安非他明改变一夫一妻制雌性草原田鼠（2011）的行为和中脑皮质素多巴胺受体的表达

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抽象

我们最近建立了社会一夫一妻制的草原田鼠（Microtus ochrogaster）作为一种动物模型，用于研究中脑皮质边缘多巴胺（DA）参与苯丙胺（AMPH）引起的社会行为损害。 迄今为止，我们的大部分工作都集中在雄性，并且在对AMPH的行为和神经生物学反应中通常报告性别差异，目前的研究旨在检查AMPH治疗对雌性草原田鼠的行为和神经生物学影响。 我们使用条件性位置偏爱（CPP）范例来确定AMPH在雌性草原田鼠中的行为影响的剂量 - 反应曲线，并发现低至中等条件（0.2和1.0 mg / kg），但不是很低（ 0.1 mg / kg），AMPH剂量诱导CPP。 我们还发现暴露于行为相关剂量的AMPH（1.0 mg / kg）诱导伏隔核（NAcc）和尾状壳核中的DA浓度增加，但不影响内侧前额叶皮质或腹侧被盖区（VTA）。 最后，重复AMPH暴露（连续1.0天3 mg / kg每天一次;最近显示改变DA受体表达并损害雄性草原田鼠社会结合的注射范例）增加D1，但不增加D2，受体mRNA NAcc，并且在VTA中降低D2受体mRNA和D2样受体结合。 总之，这些数据表明AMPH以区域和受体特异性方式改变中脑皮质激素DA神经传递，这反过来可能对雌性草原田鼠的社会行为产生深远影响。

关键词： 精神兴奋剂，伏核，腹侧被盖区，自动受体，结合，条件性位置偏好

1. 简介

人们认为滥用药物会对行为产生强大的控制，部分原因在于它们对中脑皮质多巴胺（DA）系统的影响（Kelley和Berridge，2002; Nesse和Berridge，1997; Nestler，2004, 2005; Panksepp等人，2002），一种神经回路，由产生DA的细胞组成，起源于腹侧被盖区（VTA）并投射到各种前脑区域，包括内侧前额叶皮层（PFC）和伏隔核（NAcc）。 这种高度保守的神经回路在自适应目标导向行为的产生中起着重要作用（Zahm，2000） - 包括对所有动物无处不在的行为（例如，喂养（Narayanan等人，2010; Palmiter，2007））和那些物种特异性的（例如，一夫一妻制中的配对结合（Aragona和Wang，2009; Curtis等人，2006; Young等，2010）） - 因接触滥用药物而显着改变。 例如，急性和/或反复接触滥用的精神兴奋药物，如可卡因或安非他明（AMPH），导致DA释放，DA受体表达和敏感性改变，以及中脑皮质边缘脑区内的神经元形态（亨利等人，1989; 亨利和怀特，1995; Hu等人，2002; Nestler，2005; 皮尔斯和卡利瓦斯，1997; Robinson等，2001, 1988; Robinson和Kolb，1997; White和Kalivas，1998）。 据认为，这些神经适应可能是药物诱导的动物行为改变的基础（Robinson和Becker，1986），包括社会行为（供审查，见（见）Young等，2011））。

我们实验室最近的工作已经建立了草原田鼠作为动物模型来研究中脑皮质素DA在滥用药物对社会行为的影响中的作用（Liu等人，2010）。 草原田鼠是社交一夫一妻制的啮齿动物，在延长的同居和/或交配后形成对熟悉的伴侣（即伴侣偏好）的偏好（Insel等人，1995; Williams等人，1992; Winslow等，1993）和中脑皮质激素DA - 特别是NAcc中的DA神经传递 - 对于这个过程是必不可少的（Aragona等，2003, 2006; Aragona和Wang，2009; Curtis等人，2006; Gingrich等，2000; 刘和王，2003; Wang等人，1999; Young等，2010）。 有趣的是，接触AMPH可显着改变雄性草原田鼠的中脑皮质素DA活性和神经传递。 例如，单次AMPH注射显着增加NAcc中的细胞外DA水平（柯蒂斯和王，2007）。 此外，当与环境背景配对时，三天的AMPH暴露诱导形成条件性位置偏爱（CPP），以受体特异性方式改变NAcc中的DA受体表达（Liu等人，2010）。 重要的是，这种相同的药物治疗抑制了交配诱导的伴侣偏好的形成，表明AMPH诱导的中脑皮质激素DA神经传递的改变可能是AMPH诱导的该物种对结合受损的基础（Liu等人，2010).

虽然上述研究已经确定草原田鼠是一种优秀的模型，用于检查AMPH诱导的社会结合损伤及其潜在的神经机制，但它们仅在男性中进行。 因此，我们对AMPH在雌性草原田鼠中的行为和神经生物学影响知之甚少。 有证据表明雌性草原田鼠对AMPH的敏感性高于雄性草原田鼠（Aragona等，2007）和其他物种的研究通常报告AMPH和其他精神兴奋药滥用的行为和神经生物学效应的性别差异（Becker和Hu，2008; Fattore等，2008; 林奇，2006）。 例如，雌性大鼠表现出更强的自发活动，并且对AMPH的反应更快速地诱导行为致敏（Camp和Robinson，1988），更快地获得可卡因和甲基苯丙胺自我管理（Hu等人，2004; 林奇，2006; 林奇和卡罗尔，1999; 罗斯和卡罗尔，2004），并表现出更高程度的动机来获得精神兴奋剂（Roberts等，1989; 罗斯和卡罗尔，2004）比男性。 此外，在对精神兴奋剂的神经生物学反应中已经注意到性别差异，包括AMPH诱导的DA释放的差异（Becker，1990; Becker和Ramirez，1981），DA代谢（Camp和Robinson，1988），及早期基因表达（Castner和Becker，1996）。 因此，研究AMPH在雌性草原田鼠中的神经生物学效应对于完全建立草原田鼠模型以研究检测滥用药物，社会行为和中脑皮质激素DA之间的关系至关重要。

目前的研究旨在检查AMPH暴露在雌性草原田鼠中的行为和神经生物学效应。 我们使用了先前在雄性草原田鼠中建立的CPP范例（Liu等人，2010）检查不同剂量AMPH在女性中的行为相关性。 由于女性对AMPH的行为敏感度往往高于男性（Aragona等，2007; Becker等，2001; Camp和Robinson，1988），我们假设雌性草原田鼠在AMPH剂量较低时会形成CPP，而不是男性。 我们还检查了AMPH暴露对DA浓度和DA受体基因表达和各种中脑皮质边缘脑区域结合的影响。 我们假设AMPH暴露会以受体和区域特异性方式改变DA浓度和DA受体表达。 本研究的结果将为今后研究AMPH对该物种雌性社会行为的影响提供有用的见解。

2。 结果

2.1。 实验1：AMPH调节诱导的CPP

实验1建立了AMPH诱导的雌性草原田鼠CPP的剂量 - 反应曲线。 为了最终比较雌性与雄性的剂量 - 反应曲线，我们使用了与最近在雄性草原田鼠中发现的相同的条件范例（Liu等人，2010）。 受试者被随机分配到四个实验组中的一个，这些实验组通过AMPH浓度[0.0（n= 20），0.1（n= 8），0.2（n= 12），或1.0 mg / kg（n他们在AMPH预处理会议期间收到了（13）]（详见实验程序）。 在最终调理期后的第二天测试所有受试者是否存在无药物状态的CPP。 CPP的定义是，与预测试相比，在测试后在药物配对笼中花费的时间显着增加。

单独用盐水治疗的受试者[0.0 mg / kg; Ť(19)= 1.65; p<0.12]或盐水中最低的[0.1 mg / kg; Ť(7)= 1.89; p<0.90] AMPH的浓度在调理前后在配对药室中的统计时间相等，因此没有形成CPP（图1A）。 相反，受0.2治疗的受试者[t(11)= 2.77; p<0.02]或1.0 mg / kg [t(12)= 2.53; p<0.03] AMPH表现出强大的CPP，因为在测试后，他们在药物配对室中花费的时间明显多于测试前（图1A）。 在药物治疗之前或之后，在组内或组之间没有发现运动活动的差异（图1B).

图。 1 

安非他明（AMPH）诱导的雌性草原田鼠的条件性位置偏爱（CPP）和自发活动。 在0.0天的调理期间接受0.1（仅盐水）或3 mg / kg AMPH的女性不会形成CPP，因为他们花费相同的时间 ...

2.2。 实验2：AMPH治疗改变了中脑皮质激素DA浓度

实验2检查了单次AMPH治疗对选择性脑区DA浓度的影响，包括PFC，NAcc，尾壳核（CP）和VTA（图2A）。 受试者被随机分配到两个实验组中的一个，该组接受单次ip注射0.9％盐水（n= 6）或1.0 mg / kg AMPH溶于盐水（n= 6）。 选择该剂量是因为它足以在雌性（实验1）和雄性草原田鼠中诱导CPP（Aragona等，2007; Liu等人，2010），表明其与两性的行为相关性。 所有受试者在注射后处死30 min，并且使用具有电化学检测的高效液相色谱法（HPLC-ECD）测量其脑组织中DA的浓度。

图。 2 

单次AMPH注射（1 mg / kg）对中脑皮质边缘脑区DA浓度的影响。 内侧前额叶皮层（PFC），伏隔核（NAcc），尾壳核（CP）和腹侧组织穿刺位置的示意图 ...

单次AMPH治疗在中脑皮质激素DA系统内以区域特异性方式改变DA浓度（图2B）。 用AMPH治疗的受试者在NAcc中具有显着更高的DA浓度[t(10) = 2.06; p<0.03]和CP [t(10)= 2.07， p<0.03]比注射生理盐水的对照。 但是，在PFC中没有发现组差异[t(10)= 0.03; p<0.49]或VTA [t(10)= 1.41; p<0.09]。

2.3。 实验3和4：重复AMPH暴露改变DA受体mRNA表达和结合

实验3和4分别检测了重复AMPH处理对D1受体和D2受体mRNA表达以及D1样和D2样受体结合的影响。 先前在雄性草原田鼠中进行的实验表明，重复AMPH暴露（1.0 mg / kg连续3天每天一次）显着改变最终注射后NAcc 24 h中的DA受体表达，并且这种改变可能是AMPH诱导的损伤的基础。社会联系（Liu等人，2010）。 因此，我们使用这种药物注射范例来研究重复AMPH暴露在女性中的神经生物学效应。 受试者被随机分配到接受腹腔注射生理盐水的两组中的一组（对照组， n= 6）或含有1.0 mg / kg AMPH的生理盐水（n= 8），连续三天每天一次。 最后一次注射后，所有受试者都被处死24 h。 在NAcc和CP中测量D1受体mRNA和D1样受体结合的密度，同时在NAcc，CP和VTA中测量D2受体mRNA和D2样受体结合。 D1R mRNA和D1样受体结合在VTA中没有测量，因为它们不存在于这个大脑区域（Weiner等，1991).

重复的AMPH暴露以受体和区域特异性方式改变DA受体mRNA表达。 接受重复AMPH治疗的受试者在NAcc中显示出显着更高水平的D1受体mRNA标记[t(12)= 2.85; p <0.01]，而不是CP [t(12)= 1.96; p <0.07]，比注射生理盐水的对照（图 3A和B.）。 在NAcc中D2受体mRNA标记中未发现组间差异[t(12)= 1.56; p <0.14]或CP [t(12)= 1.79; p <0.10]（图 3C和D.）。 然而，重复AMPH治疗显着降低了VTA中D2受体mRNA的水平[t(12)= 3.11; p <0.01]（图 3E和F.).

图。 3 

重复AMPH给药（1 mg / kg /天连续3天数）对雌性草原田鼠多巴胺受体mRNA标记的影响。 重复AMPH处理增加伏隔核（NAcc）中的D1受体（D1R）mRNA标记，但不是 ...

反复AMPH暴露对D1样受体没有影响（图 4A和B.）或D2样受体（图 4C和D.）NAcc中的结合水平[D1-like： t(12)= 0.40; p <0.35，类似于D2： t(12)= 0.77; p<0.23]或CP [类似于D1： t(12)= 0.63; p<0.27，类似于D2： t(12)= 0.91; p<0.19]。 但是，接受AMPH治疗的受试者在VTA中的D2样受体结合水平明显低于注射生理盐水的对照组[t(12)= 1.91; p<0.04]（图 4E和F.).

图。 4 

重复AMPH给药（1 mg / kg /天连续3天数）对雌性草原田鼠多巴胺受体结合水平的影响。 重复AMPH治疗没有改变D1样（A和B）或D2样受体结合水平（C和D） ...

3。 讨论

目前的研究调查了AMPH暴露在雌性草原田鼠中的行为和神经生物学效应。 总的来说，我们的数据表明，AMPH对行为具有剂量依赖性作用，增加NAcc和CP中的DA浓度，并以受体和区域特异性方式改变DA受体基因表达和结合。 这些数据最终可能为将来研究调查AMPH对该物种雌性社会行为的影响提供有用的见解。

CPP反映了对与主要强化物配对的环境背景的偏好（Bardo和Bevins，2000） - 在这种情况下，AMPH - 通常用作药物奖励的行为相关的，虽然是间接的衡量标准。 我们的结果表明，雌性草原田鼠在用低至中等剂量的AMPH处理后形成CPP。 与我们最近使用相同CPP范例获得的雄性草原田鼠的结果相比（Liu等人，2010），这些数据一起显示了雌性草原田鼠CPP剂量 - 反应曲线的向左移动。 具体而言，0.2 mg / kg或更高剂量的AMPH在女性中诱导CPP，而1.0 mg / kg或更高剂量的AMPH在男性中诱导CPP是必需的（Liu等人，2010）。 女性剂量 - 反应曲线的这种向左移动与以前使用不同条件范例的草原田鼠研究一致（Aragona等，2007），并且表明女性对AMPH的行为影响更敏感，并且可能更容易受到奖励影响，而不是男性 - 这一发现在其他物种中得到了一致的证明（Camp和Robinson，1988; Hu等人，2004; 林奇，2006; 林奇和卡罗尔，1999; Roberts等，1989; 罗斯和卡罗尔，2004）这可能对AMPH对雌性草原田鼠的社会行为的影响具有重要意义。

在本研究中，我们还发现AMPH给药 - 对于雌性草原田鼠的行为相关剂量（1.0 mg / kg） - 增加了NAcc和CP中的DA浓度，但没有增加PFC或VTA中的DA浓度。 这些结果表明区域特异性AMPH诱导的DA浓度增强。 由于先前在许多物种中的研究已证明AMPH注射后不久在NAcc和CP中诱导细胞外DA释放（Cho等人，1999; Clausing和Bowyer，1999; 柯蒂斯和王，2007; Di Chiara等，1993; Drevets等，2001），本研究中这些区域DA浓度的增加可能是由于AMPH诱导的DA释放增强。 然而，由于DA浓度也受DA合成和代谢的影响，因此需要在进一步的实验中测试这种推测。 此外，在雌性草原田鼠中接触AMPH后，VTA中DA浓度降低的趋势值得注意。 虽然这种影响并不显着（p <0.09），需要进一步实验以排除或排除AMPH对该脑区域DA浓度的影响。

为了进一步了解AMPH暴露在雌性草原田鼠中的神经生物学后果，我们研究了重复AMPH处理对DA受体mRNA表达和各脑区结合的影响。 我们使用AMPH剂量和注射范例，最近证明它可以改变DA受体表达并损害雄性草原田鼠的社会行为（Liu等人，2010）。 我们的数据表明，重复的AMPH暴露显着增加了NAcc中D1受体mRNA的水平。 类似但不重要（p <0.07），在CP中注意到作用，表明AMPH也可能对该区域的D1R mRNA表达有影响。 尽管基因表达发生了这些变化，但AMPH暴露并没有改变NAcc或CP中D1样受体结合的水平。 D1样受体有两种类型-D1受体和D5受体-两者都有可能被我们的受体结合实验中使用的D1样配体标记。 但是，由于NAcc和CP中实际上不存在D5受体（Missale等人，1998; Tiberi等，1991），我们的数据表明缺乏变化，特别是D1受体蛋白水平。 同样，之前在其他啮齿动物物种中的报告表明，反复暴露于AMPH或其他精神兴奋剂并不能可靠地改变这些大脑区域的D1受体亲和力或密度（综述见（皮尔斯和卡利瓦斯，1997; White和Kalivas，1998）），尽管在药物治疗后增强了NAcc神经元对D1受体激动剂的反应性长达一个月（亨利等人，1989; 亨利和怀特，1991, 1995）。 我们还报告AMPH处理后雌性草原田鼠的NAN或CP中D2受体mRNA或D2样受体结合水平没有变化，这一发现与大鼠和小鼠的结果一致（Richtand等人，1997; Sora等人，1992）以及NAcc D1受体在重复AMPH暴露反应中发挥更大作用的建议（伯克和海曼，2000).

本研究中一个有趣的发现是，重复的AMPH处理显着降低了雌性草原田鼠VTA中D2受体基因表达水平和D2样受体结合。 VTA中的D2受体位于A10 DA神经元的体细胞树突区域（DA投射神经元起源于VTA并投射到中脑皮质边缘区域）（Aghajanian和Bunney，1977; Mercuri等，1997; Oades和Halliday，1987; 怀特和王，1984b）。 这些受体作为自身受体起作用，它们的活化导致细胞膜的超极化和细胞激发的抑制（Mercuri等，1997）（供审查见（Mercuri等，1992）），减少释放到目标区域（如NAcc）的DA量（Usiello等，2000）。 因此，D2受体阻断或基因缺失导致缺乏A10细胞抑制和随后DA响应各种刺激而进入NAcc（Mercuri等，1997; Rouge-Pont等人，2002）。 因此，本研究中提到的VTA中D2受体的减少可能表明AMPH诱导的雌性草原田鼠中的体细胞树突状自身受体的下调。 由于自身受体密度与A10 DA神经元的活动率呈负相关（怀特和王，1984a），这种效应可能导致NAcc中DA释放和神经传递增强。 同样，先前的研究表明，在反复的精神兴奋剂暴露后，躯体树突状自身受体对A10 DA神经元具有亚敏感性，导致A10 DA细胞的自发活动和基础激发率增加（亨利等人，1989）药物治疗结束后可持续数天（阿克曼和怀特，1990）。 然而，值得注意的是，D2和D3受体均在VTA中表达，并且在多巴胺能神经元上突然定位（Diaz等人，1995; Mercuri等，1997），表明D2样受体结合的当前减少可归因于任一或两种受体亚型的变化。 受AMPH暴露影响的特定受体亚型的知识对于我们的数据解释是重要的，因为D2而不是D3受体是自身受体抑制DA神经元所必需的（Mercuri等，1997; Rouge-Pont等人，2002）。 尽管如此，由于D3受体在VTA中的表达相对于D2受体而言极低（Bouthenet等人，1991）和spiperone对D2的亲和力高于D3受体（Missale等人，1998），对D2样受体结合的当前作用可能代表D2水平的特异性降低，而不是D3受体。

虽然重复AMPH暴露在雌性中的神经生物学效应与之前在雄性草原田鼠中发现的有一些相似之处（Liu等人，2010），两个重要的区别是显而易见的。 首先，虽然AMPH经验增加了两性中NAcc的D1受体mRNA，但其增加的基因转录的功能性后果仅保留在雄性中（即，雌性未显示D1样受体结合水平的任何变化，而AMPH增加了NAcc D1受体蛋白水平。男性）。 这些差异可能是由于使用不同的定量技术来检测这些功能性后果（即雌性使用受体结合，而雄性使用蛋白质印迹）或可能表明重复AMPH处理对NAcc内D1受体的性别特异性影响草原田鼠 其次，AMPH处理对雄性草原田鼠VTA中D2受体mRNA表达没有影响（Liu等人，2010），但在雌性中显着降低它以及D2受体结合水平 - 进一步表明AMPH的神经生物学作用是性别特异性的。 这一观点得到了其他物种的研究结果的支持，这些研究表明AMPH处理后基因表达的性别差异（Castner和Becker，1996).

AMPH诱导的中脑皮质激素DA系统的改变可能对草原田鼠的社会行为产生重要影响。 如前所述，成年雄性和雌性草原田鼠在交配后形成持久的双重结合（Carter等，1995; Williams等人，1992; Winslow等，1993）和NAcc DA以受体特异性方式调节两种性别的这种行为：D2样受体激活促进和D1样受体激活抑制伴侣偏好的形成（Aragona等，2003, 2006; Aragona和Wang，2009; Gingrich等，2000; 刘和王，2003; Wang等人，1999）。 因此，AMPH诱导的中脑皮质边缘脑区域的变化，包括此处报道的那些，可能对草原田鼠中的对结合行为产生深远的影响。 例如，在雄性中，AMPH诱导的NAcc中D1样受体的增加被认为是AMPH诱导的伴侣偏好形成受损的基础（Liu等人，2010），因为NAcc D1受体激活抑制交配诱导的伴侣偏好（Aragona等，2006）。 此外，在AMPH治疗期间D1受体的药理学阻断剂量依赖性地消除了AMPH诱导的伴侣偏好形成的损伤，进一步表明AMPH可能通过D1受体介导的机制损害配对键合（Liu等人，2010）。 相反，在雌性中，由于缺乏当前发现所暗示的自身受体抑制（即，VTA中D2受体表达减少），在AMPH处理的田鼠中，NAcc中交配诱导的DA释放可能会增强。 随着DA浓度的强烈升高激活低亲和力D1受体（Richfield等，1989），这种神经适应可能对女性的社会联系产生重要的行为影响。

总之，目前的研究表明行为相关剂量的AMPH改变了雌性草原田鼠的中脑皮层边缘DA系统中的DA浓度和受体表达，这是该物种的一夫一妻制社会行为的关键环路。 这些结果为雌性草原田鼠未来的研究奠定了基础，以研究AMPH对配对结合的影响以及所涉及的神经化学机制。

4。 实验步骤

4.1。 动物

圈养繁殖的雌性草原田鼠（Microtus ochrogaster来自伊利诺斯州南部的人群的后代在21天龄断奶，然后在含有雪松芯片垫料的塑料笼（29×18×13 cm）中饲养在同性同胞中。 它们保持在14：10光照：黑暗周期（在0700 h点亮） 随意 获得食物和水。 温度保持在21±1℃。 本研究中使用的所有动物均在90和120天之间。 根据佛罗里达州立大学的机构动物护理和使用委员会的指导进行实验。

4.2。 条件性地方偏好范式

CPP设备与先前描述的相同，并且由两个视觉上不同的塑料笼（白色与黑色）组成，并通过中空管彼此连接（Aragona等，2007; Liu等人，2010）。 我们最近在雄性草原田鼠中开发了一种条件范例（Liu等人，2010）。 简言之，在30天对所有受试者进行1 min预测试，并量化在每个笼中花费的时间量。 在预试验期间个体花费较少时间的笼子被指定为药物配对笼子，另一个被指定为盐水配对笼子。 在接下来的三天（天40-2）中，每天两次4分钟会话期间进行调节。 在早晨会话期间（0900 h）受试者在放置之前立即腹膜内（ip）注射溶解在盐水中的0.0，0.1，0.2或1.0 mg / kg d-AMPH硫酸盐（Sigma，St.Louis，MO，USA）进入药物配对笼。 在下午会话期间（1500 h），受试者在被放入盐水配对笼之前立即腹膜内注射盐水。 每天两次试验训练计划已用于大鼠（坎贝尔和斯皮尔，1999; 周等人，2010）并用于我们之前在雄性草原田鼠中的研究（Liu等人，2010）。 此外，选择这种范例是因为我们的试验数据表明，用平衡和固定注射/调节范例（未发表的数据）治疗的受试者之间的行为没有差异，并且因为标准化的注射和组织采集时间表对于后续实验中DA标记物表达的测量很重要。以及与雄性草原田鼠数据的直接比较（Liu等人，2010）。 在第5天，在30 min后测试中测试所有受试者是否存在CPP。 在试验前和试验后记录动物在笼子之间交叉的次数，并用作运动活动的指标。

4.3。 组织准备

在实验30和2中最后一次注射后，在实验24和3 h中注射后，受试者迅速断头4 min。 将它们的脑迅速取出并立即在干冰上冷冻，然后在-80℃下储存。 将来自实验2的脑在300μm处冠状切片，并将切片解冻安装在Superfrost / plus载玻片上。 Paxinos和Watson大鼠脑图谱（Paxinos和Watson，1998）用于识别各种大脑区域，包括PFC（板8-10），NAcc（板9-11），CP（板10-12）和VTA（板40-43），其中双侧组织冲头取1毫米直径（图2A）并存储在-80°C直到处理完毕。 虽然不是中脑皮质边缘脑区域，但CP包含在我们的分析中，因为它像NAcc和PFC一样从VTA接收DAergic输入（Oades和Halliday，1987）但似乎没有参与草原田鼠伴侣偏好形成的DAergic调节（Aragona等，2003, 2006; 刘和王，2003）。 对于实验3和4，将脑冠状切割成10组的14μm切片，将其解冻安装在Superfrost / plus载玻片上。

4.4。 DA提取和HPLC-ECD分析

如前所述进行DA提取（Aragona等，2002），除了组织样品在50μL0.1M高氯酸中用0.02％EDTA超声处理。 如前所述，使用高效液相色谱和电化学检测（HPLC-ECD）评估DA浓度（Curtis等人，2003）以下例外情况。 流动相由75mM磷酸二氢钠一水合物，1.7 mM 1-辛烷磺酸钠盐，0.01％三乙胺，25 um EDTA和7％乙腈组成，并用3.0％磷酸将pH调节至85。 流速为0.5 ml / min。 如前所述计算标准曲线和峰面积（Aragona等，2003）。 每个样品的检测限为~10 pg。

4.5。 D1和D2受体mRNA的原位杂交

处理来自实验3的交替的脑切片组 原位 DA受体mRNA的杂交标记。 反义和有义核糖核酸探针（由加利福尼亚大学欧文分校的O. Civelli博士慷慨提供）用于D1和D2受体mRNA标记，并如前所述制备（Liu等人，2010）。 在由37μg/μl相应DNA模板组成的转录优化缓冲液中，在1°C单独标记探针0.5 h [35S] -CTP，4 mM的ATP，UTP和GTP，0.2 M二硫苏糖醇（DTT），RNasin（40 U /μl）和RNA聚合酶（20 U /μl）。 然后用1 U /μlDNaseI消化DNA模板。 使用色谱柱（Bio-Rad，Hercules，CA）纯化探针，然后在包含50％去离子甲酰胺，10％葡聚糖硫酸盐，3x SSC，10 mM磷酸钠缓冲液（PB，pH 7.4），1的杂交缓冲液中稀释×Denhardt溶液，0.2 mg / ml酵母tRNA和10 mM DTT产生5×106 的cpm / ml的。

将脑切片在4 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的0.1％多聚甲醛中在4℃下固定20 min，在PBS中冲洗10 min，并用0.25％乙酸酐在三乙醇胺（pH 8.0）中处理15 min以减少非特异性结合。 然后将载玻片在2×盐酸柠檬酸钠（SSC）中洗涤，通过增加浓度的乙醇（ETOH）（70，95和100％）脱水，并空气干燥。

每个载玻片接受含有适当的100μl杂交溶液 35将S标记的探针盖上盖子，然后在55℃下在加湿室中温育过夜。 孵育后，在2×SSC中除去盖玻片，在2×SSC中洗涤载玻片两次5 min，然后在37℃下在RNase缓冲液（1 mM Tris-HCl，8 mM EDTA和0.8）中洗涤0.4 h。 M NaCl，pH 8.0）含有25 mg / ml RNaseA。 接下来，将载玻片在递减浓度的SSC（2×SSC，1×SSC和0.5×SSC）中洗涤5 min，并在0.1×SSC中在65℃下孵育60 min。 最后，将载玻片升至室温，通过增加浓度的ETOH脱水，并风干。 根据探针和感兴趣的区域，将切片与BioMax MR胶片（Kodak，Rochester，NY）一起用于不同的时间段，以产生最佳的放射自显影图。 对于NAcc和CP，D1R和D2R mRNA标记的切片分别用于14和60 h的胶片，而标记为D1样和D2样受体结合的切片分别用于15和6.5 h。 对于VTA，标记为D2R mRNA的切片用于60 h，标记用于D2样结合的切片用于40 h。 如所预期的，还针对每种探针测试了有义RNA对照，并且没有产生标记。

4.6。 DA受体放射自显影

对于实验4，处理替代的脑切片组用于D1样和D2样受体放射自显影。 D1样配体[125I] SCH23982和D2样配体[125I] 2'-碘代螺哌隆从PerkinElmer（Waltham，MA）获得。 DA受体放射自显影如前所述进行（Aragona等，2006).

4.7。 数据分析

对于实验1，通过与测试前相比在测试后在药物配对笼中花费的时间显着增加来定义CPP，如通过配对测量的 t-测试。 使用双向重复测量ANOVA分析运动活动，比较测试前和测试后的运动（受试者内变量）和通过治疗进行的运动（受试者间变量）。 对于实验2，使用该样品的总蛋白质浓度标准化每个样品的DA浓度以控制收集的组织量。 然后将DA浓度的标准化值（pg /μg组织）转换为盐水对照的平均DA浓度的百分比。 对于每个脑区域，将组间DA浓度百分比与a进行比较 t-测试。 在实验3和4中，使用计算机图像程序（NIH IMAGE 1.60）分析放射自显影图中NA标记或受体结合的NAAC，CP和VTA的光学密度（PFC未包括在分析中，因为该区域未显示响应在实验2中进行AMPH处理。 NAcc，CP和VTA的图像分析的延髓/尾部程度与实验2所述的相同。 使用Paxinos和Watson大鼠脑图谱进行NAcc和CP之间的神经解剖学区分（Paxinos和Watson，1998）作为指导，参考标签的形状和前连合的位置。 每个脑区域的切片在受试者之间在解剖学上匹配，并且通过从每只动物的每个脑区域的三个切片中双侧测量光学密度来获得每个受试者的个体平均值。 从每个部分的测量值中减去背景密度。 将最终的光密度转换为盐水对照平均值的百分比。 使用a分析每种DA受体的mRNA区域或脑区域内结合水平的组差异 t-测试。 显着性水平设定为 p

致谢

我们感谢Kevin Young和Adam Smith对手稿的批判性阅读。 这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持，DAF31-25570授予KAY，MHF31-79600授予KLG，DAR01-19627，DAK02-23048和MHR01-58616授予ZXW。

脚注

缩写： AMPH，安非他明; 方差分析，方差分析; CP，尾状壳核; CPP，条件性地点偏好; DTT，二硫苏糖醇; DA，多巴胺; 乙醇，乙醇; HPLC，高效液相色谱; ip，腹膜内; PCF，内侧前额叶皮层; NAcc，伏隔核; PBS，磷酸盐缓冲盐水; SSC，盐水柠檬酸钠; PB，磷酸钠缓冲液; VTA，腹侧被盖区

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