Orexin-1受体机制在雌性大鼠暴食模型中对强迫性食物消耗的作用（2012）

神经精神药理学。 2012 Aug; 37（9）：1999-2011。

PMCID：PMC3398727

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抽象

Orexins（OX）及其受体（OXR）可调节摄食，唤醒，压力和药物滥用。 刺激和加强药物滥用的神经系统也可能成为强迫性食物寻求和摄入的基础。 因此，GSK1059865（5-bromo-）的作用N- [（2S,5S）-1-（3-氟-2-甲氧基苯甲酰基）-5-甲基哌啶-2-基]甲基 - 吡啶-2-胺），选择性OX1R拮抗剂，JNJ-10397049（N- （2,4二溴苯基） - N' - [（4S,5S）-2,2-二甲基-4-苯基-1,3-二恶烷-5-基]脲），选择性OX2R拮抗剂和SB-649868（N- [（（2S)-1-{[5-(4-fluorophenyl)-2-methyl-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl}-2-piperidinyl)methyl]-1-benzofuran-4-carboxamide), a dual OX1/牛2在雌性大鼠的暴食（BE）模型中评估R拮抗剂。 高度可口的食物（HPF）的诱导是由三个周期的食物限制和随后的压力诱发的，通过将大鼠暴露于HPF引起，但是阻止他们在15分钟时获得它。 在用于行为实验的相同实验条件下获得所有化合物的药代动力学评估。 托吡酯用作参考化合物，因为它选择性地阻断大鼠和人的BE。 在平行实验中使用多导睡眠图测量OXR拮抗剂的睡眠诱导效应的剂量相关阈值。 SB-649868和GSK1059865，但不是JNJ-10397049，在不影响标准食物颗粒摄入量的情况下，选择性地降低BE的HPF，剂量不会导致睡眠。 这些结果首次表明了OX的主要作用1BE中的R机制，表明OX的选择性拮抗作用1R可代表BE和可能具有强迫成分的其他饮食失调的新型药理学治疗。

关键词： orexin-1受体拮抗剂，食欲素-2受体拮抗剂，暴食，雌性大鼠，强迫性食物消耗

引言

在人类中暴食（BE）的发作的特征在于在短时间内非常大量的高度可口食物（HPF）的强迫性，非稳态消费。 即使他们不饿，受试者吃得比正常人快，直到感到不舒服。 如DMS-IV-TR所述（美国精神病学协会，2000），这些事件伴随着对饮食失去控制的主观感觉，并且与痛苦，厌恶，抑郁，对暴饮暴食有关，以及因尴尬而单独进食有关。

BE代表神经性贪食症的中心特征，其中BE的发作之后是旨在避免体重增加的行为，例如自诱导的呕吐。 强烈和持续的BE事件代表在患有暴食症（BED）的受试者中也发生的典型现象（Walsh和Devlin，1998）。 BED的特征在于在没有补偿行为的情况下反复发作BE以避免体重增加。 DSM-IV-TR中BED的诊断标准表明，对于2月，BE发作应至少每周6天发生。 BED与重大的医疗和精神病合并症有关（Javaras 等, 2008; Grucza 等, 2007; 法西诺 等, 2003）。 据估计，BE在其一生中的某个时间折磨了大约5％的美国成年人口（Foulds Mathes 等, 2009）它有助于加重肥胖和相关病理（哈德森 等, 2007; 希思，1998; 德夫林 等, 2000; Yanovski，2003).

目前的药物，如托吡酯（麦克尔罗伊 等, 2007; 麦克尔罗伊 等, 2009）或西布曲明（Appolinario 等, 2000; Wilfley 等, 2008），有报道称在临床研究中减少BE。 然而，它们的给药与各种不良副作用有关，这些副作用在慢性治疗期间代表严重问题（麦克尔罗伊 等, 2009; 卡特 等, 2003; Yager，2008）。 特别是西布曲明最近已从欧洲市场撤出，而托吡酯以其认知损害特性而闻名。 强烈需要对没有严重副作用的神经性贪食症和BED进行创新治疗。

在1998中，两组独立鉴定了一类新的神经肽，起源于下丘脑核（樱井 等, 1998; 德莱恰 等, 1998）。 这些称为orexin-A（OXA）和orexin-B（OXB）（也称为hypocretin 1和hypocretin 2）的肽是由pre-pro-OX肽的蛋白水解加工产生的，并与两个GPCR结合，即OX- 1和OX-2受体（OX1R和OX2R）（也表示为HcrtR1和HcrtR2）。 牛1R与Gq / 11偶联，而使用神经元细胞的研究表明OX2R与Gq，Gs和Gi蛋白偶联。 在中枢神经系统，OX1R和OX2R显示部分重叠但很大程度上不同且互补的分布模式（Sakurai，2007）。 脑边区如下边缘皮质，海马和蓝斑表现出高表达的OX1R，而OX2R是在弓状核，结节乳头核和背内侧和外侧下丘脑（LH）中表达的唯一受体。 两种受体均存在于前额叶皮质，杏仁核，纹状体末端核，室旁丘脑核，中缝背侧，腹侧被盖区（VTA）和后背侧肌 - 脑桥 - 脑桥核（Lu 等, 2000; 马库斯 等, 2001; 特里维迪 等, 1998）。 这些发现表明，OX及其受体可能在中枢神经系统中发挥广泛的调节作用。

清醒/睡眠状态的生理学是OX的作用被最广泛研究的领域之一。 事实上，prero-OX敲除小鼠中OX信号传导的破坏产生了一种表型，其特征与患有发作性睡病的患者非常相似，嗜睡症是一种以过度嗜睡为特征的慢性疾病，可能与非常严重的睡眠麻痹，催眠幻觉和猝倒有关。 （Chemelli 等, 1999）。 过度嗜睡似乎是无法维持延长醒来的表现。

而且，同时对两种OX都有拮抗作用1R和OX2R或选择性抑制OX2R导致强烈的催眠作用（Brisbare圣洛克 等, 2007; Dugovic 等, 2009; 迪法比奥 等, 2011).

文献中的数据还支持OX系统在摄食行为中的作用，控制稳态和基于奖励的食物摄入。 除了表现出发作性睡病表型外，与体重和年龄匹配的同窝仔相比，OX基因敲除小鼠也是低食性的，这表明OX在调节摄食和能量代谢中的作用（威利 等, 2001）。 在早期光照阶段，将OXA注射到大鼠侧脑室，诱导剂量相关的大鼠食物摄入增加（樱井 等, 1998），用OX预处理阻断1R拮抗剂SB-334867（海恩斯 等, 2000; 罗杰斯 等, 2001）。 最近的一篇论文记录了OX在基于奖励的食物摄入中的作用 PERELLO 等 (2010)，表明生长素释放肽诱导的高脂饮食的奖赏价值增加是OX依赖的; 此外，据报道SB-334867可抑制高脂肪食物的自我给药（奈尔 等, 2008）。 激活OX1R是食物强化响应，动机或两者的必要组成部分（沙夫 等, 2010）。 此外，LH OX神经元被与食物等完善奖励相关的线索激活（哈里斯 等, 2005），建议OX系统在响应与喂养的认知方面相关的外部环境线索中的潜在作用。

最近的报告支持OX信号传导在滥用药物的神经行为和动机效应中的作用（哈里斯 等, 2005; Borgland 等, 2006; 朱佩 等, 2011; 有关评论，请参阅 Bonci和Borgland，2009; 马丁 - Fardon 等, 2010）。 因此，封锁了OX1R减少乙醇（劳伦斯 等, 2006）和尼古丁自我管理（霍兰德 等, 2008），抑制线索诱导的乙醇复原 - （劳伦斯 等, 2006），可卡因 - （SMITH 等, 2010）和吗啡寻求（哈里斯 等, 2005），并减轻压力诱导的可卡因复原 - （Boutrel 等, 2005）和寻求乙醇（理查兹 等, 2008）。 此外，最近的证据也与OX有关2酒精奖励和寻求行为的R选择机制（Shoblock 等, 2011).

越来越多的证据表明，在特定条件下过量摄入某些食物会产生类似上瘾状态的大脑行为和变化（黄金 等, 2003; 肯尼，2011; Pelchat 等, 2004; 燕麦 等, 2008; Ifland 等, 2009; Gearhardt 等，2011a）。 还提出了激励和加强药物滥用的神经系统，以强调与强迫性寻求食物和摄入食物有关的行为（约翰逊和肯尼，2010; Hoebel，1985; Volkow和Wise，2005; 考文 等, 2011; Gearhardt 等，2011b; 王 等, 2011）。 这些发现提出了一个问题，即OX系统是否也可能在以强迫性暴食类型发作为特征的饮食失调中起作用，例如神经性贪食症和BED。

因此，本研究旨在研究双重OX的作用1/牛2R拮抗剂SB-649868（N-[((2S)-1-{[5-(4-fluorophenyl)-2-methyl-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl}-2-piperidinyl)methyl]-1-benzofuran-4-carboxamide) (迪法比奥 等, 2011），选择性OX1R拮抗剂GSK1059865（5-bromo-N- [（2S,5S)-1-(3-fluoro-2-methoxybenzoyl)-5-methylpiperidin-2-yl]methyl-pyridin-2-amine) (高吉 等, 2011）和选择性OX2R拮抗剂JNJ-10397049（N- （2,4二溴苯基） - N' - [（4S,5S）-2,2-二甲基-4-苯基-1,3-二恶烷-5-基]脲）（McAtee 等, 2004; Dugovic 等, 2009）在BE模型中描述 Cifani 等 (2009)通过食物限制/再喂养和急性应激循环，在雌性大鼠中诱发HP发作的BE发作。 首先评估了三种拮抗剂 细胞/组织 在大鼠重组OX中1R和OX2R确定它们的效力并确认它们对两种受体亚型的选择性。 然后评估它们的药代动力学（PK），并在睡眠大鼠模型中测定能够诱导催眠作用的剂量。 最后，在BE模型中以确定的剂量测试化合物。

材料和方法

动物

所有涉及动物的研究都是根据有关动物福利和保护的欧洲指令86/609 / EEC进行的，该指令得到了意大利第116号法令的承认。 葛兰素史克（GlaxoSmithKline）动物研究与伦理委员会（CARE）进行的内部审查，以及公司关于实验动物的护理和使用政策的27年1992月XNUMX日第XNUMX条。

毒品

SB-649868（迪法比奥 等, 2011），GSK1059865（高吉 等, 2011）和JNJ-10397049（McAtee 等, 2004）在GSK实验室合成。 OXA由California Peptides Research（目录号471-99，CA）提供。 肌[1,2，3H(N肌醇（NET-906，比活性：51 Ci / mol）和硅酸钇RNA结合珠（RPNQ0013）购自Perkin-Elmer（意大利）。 托吡酯（Topamax; Janssen-Cilag）购自Janssen-Cilag。 它可以在片剂中获得，在给药前将其还原成粉末。

实验1：大鼠OX中SB-649868，JNJ-10397049和GSK1059865的拮抗作用1R和Rat OX2R

细胞培养

用大鼠OX稳定转染的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞1R（rOX1R）或大鼠OX2R（rOX2R）在补充有10％胎牛血清（FBS，PAA），100 U / ml青霉素G，100 U / ml链霉素（Pen / Strep; Invitrogen / GIBCO）和400的α-MEM（Invitrogen / GIBCO）中培养。 μg/ ml遗传霉素（Invitrogen / GIBCO），37°C，5％CO2 在潮湿的环境中。

积累 [3H]肌醇磷酸酯（IPs）

积累 [3如前所述测量H]肌醇磷酸酯（IP）（挥舞 等, 2003）具有以下修改。 细胞系稳定表达rOX1R或rOX2将R以96×3接种在10-孔组织培养板中4 每孔细胞和1.5×104 每孔中的细胞分别在补充有10％FBS的α-MEM和不含遗传霉素的Pen / Strep中。 在24 h后，吸出培养基并向细胞中加入100μl补充有10μCi/ ml NET-906（Perkin-Elmer）的新鲜培养基; 因此，每孔使用1μCi的放射性标记的肌醇。 温育16小时后，在加入激动剂或拮抗剂之前，用测定缓冲液（1×HBSS，20 mM HEPES（pH 7.4），加上0.1％牛血清白蛋白和10 mM LiCl）洗涤细胞两次。 在用激动剂刺激之前，将拮抗剂在30℃下孵育37 min。 进行从0.0001到10μM的OXA的浓度 - 响应曲线（CRC）。 在1℃温育37 h后，吸出测定缓冲液，加入每孔80μl的0.1 M冰冷甲酸，并将细胞在室温下孵育30 min。 将20μl细胞提取物的量度加入到80μl的硅酸钇珠（YSi SPA; Perkin-Elmer; 12.5 mg / ml）中，在室温下摇动1 h，并在4℃下放置2 h之前依靠Packard Top-Count NXT微孔板闪烁计数器。

数据表示为％最大激动剂响应，计算如下：％最大激动剂反应=（（cpm对手-cpm基础）/ CPMmaxagonistresponse-cpm基础）×100。

在体外 数据分析

使用GraphPad Prism 5.0软件（GraphPad Software，San Diego，CA）通过S形非线性回归分析拟合CRC以获得激动剂EC50 （获得最大响应的50％所需的激动剂浓度）。

效力（KB通过应用非竞争性拮抗的操作模型方程确定不可克服的拮抗剂的拮抗剂解离常数（Kenakin 等, 2006）。 该 KB 通过Schild的分析计算出可克服的拮抗剂的值（Arunlakshana和Schild，1959）。 对于SB-649868只有拮抗剂IC50 算了。 我们绘制了1μMOXA在不存在和存在四种不同浓度的拮抗剂时产生的响应。 我知道了50 定义为抑制激动剂产生的反应所需的拮抗剂浓度50％。 结果表示为pEC50 （-log10 EC50），pKB （-log10 KB），或pIC50 （-log10 IC50并且它们以平均值±SEM或平均值表示，具有至少三次独立实验的95％置信限（95％CL）。 将测试的所有药物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并在测定缓冲液中进一步稀释，得到最终DMSO浓度不超过0.5％。

实验2：雄性和雌性大鼠的PK测定

为了评估睡眠和BE研究的PK血液暴露，已经在睡眠和BE实验的相同实验条件下在雄性和雌性大鼠中分析了化合物的PK曲线。 在雌性和雄性大鼠中通过管饲3 mg / kg SB-649868，在女性中腹膜内施用10 mg / kg和在JNJ-5的雄性大鼠中施用10397049 mg / kg，并且通过强饲法施用来研究PK曲线。雌性大鼠和10 mg / kg GSK1059865的雄性大鼠腹膜内给药。 通过股静脉收集血液样品，给药后间隔至4小时。 在实验结束时收集脑样品。 使用基于蛋白质沉淀的方法然后通过HPLC-MS / MS分析测定血液和脑样品中SB-649868，JNJ-10397049和GSK1059865的浓度。 使用软件包WinNonlin v.4.0（Pharsight，Mountain View，CA）从血液浓度 - 时间曲线获得非隔室PK参数。 PK参数表示为平均值±SD（阅读和Braggio，2010).

实验3：SB-649868，JNJ-10397049和GSK1059865对大鼠睡眠模型的影响

动物

在手术前一周，将雄性Sprague-Dawley大鼠（275-300 g; Charles River，Calco，Como，Italy）单独圈养在12-h光 - 暗循环（在0300光照下）1上。 允许获得食物和水 随意。 为了收集生物电势信号，将微型多通道遥测发射器（TL10M3-F40-EET; Data Sciences Int。）腹膜内植入动物体内。 将两个电极永久地用牙科粘固剂固定到颅骨以记录皮质脑电图（EEG）。 他们直接接触了 硬脑膜 通过额顶区域的两个钻孔。 将另外两个电极固定到颈部的骨骼肌上，用于记录肌电图（EMG）或在眼睛的眶周区域记录眼电图（EOG）。

录音

从手术中恢复后，将动物保持在温度可控的环境中（21±1°C）的家笼中，并获取食物和水 随意。 植入的动物在从手术恢复后立即表现出正常的行为特征。 然而，为了重新建立正常的睡眠模式，在3周期后使用动物。 在整个睡眠研究中保持上述环境条件。 在测试期间，自由移动的动物留在他们的家笼中的个体接收器上。 使用DSI Dataquest ART连续记录EEG和EMG或EOG信号。将分为10-s时期的EEG迹线进行数字变换（FFT变换）以提供功率谱。 δ, θ, α及 β 用于区分大鼠中三种不同活动模式的条带（清醒，NREM睡眠和REM睡眠）。 将由自动评分系统（睡眠阶段，DSI）分配的标记物转移至EEG数字信号，随后由训练有素的操作者目视检查EEG和EMG / EOG痕迹，对药物治疗无视。 睡眠参数的分析包括：NREM睡眠的潜伏期（注射后前六个连续NREM睡眠时期的时间间隔），REM睡眠的潜伏期（注射后第一个REM睡眠时期的时间间隔），NREM睡眠，REM睡眠和总数睡觉时间。

药物治疗

根据随机配对交叉设计进行药物治疗，其中在单独的实验期间，每只动物接受载体或药物治疗。 在关闭光（昼夜节律时间（CT）2）后，以6 ml / kg，18 h的体积用实验化合物或其各自的载体处理大鼠。 记录用于随后的3-h测试期。 将SB-649868溶于蒸馏水中的0.5％HPMC（羟丙基 - 甲基 - 纤维素）（w / v）中，并通过管饲法以3和10 mg / kg的剂量给药。 将JNJ-10397049溶于mygliol 812N，并以5和25 mg / kg的剂量腹膜内给药。 将GSK1059865溶于0.5％HPMC（w / v）的蒸馏水中，并以5和25 mg / kg的剂量腹膜内给药。

数据分析

所有数据均表示为平均值±SEM。 使用单因素方差分析（ANOVA）分析结果。 事后 用Dunnett检验进行比较。 统计显著性设定为 P

实验4：暴饮暴食

动物

使用雌性Sprague-Dawley大鼠（Charles River）。 在实验开始时，它们的体重是225-250 g。 在12-h光/暗循环（在0800 h上点亮）使大鼠适应各个笼子， 随意 在实验前几周，2的食物和水。 将它们保持在恒温（20-22℃）和湿度（45-55％）的房间中。 将大鼠保持在具有金属壁的单独笼中; 地板和前墙由金属网格制成。 笼底的尺寸为30 cm×30 cm; 笼子高30厘米。 由金属栅格组成的前门（30 cm×20 cm）存在于笼子的前壁中，以允许进入笼子的内部。 前墙的其余部分配备了饮用滴定管。

饮食

给动物提供标准大鼠食物颗粒，4RF18（Mucedola; Settimo Milanese，Milano，Italy; 2.6 kcal / g）。 HPF是通过混合Nutella（Ferrero，Alba，Torino，Italy）巧克力奶油（5.33 kcal / g; 56％，31％和分别来自碳水化合物，脂肪和蛋白质的7％），接地食品颗粒（ 4RF18; Mucedola; Settimo Milanese）和以下重量/重量百分比的水：52％Nutella，33％食物颗粒和15％水。 HPF饮食的卡路里含量为3.63 kcal / g。 在金属网格容器内提供标准颗粒，该容器悬挂在笼子的前壁上; 将其从笼中取出以测量其重量以确定食物颗粒的摄入量。 HPF是用咖啡杯提供的; 将杯子的把手插入笼子前壁的金属网格中并固定在墙壁上。

压力程序

对于15 min，将含有HPF的中国咖啡杯放在金属网格容器内，该网格容器挂在笼子的前壁上。 在这些条件下，动物能够在前两个周期的5，6，13和14天看到其接受HPF的杯子能够看到HPF本身，并且还能闻到它的气味。 在这个15-min期间，老鼠进行前爪，头部和躯干的反复运动，目的是获得HPF，但是无法到达它。

这产生了轻微的压力状态，导致血清皮质酮水平显着增加（Cifani 等, 2009）。 在15分钟后，将杯子放入应力组大鼠的笼子内，使HPF变得容易接近。

药物治疗

在25当天，在进入HPF之前给予化合物或相应的载体。 将SB-649868溶于0.5％HPMC（w / v）的蒸馏水中，并通过管饲法以1和3 mg / kg的剂量给药。 将托吡酯溶于0.5％HPMC（w / v）的蒸馏水中，并通过管饲法以60 mg / kg的剂量给药。 将JNJ-10397049溶于0.5％HPMC（w / v）的蒸馏水中，并以1和3 mg / kg的剂量腹膜内给药。 将GSK1059865溶于0.5％HPMC（w / v）的蒸馏水中，并通过管饲法以10和30 mg / kg的剂量给药。 在进入HPF之前，所有药物或其载体均施用1 h。

实验4A：SB-649868和托吡酯的作用

为了评估OXR拮抗剂在BE中的作用，在我们的BE模型中测试了非选择性OXR拮抗剂SB-649868。

将动物分成四组，每组27动物，与体重和每日食物摄入量相匹配：（1）非限制性和未暴露于应激（NR + NS）组; （2）受限制且未暴露于压力（R + NS）组; （3）非限制性和暴露于压力（NR + S）组; 和（4）受限和暴露于压力（R + S）组。 一旦分配到这些组中的一个，在整个研究期间大鼠保持在该组中。 暴露于压力的大鼠在与未暴露于压力的组不同的房间中适应。 将大鼠暴露于连续三个8天循环，然后在第25天进行最终测试（表1):

表1 

采取的计划引起暴饮暴食
  1. NR + NS组有食物 随意 对于4天，在5和6天，他们收到2 h的chow + HPF; 在7和8的日子里，他们有食物 随意; 在25当天他们没有受到压力;
  2. 第二组有食物和HPF作为NR + NS，但在测试当天（25日）他们暴露于压力（NR + S）;
  3. 第三组（R + NS）的食物限制为66天正常摄入量的4％，它们在2和5天提供食物和HPF（6 h），并且在7和8日仅提供食物; 在25当天他们没有受到压力。
  4. R + S组的食物限制为66天正常摄入量的4％，它们在2和5日提供食物和HPF（6 h），并且仅在7和8日提供食物; 在25当天，他们面临压力。

8天循环重复三次，但在第三个循环中，动物无法获得HPF食物。

在第25天，将每组27大鼠分成三个亚组，分别用载体，SB-649868，1或3 mg / kg处理，在进入HPF之前通过管饲法1 h给予。

HPF摄入量表示为摄入的平均kcal / kg±SEM; 在开始访问后，在15，30，60和120 min测量HPF摄入量。 食物颗粒摄入量仅在120分钟时测量，因为先前研究的结果显示食物颗粒摄入量非常小，并且在测试期间避免对动物的干扰。

托吡酯，用作该实验范例的参考化合物（Cifani 等, 2009），在SB-10实验结束后的649868天，在相同的大鼠中进行测试。 在这些108动物中，72被分成前面描述的相同的四组（每组的18动物）。 在第一次测试结束后休息一天后，这些大鼠组接受了额外的8天周期：NR + NS和NR + S组具有8天的食物 随意而R + NS和R + S组的4天数限制为正常摄入的66％，接着是4天的食物 随意。 在此附加周期中，所有组都无法访问HPF。 第二天，NR + S和R + S组暴露于压力，而NR + NS和R + NS组则没有。 在这一天，托吡酯（60 mg / kg）或其载体通过管饲1 h给药，然后进入HPF。

实验4B：JNJ-10397049和GSK1059865的作用

为了研究参与减少BE事件的OXR，选择性OX2R拮抗剂，JNJ-10397049和选择性OX1R拮抗剂GSK1059865在我们的BE模型中进行了测试。

将另外的54雌性大鼠（分为两组（NR + NS和R + S）的27大鼠）进行与实验4A相同的实验程序。 在该实验中仅使用两组大鼠，因为NR + S和R + NS大鼠均未显示BE。 在测试当天（25天），在进入HPF之前的1 h，用JNJ-10397049（1和3 mg / kg）或其载体腹膜内处理大鼠。

在JNJ-10397049测试结束一天后，同一组大鼠接受另外的8天循环，然后在第一天10（如先前实验中所述）通过GSK1059865处理。 在进入HPF之前，通过管饲法1059865 h施用GSK10（30和1 mg / kg）或其载体。

数据分析

所有数据均表示为平均值±SEM，并且每个值反映了如图例中所述的每组动物数的平均值。 通过双向ANOVA分析数据，其中对于实验组或药物治疗进行主体间比较，并且对于观察时间进行受试者内比较。 事后 比较由Bonferroni测试进行。 统计显着性设定为 P

成果

实验1：在rOX中对SB-649868，JNJ-10397049和GSK1059865的拮抗作用1R和rOX2R

OXA（0.1 nM-10μM）增加了[3H]以浓度依赖性方式利用pEC积累IP50 值7.79±0.04（n= 16）和7.68±0.04（n= 16）在rOX1R和rOX2R，分别。 在rOX1R，JNJ-10397049（1μM-33μM; 图1a）和GSK1059865（0.3 nM-10 nM; 图2a）产生不可克服的拮抗作用，具有OXA EC的剂量依赖性右移50 并伴随着激动剂最大反应的减少。 计算出的pKB 值为5.73±0.16（n= 3）和8.77±0.12（n= 3）分别用于JNJ-10397049和GSK1059865。 SB-649868（0.1，0.3，0.6和1 nM）（图3a）产生OXA最大反应的显着降低，而没有激动剂EC的转变50。 估计的pIC50 值为9.46±0.02（n= 3）。 在rOX2R JNJ-10397049（10 nM-0.3μM）（图1b）和GSK1059865（0.1-3.3μM）（图2b）产生了经典的可克服型材，OXA EC平行向右移动50 不会降低激动剂的最大反应。 通过Schild回归分析得出的斜率，对于JNJ-1.17和GSK95，分别为0.92（1.42％CL 0.86–95）和0.71（1.00％CL 10397049–1059865），并且它们之间的斜率没有统计学差异。P> 0.05）。 将斜率约束为pKB 值为8.49（95％CL 8.34-8.63; n= 3）和6.90（95％CL 6.80-6.99; n= 3）分别用于JNJ-10397049和GSK1059865。 SB-649868（0.1-3.3 nM）（图3b）产生OXA EC的剂量依赖性右移50，伴随着激动剂最大反应的减少。 通过应用非竞争性拮抗分析的操作模型，如材料和方法中所述，apKB 值9.35±0.15（n计算出= 3）。

图1 

[3H]肌醇磷酸（IPs）积累由orexin-A（OXA）的浓度 - 响应曲线（CRC）引发（•）在大鼠嗜碱性粒细胞白血病（RBL）细胞中表达：大鼠OX1R（rOX1R）（a）存在1（Δ），3.3（▾），10 ...
图2 

[3H]肌醇磷酸（IPs）积累由orexin-A（OXA）的浓度 - 响应曲线（CRC）引发（•）在表达：rOX的大鼠嗜碱性粒细胞白血病（RBL）细胞中1R（a）存在0.3（▴），1（▾），3.3（♦） ...
图3 

[3H]肌醇磷酸（IPs）积累由orexin-A（OXA）的浓度 - 响应曲线（CRC）引发（•）在大鼠嗜碱性粒细胞白血病（RBL）细胞中表达：大鼠rOX1R（rOX1R）（a）存在0.1（□），0.3（Δ）， ...

实验2：雄性和雌性大鼠的PK测定

在与实验3相同的实验条件下研究雄性大鼠的PK测定，并显示在中 表2.

表2 

雄性Sprague-Dawley大鼠SB-649868，JNJ-10397049和GSK1059865的药代动力学参数

C最大 649868 mg / kg的SB-3为333±52 ng / ml，AUC 1260±262 ng*H /毫升。

C最大 10397049 mg / kg的JNJ-5为14.2±1.0 ng / ml，AUC 64±4.3 ng*H /毫升。

C最大 1059865 mg / kg的GSK10为366±70 ng / ml，AUC 1290±320 ng*H /毫升。

在与实验4相同的实验条件下研究雌性大鼠中的PK测定，并且它们显示于 表3.

表3 

女性Sprague-Dawley大鼠SB-649868，JNJ-10397049和GSK1059865的药代动力学参数

C最大 649868 mg / kg的SB-3为572±115 ng / ml，AUC 1708±331 ng*H /毫升。

C最大 10397049 mg / kg的JNJ-10为369±97 ng / ml，AUC 457±224 ng*H /毫升。

C最大 1059865 mg / kg的GSK10为268±29 ng / ml，AUC 768±46 ng*H /毫升。

实验3：SB-649868，JNJ-10397049和GSK1059865对大鼠睡眠模型的影响

在大鼠活动期的3-h期间评估OXR拮抗剂的催眠曲线，开始在大鼠明 - 暗循环的CT 18（在CT 12处熄灭）的记录阶段。 CT 18经过特别选择，允许最大窗口评估化合物的催眠作用。

在这些实验条件下，双OX1/牛2R拮抗剂SB-649868（3和10 mg / kg，通过管饲法）诱导清醒的强烈降低（F（2，21）= 22.9; P<0.01），睡眠潜伏期缩短（F（2，21）= 9.11; P<0.01）与对照组相比。 方差分析后的Dunnett试验显示，在3 mg / kg和10 mg / kg的条件下，有统计学意义的效果（P在两个睡眠参数中均<0.01）。 睡眠模式分析表明，两种剂量的NREM和REM睡眠均增加（表4a).

表4a 

SB-649868（灌胃）对大鼠睡眠参数的影响

选择性OX2R拮抗剂JNJ-10397049（5和25 mg / kg，腹膜内）显示出催眠作用，如通过觉醒减少所揭示的（F（2，14）= 18.8; P<0.01）和睡眠潜伏期（F（2，14）= 4.8; P<0.05）。 方差分析后的Dunnett检验显示，在5和25 mg / kg的剂量下，降低幅度具有统计学意义（P<0.01的清醒度和 P睡眠潜伏期<0.05。 两种剂量均观察到NREM睡眠增加（P<0.01），但未对REM睡眠产生影响（表4b).

表4b 

JNJ-10397049（ip）对大鼠睡眠参数的影响

选择性OX1R拮抗剂GSK1059865（5和25 mg / kg，腹膜内）产生降低觉醒的趋势（F（2，14）= 3.27; P<0.05）和睡眠潜伏期（F（2，20）= 1.73; P> 0.05）。 睡眠模式分析显示，仅NREM睡眠增加，在最高测试剂量下具有统计学意义（P<0.05方差分析后的邓尼特检验）； 在REM睡眠中未观察到任何影响（表4c).

表4c 

GSK1059865（ip）对大鼠睡眠参数的影响

实验4A。 BE：SB-649868和托吡酯的作用

ANOVA显示载体给药后四组大鼠中2-h HPF摄入量的显着差异（F（3，32）= 13.81; P<0.01）。 如图所示 图4载体给药后，R + S组HPF摄入量明显高于对照组（NR + NS）。 HPF摄入的R + S大鼠在获得它的第一个15分钟中非常明显; NR + S组的HPF摄入量与对照组（NR + NS）没有显着差异，表明应激不足以诱导BE。 此外，R + NS组的HPF摄入量与对照组（NR + NS）没有显着差异，表明限制食物的周期不足以诱导BE。 因此，BE可能是由节食和压力之间的独特相互作用引起的。

图4 

SB-649868（1和3 mg / kg，通过强饲法）或其载体对高度可口的食物（HPF）摄入的影响。 数值表示为9只大鼠的平均值±SEM。 **P<0.01，与用赋形剂处理的大鼠的差异； 除非另有说明， ...

标准食物颗粒的摄入量非常小（约为3 h测试中总卡路里摄入量的4-2％），并且不受食物限制，压力或两者的组合影响。

如图所示 图4，SB-649868显着降低R + S组的HPF摄入量（F（2，24）= 18.63; P<0.01），但在其他组中则没有：NR + NS（F（2，24）= 0.91; P> 0.05）； R + NS（F（2，24）= 0.16; P> 0.05）； NR + S（F（2，24）= 1.1; P> 0.05）。 事后 比较显示，响应于最高剂量的649868 mg / kg，在所有时间点，SB-3在R + S组中的作用是统计学显着的。 R + S组中1 mg / kg的剂量显示出降低的趋势，这在统计学上不显着。

托吡酯试验显示2-h HPF摄入量的显着差异（F（3，32）= 3.93; P车辆管理后，各组的<0.01）。 托吡酯以60 mg / kg的选择性给药降低了HPF的摄入量（F（1，16）= 6.57; P<0.01）在R + S组（图5），但不是NR + NS，NR + S和R + NS组。 未显示NR + S和R + NS组的数据。

图5 

托吡酯（60 mg / kg，通过强饲法）或其载体对高度可口的食物（HPF）摄入的影响。 数值表示为9只大鼠的平均值±SEM。 *P<0.05，与赋形剂处理的大鼠的差异； 除非另有说明，否则区别 ...

实验4B。 BE：JNJ-10397049和GSK1059865的作用

对于之前的实验，ANOVA证实R + S组显示HPF摄入显着增加（F（1，16）= 16.17; P<0.01）。 JNJ-10397049 NR + NS组均未影响进食（F（2，26）= 0.23; P> 0.05）或R + S组（F（2，24）= 0.49; P> 0.05）（图6a).

图6 

JNJ-10397049（1和3 mg / kg，腹膜内）（a）或GSK1059865（10和30 mg / kg，通过管饲法）（b）对高度可口的食物（HPF）摄入的影响。 数值表示为9只大鼠的平均值±SEM。 *P<0.05，差异 ...

得到的结果表明OX2R拮抗作用不影响摄食行为。 因此，先前用SB-649868观察到的效果可能是通过OX介导的1R机制。 为了证实这一发现，选择性OX1测试R拮抗剂GSK1059865（10和30 mg / kg）。 ANOVA显示响应媒介物处理的组之间的显着差异（F（1，16）= 17.1; P<0.01），证实了R + S组的BE效应。 GSK1059865（10和30 mg / kg的剂量）对NR + NS组的喂养没有影响（F（2，24）= 0.10； P> 0.05）。 在R + S组中，ANOVA显示出显着效果（F（2，23）= 4.20， P<0.05）（图6b). 事后 比较显示，在1059865和10 mg / kg剂量下，GSK30在R + S组中的作用在自由获得HPF后在15，30和60 min处具有统计学显着性。

讨论

大量证据表明，节食，压力和负性情感状态代表了患有BED或神经性贪食症的患者的BE可能诱因（瓦德尔 等, 2000; Freeman和Gil，2004）。 事实上，节食时期在暴食者的历史中很常见，尽管饥饿本身似乎不足以在没有压力和消极情感状态的情况下诱导BE（Polivy 等, 1994; 沃特斯 等, 2001）。 大量证据表明BE可能是由节食和压力之间的独特相互作用引起的; 因此，环境压力和循环食物限制的历史可能是其降水和维护的原因（公正性 等, 2001; 克劳瑟 等, 2001; 沃尔夫 等, 2000）。 因此，反复出现的食物限制始终是应对压力的暴饮暴食的最强预测因子（瓦德尔 等, 2000).

节食和压力的结合在我们的临床前模型中的BE发展中也起着重要作用。 在由...开发的模型中 Cifani 等 (2009)BE是由悠悠球节食和压力暴露于HPF引起的。 在该模型中，雌性大鼠暴露于重复的限制循环和压力过程，其特征在于将动物暴露于HPF而不可能接近它。

如引言中所述，OX机制涉及控制稳态和基于奖励的喂养，以及滥用药物的动机（Bonci和Borgland，2009）。 认为激励和加强药物滥用的神经系统也可能成为与寻求食物和摄入相关的行为的基础（Gearhardt 等，2011b），该研究调查了OXR拮抗剂阻断BE发作和评估OX参与的能力1 和OX2 BE事件控制机制。

因此，文献中报道的三种化合物具有不同的选择性 vs OX1 和OX2 测试了人类受体：双重OX1/牛2R拮抗剂（SB-649868），选择性OX2R拮抗剂（JNJ-10397049）和选择性OX1R拮抗剂（GSK1059865）。 为了使用药理学相关剂量，首先评估三种OXR拮抗剂 细胞/组织 在大鼠重组OX中1R和OX2R确定效力并确认它们在这种动物物种中的选择性。 不同的OX1/牛2使用[确认大鼠的R选择性[3H]肌醇测定。

为了评估PK血液暴露以支持睡眠和BE研究，已经在雄性和雌性大鼠中分析了化合物的PK曲线，因为这些分别是睡眠和BE实验中使用的性别。

接下来，在睡眠大鼠模型中确定能够诱导催眠作用的剂量。 最后，在BE模型中以确定的剂量测试化合物。

OX1R和OX2文献报道R拮抗剂参与控制睡眠，特别是诱导催眠作用（迪法比奥 等, 2011; 高吉 等, 2011; Dugovic 等, 2009）。 在雄性大鼠的临床前催眠睡眠模型中，获得的结果证明了双重OX1/牛2R拮抗剂SB-649868在诱导和维持睡眠的能力方面诱导强烈的催眠作用，在3 mg / kg时达到统计学上显着的作用。 与SB-649868类似，OX2R拮抗剂JNJ-10397049显示出良好的催眠作用，并且在5 mg / kg时清醒时间显着减少。 相反，OX1R拮抗剂GSK1059865显示出非常差的诱导和维持睡眠的催眠能力。 这些发现与其他报告一致，表明OX2R可能比OX更重要1R介导OX对睡眠的影响（Sakurai，2007; Brisbare圣洛克 等, 2007; 马勒布 等, 2009; Dugovic 等, 2009; 迪法比奥 等, 2011).

在四种不同的压力和食物限制条件下（NR + NS，R + NS，NR + S，R + S）测试的SB-649868仅能在R + S组中降低HPF摄入量。 在3 mg / kg时，SB-649868具有与用托吡酯观察到的效果相似的效果。 与托吡酯一样，SB-649868在食物限制和压力的其他条件下没有改变HPF摄入量。

牛年2在相同条件下测试的R拮抗剂JNJ-10397049在所有四种测试条件下均未显示出对HPF摄入的任何影响。

这些结果清楚地表明了OX1R参与BE事件的控制并且暗示了OX的潜在作用1R拮抗剂逆转由压力和限制饮食引起的BE事件。 为验证这一假设，选择性OX1在限制性和应激性动物中评价R拮抗剂GSK1059865。 得到的结果证实了OX1R拮抗剂抑制R + S大鼠HPF摄入的增加，而不影响对照（NR + NS）中的食物消耗。

缺乏JNJ-10397049的作用不能归因于提交给BE模型的动物中化合物暴露不足。 JNJ-10397049的PK评估表明性别差异，在相同剂量的JNJ-10397049（10 mg / kg）下，雌性大鼠比雄性大鼠更暴露。 估计的AUC值为64 ng*雄性大鼠的h / ml vs 457 ng*雌性大鼠的h / ml（大约高7倍）。 因此，可以得出结论，在1和3 mg / kg JNJ-10397049的BE模型中的动物暴露远高于在5和25 mg / kg的睡眠研究中实现的动物暴露。 另一方面，在SB-649868和GSK1059865的PK中没有观察到性别差异，并且在雄性和雌性大鼠中两种化合物的暴露是重叠的。

如引言中所述，压力是BE的关键决定因素。 在过去十年中已经产生了几个数据集，支持OX肽在高唤醒状态中的作用，包括压力，后者与显着更高的OXergic神经传递率相关。 已经提出在下丘脑 - 背内侧下丘脑中的OX神经元介导应激激活（哈里斯和阿斯顿琼斯，2006，查看，请参阅 Koob，2008）。 可能来自这个下丘脑区域的OXA激活下丘脑室旁核和杏仁核中央核中的CRF表达神经元（坂本 等, 2004）。 因此，OX1R拮抗剂抑制由药理学应激物育亨宾诱导的乙醇和蔗糖寻求的恢复（理查兹 等, 2008）和OXA恢复可卡因寻求行为（Boutrel 等, 2005）。 最近， Kuwaki（2011） 发现OX系统是控制自主功能和情绪行为的神经回路中必不可少的调节器之一。 早期的研究结果 约翰逊 等 (2010) 表明选择性OX1R拮抗剂SB334867减轻了焦虑样行为，并阻断了大鼠乳酸钠激发诱导的运动，心率和血压反应的增加。

一些研究表明，神经性贪食症和BED患者可能存在改变的纹状体多巴胺（DA）调节（Bello和Hajnal，2010; Broft 等, 2011; 王 等, 2011）。 Hoebel及其同事的研究（综述，见 Avena和Bocarsly，2011）揭示了纹状体DA释放和受体结合的变化，类似于对滥用药物的反应。 在LH中产生的神经肽可以调节VTA-DA和纹状体神经元的活性。 含有OX的神经元从LH投射到VTA，即OX1R在控制中脑边缘DA传播和各种滥用药物和食物的有益特性方面起着关键作用（卡森 等, 2010; 浦村 等, 2001; 郑 等, 2007）。 此外，BE剧集可以通过对HPF的奖励和强化过程的特定影响来控制。 在这方面，值得注意的是，LH中的OX神经元已被提议用于调节奖励激活（有关评论，请参阅 Koob，2008）。 因此，建议LH中的OX神经元被与奖赏相关的线索激活，例如食物或药物，并且LH中的OX神经元的刺激恢复了对大鼠的药物寻求（哈里斯 等, 2005).

我们小组最近通过临床前MRI方法证明了OX1R而不是OX2R选择性地调节中脑边缘脑区和脑岛的皮质部分，涉及奖励处理的区域（高吉 等, 2011）。 这些数据证实并扩展了OX之前的研究结果1R在奖励处理和寻求毒品行为的沉淀中发挥作用（Boutrel 等, 2005; 劳伦斯 等，2006; 霍兰德 等, 2008; SMITH 等, 2010）。 因此，需要进一步的工作来评估OX对BE的抑制作用1R拮抗剂与它们对压力或奖励机制或两者的影响有关。

总之，本研究中使用三种对OX具有不同选择性的OXR拮抗剂获得的结果1R vs OX2R清楚地证明了OXR在控制BE发作和调节睡眠中的不同作用。 我们的数据证实了OX的主要作用2睡眠控制中的R机制。 此外，他们还第一次展示了OX1R机制在BE事件的控制中起主要作用。 这些发现表明针对OX1R可代表治疗BE相关疾病的一种有趣的新型药理学方法。

致谢

我们感谢Charles Pickens博士对手稿的风格修正。

EM-P是GSK的全职员工。

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