色图中提取作为时间函数的多巴胺浓度，并通过曲线拟合来识别tau。 两个红点标记达到tau时的峰值和多巴胺浓度。 Tau在右侧显示。 d) 与c）相同，但数据从b）中提取。

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g003

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图4。 六周的高脂肪饮食可降低多巴胺再摄取的速度，并减弱多巴胺对可卡因的反应。

2后VTA / SNpc刺激引起的平均峰值多巴胺浓度（a）或6周（b）可卡因注射前的饮食暴露。 光盘）2之后的平均Tau（c）wks或6 wks（d）饮食暴露。 相对于LFD-6 wk大鼠，HFD-6 wk大鼠的Tau显着增加（*p E-F）可卡因注射2后峰值诱发多巴胺浓度的百分比变化（e）和6（f）几周的饮食暴露。 相对于LFD-6周大鼠，HFD-6周的变化百分比显着较小（**p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g004

延长的HFD降低了对可卡因的DA反应

为了进一步探测饮食诱导的DAT改变，我们给大鼠注射了DAT阻滞剂可卡因。 电刺激后的多巴胺峰浓度是由多巴胺释放引起的，但也受到DAT同时去除多巴胺的限制 [21]。 我们通过计算诱发多巴胺相对于药物前值（变化百分比）的变化来表征可卡因对多巴胺传递的影响。 两周的HFD没有影响相对于LFD的％变化（图4e; NS）。 然而，在6饮食暴露后，相对于LFD，HFD的％变化显着减弱（图4f; t（10）= 4.014; p<0.01）。 我们的结果表明，HFD暴露6周（而不是2周）可降低多巴胺对可卡因的反应。

延长的HFD暴露降低了突触体膜中的DAT蛋白表达

为了确定延长的HFD的作用是否是由于DAT数量的变化，在总组织匀浆（H级分），突触体膜（P2级分）和细胞内循环内体（P3级分）中定量DAT蛋白质水平。 DAT是一个 N由于蛋白质成熟时糖基化水平增加，表观分子量在50和80 kDa之间的相关糖蛋白 [32]。 通过在突触体膜部分中的NMDA受体的NR2B亚基和内体部分中的转铁蛋白受体的富集表达来确认分级（例如印迹见 图5b）。 我们发现2和6饮食暴露后总DAT蛋白没有差异（数据未显示）。 为了测试DAT蛋白的分数特异性差异，我们使用双向重复测量ANOVA（dietXfraction）。 与伏安法实验一致，2饮食暴露不足以改变P2或P3组分中任何DAT同种型的水平（图。 5。 C，E，G; 所有ns）。 然而，在6饮食暴露之后，有一个显着的饮食Xfraction相互作用（F(1,18) = 8.361， p<0.01）; 图5d）对于DAT的50 kD同种型。 因此，延长的HFD显着降低了P50级分中DAT的2 kD同种型，并导致P3级分增加的趋势。 我们发现饮食或分数对64 kD没有影响（图5f; ns）或70 kD（图5h; ns）DAT同种型。

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图5。 摄入高脂肪饮食可减少腹侧纹状体中与膜相关的DAT蛋白。

a) 代表性图像显示取自腹侧纹状体的（2）1×1 mm组织冲头，其组合用于DAT蛋白质分析。 VStr =腹侧纹状体; DStr = Dorsal Striatum; cc =胼call体; ac =前连合。 b) 数据的代表性西方印迹以c-h表示。 L = LFD; H = HFD; TfR =转铁蛋白受体; NR2B = NMDA受体的NR2B亚基。 c) 在饮食暴露50周后，对于P2或P3级分，2 kD DAT蛋白没有差异。 d) P50中的2 kD DAT蛋白显着降低（* = p<.05），但相对于LFD-3 wk大鼠，不是HFD-6 wk腹侧纹状体组织的P6分数。 任64个后，2 kD DAT蛋白均无差异（e）或6周（f）饮食暴露。 70后2 kD DAT蛋白无差异（g）或6周（h）饮食暴露。

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g005

为了确定P2级分中DAT蛋白水平的降低是否部分归因于DAT转录的减少，在与上述相同的大鼠中测量VTA / SNc DAT mRNA水平（图6a 例如）。 我们观察到2或6饮食暴露后中脑DAT mRNA饮食组之间没有差异（图6b-c; 两个ns）。 因此，腹侧纹状体内DAT蛋白水平的差异不太可能是由于DAT产生的缺陷。

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图6。 高脂肪饮食消费不会改变DAT mRNA水平。 一个）

代表性图像显示取自VTA / SN的1×1 mm组织冲头并组合用于DAT mRNA分析。 cp =脑腱; pc =后连合; MM =乳头内侧核。 2周后相对DAT mRNA水平无差异（b）或6周饮食暴露（c).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g006

讨论

延长的HFD消耗可导致中枢神经系统内的DIO和可塑性。 多巴胺神经元和纹状体多巴胺受体似乎是受HFD和肥胖个体影响的一组CNS靶标 [11], [13], [33]。 在这里，我们报告HFD降低了腹侧纹状体中多巴胺再摄取的速率，并且这种效果取决于暴露的持续时间。 重要的是，HFD对DAT功能的影响发生在没有DIO的情况下。 虽然在本研究中我们没有直接测量身体肥胖的标志物，但传统上动物被归类为DIO或饮食抗性，仅基于暴露于HFD后的体重增加 [34]。 延长的HFD显着减弱了干扰DAT的可卡因的能力，从而加强了多巴胺释放的程度。 我们使用Western印迹分析量化腹侧纹状体中的DAT蛋白水平 - 区分位于富含质膜或再循环内体的亚细胞级分中的DAT。 我们发现与质膜相关的DAT的未成熟同种型显着减少。 因此，延长的HFD似乎通过干扰DAT运输或可能成熟而不是通过降低DAT基因表达或DAT mRNA稳定性来降低通过DAT的多巴胺再摄取速率。 此外，暴露于HFD的2至6周的时间段似乎是饮食诱导的可塑性相对于DAT的最早临界点。

肥胖与纹状体多巴胺信号传导的多个方面相关，包括人类中的DAT可用性 [18] 和老鼠 [19]。 然而，直到最近才显示DIO的发展改变了大鼠中多巴胺再摄取的速率 [20]。 虽然该研究表明仅在4周的HFD后外源施用的多巴胺后多巴胺再摄取受损，但是基于初始体重增加选择维持在HFD上的动物，因此可以代表独特的群体。 与这种观点一致，与LFD对照相比，HFD动物继续摄入更多的卡路里并获得更多的体重。 最近的另一项研究报告，在外行大鼠的12周HFD后，多巴胺再摄取受损 [35]。 然而，当进行再摄取测量时，喂食HFD的动物与标准实验室饲料饮食之间的体重存在显着差异。 因此，尚不清楚多巴胺再摄取的损伤是否是DIO发展的直接结果或先于DIO的发展。 与最近的这些报告相反，我们发现当进行再摄取测量时，我们的饮食组之间的体重或总卡路里消耗量没有差异。 我们发现6后多巴胺再摄取的差异，而不是2，HFD周，表明饮食诱导的多巴胺再摄取改变是对饮食组成的慢性但非急性变化的反应。 此外，我们的研究结果表明，饮食诱导的DAT改变不是肥胖的结果，而是导致疾病的发展。 未来的研究将需要解决动物种群是否对DIO差异敏感 [34] 在DAT表达/功能方面存在预先存在的差异，或者在饮食诱导的DAT变化方面存在差异敏感性。

据我们所知，这是第一项证明HFD可降低多巴胺对可卡因反应的研究。 考虑到多巴胺在药物奖励中的作用，我们的研究结果与先前的研究结果一致，证明喂食HFD大约6周的大鼠获得可卡因自我给药的速度比喂食对照饮食的动物慢。 [36]。 重要的是，这种效果也与DIO的发展无关。 此外，大鼠选择性繁殖对DIO的易感性表明可卡因位置偏好减少，这表明可卡因的有益特性在这些动物中变得迟钝 [37]。 我们在HFD-6 wk大鼠中观察到的对可卡因的反应降低可能是由于纹状体DAT可用性降低。 然而，可卡因还通过非DAT依赖性机制增加多巴胺信号传导。 具体而言，HFD可能具有受损的可卡因诱导的储备多巴胺囊泡的动员 [38]。 可卡因还减弱了VTA内多巴胺神经元的GABA传递 [39] 并诱导多巴胺细胞体的激发速率的振荡 [40]。 任何或所有这些过程也可能受到HFD的影响。 未来的研究将需要解决HFD如何改变可卡因的有益方面和/或药物诱导的神经适应的可能性的机制 [18]。 消耗HFD会削弱行为 [41] 和多巴胺反应 [20], [42] 安非他明，也会干扰DAT。 重要的是，摄入HFD的大鼠与喂食对照饮食的大鼠的热量相匹配，不会产生DIO但仍未能形成安非他明条件性位置偏爱 [41]。 与此处提供的数据一起，似乎消费HFD减弱了对精神兴奋剂的反应。 所有滥用药物都会影响多巴胺系统，药物诱导的多巴胺信号增强被认为对成瘾的发展至关重要 [43]。 因此，HFD大鼠对可卡因的反应降低与肥胖人群发生药物滥用障碍的终生风险显着降低的报道一致。 [44]。 未来的工作将需要解决与正常体重控制相比，肥胖个体的可卡因奖励的主观评级是否不同。

我们的蛋白质印迹分析表明延长的HFD消耗不会影响总纹状体DAT蛋白，而是减少非糖基化50 kDa DAT同种型整合到突触体膜中。 虽然DAT糖基化改善了多巴胺转运速率并增加了膜表面稳定性 [45], [46], [47]，来自人的非糖基化DAT [45], [46] 以及老鼠 [47] 容易运输多巴胺。 此外，免疫标记实验表明，与猴子和人类的背侧纹状体相比，腹侧的非糖基化DAT水平更高。 [47]。 总之，这些研究表明，50 kDa DAT的膜水平降低可能导致我们在6 wk HFD大鼠中观察到的再摄取缺陷。 我们的数据与先前的研究一致，显示HFD消耗降低了小鼠腹侧纹状体中的DAT可用性 [19]。 然而，该研究未测量不同细胞内区室中的DAT定位。 此外，我们的研究结果与显示DIO大鼠纹状体细胞表面DAT降低的研究一致 [20]。 该研究还报道了在DIO模型中DAT蛋白质总水平不受饮食影响。 我们扩展了这一发现，表明总DAT蛋白也不受外来大鼠的HFD影响。 因此，长期食用HFD不会改变DAT表达，但可能会干扰DAT运输或成熟。

在HFN暴露的2或6周围，VTA / SNpc DAT mRNA水平缺乏差异进一步支持了总体DAT水平不受我们的饮食操作影响的观点。 该结果与之前的报告形成对比，该报告显示在HFD消耗的17周后小鼠VTA中DAT mRNA降低 [12]。 然而，在该研究中，在饮食组的12周的体重不同之后测量DAT mRNA水平。 因此，他们的结果可能代表了对DIO的后期调整。 总之，我们的数据提供了强有力的证据，即通过减少膜相关DAT而不改变总DAT表达，暴露于HFD导致纹状体多巴胺再摄取的功能性改变。 重要的是，我们报告DAT饮食诱导的中断可能发生在DIO发病之前，这表明这些改变可能导致肥胖的发展。

我们的数据增加了越来越多的文献，涉及饮食调节多巴胺功能，并提供进一步的证据表明饮食诱导的DAT表达变化导致多巴胺信号传导的功能相关变化。 通过DAT的饮食诱导的纹状体多巴胺信号传导动态的改变可能对喂养行为产生影响。 与食物有关的刺激引起纹状体多巴胺的阶段性增加 [9], [48], [49]，这可能会加强和加强以食物为导向的行动 [50]。 在这里，我们显示6周的HFD消耗通过减少纹状体区域中膜相关的DAT来延长相位多巴胺释放的持续时间，其中多巴胺功能对于食物摄入是必需的。 [51]。 DAT的饮食依赖性改变可以促进前馈机制，由食物刺激引起的延长的多巴胺信号增加低亲和力纹状体多巴胺D1受体的激活，这对于接近行为是至关重要的 [52], [53], [54]。 随着时间的推移，纹状体多巴胺的持续升高可以促进适应性，例如多巴胺D2受体（D2R）的下调，这已经在人类和啮齿动物的肥胖模型中得到证实。 [11], [33]。 我们的研究表明肥胖的发展不是改变多巴胺再摄取的必要条件。 因此，膜DAT的饮食相关减少可能先于并且促成D2R下调，肥胖和在HFD消耗过程中发展的强迫性进食行为的发生。 [11].

致谢

我们要感谢Drs。 Jamie D. Roitman和James E. McCutcheon对早期版本的手稿提供了有用的评论。 本文的内容完全由作者负责，并不一定代表NIH或芝加哥生物医学联盟的官方观点。

作者贡献

构思并设计了实验：JJC EHC MFR。 进行实验：JJC DNP SRE。 分析数据：JJC EHC SRE MFR。 写了这篇论文：JJC EHC MFR。

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