Hypocretin(orexin)通过减弱腹侧被盖区(2014)中其共同递质强啡肽的逆向作用来促进奖励

Proc Natl Acad Sci US A. 2014 Apr 22; 111(16):E1648-E1655。

在线发布2014 Mar 24。 DOI:  10.1073 / pnas.1315542111

PMCID:PMC4000785

神经

参见“强啡肽和hypocretin共同传播对奖励和动机的反对作用”在第111页的第5765卷中。

参见“PNAS Plus重要性陈述”在第111页的第5771卷中。

这篇文章已经 被引用 PMC的其他文章。

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意义

Hypocretin(orexin)和dynorphin是神经调节剂,在调节情绪和动机方面起着重要作用。 食欲素对于奖励是至关重要的,并且与药物寻求有关,而强啡肽介导消极情绪并且与抑郁状态有关。 考虑到这些相反的效应,报道两种肽在相同的神经元中表达并且是核心的,这是违反直觉的。 在这里,我们证明食欲素和强啡肽在相同的突触囊泡内共表达,并且这种共定位对奖赏,吸毒和类似冲动的行为具有深远的影响。 食欲素阻断强啡肽的抑郁样逆向作用的事实显着改变了我们如何看待食欲素在大脑中的功能作用。

关键词: 成瘾,κ-阿片受体,情绪,神经传递,压力

抽象

Hypocretin(食欲素)和强啡肽是对动机行为具有相反作用的神经肽。 食欲素与唤醒和奖赏有关,而强啡肽则与抑郁状态有关。 我们表明,尽管它们具有相反的作用,但这些肽包装在下丘脑内的相同突触囊泡中。 食欲素功能的破坏减弱了下丘脑外侧(LH)刺激的有益效果,消除了可卡因诱导的冲动,并减少了可卡因自我给药。 强啡肽功能的伴随破坏逆转了这些行为变化。 我们还表明,食欲素和强啡肽对腹侧被盖区(VTA)多巴胺神经元(一种含有食欲素的神经元的突出靶点)的兴奋性具有相反的作用,并且VTA内食欲素拮抗作用导致可卡因自我给药和LH自我刺激的减少。被强啡肽拮抗作用逆转。 我们的研究结果确定了一种独特的细胞过程,通过该过程,食欲素可以阻断核心强啡肽的奖赏阈值提升效应,从而以宽松的方式起作用以促进奖励。

食欲素促进唤醒(1并且与食物的有益效果有关(2, 3),性行为(4)和滥用药物(5, 6)。 它主要在下丘脑内产生(7),并作用于orexin 1受体(OX1R)和OX2R(也称为Hcrt-R1和Hcrt-R2),在许多脑区表达,包括中脑的腹侧被盖区(VTA)(8)。 相反,强啡肽被广泛表达,促进抑郁样行为,并在调节压力的厌恶效应中起关键作用(9, 10)。 激活κ-阿片受体(KORs),强啡肽作用的受体(11),可以减轻滥用药物的奖励效果(12, 13通过至少部分介导的中脑多巴胺(DA)系统中的作用(14, 15)。 尽管它们似乎对动机产生了相反的影响,但有证据表明这些肽可能同时发挥作用; 例如,在电刺激下丘脑期间释放出食欲素和强啡肽(16)。 与DA神经元一样,食欲素和强啡肽神经元会增加其活动,以响应唤醒和压力因素等刺激性刺激(17)。 这种神经肽共表达模式对脑奖励系统的功能影响,以及反过来对动机行为的影响,人们知之甚少,因为食欲素和强啡肽不是传统上一起研究的。 鉴于它们在单独研究时对行为和神经元生理学的反作用,可以假设一种肽相对于另一种肽的作用的优势可能导致奖赏敏感性中广泛不同的行为表型。 例如,显性食欲素信号传导可以增强奖赏敏感性和奖励寻求,而显性强啡肽信号传导可以导致奖励敏感性和协同作用降低。 因为这些状态与成瘾和抑郁等精神疾病有很大关联,奖励处理是无序的,我们试图研究这些肽单独和组合如何影响动机行为以及调节它们的VTA DA电路。 为此,我们使用EM来表征微观结构水平的肽共定位,以及在食欲素 - 强啡肽系统的药理学或遗传操作后评估脑奖励电路,冲动控制和药物摄取的敏感性的行为技术。 此外,我们使用电生理学来确定伴随的orexin和强啡肽单独或与其受体的拮抗剂组合存在如何影响VTA DA神经元的兴奋性。

成果

食欲素和强啡肽是共同发射体。

我们使用荧光显微镜证实了orexin和dynorphin在小鼠外侧,双侧和背内侧下丘脑的相同神经元中的共表达(18)(图。 1A)。 在其他大脑回路中已经描述了表达多个发射器的神经元的存在,并且可以代表过滤机制的神经基础,通过该机制,共表达的神经递质在不同的发射速率下发生(19)。 然而,使用EM,我们发现食欲素和强啡肽在相同的突触小泡内共定位。 在无髓鞘的曲张轴突过程中观察到大多数共包装的情况,其中在囊泡内或附近发现免疫标记。 在神经元细胞体内,显着的标记与高尔基复合体有关,而在相邻的细胞核中没有发现(图。 1 BC)。 树突还包含两种肽的囊泡相关标记,表明这些发射体可能具有树突状释放。 少数微结构特征捕获轴突末端,标记位于不对称突触释放区外的大(〜100 nm)囊泡中的两种肽(图。 1 BC),支持食欲素和强啡肽作为共转运体起作用的结论,并且在正常条件下,它们作为细胞发射频率的函数一起释放而不是差异地释放。

图。 1。 

食欲素和强啡肽是下丘脑神经元中的共同发射体。 (A,最左边明视野显微照片显示检查下丘脑的orexin(红色)和强啡肽(绿色)免疫反应性区域。 (A,极右翼合并双通道图像 ...

强啡肽阻断的奖赏阈值升高效应被强啡肽阻断逆转。

为了探索这种独特的发射器表达模式的功能意义,我们检查了食欲素和强啡肽信号传导的破坏是否会影响反映正常和异常动机的复杂行为。 在C57BL / 6小鼠训练中进行颅内自我刺激(ICSS)加强外侧下丘脑(LH)刺激(20),封锁OX1在轻相期间,N-(2-甲基-6-苯并恶唑基)-N“-1,5-萘啶-4-基脲(SB334867)的Rs导致奖赏阈值的剂量依赖性增加(图。 2A; 单向重复测量剂量方差分析: F3,12 = 4.44, P <0.02)。 ICSS阈值的增加反映了治疗引起的刺激奖励作用的降低,这是一种抑郁状的征兆,表明对奖励的敏感性降低了(20)。 这种效应不是由于镇静或其他非特异性行为障碍,因为ICSS反应率未受影响(图。 2B; 单向重复测量剂量方差分析: F3,24 = 0.33, P > 0.80)。

图。 2。 

强啡肽阻断可逆转食欲素阻断的奖赏阈值提升效应。 (A)阻止OX的食欲素信号传导1R by SB334867(0-30 mg / kg,ip)提高ICSS测试中的奖励阈值,表明奖励减少。 这个效果 ...

通过使用去甲肾上腺素(norBNI)预处理SB334867引起的奖励阈值升高[药物的双向重复测量ANOVA(受试者因子之间)×剂量SB(受试者因子内)相互作用: F3,24 = 3.98, P <0.01],可在KOR处长期阻止强啡肽作用(10)。 这些数据表明,食欲素信号的丧失揭示了核心的强啡肽的潜在逆向作用。 单独使用norBNI不会降低奖励阈值。 虽然这种作用可能与norBNI和其他原型KOR拮抗剂的独特药效有关(10),它还可以表明在调节脑奖励回路的活动的过程中存在冗余,或者单独的食欲素音调的相位增加(由核心的强啡肽不对抗)不足以传递来自下丘脑外侧的刺激部位的奖赏信号。 这些发现最初可能与其他在黑暗阶段检查SB334867 ICSS阈值的人的工作不一致(21)。 然而,有大量证据表明,食欲素功能的降低可能会产生影响,这取决于动物是在光照或黑暗阶段进行测试。 例如,当在黑暗阶段进行测试而不是在光照阶段进行测试时,食物和水在orexin KO小鼠中保留其奖赏效果(22),我们进行所有行为测试的时间。

为了定位系统性SB334867和norBNI给药对ICSS的影响,将单独的一组小鼠植入LH刺激电极和VTA引导套管。 将SB334867微量注射到VTA中导致奖励阈值显着增加,表明奖励敏感性降低。 尽管单独的VTA内注射norBNI对ICSS阈值没有影响,但它阻止了后续SB334867输注的阈值升高效应(图。 2C; 单向重复测量药物方差分析: F3,9 = 10.98, P <0.01)。 尽管与全身性药物注射相比,颅内药物注射倾向于最大程度地降低最大反应率,但这些作用并未达到统计学意义(图。 2D; 单向重复测量药物方差分析: F3,9 = 1.03, P 0.112)。

食欲素和强啡肽传递调节的冲动性。

冲动性的特点是抑制寻求奖励行为的缺陷,高冲动性是许多精神疾病的共同特征(23)。 包括可卡因在内的滥用药物也会引发冲动性的增加,这被假设为推动成瘾的发展(24)。 考虑到核心的食欲素和强啡肽在ICSS试验中控制对LH刺激的奖赏效应的敏感性的关键作用,我们假设这两种神经肽之间的相互作用可能影响基线冲动和可卡因诱导的这种行为的缺陷。 通过测量5选择系列反应时间任务(5-CSRTT)中的过早反应,可以在啮齿动物中量化冲动性(25),类似于用于研究人类注意力的连续性能测试的动物模型。 在正常条件下,该试验中的过早反应往往较低,并且由于提高DA传播的药物而恶化(26)。 我们使用5-CSRTT来检查食欲素 - 强啡肽系统对自发和可卡因诱导的冲动行为的贡献。 单独使用时,SB334867进一步减少了已经很少的自发性早产反应(图。 3A; F3,21 = 4.89, P <0.01)。 这些降低是在不影响响应准确性的情况下发生的(F3,21 = 1.45, P = 0.25),颗粒检索潜伏期(F3,21 = 0.91, P = 0.44),或完成的刺激试验次数(F3,21 = 1.46, P = 0.25),表明它们不是由于警惕性降低或运动能力降低。 然而,给予norBNI可逆转SB334867对早产反应的影响(图。 3B; F3,18 = 0.45, P = 0.71),表明无反对的强啡肽传递对于调节这些抗梗塞作用至关重要。 单独给予或与SB334867组合使用,norBNI对响应准确度的测量没有影响(F3,18 = 0.66, P > 0.58),延迟(F3,18 = 3.09, P > 0.06),或完成的刺激试验次数(F3,18 = 2.38, P > 0.10)。 用SB334867进行预处理还可以防止可卡因引起的过早反应增加两倍(图。 3C; F6,24 = 5.84, P <0.01)。 这些数据提供了食欲肽神经传递可以以对强啡肽敏感的方式在基线和可卡因刺激的条件下调节冲动行为的证据。

图。 3。 

由食欲素和强啡肽平衡调节的冲动行为。 (ASB334867减弱5-CSRTT大鼠运动冲动模型中的过早反应。 准确度,检索食物颗粒的等待时间和省略的试验次数均为 ...

强啡肽在OX中介导减少的可卡因自我管理1R-Null小鼠。

在冲动的个体中,成瘾的脆弱性显着增加,并且假设可卡因诱导的冲动性增加有助于成瘾的出现(23, 27)。 此外,食欲素传播和强啡肽传播已经独立地涉及调节可卡因和其他滥用药物的奖赏效果(2832)。 我们假设食欲素和强啡肽传递之间的相互作用可能直接控制药物摄取。 为了探索这种可能性,我们研究了在缺乏OX的转基因小鼠中静脉注射可卡因的自我管理1Rs(OX1R - / - )。 这种基因型的小鼠在广泛的剂量范围内表现出显着较低的可卡因自我给药(0.1-1 mg / kg每次输注),但在相同的加强方案下表现出对食物奖励的不变响应(33),表明减少可卡因服用并不是行为表现缺陷的继发因素。 而且,OX1R - / - 小鼠在可卡因进入的大约三个初始阶段显示正常的可卡因自我施用率,但随后迅速显示可卡因摄入减少(33)。 我们以每次输注0.3 mg / kg的剂量证实了这种表型,表明通过OX发出信号1Rs在建立和维持可卡因自我管理行为方面发挥着关键作用[图。 4; 双向重复测量方差分析,基因型(受试者因素之间)×药物治疗(受试者因素): F1,12 = 12.91, P <0.01]。 正如用norBNI进行的预处理可以恢复使用SB334867的小鼠的正常ICSS和冲动样行为一样,它也可以部分恢复OX中的可卡因自我管理1R - / - 小鼠,提供了一个独特的例子,其中由一个神经递质系统的功能中的遗传消融产生的行为缺陷通过阻止另一个神经递质系统来拯救。 这些发现表明,在OX中1R - / - 小鼠,强啡肽的无对抗作用减弱了可卡因的有益特性,从而减少了药物的自我给药。 有趣的是,在OX1R+ / + (对照)小鼠,norBNI意外地减少了可卡因的自我给药。 对这种效应的一种可能的解释是由非食欲素神经元释放的强啡肽,例如所谓的“直接”纹状神经元中型多刺神经元,对可卡因的摄入具有相反的作用,并且实际上可能促进可卡因的奖赏效应。 在可卡因奖励中存在两个具有相反作用的KOR群体也可以解释为什么norBNI仅部分逆转了在OX中检测到的可卡因摄取行为的缺陷。1R KO老鼠。 或者,KOR拮抗作用可减少可卡因戒断的厌恶或压力(34),这有助于药物摄入模式(17)。 无论如何,这些数据表明强啡肽的抑郁样作用在没有完整的食欲素信号传导的情况下占优势,减少了可卡因的奖赏效果,而食欲素的作用促进了可卡因的奖赏效果,延长了它们在没有可卡因的情况下的持续时间。强啡肽信号传导。

图。 4。 

减少OX中的可卡因自我管理1R KO小鼠通过KOR封锁恢复。 OX中orexin信号传导的损害1R通过该受体的遗传缺失减少了可卡因的静脉内给药(每次输注0.3 mg / kg)。 这种赤字是部分原因 ...

食欲素和强啡肽可对VTA DA神经元的兴奋性产生平衡的相反作用。

接受来自下丘脑食欲素和强啡肽神经元的输入的脑结构可能暴露于两种肽,因此受到它们对神经元兴奋性的相反作用(35, 36)。 一种肽的效果优于另一种肽的效果可能取决于多种因素,包括每种肽的相对丰度,细胞外空间的寿命,以及不同靶神经元群体中的受体表达,以及它们之间的相互作用。突触后细胞中的受体及其细胞内信号传导机制。 冲动性和可卡因奖励至少部分受到VTA中DA神经元的调节(26),下丘脑食欲素细胞的突出目标(37)。 此外,将食欲素注入VTA可增强寻药效果(6)。 为了评估每种肽对VTA神经元活性的相对贡献,我们在暴露于食欲素和强啡肽的C57BL / 6小鼠脑切片中单独或一起施用来自DA细胞的电生理学记录。 正如预期的那样,当单独应用时,食欲素是均匀兴奋的,而强啡肽仅产生抑制作用(图。 5 AB; F2,50 = 18.95, P ≤0.01)。 在记录的DA神经元群体中,大多数对两种肽的饱和浓度都有反应,尽管少数只对orexin或dynorphin有选择性反应(图。 5B)。 值得注意的是,当两种肽应用于双响应神经元时(n = 10),对射击率没有净影响(图。 5A),表明每种肽在饱和浓度下的相反作用会在共释放时有效地相互抵消。 尽管有orexin存在,但10个神经元中有1.5个表现出了强啡肽的优先抑制作用,尽管存在强啡肽(图。 5 AC)。 总的来说,虽然更多的细胞对食欲素的反应比强啡肽更多,但当对食欲素和强啡肽进行共同施用时,那些对这两种肽都有反应的细胞的发放率没有净变化,这表明每种肽的相反影响在VTA DA的集合内是平衡的。神经元研究。

图。 5。 

食欲素和强啡肽对VTA DA神经元发挥平衡但相反的作用。 (A,左)合用的食欲素和强啡肽导致VTA DA神经元的放电率没有净变化(n = 10)。 单独应用,强啡肽具有抑制作用,食欲素具有兴奋作用。 ...

为了进一步阐明对食欲素和强啡肽敏感的VTA DA神经元内潜在的食欲素 - 强啡肽相互作用,我们尝试通过SB334867处理来增强浴液应用强啡肽的抑制作用(图.S2A; F5,25 = 2.13, P <0.01)或通过norBNI治疗来增强沐浴剂orexin的兴奋作用(图.S2B; F3,27 = 5.48, P <0.01)。 在两个实验中,OX1R和KOR阻断未能产生这些效应,表明SB334867和norBNI没有通过非特异性作用发挥作用。 更重要的是,这些数据表明,每种肽在体外的基调不足以受到应用小分子拮抗剂如SB334867和norBNI的影响。 这一发现与先前的研究结果一致,表明大的含肽囊泡的胞吐作用通常仅发生在切片制剂中通常不存在的高持续发射频率下(38).

验证norBNI是否直接通过OX的“脱靶”操作影响行为1Rs,我们接下来检查了这种拮抗剂对OX的影响1R信令。 具体而言,我们使用荧光成像板读数器(FLIPR)测定来确定浴液应用的食欲素A,SB334867或norBNI在培养的表达人OX的CHO细胞中诱导细胞内钙瞬变的能力。1卢比。 尽管orexin A产生了细胞内钙的预期增加(EC50 =0.01μM)和SB334867剂量依赖性地减弱这种作用(EC50 =0.035μM),norBNI未对基线或食欲素A诱发的细胞内钙增加产生任何影响。 这表明norBNI对VTA DA神经元生理学的影响仅仅是通过提出的KOR信号传导机制,并且该药物对OX没有直接影响。1R(39)(图.S3 AC).

VTA中的食欲素 - 强啡肽相互作用调节可卡因自我管理。

我们的电生理学研究表明,食欲素和强啡肽之间的动态相互作用调节VTA DA活性,并且VTA神经元可能作为食欲素 - 强啡肽系统对动机行为的影响的关键底物。 为了直接检验这一假设,我们检测了VTA内输注SB334867对大鼠静脉注射可卡因的影响。 与VTA内输注相比,VTA内SB334867导致可卡因摄入明显减少,并被norBNI阻断(图。 6; 单因素方差分析: F3,24 = 11.56, P <0.01),表明该脑区域内强啡肽的抗药性减弱了可卡因的奖励。 这些结果似乎与那些证明在低努力固定比例334867(FR1)的补给时间表中缺乏可卡因自用VTA SB1的结果(40)。 然而,一些报告显示随着任务需求的增加,SB334867在减少吸毒方面更为有效(2, 33)。 因为该实验中的大鼠正在进行更高努力的FR5计划,所以本发现与该文献一致。 这些数据提供了直接证据,表明食欲素和强啡肽对VTA DA神经元生理学的反对性质可能对奖励驱动的行为产生显着影响。

图。 6。 

VTA中的食欲素 - 强啡肽相互作用介导药物摄取。 VTA SB334867(每侧3μg)可降低可卡因自我给药,而用norBNI(10 mg / kg,ip)预处理可逆转这种效应(n = 9)。 ***P < ...

讨论

我们报道,在相同的突触小泡中发现了食欲素和强啡肽,它们可以对动机产生相反影响的神经肽。 发现这些神经肽是在相同的生理条件下被包装并且可能是核心的(16)具有深远影响,因为它提出了这一过程也可能发生在传统上主要依赖于个别发射机的系统中的可能性。 我们还证明了orexin,通过OX发出信号1Rs减弱了其共转发物强啡肽的关键功能和行为影响。 食欲素 - 强啡肽神经元表达增加的即时早期基因c-Fos水平以响应奖励和奖励预测线索(4, 6, 22),表明有利于神经肽释放的高水平神经元活化。 然后,我们提供证据表明,食欲素的核心酶可通过其对VTA中DA神经元的作用来阻断强啡肽对动机行为的影响。 对食欲素的阻断可以对ICSS和可卡因相关行为产生强啡肽或KOR激动剂样作用,这些行为可通过KOR拮抗作用逆转(13, 41, 42)。 以前对这些肽中的每一种进行单独研究都支持这些结论:将食欲素直接输入VTA恢复药物寻求(6),而VTA内注射KOR激动剂会产生抑郁样作用,如烦躁不安(43)。 我们假设食欲素通常与VTA的兴奋性奖励反应输入共同作用[例如,来自前额皮质和其他结构的谷氨酸(44, 45)]克服强啡肽和局部GABA传递对DA神经元的抑制作用,增强与奖励和动机行为相关的前脑DA释放。

重要的是要强调尽管促进食欲素传递似乎能够抵消KOR激活的抑制作用,但KOR拮抗作用不会产生纯粹的相互作用(升高的奖赏功能)。 我们假设这可能部分归因于SB334867和norBNI的不同药效学和药代动力学特征。 前药显示经典活动和 t1/2 of〜24 min(46),单次注射后者会产生持续数周的KORs功能性拮抗作用(10)。 此外,像norBNI这样的典型KOR拮抗剂是“有偏见的激动剂”,可以同时激活其他信号通路,例如c-Jun激酶的通路(39),从而产生足以抵消较高水平的食欲素调节的急性效应或补偿性适应。 关于这些作用是否相互作用的确定性结论等待短效KOR拮抗剂的发展,这些拮抗剂不作用于其他细胞内信号通路; 这些化合物目前无法获得(10)。 此外,本实验集中于VTA并且不能排除食欲素和强啡肽的作用在其他结构中可能不是二分的可能性或VTA是食欲素 - 强啡肽相互作用影响行为的唯一结构的可能性。 例如,有证据表明食欲素参与应激反应,并可能与强啡肽一起参与产生伴随停药的负性情感状态(40, 47)。 显然,需要进一步的工作来确定环境,解剖位点和机制,这些机制似乎允许食欲素和强啡肽在不同的行为范例中采取协调一致的对立行动。

我们的数据也支持这两种肽的作用是调节性的观点,因为OX的破坏1Rs或KOR降低但未消除测试的行为。 例如,即使在高剂量的SB334867下ICSS行为也持续存在,证明单独的食欲素不足以解释LH刺激的奖赏效应。 一种可能性是尽管食欲素可能不能维持ICSS行为,但它通过抵消强啡肽的作用来减轻其破坏。 同一种下丘脑神经元的食欲素和强啡肽的差异表达可能是一种机制,通过该机制,VTA中DA神经元的兴奋性可以通过外部刺激以及经验或疾病来调节。 作为一个例子,在一种导致小鼠抑郁样表型的慢性社会压力后,orexin mRNA水平降低(48)和老鼠(49)。 这种抑郁样表型可能至少部分是由于食欲素表达的减少使得强啡肽的作用无对抗。 这些发现对于单独解释涉及食欲素和强啡肽的数据具有重要意义,因为在一个系统中的适应性可以通过另一个系统的适应性来抵消。 它们还可以增加治疗策略设计的灵活性,以治疗从发作性睡病到情绪和脉冲控制障碍的疾病。 例如,治疗由食欲素失调引起的病症的独特方法可能是操纵KOR功能,相反,以强啡肽功能改变为特征的病症可能被食欲素系统的操作所抵消。

材料和方法

动物。

用于EM实验的成年雄性C57BL / 6J小鼠(8年龄; Jackson Laboratory)分组饲养(每笼3至5只); 用于ICSS的那些在手术后单独饲养。 成年雄性(350 g)Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories)用于5-CSRTT和可卡因自我给药实验,并以四个一组的形式饲养。 用于电生理学实验的成年雄性C57BL / 6J小鼠(出生后天数19-21)被分组饲养(每笼3至5只)。 OX1 - / - 老鼠和他们的OX1+ / + 用于自我给药研究的同窝小鼠(6年龄)从杰克逊实验室获得,并与C57BL / 6小鼠回交超过7代。 将这些小鼠分组饲养(每笼两只)。 将所有动物在温度受控的条件下在12-h光/暗循环中饲养,并且行进测试发生4-5 h进入光循环; 除非另有说明,否则可随意提供食物和水。 程序根据美国国立卫生研究院进行 实验动物护理和使用指南 (50并获得了麦克莱恩医院,不列颠哥伦比亚大学和佛罗里达州斯克里普斯的机构动物护理和使用委员会的批准。

免疫组织化学和显微镜检查。

根据先前报道的程序,对替代小鼠脑切片进行食欲素A或前体啡肽的荧光和银增强金免疫标记(51),并按照标准EM协议进行处理。 然后随机选择免疫标记组织的非重叠区域并使用ImageJ软件(National Institutes of Health)拍照以定量颗粒(SI材料与方法,免疫组织化学和显微镜).

电。

用3 mM葡萄糖酸钾,5 mM Hepes,143 mM EGTA,10 mM MgATP,0.2 mM NaGTP(pH为2)和0.3-7.2 mM mOsmol填充膜片移液管(270-280MΩ)。 数据以20 kHz获得,并使用pClamp 2软件(Molecular Devices)以10.0 kHz过滤。 获得全细胞构型后,将细胞电压钳制在-70 mV,并应用一系列电压步骤(250 ms,从-60到-130 mV,10-mV步骤)以检测超极化(Ih)电流。 Ih 确定为施加电压步骤后~30 ms和248 ms之间的电流变化。 在电流钳模式下测量VTA DA神经元的内在活性。 当达到稳定的基线射击率时开始实验; 然后将基质用于5 min,随后用人造脑脊髓液洗掉。 每个3-min段的最后一个5 min用于数据分析。 强啡肽A(1-17; 200 nM)和食欲素A(100 nM)从American Peptide获得并溶解在蒸馏水中。 之前发现这些浓度对VTA细胞活性产生饱和作用(5, 52)。 Thiorphan(1μM)和bestatin(10μM)从Sigma-Aldrich获得,溶于蒸馏水中,并与强啡肽A一起施用(SI材料与方法,电生理学).

FLIPR分析。

OX1如前所述,通过FLIPR测定法测量细胞内钙水平来评估R活性(53)(SI材料和方法,荧光成像板读数器测定).

ICSS。

用氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为80和10 mg / kg,ip; Sigma)立体定向于LH(小鼠)植入单极刺激电极或套管(PlasticsOne)的小鼠(18)和/或对侧VTA [来自前囟:前后位(AP), - 3.2 mm; mediolateral(ML), - 0.5 mm; dorsoventral(DV),-4.7 mm来自dura]。 在7-d恢复期后,如前所述训练小鼠响应脑刺激(18)。 使用最小二乘最佳拟合分析计算支持响应的最低频率(阈值)。 当小鼠满足ICSS阈值的稳定性标准(连续10天数±5%)时,测量药物治疗的效果。 使用Hamilton注射器(334867 mL / kg ip)隔天给予SB0.1(Scripps Florida)或DMSO载体,并在15-min测试期间立即量化阈值。 在ICSS测试开始之前,在盐水(10 mL / kg)10 h中给予norBNI(48 mg / kg ip; Sigma)。

5-CSRTT。

大鼠受食物限制(以85%的自由喂养体重)并在通风,声音衰减柜(Med Associates)内的计算机控制的操作室中训练,并按照描述进行5-CSRTT程序(25)。 在测试之前通过ip注射334867 min给予SB0.1(在DMSO中,1 mL / kg)和/或可卡因(在盐水中,10 mL / kg; Sigma),如在其他实验中那样,并且norBNI在给予之前至少给予48 h。开始测试(SI材料与方法, MTT综合医学训练疗法国际教学中心选择连续反应时间任务).

IV可卡因自我管理。

用异氟烷(1-3%vol / vol)氧蒸气混合物麻醉大鼠和小鼠,并按照既定程序用颈静脉中的Silastic(VWR Scientific)导管手术制备(54)。 在大鼠中植入导管后,立即将双侧不锈钢导管(23号,长17 mm)植入VTA中(从前reg:AP,5.3 mm; ML,±0.7 mm; DV,距硬脑膜-7.5 mm) )。 在达到稳定的可卡因摄入量后(连续334867天的响应变化<60%;在每天20分钟的时间内,使用SB3或norBNI进行测试)。 SI材料和方法,IV可卡因自我管理).

统计。

数据表示为平均值±SEM。 对于ICSS实验,使用双向重复测量ANOVA来比较SB334867处理的和norBNI + SB334867处理的条件之间的平均值。 使用具有Newman-Keuls事后检验的单向重复测量ANOVA来比较SB334867和norBNI + SB334867条件内的平均值。 单向重复测量ANOVA和Newman-Keuls测试也用于比较所有5CSRTT实验中的平均值。 双向重复测量ANOVA用于比较可卡因自我给药实验中的治疗组与OX之间的平均值1R KO老鼠。 使用单向重复测量ANOVA和Newman-Keuls测试来比较VTA DA神经元对食欲素和强啡肽的平均响应。 单向重复测量ANOVA和Newman-Keuls测试也用于比较用SB334867和norBNI处理的大鼠中可卡因摄入的平均值。 如果,差异被认为是重要的 P <0.05。

补充材料

支持信息: 

致谢

我们感谢Garrett Fitzmaurice博士对手稿的有用评论以及Miranda S. Gallo和Melissa Chen在数据收集方面提供的帮助。 这项工作得到美国国立卫生研究院拨款F32-DA026250和K99-DA031767(对JWM),F32-DA024932和K99-DA031222(对JAH),R01-DA023915(对.PJK)和R01-MH063266(给WAC)的支持。 )和自然科学与工程研究委员会发现补助金(SLB)。

脚注

 

利益冲突声明:WAC持有与使用κ-阿片拮抗剂治疗抑郁症有关的专利(美国专利6,528,518;受让人:麦克莱恩医院)。 所有其他作者均未宣布任何竞争性经济利益。

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本文包含在线支持信息 www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.

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