前精神病。 2018; 9：81。
在线发布2018 Mar 12。 DOI： 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID：PMC5858605
结论： 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 吉恩李,7 Jung-Seok Choi,9 戴大金,5,* 和 Yeun-Jun Chung1,2,3,*
抽象
背景
上瘾使用互联网和在线游戏是一种潜在的精神疾病，称为网络游戏障碍（IGD）。 已经报道了在患有某些精神疾病的患者的血液和脑组织中改变的microRNA（miRNA）表达谱，并且被建议作为生物标志物。 然而，没有关于IGD中血液miRNA谱的报道。
方法
为了发现IGD相关的miRNA，我们使用TaqMan低密度miRNA阵列分析了51样品（25 IGD和26对照）的miRNA表达谱。 为了验证，我们使用36独立样品（20 IGD和16对照）进行定量逆转录PCR。
成果
通过发现和独立验证，我们鉴定了在IGD组中显着下调的三种miRNA（hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-26b-5p，hsa-miR-652-3p）。 具有所有三种miRNA改变的个体具有比没有改变的那些更高的IGD风险[比值比（OR）22，95％CI 2.29-211.11]，并且OR随剂量依赖性地随着改变的miRNA的数量而增加。 三种miRNA的预测靶基因与神经通路相关。 我们通过蛋白质印迹探索了三种下游靶基因的蛋白质表达，并证实了IGD组中GABRB2和DPYSL2的表达显着更高。
结论
我们观察到在IGD患者中hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-652-3p的表达下调。 我们的结果将有助于理解IGD的病理生理学。
介绍
在具有广泛的互联网接入基础设施的国家，上瘾使用互联网和基于互联网的游戏不仅仅是一种社会现象，而是一种被称为网络游戏障碍（IGD）的潜在精神疾病（1–3）。 根据流行病学报告，各国青少年IGD患病率各不相同，从0.8到26.7％（4）。 特别是，研究表明，在韩国，中国，台湾，香港和新加坡等许多亚洲国家，青少年的患病率高于10％（4）。 IGD与认知，心理社会关系和日常生活受损有关; 例如，学业或职业表现下降（4–7）。 IGD现已列入精神疾病诊断和统计手册（DSM-V）第五次修订的第III部分（进一步研究的条件）（8）。 然而，尽管其具有临床社会重要性，但对IGD背后的分子遗传机制知之甚少。
最近的大规模双胞胎研究表明了IGD的遗传背景（9, 10）。 Vink等人。 调查荷兰双胞胎登记册中5,247单卵双生和双卵双胎的强迫性互联网使用的个体差异，并报告48％的差异由遗传因素解释（9）。 李等人。 观察825对中国青少年双胞胎并报告遗传因素解释了58-66％的差异（10）。 因此，参与神经传递，认知和注意的基因的多态性，如多巴胺受体D2基因（DRD2），儿茶酚胺-O-甲基转移酶基因（COMT），血清素转运蛋白基因（5HTTLPR）和胆碱能受体烟碱α4基因（CHRNA4据报道，与网络成瘾有显着关联（11–13）。 最近，Kim等人。 通过下一代测序分析筛选出与神经递质的产生，作用和代谢相关的超过100候选基因的变体，并报道了rs2229910的 NTRK3 基因与IGD有关（14).
除遗传因素外，众所周知，神经行为表型是由包括microRNA（miRNA）在内的非编码RNA进行表观遗传学控制的（15, 16）。 miRNA是小的非编码单链RNA分子（长度约为20-23核苷酸），通过降解mRNA负调节蛋白质编码基因的表达，并在多种疾病的病理生理过程中发挥关键作用（17）。 有证据表明miRNA在人类中枢神经系统（CNS）中含量丰富，可以微调其靶基因的表达水平，这些基因参与CNS系统的发育和成熟（15）。 事实上，最近的研究表明miRNA表达谱在精神疾病患者的脑组织中发生了改变，这表明他们的表达谱可能是精神疾病的生物标志物（15, 16, 18）。 例如，通过尸检分析，Lopez等人。 据报道，调节代谢型谷氨酸受体-1202基因表达并预测对抗抑郁药反应的miR-4的表达在重性抑郁症患者的前额皮质组织中下调（19）。 就生物标志物筛选而言，该方法具有明显的限制，因为不可能进行CNS组织的活组织检查以进行筛选。 由于miRNA可以在血液（血浆或血清）中检测到，因此循环miRNA作为神经精神疾病中的非侵入性生物标志物具有明确的优势。 然而，到目前为止，还没有关于在IGD中循环miRNA谱的研究。 更好地理解循环miRNA表达谱有助于阐明IGD发展的机制并促进临床翻译。
在本研究中，我们旨在通过观察IGD和对照组之间差异表达的血浆miRNA来鉴定IGD相关的miRNA标记，并探索其生物学意义。
材料和方法
研究对象
我们使用DSM-V IGD评分对3,166青少年（12-18岁）进行了调查。 其中，根据DSM-V标准，251（168雄性和83雌性）被诊断为IGD（8）。 共有91个体（49 IGD和42对照）为本研究提供了知情同意书。 其中，根据排除标准排除了4个人。 最后，87个体（45 IGD受试者和42健康对照个体）参加该研究。 其中，51参与者（25 IGD患者和26对照）被招募为从2014到2016的发现集。 其他36参与者（20 IGD患者和16对照）被招募为来自2016的独立验证集。 所有参与者均为韩国人，来自首尔圣玛丽医院（韩国首尔）和首尔国立大学Boramae医院（韩国首尔）。 所有参与者都根据韩国儿童情感障碍和精神分裂症儿童时间表（K-SADS-PL）进行了精神科医生的结构化访谈（20）。 所有参与者完成了韩国韦氏儿童智力量表4th版（K-WISC-IV）的块设计和词汇子测试（21）。 冲动性通过Barratt冲动量表（BIS）进行评估（22）。 测量行为抑制系统（BInS）和行为激活系统（BAS）量表以评估人格维度（23）。 排除标准包括过去或现在的主要医学疾病（例如，糖尿病），神经障碍（例如，癫痫症，头部损伤），精神障碍（例如，重度抑郁症，焦虑症），精神发育迟滞或任何物质滥用（例如， ，烟草，大麻，酒精）。 表中总结了研究对象的一般特征 Table1.1。 该研究得到了韩国天主教大学医学院的机构审查委员会（MC16SISI0120）的批准。 所有参与者及其父母都签署了书面知情同意书
表1
研究对象的一般特征。
| 药物发现 | 验证 | 组合 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 系统 | IGD | P-值 | 系统 | IGD | P-值 | 系统 | IGD | P-值 | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| 年龄（岁） | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 13（12-17） | 13（12-15） | 0.759 | 15（13-18） | 14.5（12-18） | 0.628 | 14（12-18） | 14（12-18） | 0.509 |
| 每周互联网游戏时间（小时） | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 5.25（2-17） | 18（6-46） | 1.27E-6a | 5.5（2-23） | 8（1-112） | 0.374 | 5.5（2-23） | 14（1-112） | 1.63E-5a |
| 家庭月收入（百万韩元） | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 5（1-9） | 3（1-9） | 0.588 | 4（4-4） | 2（2-2） | 1.000 | 5（1-9） | 3（1-9） | 0.460 |
| 教育（年） | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 8（7-9） | 8（7-9） | 0.584 | 12（12-12） | 6（6-13） | 0.305 | 8（7-12） | 8（6-13） | 0.269 |
| K-WISC：块设计 | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 10.5（4-17） | 10（4-16） | 0.544 | 10（3-16） | 12.5（4-15） | 0.125 | 10（3-17） | 11（4-16） | 0.598 |
| K-WISC：词汇量 | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 9（5-17） | 7（5-13） | 0.174 | 9.5（8-15） | 11.5（5-15） | 0.595 | 9（5-17） | 9（5-15） | 0.527 |
| KS | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 24（17-36） | 37（22-51） | 3.81E-6a | 29（17-34） | 59（22-108） | 1.2E-5a | 25（17-36） | 40（22-108） | 2.05E-10a |
| BIS验证 | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 63（35-75） | 67.5（45-81） | 0.080 | 61（45-79） | 63（32-82） | 0.835 | 62（35-79） | 65（32-82） | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 31（15-40） | 31（13-51） | 0.558 | 36.5（22-48） | 34（27-52） | 1.000 | 32（15-48） | 34（13-52） | 0.637 |
| 垃圾箱 | |||||||||
| 中位数（最小 - 最大） | 18（10-26） | 17.5（13-27） | 0.642 | 18.5（12-25） | 20（13-21） | 0.138 | 18（10-26） | 19（13-27） | 0.302 |
IGD，网络游戏障碍患者; KS，韩国网络成瘾倾向量表; BIS，Barratt冲动性量表; BAS，行为激活系统; BInS，行为抑制系统; KRW，韩元.
aP <0.05（Mann–Whitney–Wilcoxon检验）.
TaqMan低密度miRNA阵列（TLDA）实验
从每个参与者收集外周血并在4 h内转移到实验室以最小化血细胞裂解。 将样品在室温下以3,000 rpm离心10 min。 然后，收集上清液（血浆层）而不污染血细胞。 使用TaqMan miRNA ABC纯化试剂盒（Human Panel A; Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）根据制造商的说明提取循环miRNA。 简言之，将50μL血浆样品和100μLABC缓冲液混合。 在与靶特异性抗miRNA磁珠杂交后，用100μL洗脱缓冲液从珠中洗脱有界循环miRNA。 在发现阶段，根据制造商的说明，使用TaqMan miRNA ABC纯化试剂盒（Human Panel A; Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）从381血浆样品（51 IGD和25对照）检查26 miRNA。 使用MegaplexPreAmp Primers Human Pool A和TaqManPreAmp Master Mix（Thermo Fisher Scientific）进行Megaplex逆转录和预扩增反应以增加用于miRNA表达分析的cDNA的量。 在ViiA2.0实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上运行TLDA组A v7（Thermo Fisher Scientific）以评估miRNA的表达。 使用ExpressionSuite软件v1.0.4（Thermo Fisher Scientific）处理原始数据以确定每种miRNA的Ct值。
TLDA的数据分析
我们首先测量了每个miRNA的阈值循环（Ct值）。 Ct值> 35的miRNA被认为是不可检测的，因此不进行后续分析。 将所有Ct值均标准化为miR-374b的Ct值（ΔCt值），miR-XNUMXb是在人血浆中循环最稳定表达的miRNA之一（24）。 使用对照样品的平均值作为Bioconductor中的HTqPCR包中的校准物计算表达的log2倍数变化率（ΔΔCt值）（25）。 每个miRNA靶标的相对定量（RQ）定义为2-ΔΔCT。 对于两组之间表达差异的假设检验，我们应用替代变量分析（SVA）来捕获异质性，例如使用 SVA Bioconductor中的包装（26）。 带有miRNA的miRNA P-值<0.05被认为在两组之间有显着差异。
基因集富集分析
对于基因集富集分析，我们在ToppGene Suite中使用ToppFun（27）推断显着丰富的基因本体论（GO）（28）术语，途径和疾病术语。 作为该方法的输入，我们使用1,230预测候选miRNA的靶基因。 根据ToppGene途径中的KEGG，BioCarta，Reactome，GeneMAPP和MSigDB，使用途径分析来发现预测的靶基因的显着途径。 功能富集术语的重要性是基于Bonferroni调整的 P-值。
定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证和复制
为了验证在发现阶段差异表达的10 miRNA，使用TaqMan MicroRNA Assay进行qRT-PCR（miR-15b-5p，＃000390; miR-26b-5p，＃000407; miR-29b-3p，＃ 000413; miR-125b-5p，＃000449; miR-200c-3p，＃002300; miR-337-5p，＃002156; miR-411-5p，＃001610; miR-423-5p，＃002340; miR-483根据制造商的协议，-5p，＃002338;和miR-652-3p，＃002352）和ViiA7系统（Life Technologies）。 使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（#4366596，Life Technologies），用miRNA特异性引物将10纳克总RNA转化为第一链cDNA，然后用TaqMan探针进行实时PCR。 每个miRNA的RQ定义为2-ΔCt其中ΔCt是所讨论样品的阈值循环的差异，相对于内源miRNA（miR-374b-5p，＃001319）标准化。 所有PCR反应一式三份进行，并将它们的Ct值取平均值。 我们以与基于阵列的分析相同的方式计算每种miRNA的log2倍数变化率（ΔΔCt）。 进行非参数Mann-Whitney-Wilcoxon检验以测试两组中miRNA表达水平的差异和阈值 P- 0.05的值。
蛋白质印迹分析
每个血清样本首先耗尽顶部14高丰度蛋白（白蛋白，免疫球蛋白G，免疫球蛋白A，血清转铁蛋白，触珠蛋白，α-1抗胰蛋白酶，纤维蛋白原，α-2巨球蛋白，α-1酸性糖蛋白，免疫球蛋白M，载脂蛋白AI）在蛋白质印迹分析之前，使用MARS-3柱（14×4.6mm，Agilent Technology，Santa Clara，CA，USA），载脂蛋白A-II，补体C50和转甲状腺素蛋白）。 使用Amicon Ultracel-14离心过滤器（3 kDa截留值）浓缩从MARS-3柱获得的未结合部分，然后使用二辛可宁酸法测定蛋白质浓度。 在10-30％Mini-PROTEAN TGX预制凝胶（Bio-Rad，CA，USA）上分离相同量（来自4至20μg）的对照和IGD血清样品，并转移至聚偏二氟乙烯膜。 接下来，将膜在室温下用190％脱脂奶粉在TBS-T（25 mM NaCl，7.5 mM Tris-HCl，pH 0.05和20％Tween 5）中封闭30 min。 然后将膜与针对DPYSL2（1：500，Novus Biologicals，Littleton，CO，USA），GABRB2（1：1000，Abcam，Cambridge，MA，USA）和CNR1（1：100，Santa Cruz Biotechnology）的一抗孵育。 ，Inc。，Santa Cruz，CA，USA），DUSP4（1：500，MybioSource，San Diego，CA，USA）和PI15（1：500，MybioSource，San Diego，CA，USA），TBS-T与5在4°C过夜的非脂肪干奶，然后使用适当的二抗，牛抗小鼠（1：1,000，Santa Cruz Biotechnology）或山羊抗兔（1：1,000，Cell Signaling，Beverly，MA，USA） ）在室温下与辣根过氧化物酶偶联1 h。 使用ECL试剂（GE healthcare，Piscataway，NJ，USA）使用化学发光进行信号检测。 我们使用TotalLab 1D分析软件（Non-linear Dynamics，Newcastle upon Tyne，UK）定量Western印迹结果。 然后，通过除以其他地方描述的每个样品的光密度值来计算密度测定值比值（29）。 作为标准化的对照，将来自46 IGD和对照样品的血清样品用于每个实验。 使用具有阈值的非参数Mann-Whitney-Wilcoxon检验确定统计学显着性 P- 0.05的值。
成果
研究对象的特征
研究对象的人口统计学和临床特征如表所示 Table1.1。 当我们根据韩国网络成瘾倾向量表比较IGD和对照组时（K-Scale）如别处所述（20, 30），IGD组显示出比对照组显着更高的中位K-标度值（37 vs.24， P = 3.81×10 - 6）（表 （Table1）.1）。 IGD组在互联网游戏上花费的每周中位时间明显长于对照组（18与5.25 h， P = 1.27×10 - 6）。 鉴于K-WISC，BIS，BInS和BAS的年龄，家庭月收入，教育持续时间，区块设计和词汇子测试结果两组之间没有显着差异。
IGD和对照之间差异表达的miRNA
为了发现与IGD相关的miRNA，我们采用了两步（发现和独立验证）方法。 研究设计和总体策略如图S1补充材料所示。 在发现阶段，我们使用含有51 miRNA的miRNA阵列分析了25样品（26 IGD和384对照）的miRNA表达谱。 发现10 miRNA的表达水平在IGD和对照组之间显着不同（表 （Table2）.2）。 这些10 miRNA的相对表达水平如图所示 Figure1.1。 其中，两个（hsa-miR-423-5p和hsa-miR-483-5p）上调了8个（hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-26b-5p，hsa-miR-29b-3p，在IGD组中下调hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-337c-5p，hsa-miR-411-5p和hsa-miR-652-3p）。
表2
差异表达的微小RNA（miRNA）和倍数变化。
| 的miRNA | 药物发现 | 验证 | 组合 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-值 | 折叠变化 | P-值 | 折叠变化 | P-值 | 折叠变化 | |
| HSA-MIR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| HSA-MIR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| HSA-MIR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| HSA-MIR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| HSA-MIR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93×10 - 5 | 0.415 |
| HSA-MIR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| HSA-MIR-411 - 5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| HSA-MIR-423 - 5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| HSA-MIR-483 - 5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| HSA-MIR-652 - 3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA在发现和验证集中以一致的方式显着改变.
qRT-PCR验证候选miRNA
为了验证10候选miRNA，我们使用独立验证集（20 IGD和16对照）进行qRT-PCR（补充材料中的表S1）。 这些miRNA中的三个（hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-652-3p）在验证集的IGD组中显着下调（表 （Table2）.2）。 其他三种miRNA（hsa-miR-337c-5p，hsa-miR-125b和hsa-miR-423-5p）也在IGD组中下调但不显着。 剩余的四种miRNA（hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-29b-3p，hsa-miR-411-5p和hsa-miR-423-5p）在验证组中相反地表达。 当我们结合发现和验证集（总共45 IGD受试者和42对照）时，三个经验证的miRNA一直显着（表 （Table2）.2）。 这三种miRNA的CNS中的详细信息，染色体位置，成熟序列和表达水平可在补充材料的表S2中获得。
三种miRNA同时改变对IGD风险的协同作用
为了评估三种miRNA的组合效应，我们观察了四个亚组（0，1，2或3 miRNA改变）的优势比（OR）。 miRNA改变由RQ值定义，如“材料和方法“因为IGD组中所有三种miRNA标记都被下调，因此RQ值低于1的miRNA被认为是改变的。 每个研究对象的三种miRNA的RQ值的详细信息可在补充材料的表S3中获得。 对于每个亚组，优势被计算为对照组与IGD组的比率，然后通过将每个亚组的几率除以亚组的几率而没有任何miRNA改变来计算每个OR。 具有三个miRNA改变的个体显示出比没有任何miRNA改变的那些（22，22％CI 95-2.29）高211.11倍的风险。 随着从0到3的改变的miRNA的数量，OR呈现出增加的趋势（r2 = 0.996）（图 （Figure22).
候选miRNA靶基因的GO和途径分析
为了深入了解IGD组中显着下调的三种miRNA标记的功能，使用miRWalk 2.0数据库预测其靶基因（31）。 使用miRWalk数据库通过四种算法（miRWalk，miRanda，RNA1,230和Targetscan）一致预测总共22基因作为下游靶标（32–34）（表S4在补充材料中）。 在ToppGene Suite中使用ToppFun进行的基因集富集分析显示，这些miRNA的靶基因与神经发育途径如“轴突导向”和GO术语如“神经发生”（补充材料中的表S5）显着相关。
预测目标基因的表达
在三种miRNA的下游靶基因中，同时预测两种或更多种miRNA的140（补充材料中的表S4）。 为了探究IGD和对照组之间下游靶基因的蛋白质表达水平是否不同，我们选择了2基因（DUSP4 和 PI15），预测为所有3 miRNA和其他3基因的下游靶标（GABRB2，DPYSL2及 CNR1来自2 miRNA预测的那些，并用来自28 IGD和28对照的血浆样品进行蛋白质印迹分析，可用于实验。 我们通过测量其他地方描述的带强度和面积来比较IGD和对照组之间五个目标的表达（29）。 其中，DPYSL2（28 IGDs和28对照， P = 0.0037）和GABBR2（27个IGD和28个对照， P = 0.0052）在IGD组中显着更高（图 （Figure3）.3）。 但是，我们无法观察到CNR1的差异表达（P = 0.0853），DUSP4（P = 0.5443）和PI15（P = 0.6346）。
讨论
据报道，miRNA参与神经元发育（35, 36），精神分裂症等精神疾病中观察到脑miRNA的差异表达（37）。 因此，循环miRNA谱可能是IGD的有用生物标志物是合理的。 循环miRNA已被建议作为多种神经精神疾病的生物标志物（38–40）; 然而，IGD发展背后的分子机制尽管具有临床和社会重要性，但仍然未知。 具体而言，尚未对IGD相关miRNA进行研究。 这项研究的目的是双重的。 首先，我们尝试发现与IGD相关的血浆miRNA。 其次，我们通过探索下游靶基因的蛋白质表达和GO来评估miRNA候选物的生物学意义。 通过miRNA表达谱的全基因组筛选和候选物的下游验证，我们发现三种miRNA（hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-652-3p）的表达是IGD患者显着低于对照组。 虽然其他7种miRNA候选物的表达模式未在验证中复制，但由于本研究中样本量较小，因此可能是假阴性。 据我们所知，这是关于血液miRNA表达谱可能是IGD的有用生物标志物的可能性的第一份报告。 三种miRNA标记的组合可以作为早期鉴定具有IGD风险的人的微创工具。
据报道，本研究中鉴定的miRNA参与多种神经精神疾病。 据报道，hsa-miR-200c在血液中的表达在一些精神疾病如精神分裂症中被下调（41）和重大抑郁发作（42）。 据报道miR-200c在突触部分中的表达高于总前脑中的表达（43并且还与神经细胞死亡有关（44）。 基于这些先前的报道，miR-200c参与神经发育，并且如果其表达受到干扰则可能与神经精神疾病相关。 一些研究表明miR-652与神经精神疾病风险之间存在关联。 与我们的方法类似，为了识别精神分裂症的血液生物标志物，赖等人。 对精神分裂症患者和正常对照进行TLDA分析，发现包括hsa-miR-652在内的7种miRNA在精神分裂症患者中差异表达（45）。 在随后的研究中，他们使用miRNA表达数据设计了一个预测模型，并成功地将精神分裂症与正常对照区分开来（46）。 在酗酒者中也观察到hsa-miR-652的改变表达（47）。 发现Hsa-miR-26b在神经细胞分化过程中被激活（48）。 珀金斯等人。 报道hsa-miR-26b在精神分裂症患者的前额皮质中下调（49).
虽然没有直接的证据支持这些miRNA的扰动表达与IGD的病理生理学之间的关系，但我们可以推断这些miRNA的失调可能与IGD的病理生理学有关，这是基于我们预测的下游基因的各种先前报道。 。 一些下游基因的三种miRNA如 GABRB2，CNR1，NRXN1及 DPYSL2 据报道与神经精神疾病有关。 γ-氨基丁酸（GABA）是CNS中的主要抑制性神经递质。 GABA受体的失调与神经精神疾病有关，包括成瘾，焦虑和抑郁（50），这也是IGD的主要特征（8）。 据报道，GABA受体基因的遗传多态性与酒精成瘾和精神分裂症有关（51, 52）。 二氢嘧啶酶样2（DPYSL2）是collapsin反应介质蛋白家族的成员，其在微管组装，突触信号传导和轴突生长的调节中起作用。 因此，这种分子被认为是精神疾病的生物标志物（53, 54）。 多态性 DPYSL2 据报道，该基因与酒精使用障碍有关（55）。 以前的报道和我们的数据表明GABRB2和DPYSL2（下调miRNA的下游靶标）的过表达对神经精神疾病（包括IGD）的发病机制有影响。 大麻素受体类型1（CNR1）是一种突触前异质受体，调节神经递质释放和大麻素信号传导的紊乱与各种神经精神疾病有关（56）。 遗传多态性 CNR1 已知基因与高加索人的物质依赖有关（57）。 在大鼠模型中，腹侧海马CNR1的激活破坏了正常的社会行为和认知（58）。 已知NRXN家族的遗传改变涉及多种神经精神疾病，包括成瘾（59).
为了更直接地检查三种miRNA候选物的生物学意义，我们探索了它们的下游靶基因的蛋白质表达。 由于140常见候选物（预测为2的下游或更多miRNA）的血浆样品的有限性，我们通过蛋白质印迹检查了5靶标（GABRB2，DPYSL2，CNR1，DUSP4和PI15）并确认了GABRB2的表达和DPYSL2在IGD组中显着更高。 以前的报道和我们的数据表明GABRB2和DPYSL2（下调miRNA的下游靶标）的过表达可能对包括IGD在内的神经精神疾病的发病机制有影响。 GO和通路分析神经发育途径的结果也支持miRNA标记的神经生物学意义。 另一个有趣的发现是同时改变miRNA的协同效应。 所有3 miRNA下调的个体显示22风险高于没有下调的个体，并且ORs以剂量依赖性方式增加。 虽然由于样本量有限，这三种变化的CI很宽，但是明显的正相关性（r2 = 0.996）支持三种miRNA的协同效应。
虽然我们确实发现了IGD相关的miRNA标记物，并且具有所有三种miRNA改变的个体具有比没有任何miRNA改变的那些22倍高的风险，但是在该研究中存在若干限制。 首先，小样本量增加了错过其他重要miRNA标记的可能性。 其次，由于我们的数据不足以澄清血浆miRNA谱是否有原因或结果，我们无法确认这些非侵入性标记物在临床环境中的生物学作用。 使用来自脑组织库的人脑组织进一步进行miRNA分析及其下游基因分析可以给出更直接的答案。 使用游戏障碍动物模型进行脑组织分析也会有所帮助。 第三，由于血浆样品的可用性有限，我们仅检查了五个下游候选分子。 用更大的样本集探索更多的下游目标将有助于进一步了解IGD的分子机制。
总之，通过miRNA表达谱的全基因组筛选和独立验证，我们发现了三种IGD相关的miRNA（hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-652-3p）。 据报道，他们的许多下游基因参与了多种神经精神疾病，这些下游基因表达改变的实验验证支持了本研究中鉴定的miRNA的含义。 我们发现，对所有三种miRNA进行下调的个体都存在IGD的高风险。 结合已知的临床或环境风险因素和诊断标准，我们的研究结果可以促进早期干预，以帮助IGD风险较高的人。
作者贡献
ML和HC对本文的贡献相同。 ML，D-JK和Y-JC设计了这项研究。 SJ，S-MC，YP，DC和JL进行了实验和数据生成。 J-WC，S-HP，J-SC和D-JK收集血液样本和临床信息。 ML，HC，S-HY和Y-JC分析数据。 ML，HC，S-HY和Y-JC描述了手稿。 Y-JC负责监督该项目。
补充材料
本文的补充材料可在网上找到 http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
参考资料
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