Nat Neurosci。 作者手稿; 可在PMC Jan 1，2014中找到。
以最终编辑形式发布为：
Nat Neurosci。 Jul 2013; 16（7）：10.1038 / nn.3420。
在线发布Jun 2，2013。 DOI： 10.1038 / nn.3420
PMCID：PMC3703824
NIHMSID：NIHMS477621
王辉,*,1,2,3 Florian Duclot,*,1,2 刘艳,2,3 王作新,2,3 和 穆罕默德卡巴伊1,2
可在以下位置获得发布者对本文的最终编辑版本： Nat Neurosci
请参阅PMC中的其他文章 引用 已发表的文章。
抽象
在社会一夫一妻的草原田鼠（Microtus ochrogaster），交配诱导由伴侣偏好形成引发的持久对键，并受各种神经递质（包括催产素，加压素和多巴胺）的调节。 在这里，我们研究了调节配对调控的潜在表观遗传机制。 我们表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠和TrichoStatin A（TSA）在没有交配的情况下促进雌性草原田鼠的伴侣偏好形成。 这与伏隔核中催产素（OTR）和加压素V1a受体（V1aR）的特异性上调有关，通过其各自启动子处组蛋白乙酰化的增加。 此外，伏隔核中的OTR或V1aR阻断阻止了TSA促进的伴侣偏好。 重要的是，交配诱导的伴侣偏好引发了与TSA相同的OTR和V1aR基因启动子的表观遗传调节。 因此，这些观察表明TSA和交配通过表观遗传事件促进了伴侣偏好，为配对结合的表观遗传调控提供了第一个直接证据。
介绍
社会归属是人类社会行为的基本特征，社会认知缺陷是多种神经精神疾病的共同特征，包括精神分裂症和孤独症谱系障碍，以及成瘾和抑郁1。 社会一夫一妻的草原田鼠（Microtus ochrogaster已经成为一个非常有趣的模型，用于调查社会依恋的神经生物学基础，因为实验室和自由生活的个体建立长期配对债券2–4这首先是通过形成对伴侣的选择性归属行为而发起的，称为伴侣偏好5。 这种伴侣偏好的形成涉及多种神经递质和激素系统，包括神经肽催产素和血管加压素（AVP）和中脑边缘多巴胺5.
I一般来说，伴侣偏好的形成是通过男性腹侧苍白球和侧隔膜（LS）的AVP神经传递介导的，而女性草原田鼠伏核（NAcc）和前肢皮质中的催产素神经传递介导的。6–8.
通常涉及交配等自然奖励，多巴胺也是草原田鼠中伴侣偏好的关键调节剂。 在NAcc中激活多巴胺D2型受体（D2R）有利于多巴胺D1型受体（D1R）的激活抑制雄性和雌性草原田鼠中的伴侣偏好形成。9–11.
重要的是，催产素和AVP V1a受体，OTR和V1aR的基因表达的变异本身可以显着影响伴侣偏好。 例如，在雌性草原田鼠中，在没有交配的情况下，NATR中OTR的过度表达促进了伴侣的偏好。12–14.
除了配对结合的调节，催产素和AVP也涉及广泛的社会行为，包括社会认可，侵略和孕产妇保健15, 16。 值得注意的是，啮齿类动物后一种行为的破坏通过表观遗传机制诱导长期的神经适应，包括雌激素受体α的DNA甲基化17 和AVP基因18，以及糖皮质激素受体启动子的组蛋白乙酰化19。 此外，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，通过增加啮齿动物大脑中的组蛋白乙酰化来增强基因表达20，可以扭转这些变化19，并直接影响性接受等社会行为21。 重要的是，在肺癌细胞系中，HDAC抑制剂曲古抑菌素A（TSA）通过局部促进组蛋白乙酰化直接增强OTR转录22.
因此，可以提出草原田鼠中伴侣偏好形成的表观遗传基础。 为了验证这一假设，我们首先评估了两种HDAC抑制剂，即丁酸钠（NaB）和TSA对成年雌性草原田鼠中伴侣偏好形成的影响。 此后，我们研究了介导TSA诱导雌性草原田鼠伴侣偏好的分子机制。 最后，我们试图确定TSA在同居期间诱导的表观遗传改变是否也是由交配引发的。
成果
TSA治疗有助于合作伙伴偏好
性脑内注射性天真的雌性草原田鼠（侧脑室。）含有0.08，0.4或4的CSF或CSF n紧接6小时与未交配的雄性同居之前的TSA，然后测试他们的伴侣偏好。 与没有交配的雄性同居6小时不会诱导雌性草原田鼠的伴侣偏好形成4 因此，这种行为范式已被广泛用于评估各种药物对促进伴侣偏好形成的影响5.
CSF治疗的动物在6小时同居后没有交配时显示出与伴侣或陌生人的非选择性并排接触（t15= 0.76， P = 0.46; 图1a）。 然而，在所有测试剂量下用TSA治疗的动物优先与伴侣一起花费的时间比与陌生人相比（t8= 4.35， P = TSA 0.002的0.08 ng组; t15= 3.63， P = TSA 0.002的0.4 ng组; 和 t8= 2.58， P = TSA 0.03的4 ng组）。 重要的是，在运动活动中没有发现组间差异（F3,46 = 1.25， P= 0.30， 图1b并且没有观察到测试女性对陌生人或伴侣的攻击行为，证明TSA的效果是特定于社会偏好的，而不是继续改变对陌生人的运动或社交厌恶。
为了研究TSA是否增强参与伴侣偏好形成的脑结构中的组蛋白乙酰化，向中等剂量的TSA（0.4）注射一批单独的雌性。 ng）在30 min，2或9小时期间与没有交配的雄性同居。 值得注意的是，在NAcc和尾壳核的任何时间点都没有检测到全球组蛋白H3乙酰化（Lys14）水平的显着变化（P 所有组> 0.05， 图1c和d）。 这表明TSA在没有交配的情况下促进了伴侣偏好的形成，尽管不影响NAcc或尾状核壳中的全球组蛋白H3乙酰化。
重要的是，丁酸钠也促进了雌性草原田鼠的伴侣偏好，与男性同居6小时而没有交配，与NAcc中全球组蛋白H3乙酰化（Lys14）的增加相关（补充图1）。 因此，TSA对伴侣偏好形成的影响可以用另一种HDAC抑制剂再现，表明HDAC抑制的参与，而不是TSA在促进伴侣偏好中的非特异性作用。 考虑到TSA是更具特异性和亲和力的I / II类HDAC抑制剂23, 24并且TSA的行为效应比NaB更明显，我们选择使用TSA而不是NaB来研究以下部分研究中的特定分子相关性。
TSA促进的伴侣偏好的分子相关性
由于田鼠NAcc中基因表达水平的变化与一夫一妻制和非一夫一妻制田鼠之间的不同交配策略有关，并且特别是草原田鼠中伴侣偏好形成的改变。12, 13, 25, 26，我们评估了TSA促进的伴侣偏好形成是否与NAcc中基因表达的变异相关。
TSA治疗（0.4 ng, 侧脑室。）与CSF处理的对照相比，在同居2小时后诱导NAcc中OTR mRNA水平的增加（t10 = 2.38， P = 0.038， 图2a），在9小时同居后趋于持续（t9 = 2.17， P = 0.058， 图2b）。 虽然在TSA注射后的NAcc 1小时内可观察到V2aR mRNA的轻微但不显着的增加，但在任何其他测量的mRNA（包括D1R或D2R）的任一时间点均未检测到其他组差异（P > 0.05， 图2a，b）。 重要的是，在任何时间点，尾状壳核和任何测量的mRNA都没有观察到组间差异（P 所有组> 0.05， 图.2c，d），表明在TSA处理的动物中观察到的OTR mRNA的增加对NAcc是特异性的。 此外，仅在与雄性同居后才出现这种上调，因为NAAC中的OTR和V1aR mRNA水平在没有同居的TSA注射后2小时内保持不变（OTR：CSF组的100.0％±11.70，TSA的86.7％±12.11）组， t12 = 0.79， P = 0.444; V1aR：CSF组的100.0％±26.24，TSA组的92.3％±13.75， t9 = 0.27， P 0.791）。
与更高的OTR mRNA水平一致，TSA处理的动物在NAcc的两个时间点也表现出更高的OTR蛋白水平（2小时： t10 = 2.34， P = 0.041; 9小时： t10 = 3.16， P = 0.01， 图2e，f），但不是尾状壳核（t10 = 0.41， P = 0.69， 图2g，h）。 有趣的是，虽然在注射TSA后1或2小时的NAcc中未检测到V9aR mRNA水平的显着变化（图2a，b），与NAF中CSF处理的动物相比，V1aR蛋白水平在9小时显着增加（t9 = 3.46， P = 0.007， 图2f）但不是尾状壳核（t10 = 0.98， P = 0.35， 图2h）。 虽然有一些变化，但NAN和尾壳核中的D1R和D2R蛋白水平没有受到TSA给药的显着影响（P > 0.05， 图2e-h).
TSA促进oxtr和avpr1a的组蛋白乙酰化
在TSA处理后同居后OTR的mRNA和蛋白质水平的增加表明TSA可能增加了转录。 OXTR，编码OTR的基因，而不是改变蛋白质的翻译或转换。 此外，Ncc中V1aR蛋白水平较高，与TSA处理后mRNA水平略有但无显着增加相关（图。 2）。 考虑到TSA是一种强大的I类和II类HDAC抑制剂23, 24, 27，我们假设TSA增加了组蛋白的乙酰化 OXTR 和 avpr1a NAcc中的启动子，然后增强他们的转录。 收到一批新动物 侧脑室。 注射TSA（0.4 ng）并且在被处死之前立即与没有交配的雄性同居30分钟。 根据先前的工作选择30-min时间窗口，报告在大鼠和小鼠局部TSA注射后组蛋白乙酰化的最大增加28, 29。 H3K14乙酰化 OXTR 和 avpr1a 然后通过染色质免疫沉淀分析启动子。
与先前观察到的OTR mRNA和蛋白质水平的增加一致，TSA处理的动物在组蛋白H460乙酰化中表现出非常高的增加（+ 3％）。 OXTR 在NAcc中，与CSF处理的对照相比，基因启动子（t10 = 5.88， P = 0.0002），但不是尾状壳核（t9= 0.31， P = 0.76， 图3a）。 而且，组蛋白H3乙酰化了 avpr1a 在NACA中TSA给药后，启动子30 min显着升高（+ 196％）t10 = 3.12， P = 0.01）但不是尾状壳核（t9= 0.38， P 与CSF处理的对照相比（0.71）图3b）。 因此，TSA早在与男性同居开始后的30分钟时就在NAcc中特异性地增加了组蛋白乙酰化位点。
TSA通过OTR和V1aR促进合作伙伴偏好
从前一组实验中，出现了一种分子动作模型，其中在同居期间，TSA增强了组蛋白的乙酰化作用。 OXTR 和 avpr1a 启动子，此后增强它们的转录并导致在同居期开始后高达1小时的更高的OTR和V9aR蛋白水平。 重要的是，这种TSA效应是位点特异性的，因为尾状壳核不受影响。 在这里，我们测试了这种TSA诱导的OTR和V1aR的增加是否与促进伴侣偏好形成有关。 雌性草原田鼠接受了NAAC内注射TSA（0.04n有或没有预先注射（在TSA注射前30分钟，0.5）n每侧含有g的CSF或CSF，其含有两种不同的OTR拮抗剂之一，OTA（B）和OTA（T），或V1aR拮抗剂（V1aRA）。 在TSA注射后，女性与男性同居6小时而不交配，然后进行伴侣偏好测试。
CSF治疗的动物未表现出伴侣偏好（t5 = 0.17， P = 0.87， 图4a）。 然而，TSA治疗的动物与“伴侣”并肩接触的时间明显多于“陌生人”，这表明直接进入NAcc的单次TSA注射足以促进伴侣偏好形成而不交配（t5 = 7.04， P = 0.0009）。 有趣的是，通过OTA（B），OTA（T）或V1aRA预处理阻断OTR或V1aR可防止TSA的影响（P 所有组> 0.05。 由于在运动活动方面没有发现群体差异（F4,32 = 1.89， P = 0.14， 图4b），这些数据表明NAcc中的TSA通过OTR-和V1aR-介导的机制以行为特异性方式促进伴侣偏好的形成。
交配诱导与TSA类似的神经适应
根据我们先前的观察，我们确定雌性NAcc中催产素和加压素神经传递的表观遗传增强足以促进在没有交配的情况下形成伴侣偏好。 为了研究这些神经适应是否也发生在伴侣偏好的自然形成过程中，在交配的情况下，雌性草原田鼠在24小时内与雄性同居，这诱导了伴侣偏好4并且牺牲了。 我们观察到NAcc中OTR和V1aR mRNA和蛋白水平的增加与性初始女性相比（OTR：+ 38％， t10 = 2.68， P = 0.02表示mRNA，+ 58％， t8 = 3.05， P =蛋白质的0.01; V1aR：+ 89％， t14= 2.53， P = 0.02表示mRNA，+ 26％， t20 = 2.23， P =蛋白质的0.037， 图5a，b).
由于OTR和V1aR的mRNA和蛋白质水平通过与交配同居而增加，我们接下来研究了这种上调是否与表观遗传增强有关。 OXTR 和 avpr1a 基因转录。 因此，新一批雌性在6小时与雄性同居，其中交配和H3K14乙酰化 OXTR 和 avpr1a 通过染色质免疫沉淀测量启动子。 与OTR和V1aR mRNA和蛋白质水平一致，雌性草原田鼠表现出更高的H3K14乙酰化。 OXTR 和 avpr1a 与性生稚女性相比，NAcc的推动者（OXTR: t9 = 2.64， P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91， P = 0.017 图.5c，d）。 这些数据表明，在TSA处理后观察到，通过表观遗传机制，在雌性草原田鼠中可靠地诱导伴侣偏好的同居范例触发了NACC中OTR和V1aR表达的上调。
讨论
在本研究中，我们首次报告了伴侣偏好形成的表观遗传调控。 首先，我们证明通过施用HDAC抑制剂增加NAcc中的组蛋白乙酰化有助于在没有交配的情况下在成年雌性草原田鼠中形成伴侣偏好。 T母鸡，我们公开了直接证据表明女性的伴侣偏好形成是表观遗传驱动的，因为同居和与男性交配增加 OXTR 和 avpr1a 通过增强NAcc中的组蛋白乙酰化来进行基因表达。 在NAcc中的TSA施用诱导了伴侣偏好并且导致NAcc中更高水平的OTR mRNA和蛋白质。 此外，尽管全球组蛋白H3乙酰化在TSA处理的雌性中未受影响，但组蛋白乙酰化显着增加。 OXTR 早在TSA给药后30分钟就观察到NAcc中的启动子。 最后，阻止NAcc中的OTR足以阻止TSA促进的伴侣偏好. 由于在与交配同居后检测到类似的表观遗传驱动的修饰，在已知诱导伴侣偏好的程序下，我们的数据提出了社会行为的表观遗传调控模型。 D与男性，TSA或交配同居，迅速诱导特定的组蛋白H3乙酰化 OXTR NAcc中的启动子增强其转录，导致更高的OTR mRNA和蛋白质水平，此后促进伴侣偏好的形成。
在雌性草原田鼠中，与没有交配的雄性同居的6小时不会诱导伴侣偏好形成4这种行为范式已被用于检验药理学操作对诱导伴侣偏好的影响5。 在我们的研究中，虽然盐水或CSF处理的对照没有发展伴侣偏好，但用NaB或TSA处理的雌性草原田鼠确实如此。 由于NaB和TSA都不影响整体运动，它们对伴侣偏好的影响似乎是行为特异性的，而不是对运动的次要影响。 我们的分子观察进一步证实了TSA的这种特异性作用。 确实，虽然管理 侧脑室我们能够检测到NAcc中基因表达的特定改变，而不是相邻结构中的尾状核壳。 此外，即使在NAcc内，D1R和D2R mRNA和蛋白质水平仍未受影响。 对于像TSA这样影响I类和II类HDAC的广泛HDAC抑制剂，这种特异性似乎是令人惊讶的。 然而，据报道，TSA仅影响哺乳动物基因组中一小部分基因的表达30–32，包括在老鼠中20.
我们在这里证明了组蛋白H3在Lys14上的乙酰化 OXTR 启动子，与增强的基因转录相关的修饰，包括在脑可塑性期间33, 34，强调更高的OTR mRNA和蛋白质水平。 针对TSA，组蛋白的乙酰化作用 OXTR 启动子增加并促进其在人细胞系中的转录的激活22，支持我们的发现 OXTR 可以进行表观遗传学调控。 由于NAcc中局部阻断OTR足以阻止TSA的行为影响，我们的数据表明在同居期间TSA诱导的NATR中OTR的表达介导了伴侣偏好形成的促进。 此外，24与交配同居的小时数，已知可以在雌性草原田鼠中可靠地诱导伴侣偏好的程序，诱导了雌性NAcc中OTR表达的类似增加。 这与已知的催产素及其受体参与雌性田鼠中伴侣偏好形成的神经生物学完全一致。 交配诱导NAcc中细胞外催产素水平的增加25在没有交配的情况下，将催产素局部输注到NAcc中有助于形成伴侣偏好8。 此外，OTR拮抗剂阻断由催产素施用或交配诱导的伴侣偏好形成8, 35。 重要的是，女性NAcc中病毒介导的OTR过表达足以促进伴侣偏好的形成12, 13.
除了加强OTR的作用外，我们的结果还提供了在没有交配的情况下与雄性同居期间通过表观遗传机制激活OTR基因表达的证据。 实际上，虽然不足以诱导伴侣偏好，但这种没有交配短时间的同居激活了伴侣偏好形成的神经生物学过程. 例如，两个小时的自由接触男性会导致女性NAcc中催产素释放的轻微但非显着的升高。25。 因此可以提出TSA或NaB加强与男性同居诱导的神经适应，促进伴侣偏好的发展。 有趣的是，已经在啮齿类动物中报道了这种增强作用，其中I类和II类HDAC抑制剂（包括NaB和TSA）促进了不会导致对照动物长期记忆形成的学习事件的巩固。36, 37. 为了支持这一概念，需要更长时间的同居（例如。，48hours）即使在没有交配的情况下也可以诱导伴侣偏好4. 值得注意的是，通过与TSA处理同居后观察到的相同的表观遗传机制，在雌性NAcc中引发与交配的同居触发OTR和V1aR表达的上调，这表明TSA和交配影响相同的途径以促进伙伴偏好形成。 重要的是，在没有与雄性同居的情况下，TSA不会诱导雌性NAcc中OTR和V1aR的上调。 总而言之，这支持了这样的假设：TSA通过与男性同居自然引发的内源性神经适应的增强促进伴侣偏好的形成，而不是激活其自身的这些或不同的神经适应。
O你的研究还强调了NAcc V1aR在女性伴侣偏好形成中的关键作用，因为TSA治疗的动物表现出更高的V1aR水平，其阻断阻止了TSA促进的伴侣偏好形成。 此外，这些影响与更高的组蛋白乙酰化有关 avpr1a 尽管V1aR mRNA可能由于非最佳时间点而没有显着升高，但是启动子。 虽然我们不能排除TSA通过非组蛋白乙酰化对蛋白质稳定性的调节38，这一发现表明，类似于 OXTR 推动者，TSA可能会促进 avpr1a 通过局部组蛋白乙酰化转录。 虽然已经描述了AVP在雄性对结合中的贡献5，它在女性行为中的作用仍存在争议。 一方面，一个 侧脑室。 AVP注射有助于在雄性和雌性田鼠中形成伴侣偏好，这可以通过阻断V1aR或OTR来防止39. 另一方面，一个 侧脑室。 V1aR拮抗剂的注射阻断了雄性中交配诱导的伴侣偏好，而不是雌性，草原田鼠40。 然而，所有这些研究都使用了 侧脑室。 注射，防止进一步了解所涉及的结构。 在这里，我们提供了第一个证据，证明NAcc中的AVP神经传递可以参与雌性田鼠中的伴侣偏好形成，而大多数文献描述其参与不同区域，例如腹侧苍白球，侧间隔，床核。 stria terminalis和雄性杏仁核5. 因此值得注意的是，女性NAcc中OTR或V1aR的阻断足以阻止TSA治疗后伴侣偏好的形成，这表明伴侣偏好的形成需要激活V1aR和OTR。。 ţ他的发现符合并支持男性草原田鼠的早期观察，即LS中同时获取OTR和V1aR对AVP诱导的伴侣偏好至关重要6. 此外，在TSA处理的动物中观察到OTR和V1aR水平的特异性增加进一步支持了对配对结合的AVP和催产素神经传递同时激活的要求。
与催产素和AVP联合使用，NAcc中的多巴胺神经传递调节雌性田鼠的伴侣偏好形成9. 虽然交配诱导NAcc中的多巴胺释放9，受体水平的变化仅在延长的时间后观察 - 长于24h-与交配同居，对维持配对结合很重要10。 与这些观察结果一致，用TSA处理的雌性草原田鼠确实表现出伴侣偏好，而多巴胺D1R和D2R受体没有显着变化。 因此，这种多巴胺受体调节的缺失为TSA的特异性提供了另一个证据。
我们的数据首次报道了配对结合神经生物学中的表观遗传成分，并表明TSA在雌性草原田鼠中诱导“允许状态”，增强对同居的自然分子反应，并促进更强大的社会相互作用的形成导致合作伙伴偏好。 因此很有可能假设TSA促成的合作伙伴偏好可以进一步加强并导致持久的联系。 虽然所涉及的特定HDAC仍有待鉴定，但因此有必要进一步研究TSA对草原田鼠一夫一妻生活策略相关的其他行为的影响，如选择性攻击和双亲护理。 考虑到草原田鼠在模拟人类配对结合的神经生物学机制方面的相关性5，有希望的HDAC抑制剂已经在临床试验中24, 41, 42，我们的数据为影响社会行为的新药理学可能性铺平了道路。
方法
主题
性天真的女性草原田鼠（Microtus ochrogaster）来自实验室的繁殖群在21天龄断奶，并在塑料笼中保持同性同胞对（12×28×16 cm），并提供水和食物 随意。 所有笼子保持在14：10 h光暗循环下，温度约为20℃。 当它们达到70-90天龄时，将所有动物随机分配到实验组中。 使用的动物数量基于我们小组和其他人在该领域的先前研究，并结合功效分析。 实验程序由佛罗里达州立大学的机构动物护理和使用委员会批准。
毒品
溶解在盐水中的丁酸钠（NaB）和溶解在人造脑脊髓液载体（CSF，BioFluids，Rockville，MD）中的曲古抑菌素A（TSA）均购自Sigma-Aldrich（St Louis，MO）。 腹腔注射NaB（IP） 剂量为600 mg / kg，已知其在小鼠的几种脑结构中诱导组蛋白乙酰化43, 44。 同样，用于TSA的剂量范围基于先前的工作，确定其在诱导局部组蛋白乙酰化事件和啮齿动物基因表达变异方面的有效性。19, 20。 选择性V1aR受体拮抗剂V1aRA， d（CH2)5[Tyr（Me）] AVP和OTR拮抗剂OTA（B），[d（CH2)5，Tyr（Me）2，是的4，Tyr-NH29] -OVT），得自Bachem（Torrance，CA）。 第二种更具选择性的OTR拮抗剂OTA（T）， d甘氨酸 - NH2–d（CH2)5 [酪氨酸（Me）的2，苏氨酸4] OVT45，由莫里斯曼宁博士（俄亥俄州托莱多大学）友情提供。 使用这些拮抗剂和剂量是基于先前的研究选择的，分别证明了它们对V1aR或OTR的选择性。35, 39, 46–49.
立体定向插管和显微注射
女性用戊巴比妥钠（1mg / 10g体重）麻醉，26规格不锈钢导管（Plastics One，Roanoke，VA）立体定位植入，针对侧脑室（单侧;鼻梁位于-2.5 mm，0.6 mm）嘴侧，1.0 mm侧，2.6 mm腹侧至前囟）或位点特异性至NAcc（双侧;鼻杆在-2.5 mm，1.7 mm嘴侧，±1.0 mm双侧，4.5 mm腹侧至前囟）。 在3天恢复后，受试者接受含有不同浓度TSA的CSF或CSF的显微注射。 当使用OTR或V1aR的选择性拮抗剂时，在TSA之前将它们注射30分钟。 使用33测针进行注射，将1 mm延伸到引导插管下方，进入目标区域，注射体积为500 nL，进入侧脑室（侧脑室。）或200 nL每侧进入NAcc。 通过聚乙烯-20管将针连接到Hamilton注射器（Hamilton，Reno，NV），并且缓慢进行柱塞压下，每次注射需要1分钟。 在实验结束时，通过快速断头处死所有受试者并且提取脑以通过盲目实验条件的观察者验证套管放置。 具有错位插管的受试者被排除在数据分析之外。
同居和伴侣偏好测试
紧随其后 IP., 侧脑室或者在NAcc内注射药物，雌性与男性同居6小时而没有交配。 通过检查录像行为来验证没有交配。 对于与交配，雌激素引发的雌性同居引发的神经适应症的调查（每天2μg， IP。对于3天，在6或24小时内与雄性同居，并确认交配的存在 事后 在录像带上（在同居的第一个6小时内从11到6回合）。
如前所述，在6小时同居之后立即进行伴侣偏好测试11。 简而言之，三室测试仪由一个与两个平行的相同笼子相连的中性笼子组成，每个笼子中都饲养着刺激动物-陌生的男性“陌生人”或同居期间使用的熟悉的“伴侣”。 在3小时的测试中，女性受试者可以自由移动到整个仪器中，而男性刺激者则被束缚在笼子内，彼此之间不得直接接触。 记录了整个会话，随后由训练有素的实验者不了解生物学组的对象量化了对象与伴侣或陌生人并排接触的持续时间。 伴侣的偏好被定义为受试者与伴侣比陌生人花费更多的时间与伴侣进行身体接触，这取决于配对，两尾 t-测试。 此外，三室装置配备有光束传感器，允许确定由雌性进入刺激室的进入次数表示的运动活动。 因此，这种运动评分允许我们控制药物对女性行为的假定的次要影响，例如一般活动，焦虑或改变对新环境的探索，如我们小组和其他人常用的那样。12.
RNA和蛋白质提取
通过快速断头处死雌性，立即提取脑并在干冰上冷冻。 在低温恒温器上切割冠状切片（200μm）并将霜固定在显微镜载玻片上。 从整个NAcc和尾状壳核中取出具有1 mm直径的双侧组织冲头，后者是对照区域，并且在-80℃下储存直至处理。 根据制造商的说明书（Molecular Research Center，Cincinnati，OH），使用TRI-Reagent方案提取总RNA和蛋白质。
通过Western印迹分析蛋白质表达
在10％聚丙烯酰胺凝胶（15％用于组蛋白）上分离后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与以下一抗孵育：抗OTR（sc-8102，1：1000）， - VHNUMXaR（sc-1， 18096：1）， - D500R（sc-1，33660：1）， - D1000R（sc-2，9113：1，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）， - 肌动蛋白（A1000，2066：1，Sigma Aldrich。 St Louis，MO），或抗乙酰基组蛋白H1000（Lys3，＃14-06，911：1）和总H1000（＃3-05，928：1，Millipore，Temecula，CA）。 所有抗体都经过验证可用于人类，大鼠和小鼠，其中草原田鼠的同源性百分比很高（从1000到81％）。 在与HRP缀合的二抗杂交后，用ECL（ECL SuperSignal West Dura底物，Pierce Biotechnologies，Rockford，IL）显示膜，并暴露于Fuji XAR膜（Fuji Film，Tokyo，Japan）上。 使用AIS 96 Image软件（Imaging Research，St.Catharines，Ontario，Canada）进行定量，并且在相同的膜内将所有信号归一化至肌动蛋白，除了乙酰基-H6.0信号，其被归一化至总组蛋白H3信号。 然后将标准化数据表示为CSF处理的动物的百分比。
半定量实时聚合酶链反应（RT-PCR）
处理0.5μg总RNA用于互补DNA合成，然后如前所述进行分析50 与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADH）基因正常化。 所有反应一式三份进行，并通过熔解曲线分析和在2％琼脂糖凝胶上分离来验证它们的特异性。 使用的引物序列如下：5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3'（Fwd）和5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3'（Rev）用于OTR，5'-GAGGTGAACAATGGCACTAAAACC-3'（For）和5'-CCAGATGTGGTAGCAGATGAAGC-3' （Rev）for AVP1aR，5'-TTAACAACAATGGGGCTGTG-3'（For）和5'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-3'（Rev）for D1R，5'-GTGAAGGCGCTGTAGAGGAC-3'（For）和5'-CGGTGTGTTCATCATCTGCT-3'（Rev） ）用于NADH的D2R和5'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-3'（For）和5'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-3'（Rev）。 标准化数据表示为CSF处理动物的百分比。
染色质免疫沉淀
按照制造商的说明，使用Magna ChIP蛋白G组织试剂盒（Millipore，Temecula，CA）分析NAcc和尾状壳核组织穿孔中的组蛋白H3乙酰化（Lys14）。 简而言之，在用1％甲醛交联后，使用Misonix XL-2000将染色质剪切到200-600 bp的片段上。 然后用3μg的抗乙酰基-H14（Lys10）抗体（Millipore）在3℃下实现乙酰化组蛋白H14（Lys4）的免疫沉淀过夜。 洗涤后，从珠中洗脱并逆转交联，纯化免疫沉淀的DNA，并在iCycler平台（参见上文）上通过RT-PCR一式三份分析，其中内标曲线由合并的INPUT样品制备。 设计引物以扩增位于编码草原田鼠OTR的第一个外显子上游的236 bp的128 bp长区域（OXTR，Genbank加入＃AF079980）或192 bp-long区域位于编码草原田鼠V141aR的第一个外显子上游的1 bp（avpr1a，Genbank加入＃AF069304）。 序列如下：5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3'（Fwd）和5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3'（Rev） OXTR和5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3'（Fwd）和5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3'（Rev） avpr1a。 通过各自的INPUT值对每个样品进行标准化，然后将数据表示为CSF处理的动物的百分比。
统计分析和数据处理
对于伴侣偏好的分析，排除了在同居期间表现出交配行为的动物或错位的套管。 对于所有其他分子分析，当被识别为异常值时，每个生物组最多排除一个数据点。 除非结果非常清楚，否则大多数实验都会被复制。 在伴侣偏好测试期间与刺激动物并排接触所花费的时间用双尾配对进行分析 t-测试。 使用双尾分析运动评分 t- 测试（针对两组）或单因素方差分析（针对两组以上），并在适当时，Fischer的PLSD 事后 测试的显着性阈值为 P <0.05。 在验证正态性之后，所有其他数据都进行了两尾分析 t-test假设事先测试的方差相等或不等。 使用StatView软件（SAS Institute）进行所有统计分析。 当数据标准化为各自的对照（CSF，盐水或交配组的百分比）时，对原始数据进行统计分析。
致谢
这项工作得到了国家心理健康研究所（NIMH）的支持，MHR21-083128授予MK和ZW，MHR01-058616授予ZW我们也感谢Maurice Manning博士慷慨赠送的OTR拮抗剂OTA（T）。
脚注
利益冲突： 作者宣称没有利益冲突。
作者贡献
HW，FD和YL进行了实验。 HW和FD分析了数据。 HW，FD，ZW和MK设计了这项研究。 FD，ZW和MK写了这篇论文。 所有作者都讨论了结果，并对手稿发表了评论。
参考资料
;
