Tracey J. Shors , 克里希纳托布伦 , 吉娜迪菲 , 德米特里·M·达勒姆 & 韩燕M. Chang
Scientific Reports 6，物品编号：18960（2016）
DOI：10.1038 / srep18960·
抽象
女性从青春期进入青年成年期，性侵犯可能会破坏与学习相关的过程。 为了在实验室研究中模拟这些经验，我们开发了SCAR，代表性别特异性攻击性反应。 在青春期，一名啮齿动物的雌性每日与30-min配对，与性经验丰富的成年男性配对。 在SCAR经历期间，当男性从针脚逃脱时，男性追踪女性的肛门生殖器区域。
在经历期间和之后，应激激素皮质酮的浓度显着升高。 此外，在整个青春期暴露于成年男性的女性在使用联想学习任务的训练期间表现不佳，也没有在母亲致敏期间表达母亲行为的良好学习。 大多数接触成年男性的女性在17天期间没有学会照顾后代。 最后，不表达母体行为的雌性在其海马体中保留较少的新生细胞，而那些表达母体行为的细胞保留了更多细胞，其中大部分细胞在数周内分化为神经元。 这些数据共同支持SCAR作为一种有用的实验室模型，用于研究青春期和青年期女性大脑的性侵犯和创伤的潜在后果。
介绍
全世界30％的女性在其一生中经历过某种身体或性暴力1和少女一般比一般人更容易成为强奸，强奸未遂或性侵犯的受害者2。 在大学期间，每四名本科女性中就有一名经历过性侵犯和暴力，大多数是在新生和大二学生中3。 此外，患有精神疾病的人，特别是那些贫穷和无家可归的人，在街头生活时特别容易遭受性侵犯和暴力。4,5。 无论何时何地，性侵犯和虐待都是生活经历中最具压力和创伤的事件之一，往往导致成年后出现负面情绪，焦虑，学习障碍和抑郁症。6,7,8。 尽管女性性创伤与精神健康障碍之间存在着不可否认的联系，但我们对性攻击和相关经历如何改变女性大脑知之甚少。 其中一个原因是因为没有确定的动物模型来研究性创伤对女性行为和神经功能的影响。
实验室研究中的大多数压力模型依赖于暴露于束缚压力，游泳压力或厌恶冲击，这不一定反映年轻女性在现实生活中经历的压力源的种类和类型。 尽管如此，使用这些和类似的模型，我们发表了大量研究表明雌性啮齿动物的反应与雄性啮齿动物对实验室压力的反应非常不同9。 例如，在接触雄性啮齿动物的实验室压力因子后，经典条件预期反应的联想学习得到加强，但在雌性啮齿动物中严重受损10,11。 女性的这些学习缺陷伴随着海马中突触刺密度的降低。 由于压力导致的女性学习缺陷取决于许多大脑区域的神经元活动，最值得注意的是前额皮质的海马，杏仁核和前肢区域。12,13.
人们通常认为，实验动物的压力学习和神经功能的影响反映了经历压力性生活事件的女性可能发生的变化。 对于许多物种的女性和女性而言经常发生的一种经历是性侵犯，并且如所指出的，这些厌恶女性的经历可能导致心理健康并发症，以及分散过去的思想和反思，妨碍她们学习和集中注意力的能力。 即使是那些没有继续患有精神疾病的女性，性创伤经历也会给她们的生活带来持久的印象，可能是通过改变与学习和记忆相关的神经元过程。 如果我们要充分了解在性侵略期间女性大脑内激活的必要和充分的神经元和行为机制，我们必须建立一个实验室模型。 为了满足这种需要，我们开发了一种动物模型，称为性别特异性攻击反应（SCAR）。 在SCAR模型中， 我们专注于女性，因为她从青春期过渡到青年期，因为这是女性最有可能遇到性侵犯性成年男性的时期。 We也出于实际原因选择了这个时间段; 由于阴道腔未完全打开和/或动情周期未完全发育，青春期雌性大鼠不能完全交配和/或繁殖。 因此，与成年男性的互动不会产生后代。 为了模仿与成年雄性的新型相遇，将青春期雌性Sprague Dawley大鼠（出生后日35）暴露于经历性行为的成年雄性大鼠的30-min，其背景不同于它们的任一家笼。 这些遭遇是通过视频录制的，以便对与侵略和接收相关的行为进行评分。 成年雄性没有被选中进行攻击，而是来自已建立的殖民地的有性生活经验的繁殖者。 在实验期间，年轻女性暴露于两个不同的成年男性，一次一个，每隔一天交替，在整个青春期。
在以下实验中，我们描述了交互过程中发生的行为并报告了这些交互的后果。 对于这些初步研究，我们关注生理应激反应，因为确定经验对雌性啮齿动物有压力是很重要的。 测量应激激素，皮质酮的浓度，因为其高度表明下丘脑 - 垂体 - 肾上腺（HPA）轴的激活，这是哺乳动物物种的主要应激反应。 接下来我们研究了SCAR经验对学习的影响. 我们选择了经典条件下的眨眼反应，因为如上所述，暴露于标准实验室压力因素会破坏成年女性的这种学习方式。 我们也选择了这项任务，因为这种类型的学习同样会因接触成年男性而中断14。 因此，如果SCAR经验破坏了对这种反应的学习，可以得出结论，与男性的社交互动引起对更典型的实验室压力源（游泳压力，尾部刺激）的类似反应，并且该效应可以从青春期延伸到成年期。 。 在另一组实验中，我们研究了社会互动对女性母性行为表达的影响。 母亲关怀行为的发展和“学习”可以说是女性获得的最重要的功能，即使不是最重要的功能。 同样，目标是评估与对女性有意义的行为直接相关的潜在结果，同时也影响大多数物种的生存。
作为最终的依赖性测量，我们考虑了SCAR经验对海马神经发生的潜在影响。 海马体在整个生命过程中产生新的神经元 - 每天数千只，在青春期时几乎是其两倍15。 除非出现新的学习经验，否则这些新神经元中的许多会在生成后的几周内死亡16,17。 保持新神经元存活的学习类型包括痕量调节，空间导航学习和运动技能学习17,18,19。 学习对青春期细胞存活的影响与成年期相似，但由于产生了更多的细胞，学习（或不学习）脑完整性的后果尤为深远。 在本实验中，我们假设SCAR对母体行为表达的影响会破坏海马中新生细胞的存活。 目标是在女性大脑中建立一个最终受到与成年男性反复遭遇影响的结果测量。
方法
在线方法
雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠在罗格斯大学（Rutgers University）的心理学系（Departmet of Psychology）中繁殖。 出生后28天，将动物断奶并放入标准塑料鞋盒式笼子中的2-3雄性和2-4雌性鞘中（44.5 cm长×21.59 cm宽×23.32 cm高）。 母亲研究中的女性单独被安置。 给动物食物和水 随意 并保持在12：12 hr光暗循环; 光周期从7am开始，以7pm结束。 所有处理和实验操作都在昼夜循环的轻微部分进行。 实验完全符合PHC关于人类护理和实验动物使用政策以及实验动物护理和使用指南的规定和规定。 罗格斯大学动物护理和设施委员会批准了所有程序。
实验1：SCAR期间表达了什么行为？
当青春期雌性为产后日（PND）35时，SCAR暴露开始，而雄性繁殖者的年龄从大约120-160天大不等。 该年龄范围内的雌性体重在120-220-g之间，而雄性体重在400-700-g之间。 在实验操作期间，将一只青春期雌性大鼠（n = 10）置于具有成年性经验雄性大鼠的新笼中，用于30-min。 将配对期间的行为与青春期雌性大鼠（n = 10）和成年雌性大鼠之间的类似配对期间的行为进行比较。 无论个人配对如何，所有条件都相同。 每天发生的暴露连续八天。 青春期的雌性暴露于每天交替的两个成年人中的一个。 所有互动都是视频录制，行为由两名独立实验者手工评分。
很少发生性插入，因此，此处未提供数据。 我们计算并分析了三种行为如下：1）肛门生殖器追踪，2）针脚和3）逃逸。 在肛门生殖器追踪事件中，雄性在笼子周围奔跑时被追踪，大概是在嗅探雌性的生殖器区域。 当雄性的鼻子连续或几乎接触雌性的肛门生殖器区域（> 1-sec）时，我们考虑了这种跟踪行为。 成年男性在别针期间，通常可以坐在雌性上或将其翻过身，然后用爪子将她压下，从而有效地约束雌性。 在逃脱行为中，雌性坐在她的后爪上，伸手抓住笼子的顶部，好像在试图逃脱一样。 在30分钟内以10分钟为间隔计算这三种行为。 如上所述，将这些行为与成年女性（女性/女性）配对时，由青春期女性表达的相同行为进行了比较。
结果实验1
在第一次SCAR暴露期间，与成年雌性大鼠与青春期雌性（雌性/雌性）组配对的相似行为相比，成年雄性（成年雄性/青春期雌性; SCAR）表达的肛门生殖器追踪数量显着增加（t(18) = 6.07; p <0.001； 图1A）。 在与成年男性的交互过程中，青春期女性表达的逃避行为的数量也大于成年女性（t(18) = 6.94; p <0.001； 图1B）。 当青春期雌性与成年雄性相互作用时，与成年雌性相互作用时，针数的数量更多（t(18) = 5.77， p <0.001； 图1C）。 在8期间分析了这些相同的行为th 连续一天的同种暴露。 在第一次暴露期间，肛门生殖器追踪数量增加（t(18) = 10.51; p <0.001； 图1D），逃避行为（t(18) = 6.09; p <0.001； 图.1E）和针数（t(18) = 5.57; p <0.001； 图1F）。 这些行为的次数在第一次和第八次暴露之间没有变化（p> 0.05）。 这些结果表明，所记录的行为不习惯于两个具体个体之间持续的社会互动。
图1：SCAR暴露的行为测量。
(A）在第一次SCAR暴露期间，SCAR（成年男性/青春期女性）组中肛门生殖器嗅觉的数量显着大于与另一位女性（女性/女性）配对的女性。 （B）在第一次接触时，女性在与成年男性配对时比在与成年女性配对时产生更多的逃避行为。 （C成年男性也将青春期女性比成年女性多下来。（D–F这些行为结果在第八次暴露期间是相似的。 SCAR组接受了更多的肛门生殖器嗅觉，与青春期与成年女性配对时表达的类似行为相比，发出更多的逃避行为和针脚。
实验2：SCAR暴露会增加皮质酮吗？
在第二个实验中，我们分析了两个时间点SCAR暴露对应激激素皮质酮浓度的影响。 首先，我们比较了暴露于成年男性后暴露于青春期女性30-min中的皮质酮与暴露于成年女性之间的量。 将青春期雌性暴露于成年雄性育种者（n = 6）或成年雌性（n = 5，PND 60-120）用于30-min，并且在单次暴露后，后续采集30-min的躯干血液。 给动物施用致死剂量的戊巴比妥腹膜内注射并收集躯干血液。 将血液转移到肝素管（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）中，以2500 RPM离心20-min并在-20℃下储存。 根据制造商的方案（Corticosterone EIA Kit，Arbor Assays，Ann Arbor，MI）进行皮质酮免疫测定。 在不同的组中，将青春期雌性暴露于成年雄性30-min（n = 8）或单独置于新的笼中用于30-min（n = 7）。 将暴露于成年雄性的青春期雌性的血液中的皮质酮浓度与响应于新的背景释放的量进行比较，这对于啮齿动物来说是轻微的压力。 在相互作用停止后两小时，如上所述给予雌性致死剂量的戊巴比妥，并收集血液用于皮质酮浓度的放射免疫测定。
结果实验2
SCAR的经历给女性带来了压力，正如压力激素皮质酮浓度升高所表明的那样，压力激素皮质酮在紧张的经历中从肾上腺释放出来。 与第一次接触成年男性后的青春期雌性30-min相比，在新环境中与成年女性一起放置的浓度相比，浓度升高（t(13) = 2.59; p <0.05； 图2A）。 在一项单独的实验中，暴露于成年雄性30-min的青春期雌性中的皮质酮浓度在两小时后升高，与青春期雌性中的浓度相比，单独留在30-min的新环境中并返回到家笼中（t(9) = 3.07， p <0.05； 图2B）。 这些数据表明，与异性的社交互动比与同性的互动压力更大，压力更大，而不是单独留在新的环境中，至少在青春期的雌性啮齿动物中。
图2：SCAR增加压力荷尔蒙并破坏学习。
(A与与成年雌性配对的青春期雌性的浓度相比，在暴露于成年雄性后30分钟，青春期雌性中的皮质酮浓度显着升高。 （B两小时后，在与成年雄性成对的青春期雌性中，与在新的背景下的青春期雌性中的浓度相比，浓度升高。 （C在暴露于成年男性的女性中评估学习经典条件的眨眼反应。 与未接触成年男性（无SCAR）的雌性相比，那些雌性（SCAR）中的微量调节期间的表现降低。 虚线表示60％学习标准，其被建立为成功学习条件反应的量度。
实验3：SCAR会破坏青春期女性的联想学习吗？
在第三个实验中，我们使用跟踪程序检查了SCAR暴露对学习经典条件眨眼反应的影响。 来自眼睑的肌电图（EMG）活动用于评估通过肌肉的眨眼活动。 将电极植入眼睑周围以提供无条件刺激（US）。 在手术期间，啮齿动物注射戊巴比妥钠（35mg / kg），其中补充有异氟醚吸入剂。 将两对电极（绝缘不锈钢丝0.005 in。）连接到头部阶段并通过上眼睑（眼轮匝肌）植入。 从每个电极的一部分去除导线周围的绝缘以便与肌肉接触。 头部平台使用四个螺钉定位并用牙科丙烯酸固定。 手术后，将大鼠保持温暖并观察，直至麻醉恢复。 给予大鼠儿童对乙酰氨基酚（浓度为32mg / ml），手术后以112mg / kg剂量口服给药，并在训练前至少恢复2天。
在PND 35，雌性青春期大鼠（n = 6）每天暴露于成年有性经验的雄性30-min，或者单独放置（n = 6）在笼中用于30-min。 在第五次SCAR暴露后，如上所述进行眨眼电极手术。 恢复两天后，雌性每天再次暴露于成年雄性（SCAR）或单独留在没有雄性的笼子中（无SCAR）。 在第8天，将每个雌性暴露于雄性30-min，然后从SCAR暴露中取出并转移到调节室。 将电极连接到记录设备上，使它们适应训练装置一小时。 第二天，每个女性像以前一样接触成年男性，然后接受200痕量调理试验。 该过程重复四天，共进行800训练试验。
使用痕量调节程序，在此期间训练动物以学习白噪声条件刺激（CS）和眶周眼睑刺激的无条件刺激（US）之间的时间关系。 白噪声以80 dB递送250 ms，以500 ms跟踪间隔分开，并以0.5 mA刺激眼睑结束100 ms。 在每个试验（不包括美国）中记录EMG活动，以评估和分析自适应眨眼反应的百分比（在追踪间隔期间发生的那些）。 响应于CS的眨眼被评估为来自基线EMG响应的幅度和持续时间的显着变化。 如果EMG活性超过10-ms，0.3-mV，则计数眨眼，并且比基线预刺激EMG响应至少多三个标准偏差（SD）。 在500-ms追踪间隔期间和美国之前发生的那些响应被认为是条件反应（CR）。 如上所述，所有大鼠每天都进行200试验，连续4天。 在四天的过程中在任何一个疗程中排出至少60％条件反应的动物被认为已经学习了CR。
结果实验3
使用8个100试验块的性能作为依赖性测量，进行重复测量ANOVA。 正如预期的那样，培训的主要影响非常显着[F （7,70）= 7.89， p <0.001]，表示CR的数量在块中增加，因此发生了学习。 在前100个试验中，当大部分学习都发生时，暴露于成年男性的青春期女性发出的CR少于未接触成年男性的女性[F（4,40）= 3.28; p ＜0.05]。 在训练的四天中，暴露于成年男性（SCAR）的女性在100个试验的区块中也发出了较少的CR [F（1,10 = 5.78; p <0.05; 图2C）。 这些结果表明，两组都学到了，但是暴露于成年雄性的雌性产生的定时性CR较少（即在跟踪间隔期间）。 最后一天的CR百分比均未增加（p = 0.11），表明学习处于平稳状态； 然而，暴露于成年男性的女性和未暴露于成年男性的女性之间的表现仍然有所不同（p <0.001）。 使用60％响应的任意学习准则进一步分析条件数据。 该标准在图中以虚线显示 图2C 表示60％条件响应。 对照组中的所有雌性（无SCAR; 6 / 6）达到60％800试验的学习标准，而SCAR组仅有50％雌性（3 / 6）。
实验4：SCAR会破坏母体致敏吗？
成年处女女性可以随着时间的推移表达母体行为以应对新生幼崽暴露14,20 通过称为母性致敏的过程。 这些相同的行为表现为女性在青春期，如图所示 图3A。 为了确定SCAR暴露是否减少母体致敏，每个青春期初始雌性大鼠（n = 8）在PND21开始连续几天暴露于成年雄性（SCAR）35。 作为对照，根据相同的时间表将一组青春期雌性（n = 8）各自单独放置在空笼中。 在SCAR暴露的第五天，将PND39，两只新生儿出生后的幼仔（PND 1-10）放置在青春期雌性的家庭笼中，用于24-h。 幼犬出生于非实验性水坝，因此每24小时返回原始水坝进行营养和护理，将24-h与其泌乳水坝一起使用。 新生幼犬的健康状况良好; 如果他们的原始大坝忽视了幼崽，他们就会被从研究中移除。 对于母体行为观察，将幼崽放置在家笼的相对侧，并且在放置后的第一个10分钟观察并记录母体行为。 记录的行为是1）舔/梳理幼崽，2）检索一只或两只幼崽，以及3）幼崽分组。 一旦连续两天表达完整的母体行为，女性就被认为表达了母体致敏。
图3：SCAR破坏了母性行为和敏感性。
(A在青春期（SCAR）暴露于成年男性的青春期女性在17天期间学习表达母性行为的可能性较小。 这些雌性中只有三只（3 / 8）表达了母体行为，而未暴露于成年雄性的所有未处女性都表达了（8 / 8）。 （B）每天计算母亲行为（舔，检索和小组分组）的数量，以获得潜在的总分3。 暴露于成年男性（SCAR）的青春期女性比未暴露于成年男性的女性（无SCAR）表达更少的这些行为。
结果实验4
分析了以下孕产妇行为：舔食，取回和分组幼犬。 每天计算出产妇行为的数量，总分可能为3。重复测量分析暴露于幼崽和SCAR情况的天数方差，表明产妇行为显着增加[F（16）= 8.39; p <0.05； 图3B]以及与SCAR暴露的相互作用[F（1,16）= 2.18; p ＜0.01]。 幼犬接触后0.05天之内，各组之间的行为出现了显着差异（p <8）。 大多数SCAR女性并未表现出全部三种产妇行为，而未暴露于男性的女性（8/5）则通常在7至XNUMX天内表现出母亲行为（图3A).
实验5。 SCAR会破坏海马中新生成的细胞吗？
首先，我们评估了SCAR暴露对SCAR暴露前两小时内齿状回增殖细胞数量的潜在影响。 在单次5-min SCAR暴露之前立即对雌性进行一次腹膜内注射2-bromo-200-脱氧尿苷（BrdU; 30 mg / kg），并在BrdU注射后处死2小时（n = 5）。 将细胞数与注射BrdU的组中的细胞数进行比较，并在两小时后处死（n = 6）。 其次，我们评估了SCAR暴露对在一周内暴露于成年男性后用BrdU标记的细胞数量的潜在影响。 为此，从PND8（n = 35）开始，一组青春期雌性每天暴露于成年男性，连续7天。 他们在6之前注射了BrdUth 暴露（PND 40）并在注射后一周处死。 在PND 4上给予BrdU注射，另一组雌性单独留在其家笼中（n = 40），并在一周后处死。 为了检查SCAR对细胞存活的影响，给一组动物注射BrdU一次，并在注射一次BrdU后21天处死（无SCAR; n = 7）。 将用BrdU标记的细胞数与用BrdU注射的组（SCAR; n = 5）中的数字进行比较，然后在PND30开始的21天中每天暴露于成年男性35-min。
进行免疫组织化学以分析BrdU标记的细胞的数量。 用戊巴比妥钠（100 mg / kg; Butler Schein，Indianapolis，IN，USA）对动物进行深度麻醉，并在4 M磷酸盐缓冲液中用0.1％多聚甲醛经心脏灌注。 提取脑并在4℃下在4％多聚甲醛中后固定24-48-h以保留组织结构，然后转移至磷酸盐缓冲盐水（PBS）。 使用振动切片机在一个半球的齿状回的整个尾端 - 尾部范围内切割40μm冠状切片。 这是我们实验室的标准做法，因为在左右齿状回之间没有观察到半球的增殖差异。21,22。 将每第十二片切片安装在超级玻璃载玻片（Fisher Scientific，Suwane，GA，USA）上并使其风干。 干燥后，使用标准过氧化物酶方法对组织进行染色，以显示如前所述掺入BrdU的细胞22。 用加热的0.1 M柠檬酸（pH 6.0）预处理组织，用0.1 M PBS冲洗，在胰蛋白酶中孵育10-min，并在2N HCl中变性30-min，其间用PBS漂洗。 将组织在原代小鼠抗BrdU（1：200; Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）和0.5％Tween-20（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）中孵育过夜。 第二天，冲洗组织并在生物素化的抗小鼠抗体（1：200，Vector Laboratories）中孵育60-min并置于抗生物素蛋白 - 生物素 - 辣根过氧化物酶（1：100; Vectastain ABC Kit，Vector Laboratories）中用于60 -min。 将组织置于二氨基联苯胺（DAB SigmaFrost片剂，Sigma Aldrich）中4分钟，漂洗，用0.1％甲酚紫复染，脱水，澄清，并用Permount胶（Fisher Scientific）盖上盖子。
通过对每个载玻片进行编码，对实验条件进行定量显微镜分析。 使用修改的无偏立体学方案确定BrdU阳性细胞总数的估计值23,24。 在Nikon Eclipse 1000 i光学显微镜下，在80X上手动计数每个切片（颗粒细胞层和门）的齿状回中的BrdU阳性细胞数。 在载玻片上收集整个海马尾侧尾部的10个切片，并将该数量乘以24以获得两个半球中齿状回中BrdU阳性细胞总数的估计值。
为了评估母体“学习”是否从死亡中拯救了新的神经元和/或SCAR是否会阻止它们的存活，那些暴露于成年雄性（n = 7）或未接触成年雄性（无SCAR; n = 7）的青春期雌性群体先前的实验用BrdU注射一次，并将细胞数与未暴露于幼崽的其他组中的细胞数进行比较（SCAR，n = 5;无SCAR，n = 7）。 如上所述，一周后，正如大多数新细胞将经历程序性细胞死亡一样，母亲对后代开始敏感。 如实验4中所述，每天晚上将雌性与后代一起饲养并记录和分析它们的母体行为。 注射BrdU三周后，给予四组女性致死剂量的戊巴比妥钠，并制备脑用于免疫组织化学和显微镜分析。 由于BrdU注射的性质，这些组中的动物数量小于实验4中呈现的数据。 此外，我们分析了背侧和腹侧海马之间细胞数量的潜在差异。 为了实现这一点，根据耳间坐标将腹侧区域中的BrdU标记细胞与背侧中的细胞进行比较。 背侧海马与来自延髓海马的切片相关（耳间3.70 mm至6.88 mm），而腹侧与来自尾部海马的切片（耳间2.28 mm至3.70 mm）相关，如所述25.
结果实验5
暴露于成年雄性并在2小时或1周后处死的雌性之间，BrdU标记的细胞数量没有差异（p> 0.05; 图4A，B）。 在上述任何一项措施（0.05小时，2周，1周）中，我们均未观察到背侧和腹侧海马之间的任何差异（p> 3）。 同样，仅暴露于成年雄性并没有显着影响存活的BrdU标记细胞的数量（p = 0.94； p = XNUMX； p = XNUMX）。 图4C 和 图5A）。 然而，在母体致敏期间暴露于幼崽的雌性中BrdU标记细胞的数量增加（F(1,25) = 10.03; p <0.005; 图5A）。 这些数据表明，笼中幼崽的存在可能足以增加海马齿状回中新生成的神经元的存活率。 幼犬暴露与SCAR暴露之间的相互作用几乎显着[F（1,22）= 3.66; p = 0.068）。 计划进行的比较表明，未暴露于成年雄性但暴露于幼崽的雌性比未暴露于成年雄性或成年雄性的雌性具有更多的BrdU标记细胞（p = 0.002）。 相比之下，暴露于成年雄性且暴露于幼崽的雌性，其BrdU标记的细胞与未暴露于幼崽的雌性相比，没有明显更多的细胞（p = 0.41）。 在3周时，海马中剩余的细胞数量与在幼崽存在时表达的母性行为数量之间存在显着相关性（r = 0.55; p <0.05）。 在敏化过程中不太可能表达母体行为的雌性保留了较少的新细胞。 因此，SCAR对海马新细胞存活的潜在影响并不一定由SCAR经历本身的压力来介导，而是因为它减少了产妇行为的学习，这确实增加了新生细胞的存活。 这些数据之所以新颖，有两个原因：首先，它们表明暴露于后代可能足以增加海马中新生细胞的存活。 其次，数据表明，SCAR经历通过学习成为母体的缺陷而降低了女性海马中新生细胞的存活。
图4：SCAR没有减少海马中新生细胞的增殖。
(A两小时后，SCAR暴露没有改变新生成的（BrdU标记的）细胞的数量。 （B在BrdU注射后一周内BrdU标记的细胞数量增加，但SCAR暴露没有改变细胞数量。 （C三周后，大多数BrdU标记的细胞不再存在，因此可能已经死亡。 （D,E）400X处的BrdU标记细胞和青春期雌性的齿状回（颗粒细胞层）中的1000X的代表性显微照片。
图5：与齿状回中新生细胞的存活相关的母鼠的母体致敏和关怀。
(A通过母体致敏过程注射BrdU并暴露于后代的青春期雌性比没有暴露于幼崽的青春期雌性保留了更多的BrdU标记细胞。 （B）暴露于成年男性的雌性不太可能表达母体行为并且保留较少的BrdU标记细胞。 因为绝大多数这些细胞将成熟为神经元，这些数据表明学习成为母亲与雌性海马中新生成的神经元的存活正相关。
讨论
在包括美国在内的许多文化中，性侵犯和暴力是男女的问题。 这种经历对于青春期和成年早期的年轻女性尤为常见。 然而，性侵犯不仅限于人类，也可能发生在从爬行动物到啮齿动物到非人类灵长类动物的性行为和探索过程中。26,27,28,29,30,31,32。 据推测，侵略，特别是在性探索期间的身体攻击，允许男性获得接触女性的生殖目的27,33,34。 许多研究已经研究了男性之间的攻击性行为，有些人研究了男性和女性之间的攻击行为，但大多数都关注男性的反应。 很少有实验室模型专注于女性对性侵犯的反应，特别是那些在青春期和成年早期发生的反应35,36,37,38,39。 为了满足这一需求，我们开发了性侵犯的实验室模型，称为SCAR，在此期间，青春期女性反复暴露于经历过性经验的成年男性同伴，直到她到达青年期。 在相互作用过程中，即使她的阴道管未完全打开，成年男性也会积极接近，向下并试图安装青春期雌性大鼠 (图。 1). 记录的最一致的行为是肛门生殖器追踪，成年男性追求肛门生殖器区域，因为女性飞镖围绕着试图逃跑的笼子。 在互动过程中，成年男性经常会把女性压低，但因为她太小而敏捷，她能够逃跑。 几乎没有任何插入，因此相互作用不会导致交配。 这可能是因为青春期的女性可以逃脱，但也因为她的阴道管未完全打开而且她没有排卵。 有趣的是，与侵略相关的行为（针脚和肛门生殖器追踪）的数量在几天内没有适应并且即使在暴露8天后也保持其强度并且随着青春期女性达到性成熟。
本套实验的目标之一是将SCAR建立为女性压力的现实模型。 从动物实验室研究中，我们知道压力性生活经历会对神经元和行为结果产生多种不利影响。 也就是说，大多数动物模型都依赖于生活在现代社会中的人类没有遇到的压力因素（即克制压力，厌恶冲击或游泳压力），更不用说它们代表了年轻女性常见的压力源。 为了验证与男性的相遇是否有压力并且可能具有厌恶性，我们测量了皮质酮浓度，这些浓度得到了增强。 与一组青春期雌性的平均浓度相比，平均浓度显着升高，每组青春期雌性与成年雌性配对（图2A）。 在一项单独的实验中，我们确定相互作用使皮质酮浓度升高，与一组女性相比，这些女性在相同的时间内处于新的环境中（图2B）。 基于这些结果，我们得出结论，与成年男性的互动对于女性而言是一种压力的体验，并且比与另一位女性的互动或接触新的背景更具压力。 因此，SCAR体验本身比新颖性更具压力。 此外，如上所述，这些行为并不适用于会话，甚至在八天后仍然保持升高。 我们没有在这个时间点测量皮质酮浓度，但鉴于行为没有改变，皮质酮浓度可能会保持升高。 最低限度地，这些数据表明SCAR经验足够紧张，可以在几个小时内持续激活HPA响应。
社会互动和侵略的研究历史悠久，但大多数研究都集中在男性/男性的侵略上。 一种模式与我们的相似，称为少年社会征服。 在这些研究中，将青春期雄性或雌性啮齿动物与成年雄性一起放置用于10-min遭遇。 总的来说，他们的研究结果表明，女性大脑对这次遭遇的反应更敏感，选择性更低39,40。 特别活化的脑区包括杏仁核的基底外侧核，纹状体末端的床核和下丘脑。 库克和他的同事们还在遭遇后检查了两性中的抑郁和焦虑相关行为。 女性尤其受到影响，在高架十字迷宫的闭合臂上花费的时间更多，并且在强迫游泳测试期间更多的无助行为。 我们没有在这里测量这些行为，但是在每天接触成年男性后，预期青春期女性会发生类似的变化。 我们不是采取抑郁行为的措施，而是将重点放在与学习相关的过程上。 如图所示 图2C在青春期，反复暴露于侵略性男性会破坏女性学会将两种时间分离的刺激（即在微量调理过程中）联系起来的能力。 我们还评估了SCAR对与学习相关的母亲行为的影响（图。 4）。 年轻的雌性啮齿动物将学会照顾后代，即使它们仍然是处女。 这种母体致敏过程通常用于动物模型中，以评估母体行为和女性大脑的变化。 暴露于侵略性和经历过性经验的男性会破坏复杂母亲行为的发展和表达，这种反应会限制在自然条件下生存的后代数量。
青春期的大脑特别可塑，容易受到压力的生活经历的影响15,41。 在青春期，海马体每天比成年期产生数千个细胞15. 然而，细胞生产通常会因压力经历而减少。 为了确定SCAR经验是否减少海马中的细胞增殖，如前所述，将青春期雌性群体暴露于成年雄性或未暴露于成年雄性，然后注射BrdU（有丝分裂标志物）并在两周，一周或三周后处死。 该程序使我们能够评估SCAR（暴露于成年雄性）对增殖与新生细胞存活的影响。 在这些时间点的每一个中存在的BrdU标记细胞的平均数量在暴露于成年雄性的雌性和未暴露于成年雄性的雌性之间是相似的，表明SCAR经历并未通过细胞增殖的减少来减少神经发生（图。 4）。 如上所述，青春期动物比成年动物产生更多新生成的神经元15。 尽管如此，SCAR经验对于存在2-h的BrdU标记细胞的数量或初始注射后一周没有影响。 相反，差异发生在初次注射后三周，并且仅响应母体致敏经验（图5A). 因此，目前的结果表明，当产妇行为接着而不是产生细胞时，已经存在的新细胞存活率发生变化， 从头.
尽管每天都有数千人出生，但新生细胞中有多达一半甚至更多的细胞在生成后的几周内死亡21。 如图所示 图。 4一周内产生的新海马细胞超过一半在几周内不再存在。 在一系列实验室研究中，我们已经确定通过努力学习，包括青春期产生的细胞，可以从新的细胞中拯救新细胞。15,16。 我们没有检查用微量眨眼调理训练的动物的细胞存活率。 然而，我们不希望训练从SCAR雌性中拯救新神经元免于死亡，仅仅因为SCAR雌性没有学习条件反应42,43,44. 目前的数据确实表明，与后代的每日相互作用可能足以防止许多新产生的细胞在青春期雌性中死亡，进一步表明后代的存在可以防止通常在这些年轻雌性中发生的细胞死亡。 此外，新生细胞更有可能在学会表达完全母性行为的女性中存活。 因此，雌性海马齿状回中新生成的细胞对母性的经历作出反应，因此，它们可能在学习识别和照顾后代方面发挥重要作用。 这些数据与之前的报告一致，表明父本雄性成年海马中的新神经元对其后代的相互作用有反应，可能参与后代识别45.
女性大脑在学习照顾后代时会发生变化46,47。 如引言中所述，暴露于急性应激事件会抑制成年雌性大鼠经典调理期间的联想学习。 然而，压力并没有抑制女性自然（通过怀孕）或通过母亲过敏的过程照顾后代的学习14. 此外，这些影响相对持久，以至于压力不能抑制这种类型的学习，女性在生活的某些阶段已经学会成为母性。48 最近的一项研究报告说，在听觉皮层中全身或局部施用催产素可以增强未表达母体行为的母亲对大鼠幼仔的回收49. 基于这些数据，如果提供催产素ICV，暴露于SCAR的青春期女性可能会学会表达母性行为。50 或在母体致敏过程中局部在听觉皮层49。 与没有接触催产素的类似治疗的雌性相比，母体行为的这种增加应该因此增加海马齿状回中新生成的神经元的存活率。。 总之，这些不同的研究指出神经发生是一种潜在的机制，通过这种机制，父母可以认识并学会照顾他们的年轻人。 因此，SCAR模型不仅可用于研究女性对性侵犯的反应，而且可用于研究母体行为的发展及其与海马神经发生的潜在相互作用。
结论
全世界超过30％的女性在其一生中遭受性侵犯或攻击，其中许多经历发生在青春期和青年期51,52。 性侵犯和创伤与女性抑郁症和认知障碍的发生率显着增加有关53。 此外，遭受过严重的儿童性和/或身体虐待的女性经常患有创伤后应激障碍，这与杏仁核和海马体积减少以及学习缺陷有关。54。 此外，患有创伤后应激障碍的母亲的儿童创伤经历的风险更大，这有助于他们的发育预后不良55. 尽管在人类中进行了这些和其他研究，但据我们所知，还没有确定的动物模型来评估性侵犯和创伤对女性的影响。 这里报告的研究表明SCAR是女性青春期性创伤的有用模型。 这是一个重要的贡献，因为我们对大脑机制知之甚少，这些大脑机制可以解释经历性创伤和攻击性而且没有动物模型的女性抑郁症和其他情绪障碍的增加，我们在可以进行的研究类型方面受到限制。进行。 这里提供的数据进一步表明，暴露于SCAR显着减少了学习和母体行为的发展，这对女性大脑的可塑性有影响。 我们认为SCAR模型和由此产生的数据可用于为遭受性暴力和创伤的女孩和年轻女性开发临床干预措施，现在必须学会恢复r56,57.
附加信息
如何引用本文：Shors，TJ et al. 性别特异性攻击性反应（SCAR）：一种破坏女性大脑中母体学习和可塑性的性创伤模型。 科学。 众议员。 6，18960; DOI：10.1038 / srep18960（2016）。
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致谢
由行为脑健康基金会和国家精神分裂症和抑郁症研究联盟（NARSAD）颁发给TJS的杰出研究员奖和INSPIRE奖（美国国立卫生研究院：IRACDA新泽西/纽约科学合作研究和教育）向KT和Dorthy和David Cooper对HC和DD的奖学金。
作者信息
所属机构
1. 行为和系统神经科学，心理学系，协同神经科学中心，罗格斯大学。
特蕾西·J·肖斯（Tracey J.
克里希纳·托伯
吉娜·迪福
，德米特里·M·达勒姆
o＆韩艳M. Chang
捐款
TJS设计了实验，监督它们并编写了主要的手稿文本。 KT，GD，DD和HC有助于设计，实验和分析数据。 HC制备了图1-5。 所有作者都审阅了手稿。
相互竞争的利益
作者声明没有竞争性的经济利益。
通讯作者
对应 Tracey J. Shors.
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