性行为和性相关环境因素激活雄性大鼠的中脑边缘系统(2004)

神经精神药理学 (2004)29,718-730,

玛格丽特·E·贝尔福1, 雷宇1 和 Lique M Coolen1

1美国俄亥俄州辛辛那提辛辛那提大学医学院神经科学研究生项目,细胞生物学,神经生物学和解剖学系

通讯:LM Coolen博士,辛辛那提大学医学院细胞生物学,神经生物学和解剖学系,Vontz分子研究中心,3125 Eden Ave.,Cincinnati,OH 45267-0521,USA。 电话:+ 513 558 1209; 传真:+ 513 558 4454; 电子邮件: [电子邮件保护]

8年2003月6日收到; 2003年9月2003日修订; 23年2003月XNUMX日接受; XNUMX年XNUMX月XNUMX日在线发布。

抽象

中脑边缘系统在调节诸如药物成瘾和诸如性行为的正常动机行为之类的病理行为中起重要作用。 Ť他目前的研究调查了该系统在性行为中内源性激活的机制。 具体而言,研究了性经验和与性有关的环境线索对中脑边缘系统的几种组分的活化的影响。

中脑边缘系统由从腹侧被盖区域(VTA)到伏隔核(NAc)的多巴胺能投射组成。 先前的研究表明,这些神经元受到局部GABA中间神经元的强直抑制,而中间神经元中间神经元又被μ阿片受体(MOR)配体调节。 为了检验阿片类药物在性行为期间作用于VTA的假设,将VTA中MOR内化的可视化用作配体诱导的受体激活的标记物。 在交配或暴露于与性有关的环境线索后,观察到MOR内化的显着增加。 下一个目标是确定性行为是否激活VTA中的多巴胺神经元,使用酪氨酸羟化酶作为多巴胺能神经元的标记物和Fos免疫反应性作为神经元激活的标记物。 在交配或暴露于性相关环境线索后观察到活化的多巴胺能神经元的百分比显着增加。 此外,交配和性别相关的线索激活了VTA中的大量非多巴胺能神经元以及NAc Core和Shell中的神经元。。 总之,我们的结果提供了功能性神经解剖学证据,即中脑边缘系统被性行为和暴露于与性相关的环境线索激活。

关键词:

腹侧被盖区,伏隔核,多巴胺,μ阿片受体,内吞作用,GABA,性行为,Fos

引言

中脑边缘多巴胺系统是调节动机和奖励的神经回路的关键组成部分。 该系统可以通过外源性应用滥用药物来激活,通常导致一组称为成瘾的病理行为。 然而,中脑边缘系统在调节正常的动机行为(如喂养,饮酒,攻击性和性行为)中也起着重要作用。 虽然许多研究都集中在药物诱导的该途径的激活上,但对于中脑边缘系统在自然条件下的功能知之甚少。 因此,本研究调查了性行为激活中脑边缘多巴胺系统的内源机制。

雄性啮齿动物的性行为由食欲接近阶段和完成阶段组成,在该阶段中,动物爬上身体并进入体内,最终以射精达到高潮。船壳 , 2002)。行为研究表明,雄性啮齿动物的性行为,尤其是射精,是一种奖励和强化行为。雄性大鼠很容易对交配产生条件性位置偏好(Agmo和Berenfeld,1990; 阿格莫和戈麦斯,1993; 迈泽尔 , 1996; Paredes和Alonso,1997; 洛佩兹 , 1999; Martinez和Paredes,2001),并将执行操作任务以获得性接纳女性(艾维特 , 1987; Everitt和Stacey,1987).

中脑边缘多巴胺系统由位于腹侧被盖区 (VTA) 的产生多巴胺 (DA) 的神经元组成,投射到伏隔核 (NAc),在性行为的动机和奖励方面发挥着关键作用。微透析研究表明,多巴胺在雌性出现后释放到 NAc 中,并且在整个性行为过程中保持升高状态。Pfaus , 1990; Pfaus和Phillips,1991; Damsma , 1992; Wenkstern , 1993)。此外,将 DA 受体激动剂输注到 NAc 中可促进雄性大鼠性行为的启动。艾维特 , 1989),而拮抗剂具有抑制作用(Pfaus和Phillips,1989). VTA中的多巴胺能投射神经元可能受到局部GABA能中间神经元的强直抑制. 刺激GI / O- 偶联的μ阿片受体(MOR)导致这些GABA能神经元的抑制,这反过来导致多巴胺能投射神经元的去抑制和随后DA进入NAc的释放。 该电路模型得到多项电生理学和药理学研究的支持(马修斯和德国人,1984; 约翰逊和诺斯,1992; Klitenick , 1992; 池本 , 1997),并如图所示 图1. 我们假设,在性行为期间,内源性阿片类药物被释放到VTA中,导致多巴胺能投射神经元的去抑制。 这一假设得到了研究的支持,这些研究表明,注入 VTA 的阿片类拮抗剂会抑制性动机。van Furth和van Ree,1996)。目前的研究包括一组实验,旨在为该模型提供神经解剖学证据。

图1。

图1  - 遗憾的是,我们无法为此提供可访问的替代文本。 如果您在访问此图片时需要帮助,请联系help@nature.com或作者

建议在性行为期间中脑边缘激活的电路模型。 在该模型中,内源性阿片肽被释放到VTA中并与MOR结合,抑制GABA能中间神经元。 这释放多巴胺能投射神经元免于抑制,导致DA释放到NAc中。

全图和图例(30K)

这项研究的首要目标是扩展我们对 VTA 中 MOR 解剖分布的了解,特别是 GABA 能神经元。尽管有丰富的药理学数据,但人们对该电路的解剖结构知之甚少。已证明 MOR 主要存在于 VTA 中的非多巴胺能神经元中(Garzon和Pickel,2001)。然而,MOR 是否位于 GABA 神经元上尚不清楚。

本研究的总体目标是研究男性性行为期间VTA中MOR和DA神经元的激活。 首先,为了检验在性行为期间阿片类药物被释放到VTA中的假设,我们使用MOR内化作为配体诱导的受体激活的标记物。 该技术利用了G蛋白偶联受体在配体结合后经历内吞作用的事实。 特别是,已显示MORs经历配体诱导的内吞作用 细胞/组织 (基思 , 1998),以及 体内 (埃克塞尔 , 1998; 特拉夫顿 , 2000; 辛查克和米切维奇,2001)。可以使用共聚焦显微镜观察内化的内体样颗粒,并且这些颗粒的定量提供了内源性阿片肽释放的间接测量。此外,该技术允许细胞分辨率来确定内源性阿片类药物作用的靶标。我们的下一个目标是确定性行为是否激活 VTA 中的 DA 神经元。为了解决这个问题,我们使用 Fos 免疫反应性 (Fos-IR) 作为神经元激活的标记。最后,为了评估 NAc 是否在性行为过程中被激活,我们量化了 NAc 核心和壳子区域中的 Fos-IR。

经验和环境在中脑边缘系统的激活中也发挥着重要作用。在人类中,吸毒成瘾者经常报告在接触与毒品相关的环境因素后会出现强烈的渴望。柴尔德里斯 , 1988; 华莱士,1989)。在啮齿类动物中,接触药物相关信号会导致中脑边缘多巴胺系统条件性激活,这可以通过 DA 释放增加来证明。杜沃谢尔 , 2000)和 NAc 中的早期基因表达(奥斯特兰德 , 2003)暴露于药物配对环境后。人们对与正常动机行为(例如性行为)相关的环境线索的条件反应知之甚少。当经历过性行为的雄性大鼠暴露在丝网后面的发情雌性大鼠中时,NAc DA 会增加(Damsma , 1992)。然而,接触被发情女性弄脏的床上用品也会刺激 NAc 中 DA 的释放(Mitchell和Gratton,1991),并且尚不清楚中脑边缘系统的条件激活是否依赖于嗅觉输入。因此,本研究的一个主要目标是确定在没有嗅觉输入的情况下,与性别相关的空间和触觉线索是否激活中脑边缘系统。具体来说,我们使用上述方法来比较经历过性经历的动物中性诱发的中边缘系统激活 vs 天真的动物。 此外,我们比较了在不同环境中获得经验的动物,以研究性相关环境线索对中脑边缘DA系统激活的影响。

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材料和方法

动物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠(250-260 g)获自Harlan(Indianapolis,IN),并在实验期间单独圈养在Plexiglas笼中。 将菌落室维持在12 / 12 h逆转的光暗循环(在1000 h处关灯)。 提供食物和水 随意。 用于交配行为测试的刺激雌性双侧卵巢切除并接受含有5%苯甲酸雌二醇(EB)和95%胆固醇的皮下植入物。 通过施用500诱导性接受性 mu在测试前,用0.1 ml芝麻油,5 h中的黄体酮(皮下)。 所有程序均经辛辛那提大学动物护理和使用委员会批准,并符合NIH关于脊椎动物研究的指南。

性行为

本实验包括八个实验组(参见 表1)。这些群体的性经历不同(天真的 vs 经验丰富的),进行性行为测试的环境(家庭笼子 vs 测试笼),以及最后测试日的行为(性别 vs 未配对的控制)。 首先,将动物分成四组,性经验和测试环境不同。 环境由家笼或测试笼组成。 家笼是指标准的树脂玻璃笼,其中动物在实验期间单独饲养。 测试笼指的是与笼子不同的笼子,即更大且没有气味提示(60 时 45 时 50厘米3),在每个测试阶段将动物放置在其中(请参见下文)。 在两次试验之间,用酒精溶液(70%)彻底清洁该测试笼,并放置干净的被褥。 在每周两次的两次预测期间,允许有性经验的动物与雌性雌性交配一次射精或60分钟,以先到者为准。 在这些测试前的过程中,将动物与自己的笼子或较大的带有干净被褥的测试笼子交配。 在引入雌性中在试验笼中获得性经验的动物在引入雌性之前在试验笼中放置60分钟,然后使其交配一次射精或60分钟。 在家庭笼中获得性经验的雄性在家庭笼中接受女性,并允许其一次射精或交配60分钟。 在最后一次测试前的交配期后第1周,将有性行为的大鼠随机分为交配(“性”)和未交配(“对照组”)组(总共四个有性经验的组, N= 4。 在最终测试期间,允许“性”动物在获得经验的相同环境(即家中或测试笼)中与一个射精交配。 因此,在家庭笼中获得性经验的动物仍留在家庭笼中,接受雌性,并与一次射精交配。 将在试验笼中获得性经验的动物放在试验笼中1 h,然后将雌性放在试验笼中,雄性交配一次射精。 射精后5分钟,将雌性伴侣移出,将雄性伴侣留在家庭笼或测试笼中1小时直至处死。 对照动物在最后的测试日没有接受雌性伴侣,而是从家笼中取出或在没有雌性雌性的情况下将其放置在测试笼中2 h,然后处死,具体取决于它们获得性经历的环境。 将有性行为的动物(没有性经历的动物)放到家里的笼子里,或在没有雌性的情况下放到试验笼子里,每周两次,每次1小时。 在最后一次预测试后的第1周,将大鼠随机分为“性”和“对照组”(共XNUMX个未接受过性行为的组, N= 4。 与有性经历的人群相似,进行最终测试的环境与进行测试前的环境相同。 因此,将在预测试期间暴露于测试笼中的幼稚雄性放到测试笼中1 h,然后将雌性放到测试笼中,并将雄性交配一次射精(“性”)或放置在无雌性的测试笼中2小时(未配对对照)。 留在笼子里的雄性要么接受雌性并交配一次射精(“性”),要么从笼子中被杀死(未配对)。 在“性别”组中,射精后5分钟将雌性伴侣移出,雄性则留在家里的笼子或试验笼中1 h,直至处死。

 

组织准备

使用戊巴比妥(200 mg/kg)对动物进行深度麻醉,并用100 ml 0.9% NaCl和500 ml 4%多聚甲醛(0.1 M磷酸盐缓冲液(PB;pH 7.3))经心灌注。取出大脑并在室温下在固定剂中后固定 1 小时,然后置于 20 M PB 中的 0.1% 蔗糖中并保存在 4°C 下。冠状切片 (35 mum) 在冷冻切片机 (Richard Allen, Kalamazoo, MI) 上切割,以四个平行系列收集在冷冻保护剂溶液中(30 M PB 中的 30% 蔗糖、0.1% 乙二醇; 沃森 , 1986),并储存在-20°C直至进一步处理。

免疫组化

所有孵育均在室温下进行,同时轻轻搅拌。 在孵育之间用0.1 M磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分洗涤自由浮动的切片。 将切片与10%H一起温育1 min2O2然后用温育溶液(含有1%牛血清白蛋白和0.1%triton X-0.4的PBS)封闭100 h。 所有一抗孵育均在孵育溶液中进行,在室温下过夜。 染色后,将切片在0.1 M PB中彻底洗涤,用dNH中的0.3%明胶固定在载玻片上。2O 并用 DPX (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) 或含有抗褪色剂 1,4-二氮杂双环 (2,2) 辛烷 (DABCO; 50 mg/ml, Sigma-) 的水性封片剂 (Gelvatol) 盖玻片奥尔德里奇 (Aldrich),圣路易斯,密苏里州),按照之前的描述进行准备 (哈洛和莱恩,1988)。免疫细胞化学对照包括省略一抗。 VTA 和/或 NAc 系列针对以下标记进行染色:

FOS / TH

 

将VTA和NAc切片与针对c-Fos的兔多克隆抗体(1:7500; SC-52; Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)孵育过夜,然后与生物素化的驴抗兔IgG孵育1小时(1:400) ; Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)和抗生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶复合物(1:1000; ABC Elite Kit,Vector Laboratories,Burlingame,CA)。 最后,将切片在10%中孵育0.02 min。 在含有0.1%过氧化氢和0.012%硫酸镍的0.08 M PB中的二氨基联苯胺(DAB; Sigma-Aldrich,St Louis,MO),得到蓝黑色反应产物。 接下来,将VTA切片与针对酪氨酸羟化酶的小鼠单克隆抗体(TH; 1:400 000; Chemicon International,Temecula,CA),生物素化的驴抗小鼠IgG二抗(1:400; Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove, PA)和ABC如上所述。 最后,将切片在10%DAB中在含有0.02%过氧化氢的0.1 M PB中孵育0.012 min,得到红棕色反应产物。

MOR

 

如上所述,将VTA切片与识别大鼠MOR1(1:10 000; DiaSorin,Saluggia,Italy)的C-末端区域的兔多聚体抗体,生物素化的驴抗兔IgG和ABC一起孵育过夜。 接下来,将切片与生物素化的酪酰胺(BT; 10:1在PBS + 250%H)中孵育0.003 min。2O2; Tyramide信号放大试剂盒,NEN Life Sciences,Boston,MA)和30 min与CY-3偶联的steptavidin(1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)。

GABA / MOR

 

将VTA切片与针对GABA的小鼠单克隆抗体(1:不含TX的PBS / BSA中的1000; Sigma-Aldrich,St Louis,MO)孵育过夜,并且使用缀合Alexa 30的山羊抗小鼠IgG(488:1)孵育200 min在PBS / BSA; Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)。 然后如上所述对切片进行MOR染色。

GAD / TH

 

将VTA切片与识别谷氨酸脱羧酶(GAD; 1:1500,Chemicon International,Temecula,CA)的兔多克隆抗体一起温育,然后与生物素化的驴抗兔IgG,ABC,BT和CY-3-缀合的链霉抗生物素蛋白一起温育。 , 如上所述。 接下来,将切片与针对酪氨酸羟化酶的小鼠单克隆抗体(TH; 1:40 000; Chemicon International,Temecula,CA)一起孵育,然后与缀合至Alexa 30的山羊抗小鼠IgG孵育488-min(1:200) ; Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)。

数据分析

VTA解剖学

 

对于 VTA 的解剖分析,堆叠 1 mu沿着 z-axis,使用Zeiss LSM-510激光扫描显微镜。 CY3荧光用567 nm发射滤光片和He-Ne激光器成像,Alexa 488用505 nm发射滤光片和氩激光成像。 研究了GAD-IR纤维相对于TH神经元的分布。 此外,研究了MOR相对于GABA-IR细胞体的位置,并且在一只动物中定量共表达GABA的MOR-IR神经元的rostrocaudal分布。 此外,在三只动物中分析了整个VTA中MOR-IR细胞体上的rostrocaudal分布。

性行为

 

观察每个预测试和最终测试交配会话并记录性行为:坐骑次数(#M),插入次数(#I),坐骑和插入潜伏期(ML和IL,即女性出现的时间)到第一次坐骑或插入)和射精潜伏期(EL;从第一次插入到射精的时间)。 使用单向ANOVA分析测试前交配期最后一天的每个测量结果,以确定交配环境(家庭笼) vs 测试笼子)影响性经验。 使用双向ANOVA(因子:经验,环境)和最终测试日的结果进行分析 事后 使用Fisher的PLSD进行比较,所有显着性水平均为5%。

MOR内化

 

对于VTA神经元中内体计数的定量分析, z- 1 叠 mu使用蔡司激光扫描共焦显微镜系统 (Zeiss LSM-15) 捕获 30-510 个神经元的 m 个光学切片。在通过神经元的每堆图像中,神经元中间的两个连续部分用于分析。由对实验组不知情的观察者对每个细胞的免疫反应性细胞内颗粒的数量进行计数,并且对每只动物进行平均。此外,还对内化 MOR-IR 细胞的百分比进行了量化;含有三个或更多免疫反应性细胞内颗粒的 MOR-IR 神经元被认为是内化的。使用三因素方差分析(因素:交配、经验和环境)对结果进行分析 事后 比较(Fisher's PLSD)使用5%显着性水平。 将图像导入到Adobe Photoshop 7.0(加利福尼亚州圣何塞,Adobe Systems)中以构成数字。 除了亮度之外,没有以任何方式调整或更改图像。

FOS / TH

 

使用连接到徕卡显微镜(徕卡显微系统;韦茨拉尔,德国)的绘图管,对每只动物的分析切片进行相机清晰绘图。在 VTA 中,相机清晰图由四个部分组成,大约 280 mu相距米,代表 VTA 中四个从头到尾的水平(图2)。使用 TH 染色和内侧丘系 (ml) 和反屈束 (fr) 的位置作为标志,定义标准区域,在其中对 Fos-IR 核和 Fos/TH 双标记细胞进行计数。细胞计数在 2.16 mm 范围内的标准区域进行2 (延髓和两个中间水平)到1.6 mm2 (最尾端水平)。在 NAc 中,摄像机清晰图由三部分组成,大约 600 mu相距米,代表 NAc 中三个从头端到尾端的水平(图3)。每个级别的标准面积为 0.24 毫米2 定义了NAc Core和NAc Shell中Fos-IR核的数量。 计算NAc和VTA中每个单独的嘴 - 尾水平的组平均值。 此外,每只动物计算四个(VTA)或三个(NAc)嘴侧到尾侧水平的平均值,并且组平均值基于动物平均值。 使用三向ANOVA(因子:交配,经验和环境)和分析结果进行分析 事后 比较(Fisher's PLSD)使用5%显着性水平。 具体而言,在以下每个尾脑水平之间进行了比较:(1)每个性别组和相应的对照组;(2)所有对照组;(3)所有性别组。 使用连接至Leica显微镜(Leica Microsystems; Wetzlar,德国)的数码相机(Magnafire,Opttronics)捕获免疫染色切片的数字图像。 将图像导入到Adobe Photoshop 7.0(加利福尼亚州圣何塞,Adobe Systems)中以构成数字。 除了偶尔调整亮度外,没有以任何方式调整或更改图像。

图2。

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示意图显示了 VTA 中从头到尾四个水平的 Fos/TH-IR 分析区域(用方框表示)。 (a) 吻侧,分析面积 = 1.8 mm 时 1.2 毫米。 (b) Middle-1,分析面积=1.8 mm 时 1.2 毫米。 (c) Middle-2,分析面积=1.8 mm 时 1.2 毫米。 (d) 尾部,分析面积 = 1.6 mm 时 1.0毫米。缩写:AQ,脑导水管; PAG,水管周围灰质; fr,反屈束; ml,内侧丘系; cpd, 大脑脚; SN,黑质; LG,外侧膝状体复合体; SPFp,束旁核丘脑小细胞部分; VPM,丘脑腹侧后内侧核; PH,胡丘脑后核; MRN,中脑网状核; MGv,内侧膝状复合体腹侧部分; APN,顶盖前核; SC,上丘; MM,内侧乳头核。

全图和图例(129K)

图3。

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示意图显示了 NAc 核心和外壳中从头端到尾端三个水平 (a-c) 的 Fos-IR 分析区域(由方框表示)。分析面积=400 mum 时 600 mu米。缩写:C、NAc 核心; S、NAc壳; VL,侧脑室; ac,前连合; cc,胼胝体; ec,外用胶囊; CP,尾壳核。

全图和图例(89K)

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成果

VTA解剖学

在轴突末端和细胞体上均观察到 MOR-IR(图4a),以及与 GABA-IR 神经元紧密相连的纤维。此外,观察到 MOR-IR 与 GABA-IR 在细胞体中共定位(图4a)。大约 79% 的 MOR-IR 神经元在大多数 MOR-IR 神经元所在的 VTA 喙部共表达 GABA-IR。在尾部 VTA 中观察到很少的 MOR-IR 神经元,尽管这些 MOR-IR 神经元中大约 50% 共表达 GABA。此外,我们观察到 GAD-IR 纤维与整个 VTA 中的 TH-IR 神经元紧密相连(图4b).

图4。

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(a) 共焦图像显示 MOR(红色)位于 GABA-IR(绿色)细胞体(箭头)上,MOR-IR 纤维与 VTA 中的 GABA-IR 细胞(三角形)紧密相连。 (b) 共焦图像显示 GAD-IR 纤维(红色)与 VTA 中的 TH-IR(绿色)细胞紧密相连。 (c) 共焦图像显示未交配对照动物 VTA 中的 MOR-IR。 (d) 共焦图像显示了交配动物 VTA 中的 MOR-IR。箭头表示MOR-IR内体样颗粒。 (b–d) 中的共焦图像为 1 mum 个光学截面,图像 (a) 是 5 mu米光学截面。 (e, f) 显微照片显示 VTA 中的 Fos-IR(黑色,实心三角形)和 TH-IR(棕色,空心三角形)。双标记细胞由箭头指示。比例尺表示 10 mum.

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性行为

对有性经验的雄性在测试前交配过程的最后一天进行的性行为测量如图所示 表2。有经验的男性获得经验的环境不会影响任何性行为的分析参数(表2)。特别是,在预测试交配期的最后一天,在家庭笼子或测试笼子中交配的雄性之间没有差异。测试日期间性行为的测量结果如下所示 表3。在测试当天,新手和有经验的男性之间观察到显着差异(F(1,12)= 8.927; p= 0.0113; 表3)。与在测试笼或家庭笼中交配的经验丰富的雄性相比,在测试笼中交配的幼稚雄性具有更多的坐骑数量和更长的坐骑、插入和射精潜伏期。我们在笼子里交配的幼稚雄性中观察到类似的趋势,尽管差异在 事后 试验。 在家中交配的幼稚男性之间性行为的统计学显着差异 vs 仅在IL中观察到测试笼,其在测试笼中交配的幼稚雄性中更高。

 

MOR内化

在位于 VTA 头侧的神经元中分析了交配诱导的 MOR 内化(图4c,d),大多数 MOR-IR 细胞体位于此处。性行为显着增加了 VTA 中 MOR 的内化(F(1,23)= 112.382; p<0.0001)。与对照组相比,在测试当天交配的所有雄性中都观察到交配诱导的 MOR-IR 内体样颗粒数量显着增加(图5a, 填充 vs 打开酒吧; p<0.03)。 此外,仅暴露于与性相关的环境也导致MOR内部化的显着增加。 特别是,观察到交配,经验和环境之间的三向互动(F(123)= 16.370; p= 0.0005)和 事后 分析表明,与所有其他未交配的对照组相比,在经历过性经验但在测试当天没有交配的有经验的雄性中,MOR 内化显着增加。图5a,开放酒吧; p<0.05)。 性行为还显着增加了显示内在化的MOR-IR神经元的百分比(F(1,23)= 136.312; p<0.0001)。特别是,与未交配的对照组相比,在测试日交配的雄性中观察到内化 MOR-IR 神经元的比例更高(图5b, 填充 vs 打开酒吧; p<0.03),以及与所有其他未交配的对照组相比,有性经验的雄性暴露于与性相关的环境,但没有交配(图5b,开放酒吧; p

图5。

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MOR 在 VTA 神经元中的内化。 (a) 每个细胞的 MOR-IR 内体样颗粒的数量。平均数正负每个行为组每个细胞的 MOR-IR 内体样颗粒的 SEM。 (b) 显示 MOR 内化的细胞百分比。平均百分比正负每个行为组包含三个或更多内体的 VTA MOR-IR 细胞的 SEM。实心条代表在测试日交配的组,空心条代表在测试日未交配的对照组。组间统计关系用小写字母表示;具有共同字母的群体没有显着差异。

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多巴胺神经元中的Fos表达

性行为和暴露于与性相关的环境会导致整个 VTA 中的多巴胺神经元激活(图4e、f6)。交配对整个 VTA 中表达 Fos 的 TH 细胞百分比有显着影响(F(1,24)= 99.774; p 事后 分析表明,与未交配的对照相比,在家庭或测试笼中交配的幼稚雄性中,以及在家庭笼中交配的经验丰富的雄性中,与未交配的对照相比,交配诱导的 Fos 表达显着增加。图6, p<0.0001)。 此外,观察到交配与环境之间存在双向相互作用(F(1,24)= 12.479; p= 0.0017)。 事后 分析表明,与所有其他未交配对照组相比,暴露于之前接受过性经历的环境的有经验的未交配对照雄性中,活化的 TH 细胞的百分比显着增加。图6, p<0.001)。有趣的是,相对于未交配对照组中观察到的提示诱导激活,交配并没有进一步增加有经验的雄性中激活的 TH 神经元的百分比。总体而言,与尾部水平相比,VTA 头侧水平中性/环境激活的 TH 神经元的百分比似乎更高,尽管这没有进行统计分析(表4).

图6。

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VTA 中属于 Fos-IR 的 TH-IR 细胞的百分比。平均百分比正负TH-IR 细胞的 SEM 是 Fos-IR,在四个头端到尾端水平上进行平均。实心条代表在测试日交配的组,空心条代表在测试日未交配的对照组。组间统计关系用小写字母表示;具有共同字母的群体没有显着差异。

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Nosopaminergic神经元中的Fos表达

尽管性行为和性相关线索诱导 TH 神经元表达 Fos,但 VTA 中的大多数 (80-90%) Fos-IR 神经元不表达 TH。对这些非多巴胺能神经元中 Fos 表达的分析揭示了与 TH 神经元相似的诱导模式(图7)。具体而言,观察到交配对 Fos 表达的显着影响(F(1,24)= 40.093, p<0.0001),与未交配的对照组相比,在家庭笼子中交配的幼稚和有经验的雄性以及在测试笼中交配的幼稚雄性中,Fos-IR神经元数量显着增加与未配对的对照相比(图7, p<0.006)。 此外,交配与环境之间存在显着的相互作用(F(1,24)= 5.288, p=0.0305),与所有其他未交配的对照组相比,在有经验的未交配雄性中观察到 Fos 表达显着增加,这些雄性被放置在先前接受过性经验的环境中(图7, p<0.02)。与未交配的对照相比,在测试笼中交配的经验丰富的雄性的性行为并没有进一步增加 Fos 表达水平。对 VTA 的每个单独的轴尾水平中 Fos 表达的分析揭示了与上述总 VTA 相似的 Fos 表达模式。然而,大多数 Fos-IR 神经元是在 VTA 的吻侧水平观察到的(表5),尽管未对颈尾水平之间 Fos 表达的差异进行统计分析。

图7。

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VTA 中 Fos-IR 的非多巴胺能细胞数量。平均数正负非 TH-IR 的 Fos-IR 细胞的 SEM 在四个头端到尾端水平上进行平均。实心条代表在测试日交配的组,空心条代表在测试日未交配的对照组。实心条代表在测试日交配的组,空心条代表在测试日未交配的对照组。组间统计关系用小写字母表示;具有共同字母的群体没有显着差异。

全图和图例(23K)

 

在NAc中的Fos表达

性行为和暴露于与性相关的环境会导致 NAc 中的神经元激活(图8)。交配对 NAc 核心(F(1,24)= 457.265, p<0.0001)和NAc Shell(F(1,24)= 234.159, p<0.0001)。在 NAc 核心中,与对照组相比,在测试日交配的所有雄性中,交配诱导的激活神经元数量显着增加(图8b, p<0.0001)。 此外,观察到交配与环境之间存在双向相互作用(F(1,24)= 3.244, p= 0.0294)。 事后 分析显示,在有经验的未交配对照雄性中,暴露于他们之前接受过性经历的环境中,活化细胞的数量显着增加。图8b, p<0.002)。同样,在 NAc 壳中,与对照组相比,在测试日交配的所有雄性中,交配诱导的激活神经元数量显着增加(图8a, p<0.0001)。 此外,观察到交配与环境之间存在双向相互作用(F(1,24)= 8.725; p= 0.0069)。 事后 分析显示,与所有其他未交配的对照组相比,暴露于他们之前接受过性经历的环境的经验丰富的对照组雄性中,激活细胞的数量显着增加。图8a, p<0.005)。所有三个轴尾水平的结果均呈现在 表 6a 和 b.

图8。

图8  - 遗憾的是,我们无法为此提供可访问的替代文本。 如果您在访问此图片时需要帮助,请联系help@nature.com或作者

NAc 中 Fos-IR 细胞的数量。平均数正负NAc 壳 (a) 或 NAc 核心 (b) 中 Fos-IR 细胞的 SEM 平均分布在从头端到尾端的三个水平上。实心条代表在测试日交配的组,空心条代表在测试日未交配的对照组。组间统计关系用小写字母表示;具有共同字母的群体没有显着差异。

全图和图例(44K)

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讨论

目前的研究提供了第一个直接的解剖学证据,即在性行为期间,VTA中的MOR和多巴胺能神经元都被激活。 这些结果支持微透析和药理学研究的先前发现,表明中脑边缘DA途径在性行为期间被激活。 首先,证明交配导致配体诱导的VTA神经元中MOR的激活,表明VTA的激活是由性行为期间释放的内源性阿片类药物介导的。 其次,交配显示导致VTA中DA神经元的激活,可能有助于NAc中的DA释放。 实际上,在NAc神经元中观察到类似的交配诱导激活模式,可能是由于DA释放。 最后,性行为导致VTA中非多巴胺能神经元的激活. 有趣的是,所有这些影响也是在对与先前性经历相关的空间和触觉环境线索的反应中观察到的。 总之,这些数据支持中脑边缘通路参与男性性行为和奖励。

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本研究标志着VTA通过自然行为或环境线索首次证明了MOR活化。 其他人也使用类似的技术来可视化大脑和脊髓其他区域的 MOR 激活,以响应外源性阿片类药物的反应。基思 , 1998; 特拉夫顿 , 2000)和雌激素(埃克塞尔 , 1998; 辛查克和米切维奇,2001). 我们实验室最近的研究表明,性行为导致雄性大鼠下丘脑内侧视前核的MOR内化 (库仑 , 2003). 在本研究中,在性行为和性相关环境线索之后,在VTA中检测到MOR内化,表明内源性阿片肽在响应这些刺激时被释放。 尽管该技术为 MOR 的内源性激活提供了有用的标记,但它是阿片类药物释放的间接标记。此外,参与 VTA 中 MOR 激活的特定阿片配体尚未确定。解剖学研究表明β-内啡肽(曼苏尔 , 1988)和脑啡肽(约翰逊 , 1980; Fallon和Leslie,1986)VTA 末端,药理学证据表明这两种肽都可以激活中脑边缘 DA 系统(Broekkamp , 1979; Stinus , 1980; Dauge , 1992)。此外,最近的报告表明,VTA 中存在高度 MOR 特异性配体内吗啡肽-1 和 -2(格林韦尔 , 2002). 尽管本研究仅专注于MOR,但其他阿片受体也可能参与性诱导的中脑边缘系统激活。 放射自显影研究表明,VTA 中存在 δ 和 κ 阿片受体,尽管与 MOR 相比密度低得多(曼苏尔 , 1987, 1988; 迪尔茨和卡利瓦斯,1990; 夏和哈达德,1991)。此外,注入 VTA 的 δ 激动剂刺激 NAc 中 DA 释放的效力要低 100-1000 倍,而 kappa 激动剂则完全无法做到这一点。迪瓦恩 , 1993),表明性诱导的中脑边缘 DA 通路激活主要通过 MOR 激活发生。

本研究中的解剖学数据进一步支持了MOR通过抑制GABA中间神经元间接激活中脑边缘多巴胺神经元的证据。 使用共聚焦显微镜,在与 GABA 能神经元紧密相连的 GABA 细胞体和纤维上观察到 MOR。这些纤维具有纽扣的外观,表明轴突末端;因此,MOR 似乎位于 GABA 能细胞体的突触前。这些发现与之前的观察一致,即 VTA 中的 MOR 并不位于 DA 神经元上(Garzon和Pickel,2001),表明存在间接关系。此外,药理学研究表明,MOR 激动剂抑制 GABA 神经元放电,刺激 DA 神经元放电,并增加 DA 释放到 NAc 中。马修斯和德国人,1984; 塞拉利昂 , 1991; 约翰逊和诺斯,1992)。在目前的研究中,对交配诱导的内化的分析仅限于 VTA 的喙部,大多数含有 MOR 的细胞体都位于此处。在该区域,79% 的含有 MOR 的细胞体是 GABA 能的,这表明大部分 MOR 内化发生在 GABA 能神经元中。然而,尚不清楚我们在 VTA 中观察到的所有 GABA 能神经元是否都是局部中间神经元,因为 GABA 神经元也会向 NAc 或前额皮质发送投射。Carr和Sesack,2000). 尽管如此,这些结果提供了进一步的证据,即在天然动机行为期间,MOR配体抑制GABA能中间神经元,导致VTA中多巴胺能神经元的激活和NAc中DA的释放。

本研究还证明了性别诱导的VTA中DA神经元的激活。 虽然没有直接显示MOR激活引起DA神经元的激活,但在两个系统中观察到相同的激活模式 - 即,通过性行为和性相关的环境线索激活 - 表明MOR中的神经激活。和DA系统可能是相关的。 目前尚不清楚激活的 VTA DA 神经元是否投射到 NAc。然而,解剖学证据表明 NAc 是 VTA 投影 DA 的主要目标(Swanson,1982)。此外,研究表明,NAc 中吗啡诱导的 Fos-IR 是 VTA 中阿片类药物作用的结果(邦坦皮和夏普,1997). 目前的数据进一步支持该模型,并表明释放到VTA中的内源性阿片类药物在男性性行为期间启动该中脑边缘通路的激活。 此外,在NAc核心和壳中均观察到性和诱导诱导的Fos表达。 NAc 的这些亚区域的组织化学特征以及与介导动机和奖励的电路其他组成部分的连接性有所不同。迪斯海玛 , 1997; Kelley,1999; Zahm,1999)。特别是,NAc 核心与背侧纹状体具有相似之处,并将投射发送到经典的基底神经节输出结构,包括腹侧苍白球、丘脑底核和黑质。相反,NAc 壳主要向边缘结构发送投射,例如 VTA、外侧下丘脑和脑干自主中心。迪斯海玛 , 1991; Zahm和Brog,1992)。因此,性行为和与性别相关的线索会导致与随意运动功能以及动机和情绪相关的中脑边缘成分的激活。

尽管目前的结果显示中脑边缘多巴胺途径的关键组分在男性性行为期间被激活,但是在行为期间何时发生这种激活尚不清楚。 事实上,在性行为的行为中,可能会在不同时间发生这种系统的激活 vs 有经验的动物 具体而言,在没有与女性伴侣相互作用的情况下,VTA和NAc被激活以响应与性有关的环境线索,这表明阿片类药物在行为的食欲期释放。 这一推理与舒尔茨的研究一致,该研究表明,当预期奖励时,猴子的 VTA 中会出现多巴胺能活动(舒尔茨,2001)。在本研究中,交配环境似乎充当了预测性奖励的条件刺激。有趣的是,不仅多巴胺神经元被预测的奖励激活,而且 MOR 也被激活。 因此,VTA中的内源性阿片类物质可能导致该电路的激活,以响应奖励预测的环境线索。 相反, 舒尔茨 (2001) 表明,当未预测奖励时,多巴胺神经元在奖励呈现期间被激活。与这一假设一致的是,在性幼稚的动物中,中脑边缘多巴胺通路的激活可能发生在不可预测的性奖励期间。之前的报告表明射精是性行为中最有价值的组成部分(Agmo和Berenfeld,1990; 洛佩兹 , 1999). 然而,微透析研究表明,接受性女性的气味可以诱导NAc中的DA释放,即使在性天真的男性中也是如此。 (Wenkstern , 1993)。目前尚不清楚暴露于女性气味对于性行为幼稚的男性是否具有奖励或预测价值。

药理学研究表明中脑边缘系统参与性行为的动机方面。 MOR 激动剂直接注入 VTA 促进性行为(Mitchell和Stewart,1990)。相反,纳洛酮减少了双层室中预期水平变化的数量,这是性动机的一种衡量标准(van Furth和van Ree,1996)。 6-羟多巴胺 (6-OHDA) 损伤和 NAc 中的 DA 拮抗剂会导致该测试的表现出现类似的下降(范菲尔特 , 1995)。此外,NAc 的 6-OHDA 损伤会延迟雄性大鼠性行为的发生并损害非接触性勃起,这表明 DA 参与了对外部线索的性唤起反应。, 1998)。这些操纵并没有改变性表现,表明该途径涉及行为的动机方面而不是完成阶段。此外,DA 或阿片受体拮抗剂可抑制条件性位置偏好性行为的发展。Agmo和Berenfeld,1990; 迈泽尔 , 1996).

有趣的是,我们还观察到VTA中的许多非多巴胺能神经元都被性行为和与性相关的环境线索所激活。 这表明除了通过内源性阿片类物质激活DA神经元之外的途径可能参与VTA的激活。 事实上,其他与奖励相关的大脑区域,如内侧前额叶皮质(mPFC),为VTA中的非多巴胺能神经元提供了兴奋性输入。 (Sesack和Pickel,1992; Carr和Sesack,2000). 具体来说,mPFC传入项目投射到VTA GABAergic中间神经元和GABAergic mesoaccumbens投射神经元,但不投射到中皮质GABAergic神经元 (Carr和Sesack,2000)。需要进一步的研究来调查 VTA 中性激活非多巴胺能神经元的连接和神经化学表型,以及它们对性动机和奖赏的意义。

最后,当前研究的结果表明,性别诱导的VTA激活存在rostrocaudal差异,尽管在本研究中没有统计学分析这些差异。 有趣的是,Bolanos及其同事最近证明了VTA中不同地形区域的可能性通常是正面的 vs 对情绪刺激的负面反应。特别是,他们证明磷脂酶 C 的过度表达斜体伽玛1(PLC斜体伽玛1)在VTA头端增强了对吗啡和蔗糖的偏好,而PLC斜体伽玛1 尾侧 VTA 的过度表达会降低奖励偏好并增加对厌恶刺激的敏感性(博拉尼奥斯 , 2003)。与此一致的是,本研究的结果表明,VTA 可能介导性动机和奖赏,但不是尾端。

总之,当前的研究证明了中边缘系统在自然动机行为(男性性行为)过程中的激活。具体来说,该系统的激活与交配行为以及与先前性经历相关的环境线索有关。中脑边缘系统与药物滥用密切相关——这是一种“非自然”动机的行为(明智的,1996)。通过研究该系统在自然条件下的功能,我们可以更好地了解其在药物成瘾中的作用。

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