食欲素介导性行为幼年雄性大鼠的性行为，但对性行为并不重要（2011）

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抽象

下丘脑神经肽orexin介导唤醒，睡眠和自然有益的行为，包括食物摄入。 orexin受体-1激动剂或拮抗剂改变了男性的性行为，表明食欲素-A在这种自然有益的行为中起作用。 然而，内源性orexin-A或B在男性性行为的不同要素中的特定作用目前尚不清楚。 因此，目前的研究利用神经激活标记物和食欲素细胞特异性病变来检验食欲素对雄性大鼠的性动机和表现至关重要的假设。 首先，在呈现接受性或非接受性雌性之后，证明了食欲素神经元中的cFos表达，而没有通过不同的交配元件进一步激活。 接下来，利用orexin-B偶联的皂草素测试食欲素的功能作用，导致下丘脑中的食欲素细胞体损伤。 病变是在性天真的男性中进行的，随后在四次交配试验中记录了性行为。 病变男性在第一次但未随后的交配试验期间表现出缩短的潜伏期和进入期，这表明病变促进了性行为，但没有经验的男性的性行为的开始。 同样，通过跑道测试确定，病变不影响有经验的男性的性动机。 最后，高架十字迷宫测试显示受损男性的焦虑样行为减少，支持食欲素在初始暴露于幼稚动物中的女性焦虑中的作用。 总体而言，这些研究结果表明，食欲素对男性的性行为或动机并不重要，但可能在与幼稚动物的性行为相关的唤醒和焦虑中发挥作用。

关键词： 食欲素，hypocretin，性行为，交配，神经激活，动机，下丘脑，新奇，唤醒，焦虑

介绍

食欲素，也称为hypocretin，是一种对进食行为至关重要的下丘脑神经肽，（de Lecea等，1998; Sakurai等; 1998, Sakurai，2006; Benoit等，2008）唤醒和睡眠（Chemelli等人，1999; Lin等人，1999, Sakurai，2007; Furlong和Carrive，2007; Furlong等人，2009; Carter等，2009）。 食欲素神经元定位于下丘脑外侧区域（LHA）和下丘脑背侧下丘脑（PFA-DMH）并产生两种神经肽，即食欲素A和B（de Lecea等，1998; Sakurai等，1998）。 已经显示食欲素神经元投射到涉及唤醒调节的脑结构中，包括蓝斑，结节乳头核和足弓脑桥核（Peyron等人，1998; Hagan等，1999; Horvath等，1999; Baldo等人，2003）。 食欲素也与奖励和动机有关，特别是与食物和滥用药物有关（阿斯顿 - 琼斯等人，2009a; 阿斯顿 - 琼斯等人，2009b）和orexin神经元已被证明可用于奖励中脑边缘系统中的相关脑结构，包括腹侧被盖区（VTA）和伏隔核（NAc）（Peyron等人，1998; Fadel和Deutch，2002; Martin等人，2002; Baldo等人，2003）。 食欲素神经元被与食物和药物奖励相关的条件性语境线索激活（Harris等，2005; de Lecea等，2006; Choi等人，2010并且已被证明在基于奖励的喂养行为中发挥作用（Choi等人，2010）。 此外，脑室内（ICV）或腹膜内给予食欲素受体1（ORX1）拮抗剂导致可口食物的动机减少（Thorpe等人，2005; Nair等，2008），而ICV食欲素-A给药可以恢复这种动机（Boutrel等，2005).

虽然一些研究表明食欲素可以控制雄性大鼠的性行为，但是目前还不清楚食欲素在其他有益行为中的作用。 先前已经表明，orexin神经元通过雄性大鼠的交配而被激活（Muschamp等，2007）。 此外，将orexin-A施用到内侧视前区（mPOA）导致性功能增强，这可以通过减少潜伏和插入的潜伏期以及增加坐骑和插入的频率来证明（Gulia等，2003）。 相比之下，ICV给予orexin-A可通过降低女性偏好来减轻性欲，尽管只有高度性欲的男性（Bai等人，2009）。 使用ORX1拮抗剂的研究也证明了相互矛盾的数据，因为ORX1拮抗剂的全身给药通过增加引入的潜伏期而不影响性行为的其他参数而略微损害了性能力（Muschamp等，2007），ICV给予ORX1拮抗剂对性动机没有影响（Bai等人，2009）。 这些研究表明，外源性orexin-A的使用会影响性能力和动机; 然而，内源性食欲素可能在调解性行为方面不起重要作用（Bai等人，2009）。 因此，本研究的目的是确定内源性食欲素是否对雄性大鼠的性动机和表现至关重要。

首先，确定在性行为期间，食欲素神经元被激活，测试了在引入奖赏刺激时激活食欲素神经元的假设。 此外，正如已经表明性经历会影响性表现（Dewsbury，1969）和性行为的有益属性（Tenk等，2009），确定性经验是否影响交配期间的食欲素神经元激活。 最后，测试了食欲素是否在使用食欲素神经元的细胞体特异性损伤的性动机和表现中起关键作用。

材料和方法

成年雄性Sprague Dawley大鼠（200-250g）获自Harlan（Indianapolis，IN）或Charles River Laboratories（Sherbrooke，Quebec，Canada），并根据Plexiglas笼中的个体实验（见下文）单独或成对饲养。 殖民地房间保持在12 / 12逆光暗循环（在10 am点亮），食物和水可用 随意 除了在行为测试期间。 将来自Harlan（Indianapolis，IN）或Charles River Laboratories（Sherbrooke，Quebec，Canada）的雌性Sprague-Dawley大鼠双侧卵巢切除并皮下植入5％17-β-雌二醇苯甲酸酯硅橡胶胶囊。 在交配期间大约500 h皮下注射黄体酮（芝麻油0.1ml中的4μg）诱导性接受性。 所有程序均经辛辛那提大学和西安大略大学的动物护理委员会批准，并符合国家卫生研究院和加拿大动物保护协会概述的指南。 除非另有说明，否则在昏暗的红光照射下，在暗相的前半部分期间进行所有行为测试。

实验设计

cFos表达研究

将雄性大鼠（n = 48）单独圈养，并且在5每周两次交配期间，一半动物在家笼中获得性经验。 在家笼中进行交配测试，以消除因暴露于不同交配场所引起的唤醒和cFos表达以及暴露于与先前交配相关的条件线索（Balfour等人，2004）。 将接受性的雌性引入家笼并允许雄性交配直至一次射精或60分钟。 在每次测试中，观察到性行为。 记录了坐骑和插入的总数，以及首次进入和插入的潜伏期（从接受女性到第一次坐骑或插入的时间）和射精（从第一次插入到射精的时间） （Agmo，1997）。 剩下的一半动物保持性天真。 这些动物与性经验丰富的雄性一样被安置在同一个房间内，处理并暴露于与交配相关的气味和声音，但是没有交配。 将幼稚和有经验的动物各自进一步细分为6实验组（每组n = 4）。 6天真和经验丰富的团体包括：对照男性，不接触性行为（家庭笼）; 雄性暴露于家庭笼子中的非接受性雌性，持续15分钟（Anestrous Female）。 男性可以调查和互动，但由于缺乏女性接受性而没有交配; 男性暴露于接受雌性的气味，放置在家庭笼子顶部的金属丝网盒中，持续15分钟（发情女性）; 显示坐骑的男性，但不是阴道蒙面女性的插入或射精（Mount）; 男性只显示坐骑和插入（Intromission）; 和男性交配射精（射精）。 在测试结束后一小时，处死雄性以分析cFos表达。 性经验组在性行为参数上匹配，并且在最终测试之前组之间没有显着差异。 此外，在最终测试期间，天真组和有经验组之间在坐骑数量和插入数量方面没有显着差异。

灌注：cFos表达

所有雄性用戊巴比妥钠（270 mg / mL）深度麻醉，并用4％多聚甲醛（500 mL; PFA）经心脏灌注。 灌注后立即取出脑，在相同的固定剂中后固定1小时，然后转移到20％蔗糖溶液中进行冷冻保护。 将脑在35μm的冠状切片中在冷冻切片机（Microm，Walldorf，Germany）上切片，并在冷冻保护剂溶液（4％PB中含有30％乙二醇和0.1％叠氮化钠的30％蔗糖）中的0.01平行切片中收集并储存。在-20°C直到进一步处理。

免疫组化

所有孵育均在室温下进行，同时轻轻搅拌。 用0.1M盐水缓冲磷酸钠（PBS）彻底洗涤自由漂浮的切片。 切片用1％H封闭2O2 （30％储备溶液）在PBS中进行10分钟，然后用PBS再次彻底冲洗。 将切片与温育溶液（含有0.1％牛血清白蛋白和0.4％Triton X-100的PBS）一起孵育1小时。 在室温下在孵育溶液中进行一抗孵育过夜。 染色后，将切片在PBS中漂洗，安装在正电荷载玻片上，并用邻苯二甲酸二丁酯（DPX）盖上盖玻片。

cFos的/食欲素

对cFos和食欲素进行一系列切片的免疫处理。 将切片与识别cFos的兔升高的抗体（兔抗cFos，sc-52; 1：10 000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）孵育过夜，然后与生物素化的山羊抗兔1小时孵育（1：500） ，Vector Laboratories，Burlingame，CA）和抗生物素蛋白辣根过氧化物酶复合物（1：1000，ABC试剂盒，Vector Laboratories，Burlingame，CA）。 将切片在10％二氨基联苯胺（DAB）（Sigma，St.Louis，MO）中在含有0.02％过氧化氢和0.1％硫酸镍的0.012M磷酸盐缓冲液（PB）中孵育0.08分钟，得到蓝黑色反应产物。 然后将切片与识别orexin-A（兔抗orexin-A，H-003-30; 1：20 000，Phoenix Pharmaceuticals，Burlingame，CA）的兔培养抗体孵育过夜，接着与生物素化山羊抗孵育1小时。 -rabbit和ABC，如上所述。 最后，将切片与10％DAB在含有0.02％过氧化氢的0.1M PB中孵育0.012分钟，得到红棕色反应产物。

之前已对所有抗体进行了表征（陈等人，1999; Satoh等人，2004; Solomon等，2007）。 免疫组织化学对照包括遗漏一抗，蛋白质印迹分析显示适当重量的单一条带（cFos），以及食欲素B-皂草素损伤（食欲素素）丧失免疫组织化学食欲信号。

数据分析

cFos的/食欲素

标记为食欲素或食欲素和cFos的神经元在每个动物的三个代表性切片中双侧计数，已知其含有最大数量的食欲素神经元群体（Sakurai等，1998）从前囟跨越-2.3 mm到-3.6 mm（Paxinos和Watson，1998）（图1），使用连接到Leica显微镜（Leica Microsystems; Wetzlar Germany）的拉管，通过观察到的实验组不知情。 根据穹窿的位置描绘PFA-DMH和LHA（图1a）。 计算表达cFos的食欲素神经元的百分比并对每只动物的每个半球取平均值，并计算组平均值。 在最终测试期间使用具有性经验和性行为的双因素ANOVA确定组间的统计学显着性，作为具有95％置信水平的Fisher's LSD测试的因子。

图1 

下丘脑中食欲素神经元的定位。 （A）下丘脑中食欲素神经元的解剖位置。 （Paxinos和Watson，1998），比例尺：200μm。 （B）未配对对照动物中PFA-DMH中的单一标记的食欲素神经元。 （C）食欲素 ...

食欲病变研究

手术

在病变和假手术之前，将雄性单独圈养并与接受性雌性进行一次预试验交配。 如上所述记录性行为，并且基于交配行为的参数匹配组。 使用Surgivet Isotec4气体装置（Smiths Medical Vet Division，Markham，Ontario，Canada），用异氟烷（Abbot Laboratories，St.Laurent，Quebec，Canada）麻醉雄性大鼠，并置于立体定位装置（Kopf Instruments，Tujunga，CA）中。用防毒面具遮住口鼻，保持麻醉。 进行切口以暴露颅骨，发现λ和前囟并确定其水平。 使用dremel钻（Dremel，Racine，WI）和玻璃微量移液管（40μm直径，World Precision Instruments Inc，Sarasota，FL）在头骨上钻孔，其中填充有靶向毒素orexin-B皂草素（IT-20，Advanced） Targeting Systems，San Diego，CA; PBS中的200ng /μL）; 将未缀合的毒素BLANK-皂草素（IT-21，Advanced Targeting Systems，San Diego，CA; PBS中的200ng /μL;假对照）降低至下丘脑。 已显示该靶向毒素以高亲和力结合表达食欲素受体2（ORX2）的细胞，并且对表达ORX1的细胞具有显着较低的亲和力（Gerashchenko等，2001），并已被证明可以特异性消融下丘脑中的食欲素神经元（Frederick-Duus等，2007）。 在以下坐标处注射1μL（每个半球2）的双侧输注：AP = -2.8和-3.2; ML = 0.7和0.8; DV = -9.0（Paxinos和Watson，1998）。 每次输注后，将针留在适当位置3分钟以允许扩散。 慢慢取出针头并用伤口夹闭合伤口。 在损伤手术后两周，在四次交配试验期间对所有男性进行性经验测试，然后进行跑道和/或高架加迷宫测试（见下文）。 手术在三个不同的队列中进行，间隔几周，以达到每组足够数量的动物。

性行为

在家庭笼中每隔一天进行的4交配期间对所有雄性进行性行为测试。 在每次训练期间，男性与接受女性接触射精或60分钟，以先到者为准。 如上所述记录交配行为并且还计算交配效率[插入次数/（安装次数+插入次数）]。 使用以病变手术作为因子的单向ANOVA和具有95％置信水平的Fisher's LSD检验，或者在适当的情况下，使用非参数测试进行非参数测试，比较每个试验的损伤和假手术组之间性表现参数的统计差异。 Kruskal-Wallis单因素方差分析以病变手术为因素，Dunn检验95％置信水平。 此外，使用配对t检验将每组的数据与手术前数据进行比较。

性动机：跑道测试

在对性行为进行测试之后，使用直线跑道装置（MED Associates Inc.，St。Albans，VT）测试了现在性经验丰富的男性的一个亚组（120 cm长; Lopez等，1999）。 男性在同一天进行的两次随后的10分钟试验中习惯于跑道设备。 接下来，进行了两次试验。 在第一次试验期间，将刺激动物（发情的雌性，雌性动物或雄性动物）放置在球门框中，在跑道末端带有穿孔分隔物。 使用风扇将刺激动物的气味吹向雄性。 将实验雄性放置在起始盒中，打开门以允许进入跑道，并记录到达目标盒的时间。 一旦到达目标框，雄性被给予30秒以与屏幕后面的刺激动物相互作用。 一个相同的第二次试验是在1小时后进行的。 使用具有1％置信水平的配对t检验分析试验2和试验95之间达到目标框的时间之间的统计学显着性。 组间的统计学显着性使用单向ANOVA确定，其中病变手术作为因子，然后进行具有95％置信水平的Fisher's LSD检验。

类似焦虑的行为：高架加迷宫

对现在性经验丰富的男性的一个亚组进行焦虑样行为测试，以确定食欲素病变对性表现或动机的影响是由于焦虑或唤醒的变化。 在光照结束期间，在明亮的房间中将雄性暴露于高架十字迷宫装置（EPM; MED Associates Inc.，St.Albans，VT）。 EPM由4臂组成，每个50臂的长度从中心连接处延伸，并且75 cm升高。 迷宫的两个臂向外部环境开放，另外两个用黑色壁板40厘米高。 将动物置于EPM上并监测5分钟。 使用光束阵列记录在开放和闭合臂中花费的时间以及进入每个臂的总数。 组间的统计学显着性使用单因素ANOVA确定，其中病变作为因子，然后进行具有95％置信水平的Fisher's LSD检验。

灌注和交配诱导的cFos

在所有行为测试后，所有雄性用戊巴比妥钠（270mg / mL）深度麻醉，并如前所述用500mL的4％PFA经心脏灌注以进行病变验证。 此外，为了测试食欲素病变对交配诱导的cFos表达的影响，假性和病变组的一组交配直到一次射精。 射精后1小时，如上所述，用4％PFA经心脏灌注雄性。 该组中有一半的雄性未被引入雌性，并且从家笼中灌注以作为未配对的对照。

免疫组化

使用4平行系列的35μm冠状切片中的冷冻切片机切割脑，并如上所述储存。 对于病变验证，使用与上述相同的兔抗 - 食欲素-A和DAB方案，对来自所有损伤实验的含有下丘脑的一系列切片单独标记为食欲素。 如上所述，对来自交配的动物的一系列切片进行cFos和食欲素染色。

病变验证

在每只动物中，如上所述，在非手术对照中表达最大数量的食欲素细胞的3切片中的PFA-DMH和LHA中双侧计数对食欲素具有免疫反应性的食欲素神经元的数量，来自前囟的-2.3mm至-3.6mm。 对每只动物平均每个半球的细胞，并计算组平均值。 非手术对照动物（来自cFos实验）用于确定食欲素神经元的完整/基线数量，数据表示为与非手术对照雄性相比的百分比（图2）。 与非手术对照动物相比，具有少于20％食欲素细胞的雄性包括在损伤组中。 部分损伤组中包括大于20％但小于80％的动物。 假对照的食欲素细胞数量没有显着变化。 使用具有95％置信水平的单因素ANOVA和Fisher's LSD检验计算假性，部分和完全损伤动物之间的统计学显着性。

图2 

病变验证。 代表性图像显示注射了BLANK-皂草素的假病变动物中的食欲素素（A）和MCH（B）细胞。 代表性图像显示食欲素细胞（C）的损失，但在注射食欲素的病变动物中完整的MCH细胞（D） ...

病变特异性

为了验证病变仅限于食欲素神经元，对一组阴性和病变动物（n = 20）的下丘脑的一系列切片进行免疫处理，用于黑素细胞浓缩激素（MCH），一种具有重叠位置的下丘脑肽（但没有）与食欲素神经元共定位（Broberger等，1998），如前所述，使用识别MCH（兔抗-MCH，H-070-47; 1：150 000，Phoenix Pharmaceuticals，Burlingame，CA）和DAB的兔提升的抗体。 MCH神经元表达ORX1（Bäckberg等，2002）但不是ORX2（Volgin等，2004），并且在orexin B-皂草素处理后没有显着降低（Frederick-Duus等，2007）。 每只动物两个切片双侧计数MCH免疫反应细胞（假的：n = 7;损伤n = 5），使用交替切片分析那些食欲素神经元。 病变未显着减少PFA-DMH或LHA中MCH神经元的数量（表1; 图2b，d; PFA-DMH：p = 0.47; LHA：p = 0.33）。 此外，交配诱导的cFos表达在每只动物的一个代表性切片中双侧计数（假的：n = 4;损伤n = 3），使用替代切片分析那些用于食欲素神经元的切片。 病变不影响PFA-DMH或LHA中交配诱导的cFos表达（表1; PFA-DMH：p = 0.53; LHA：p = 0.82）。 最后，用于食欲素细胞计数（动物：假：n = 6;损伤：n = 6）的代表性切片是使用甲酚紫（5 g甲酚紫乙酸酯（C-5042，Sigma，St.Louis，MO）复染的Nissl， 0.5 g乙酸钠三水合物（S209，Thermo Fisher Scientific，Ottawa，Ontario，Canada），1L双蒸水与冰醋酸（AX0073-6，EMD Chemicals，Mississauga，Ontario，Canada），pH：3.14）。 在食欲素神经元的一般位置的标准分析区域（250μm×200μm）中进行Nissl染色的神经元的计数。 Nissl染色神经元的数量在假手术组和病变组之间没有差异（表1; PFA-DMH：p = 0.23; LHA：p = 0.33）。

表1 

病变特异性的验证：对Nissl，MCH或交配诱导的cFos染色的神经元数量的分析表明，在PFA-DMH中一般没有显着的神经元损失，MCH细胞或交配诱导的神经活化或 ...

由于食欲素缺乏已被证明有助于小鼠发作性睡病（Chemelli等人，1999）， 小狗 （Lin等人，1999）和人类（西格尔，1999; Nishino等，2000; Peyron等人，2000; Thannickal等，2000观察动物以确保缺乏发作性睡眠表型。 在该研究中报告的所有行为测试的持续时间内观察动物，并且没有显示发作性睡病的任何特征。

在损伤动物中交配诱导的cFos表达

在腹侧被盖区域（VTA; 3×900μm），mPOA（900×400μm）的标准分析区域中，每只动物在600切片中双侧计数cFos免疫反应细胞的数目; 伏隔核（NAc）核心和壳（400×600μm）和内侧前额叶皮层（mPFC）（600×800μm每个亚区域）的前肢，下边缘和前扣带子区域通过观察到的实验组不知情。 计算每只动物的计数，并计算组平均值。 使用具有性经验和病变作为因子的双因素ANOVA计算统计学显着性，然后进行具有95％置信水平的Fisher's LSD检验。

成果

性行为期间食欲素神经元激活

在PFA-DMH（F。）中，在性行为后观察到食欲素神经元中cFos表达的显着增加(5,31) 63.4； p <0.001； 图3a）和LHA（F.(5,31) 10.4； p <0.001； 图3b），没有性经验的影响。 具体而言，在性行为和经验丰富的动物中，所有实验组的男性表现出不同的性行为参数（对发情的女性的调查，暴露于发情的女性气味，显示安装，插入或射精）显示与家庭相比的cFos均等诱导在PFA-DMH（60-80％）与LHA（14-33％）中激活的较高百分比的食欲素细胞的笼对照，实验组之间没有差异。 这些结果表明，食欲素神经元在暴露于刺激雌性后被激活而在性表现期间没有进一步激活。 此外，激活不依赖于女性刺激的激励显着性，因为非接受性和接受性女性都会在性经验丰富的男性中诱导激活。

图3 

PFA-DMH（A）和LHA（B）中的食欲素神经元在幼稚和有经验动物的交配行为的所有参数之后表达cFos。 缩写：HC，家笼; AF：无精打采的女性; EF，发情女性; M，Mount; IM，Intromission; E，射精。 ...

食欲素病变的影响

性行为

食欲素病变导致性行为的促进（安装潜伏期：F(2,47) 3.962; P = 0.034; 插入延迟：H = 9.104; P = 0.011）。 在第一次交配试验期间，与假动物相比，病变雄性显示出较短的潜伏期和插入期（插入潜伏期：p = 0.03;插入潜伏期：p = 0.01; 图4a-b并且与术前交配试验期间的潜伏期进行比较（安装潜伏期：p = 0.02;插入潜伏期：p = 0.03;数据未显示）。 部分病变男性与假性男性没有显着差异，两组均未与手术前交配试验不同。 随着性经验，病变对坐位和插入潜伏期的影响减弱，因为在任何后续试验期间，各组之间没有差异（试验4显示于 图4a-b）。 射精潜伏期（图4c），坐骑数量（图4d）和插入（图4e）以及交配效率（图4f）在任何试验期间或在第一次交配试验和手术前试验之间的每组内，各组之间没有显着差异。

图4 

在试验1期间，Orexin病变缩短了对性天真男性的进入和插入的潜伏期。 在男性获得性经验后，Orexin病变在试验4期间不影响交配。 （A）装载潜伏期。 （B）Intromission Latency。 （C）射精 ...
跑道测试

在性经验丰富的男性中，Orexin病变不会影响直线跑道测试中的性动机。 在两次试验过程中，与第一次试验相比，第二次试验中病变男性对发情女性的速度明显加快（p = 0.03; 图5）。 这种增加的运行时间表明性动机（Lopez等，1999）。 在试验2（p = 0.03）期间，部分病变和假性雄性也向发情的女性跑得更快，尽管这在假性雄性中未达到显着性（p = 0.052）。 在试验2期间，没有一组显示出增加的速度对于一个无精打采的女性或男性。 此外，在试验1和2试验中，假性，部分和病变雄性在速度上没有观察到任何刺激动物的显着差异，表明在跑道上的一般活动缺乏差异。

图5 

Orexin病变不影响性经验男性的性动机。 在1和2试验中，所示的时间是在跑道测试中到达发情的女性。 *表示试用2的女性到达女性的时间明显缩短 ...
焦虑般的行为

迄今为止的结果表明，当男性遇到新的女性时，病变可能通过对新奇和/或焦虑样行为的反应的潜在影响促进幼稚动物的性行为的开始。 在支持中，病变男性在EPM上显示出减少的焦虑样行为，被视为在闭合臂中花费的时间百分比降低（p = 0.012; 图6并且张开臂上的时间比例增加（p = 0.023; 图6与假男性相比。 部分病变没有显着影响。 这些数据进一步支持病变减少焦虑样行为。

图6 

Orexin病变降低了高架十字迷宫的焦虑样行为。 在闭合的手臂中花费的时间百分比（左）减少，并且在受损男性中开放臂（右）的时间百分比增加。 *表示显着差异 ...
cFos表达

为了评估内源性食欲素是否有助于在食欲素神经支配的大脑区域中交配诱导的神经元活化，进行了VTA，NAc核心和壳，mPOA和mPFC中交配诱导的cFos表达的分析。 在病变和假性雄性中，与未配对的对照相比，交配显着增加了所有分析脑区的cFos（表2）。 损伤不影响神经活化，因为假性和病变动物的基线或交配诱导的cFos表达没有差异。

表2 

与相同病变状态的非交配对照相比，在假，局部和病变组中交配诱导的cFos。

讨论

这些研究调查了内源性食欲素在雄性大鼠的性表现和动机中的作用。 结果发现，食欲素对性动机或性能不是必需的。 相反，orexin神经元被女性刺激激活，不依赖于女性的激素状态或男性的性经验。 此外，通过食欲素细胞特异性损伤去除内源性食欲素减少了类似焦虑的行为，并促进性行为男性中性行为的开始。 因此，这项研究的结果支持orexin在唤醒中的作用（de Lecea等，2006; 哈里斯和阿斯顿琼斯，2006; Sakurai，2007; Boutrel等，2009; Furlong和Carrive，2009; Furlong等人，2009）和焦虑（Suzuki等，2005; 戴维斯等人，2009; Li等人，2010），但不支持食欲素在性动机或表现中的关键作用。

这些研究的结果进一步阐明了内源性食欲素的作用以及先前研究使用药理学工具检验食欲素在男性性行为中的作用的明显对比结果。 mPOA输注外源性orexin-A导致性唤起增加和性行为改善，表明食欲素可能在mPOA中起作用，增加性行为的动机和表现（Gulia等，2003）。 然而，相反，ICV输注orexin-A减弱了性动机和唤醒（Bai等人，2009），一种食欲素受体拮抗剂对性唤起没有影响（Bai等人，2009），表明内源性食欲素可能不会在性动机中发挥作用。 最后，通过全身注射进行的ORX1阻断仅显示出轻微损害交配性能（Muschamp等，2007）。 从这些相互矛盾的研究中，可以得出一些结论。 首先，外源性orexin-A的应用可能会影响行为，但ORX1阻断没有重大影响，表明内源性orexin在调节男性性行为方面的次要作用（Bai等人，2009）。 目前的结果支持这种可能性。 目前通过食欲素细胞特异性病变去除食欲素的研究表明，内源性食欲素对于性动机或性能不是必需的，与 Bai等人（2009）。 然而，重要的是要注意到，食欲素病变对跑道性动机的影响可能是由于动物在性动机测试之前已经获得性经验这一事实，因此在跑道测试中缺乏效果可能是由于对男性的性经历。 未来的实验可以通过测试食欲素病变对幼稚男性性动机的影响来解决这个问题。

两种orexin配体和食欲素受体的两种亚型（ORX1和ORX2; Sakurai等，1998）可以调节相反方向的性行为。 通过利用食欲素细胞损伤技术，在本研究中消除了食欲素受体亚型（orexin-A和B）的配体。 这两种受体亚型在不同的脑区表达（Trivedi等，1998; Marcus等人，2001并且已被证明可以差异调节记忆诱导可卡因（Smith等人，2009）。 以前关于性行为的研究主要集中在orexin-A和ORX1的作用上（见上文的讨论）。 迄今为止在研究中使用的食欲素受体拮抗剂SB334867特异性靶向ORX1，其对食欲肽-A具有高亲和力并且对食欲素-B具有显着较低的亲和力（Sakurai等，1998）。 同样，orexin-A在以前的研究中被用作外源性食欲素（Gulia等，2003; Bai等人，2009）。 未来的研究需要调查orexin-B和ORX2在调节男性性行为中的作用。

目前的研究测试了长期食用orexin的影响。 Muschamp等人。 （2007） 建议阉割后长期减少食欲素可能导致性动机和性能的丧失。 这一假设与目前的研究结果相矛盾，因为食欲素细胞病变并未降低性动机或表现。 尽管在检测到性行为的回路中交配诱导的神经激活没有发生变化，但是当前研究中的长期食欲素损失可能已经导致代偿机制。 尽管如此，显然减少或缺乏食欲素并不能防止性行为。 此外，当前研究的结果不支持食欲素通过性行为诱导cFos表达的主要作用。 已经清楚地确定orexin有助于激活VTA中的神经元（Korotkova等，2003; Borgland等，2006; 成田等人，2006; Vittoz等，2008）。 然而，尽管存在与假雄性中活化的神经元非常接近的食欲素免疫反应性纤维，但是食欲素细胞损伤并未阻断VTA或所分析的任何其他奖赏相关脑区中的交配诱导的神经活化。 因此，这些脑区中交配诱导的神经活化似乎不依赖于食欲素作用。

当前研究的一个有些出乎意料的发现是食欲素病变对促进性初始但未经历过的有性行为的性行为的影响。 这被证明与焦虑样行为的减少有关。 因此，食欲素病变对性动机和表现的影响可能是其对焦虑和唤醒的影响。 事实上，先前的研究表明食欲素在焦虑中起作用，因为ICV输注食欲素A减少了小鼠EPM开放臂的时间（Suzuki等，2005）。 将orexin-A输注到雄性大鼠丘脑的室旁核中减少了在开放场室中心区域花费的时间并减少了新物体探索，表明食欲素可能参与焦虑样行为的产生（Li等人，2010）。 此外，显示EPM风险增加的显性雄性大鼠mPFC中的ORX1 mRNA水平增加（戴维斯等人，2009）。 Orexin也被证明可以改变对压力的反应（Ida等，1999; Ida等，2000）和orexin受体的刺激增加促肾上腺皮质激素释放因子的释放（Al-Barazanji等人，2001; Singareddy等人，2006），皮质酮（Ida等，2000; Kuru等人，2000）和促肾上腺皮质激素（Kuru等人，2000）。 食欲素拮抗剂目前正在临床试验中用于治疗失眠症，这种疾病通常与焦虑症共存（Sullivan和Neria，2009），并假设食欲素拮抗剂可能被用于治疗焦虑症（Mathew等，2008）。 鉴于越来越多的证据证明食欲素在焦虑和唤醒中的作用，似乎食欲素病变可能通过减少与引入新的刺激物（即女性）相关的焦虑样反应来促进幼稚男性的性行为。

在PFA-DMH和LHA中，在性生活和经历的动物中，性唤起和性行为均显示出食欲素神经元的显着活化，其中60-80％和14-33％分别表达cFos的食欲素细胞。 有大量证据支持食欲素细胞群中食欲素神经元功能的二分法，PFA-DMH主要参与唤醒，LHA对奖赏相关行为至关重要（Harris等，2005; 哈里斯和阿斯顿琼斯，2006, 阿斯顿 - 琼斯，2009a）。 因此，通过雌性刺激激活PFA-DMH食欲素细胞支持了这样的假设：食欲素被唤醒激活并且对唤醒是至关重要的，包括幼稚和经验丰富的男性的性唤起，以及与幼稚男性中的新型女性刺激相关的焦虑。 然而，PFA-DMH细胞被激活至相似的水平，与雄性的经验和雌性的激素状态无关，这表明PFA-DMH细胞在一般唤醒期间被激活而不是特异性地通过性唤起激活。 此外，我们的研究并不完全支持完全二分的食欲素细胞群的存在，因为暴露于性唤起和表现的所有参数后LHA显着激活，无论这些行为是否与奖赏相关。 因此，与经验丰富的男性相比，暴露于发育不良的女性的有经验的男性在LHA中显示出相同水平的食欲素细胞活化。 然而，只有后一组才会形成交配的条件性位置偏好（Tenk等，2009）; 这表明与射精交配比其他交配因素更有益。 目前的研究没有具体测试orexin在性回报中的作用; 因此需要进一步的研究来解决这个问题。

总之，这些研究的结果表明，食欲素对性表现或动机并不重要。 相反，食欲素细胞病变被证明可以减少焦虑，这表明内源性食欲素参与增加焦虑。 此外，去除食欲素导致在性天真的男性中促进性行为的开始，表明内源性食欲素可能抑制交配的开始，可能通过增加对新刺激（即女性）的反应的焦虑。 这些发现进一步阐明了涉及性表现和焦虑的神经回路，并增加了关于食欲素在唤醒和焦虑的调节中的作用的越来越多的文献。

致谢

该研究得到了美国国立卫生研究院（R01 DA014591），加拿大卫生研究院（RN 014705）和加拿大国家科学与工程研究委员会（Discovery Grant（341710））对LMC的资助。

脚注

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