评论：在帕金森氏症的小鼠模型中，跑步机运动会增加多巴胺D2受体。 成瘾引起D2受体的下降，这部分是脱敏的原因。 锻炼的另一个原因。
运动障碍
卷25，问题16，页面2777-2784，15十二月2010
抽象
本研究的目的是检查MPTP小鼠进行强化平板运动时基底神经节内多巴胺D2受体（DA-D2R）表达的变化。 使用Western免疫印迹分析突触泡蛋白和 体内 使用DA-D2R特异性配体的正电子发射断层扫描（PET）成像[18F] fallypride，我们发现高强度平板运动导致纹状体DA-D2R表达增加，这在MPTP中与盐水处理小鼠相比最明显。 多巴胺耗竭的基底神经节中DA-D2R的运动诱导的变化与该受体在调节中型多刺神经元（MSN）功能和行为恢复中的潜在作用一致。 重要的是，这项研究的结果支持使用PET成像的理由[18F] fallypride检查接受高强度跑步机训练的帕金森病（PD）患者的DA-D2R变化。
运动可改善帕金森病（PD）患者的运动表现。1–3 动物模型，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）小鼠，为研究运动引起的运动行为改善的分子机制提供了重要工具。4–6 多巴胺D1和D2受体（DA-D1R和DA-D2R）是纹状体中型多刺神经元（MSN）上多巴胺的主要靶标，并调节生理特性和细胞信号传导。 具体而言，DA-D2R在长期抑郁症（LTD）中起主要作用，这是一种突触可塑性形式，涉及谷氨酸能和多巴胺能神经传递的整合，导致背外侧纹状体中运动功能的编码。 鉴于DA-D2R在运动控制中的作用，我们试图检查运动增强的运动功能是否部分是由于纹状体DA-D2R表达的增加。
正电子发射断层扫描（PET） - 使用DA-D2R放射性示踪剂进行成像，可以对人体运动的影响进行纵向研究。 以前的有氧运动研究试图测量正常人的多巴胺释放7 并且[绑定]没有变化11观察到C] raclopride，导致作者认为多巴胺水平几乎没有变化。 然而，尚未研究运动对DA-D2R表达和突触活动的影响。 PET成像配体[18F] fallypride是一种很好的检测方法，因为它对DA-D2R和DA-D3R具有高亲和力和特异性，并且不同于[11C] raclopride，它不易被内源性多巴胺的基线水平所取代。7–10 利血平预处理动物（消耗内源性多巴胺）证实了这一点，这对[18F] fallypride绑定，9,11 但显着增加[11C] raclopride结合8 这归因于表观结合亲和力的变化（Kd）而不是受体数量（B最大).
作为[的结合潜力（BP）18F] fallypride可抵抗由于多巴胺耗尽引起的变化，这对其影响不大 Kd or B最大 在基线或耗尽状态下，我们使用[18F] fallypride测试我们的假设，即MPTP小鼠模型中的DA-D2R表达随着强化运动而增加。9,10,12,13 此外，为了支持我们的PET成像测量，我们使用了对突触泡蛋白体制剂的Western免疫印迹分析的互补技术来测量相同动物中突触水平的DA-D2R蛋白表达的变化。 我们在这里报告运动对DA-D2R表达的影响和[18F]在用盐水或MPTP处理的小鼠组中进行fallypride。
方法
动物，治疗组和MPTP给药
将57周龄的雄性C6BL / 8小鼠（Charles River Laboratories，Wilmington，MA）在12 h light / 12 h黑暗循环下分组饲养在温控室中。 所有程序均按照USC IACUC批准的NIH实验动物护理和使用指南进行。 在四个治疗组中使用总共164小鼠：（1）盐水（n = 42），（2）盐水加运动（n = 55），（3）MPTP（n = 57）和（4）MPTP加运动（n = 42）。 对于损伤，小鼠接受四次腹膜内注射溶于20％盐水中的0.9 mg / kg MPTP（游离碱; Sigma-Aldrich，St.Louis，MO），2-h间隔或四次腹膜内注射0.1 ml 0.9％NaCl作为控制。 通过对纹状体多巴胺水平的HPLC分析验证损伤。 在MPTP施用后的10天，与盐水小鼠（82.2±48.0ng / mg蛋白质）相比，MPTP小鼠中的8.4％多巴胺消耗（269.5±24.9ng / mg蛋白质）。 在研究结束时，MPTP加运动小鼠（69.8±11.7 ng / mg蛋白质）与MPTP（77.9±12.0 ng / mg蛋白质）之间的纹状体多巴胺水平没有显着差异。 然而，生理盐水加运动小鼠（315.2±9.0 ng / mg蛋白质）与生理盐水（246.9±19.8 ng / mg蛋白质）相比，纹状体多巴胺显着增加（F(3,16) = 7.78; P <0.05）。
跑步锻炼
损伤后，运动开始后5天。 将来自两个运动组（生理盐水加运动和MPTP加运动）的小鼠训练为以100周（6天/周）的增量速度在6-cm电动跑步机（Exer 5M，Columbus Instruments，OH）上运行以达到持续时间。 60 min / day和18-20的速度m / min。5,6
磁共振成像
使用1-T微MRI系统（Bruker Biospin，Billerica，MA）获得小鼠脑的三维体积T7加权磁共振（MR）图像。 图像采集的参数是：TE = 46.1 ms，TR = 6292.5 ms，0.4-mm切片厚度，0.45-mm层间厚度，128×128×128矩阵尺寸。
放射化学
合成[18F] fallypride如前所述通过甲苯磺酰基前体的亲核取代反应进行[18F]使用定制的放射化学仪器。12 通过反相HPLC在C8（2）Phenomenex Luna柱上使用乙腈和磷酸钠缓冲液作为流动相（55：45）实现纯化。 在254 nm和AUFS 0.05下测量UV吸光度。 放射性峰（保留时间17 min）对应于[18收集F] fallypride并在旋转蒸发器上除去溶剂。 通过气相色谱测试最终产物的致热原性，无菌性，pH和有机溶剂的去除。 使用Waters HPLC系统使用C8（2）Phenomenex Luna分析评估比活性和放射化学纯度。 比活性在3,000-12,000 Ci / mmol的范围内。
PET测量和图像分析
将20只小鼠用于PET成像（n = 6盐水; n = 3盐水加运动; n = 5 MPTP;和n = 6 MPTP加运动）。 扫描采用Concorde microPET R4扫描仪（CTI Concorde Microsystems，Knoxville，TN）采用60-min列表模式采集协议，采用20-min传输扫描后进行衰减校正。 68葛源。 [18F] fallypride（10.92-11.28 MBq）在发射扫描开始时通过尾静脉（单次推注）注射。 用2％异氟醚和98％氧气麻醉小鼠。 动态列表模式数据被分类为具有26帧（6×20秒，4×40秒，6×1分钟和10×5分钟）的正弦图，并通过两次OSEM迭代（有序子集期望最大化）重建，然后是18 MAP（最大后验）重建算法的迭代。14 重建的图像被裁剪为包含头部并在其中进行线性插值 Z-direction生成具有各向同性128×128×63 mm的0.4×0.4×0.4图像3 体素。 使用多线性组织参考模型从重建的动态图像计算纹状体的高分辨率结合势（BP）图像15 和洛根的情节16 在纹状体中具有高活性并且在小脑中具有非常低的活性（参考区域）。 在使用Rview（版本8.21Beta）与MRI共同注册的PET图像中，在两个半球中手动定义感兴趣的解剖区域（纹状体和小脑）。17 量化[特异性结合]18F]使用BP值进行小鼠纹状体中的fallypride，其提供平衡时特异性/非特异性结合比率的量度。18,19 为了证明纹状体中的结合特异性，在配体注射后60 min收获4只小鼠，在液氮中快速冷冻脑，以30-μm厚度切片，并且将切片与磷成像仪相对应（Typhoon 9200，GE Healthcare Inc.，Piscataway） ，新泽西州）（图。 1）。 研究表明[18F] fallypride特异性结合DA-D2R，并且由于纹状体中DA-D3R非常少，结合表明DA-D2R占有率。9,10,12,13
用于HPLC和蛋白质分析的组织收集
在研究结束时，快速移除脑，并且对应于从前囟1.2到0.6的解剖区域切除新鲜的背侧纹状体，其中胼call体为背侧边缘，胼call体的外侧面为侧边缘，并且在前连合上方为腹边。20
多巴胺及其代谢物的HPLC分析
通过具有电化学检测的HPLC测定纹状体匀浆中的多巴胺水平（每组n = 4）。6 该系统由ESA自动进样器（ESA，Chelmsford，MA）组成，配备有150×3.2 mm反相C-18柱（3μm直径）和CoulArray 5600A（ESA，Chelmsford，MA），配备四个 - 通道分析单元，电位设置为-75，50，220和350 mV。
Western免疫印迹分析
在由八个合并的背外侧纹状体新鲜制备的突触体内制剂中分析DA-D1R和DA-D2R的突触表达的运动效应。21 对每组实验组的总共24小鼠的三组小鼠进行该程序（每组n = 3制备物）。 DA-D1R（~50 kDa），DA-D2R（~50 kDa），酪氨酸羟化酶（58 kDa），多巴胺转运蛋白（68 kDa）和α-微管蛋白（50 kDa）（作为上样对照）的蛋白质的相对表达通过Western免疫印迹分析22 使用市售的一抗（兔多克隆和小鼠单克隆抗体，Millipore，Temecula，CA）。 通过与IRDye缀合的亲和纯化的山羊抗兔或抗小鼠第二抗体显现蛋白质条带680 或IRDye800 （Rockland，Gilbertsville，PA）。 通过在LI-COR Odyssey近红外成像平台中扫描滤光器并使用Odyssey 2.1软件（LI-COR Biotechnology，Lincoln，NE）定量来检测荧光信号。 结果显示为与盐水组相比的相对表达水平（设定为100％）。
统计分析
血压组间的差异[18F] fallypride，DA-D1R和DA-D2R蛋白水平使用双因素方差分析（ANOVA）进行分析，治疗时间为受试者因子（生理盐水与MPTP），运动时为受试者因素（无运动对比）行使）。 对于最大跑步机速度测试，使用时间作为主题因素（1周，2等），并且将治疗用作受试者因子（盐水对比MPTP）。 在评估感兴趣的显着性时，使用Bonferroni事后检验来校正多重比较。 显着性水平设定为 P <0.05。 为了探究群体差异的实际意义，使用效应量（ES）（ES =均值）计算了群体之间差异的大小的估计值集团1的 - 意思集团2的/ SD汇集）。 ES反映了治疗在目标人群中的影响，并根据既定标准进行了报告（小（<0.41），中（0.41-0.70）或大（> 0.70）。23 使用Prism5 for Windows（GraphPad，San Diego，CA）进行分析。
成果
高强度跑台运动改善MPTP损伤小鼠的运动行为
在MPTP损伤和开始运动之前，两个运动组中所有小鼠的平均基线速度相似（生理盐水加运动：11.7±1.1 m / min，MPTP加运动：11.2±1.1 m / min）。 6周的每日运动改善了两个运动组的最大跑步机速度，与XTPUMX到1周的MPTP加运动小鼠相比，生理盐水和运动小鼠显示出显着更大的最大速度（图。 2）。 然而，在5周（MPTP加运动：17.2±3.6 m / min和生理盐水加运动：22.0±1.5 m / min）和6周（19.2±1.2 m），MPTP加运动小鼠的最大跑步机速度与生理盐水和运动小鼠相似。分别为/ min和22.2±0.9 m / min）。 如先前报道的，未经过跑步机训练的MPTP损伤小鼠在7.0周运动期结束时其0.3±6 m / min的最大速度没有显示出运动行为的自发恢复。5
高强度跑台运动增加纹状体DA-D2R但不增加DA-D1R蛋白
如Western印迹分析所示，高强度平板运动差异性地影响来自背侧纹状体的突触泡样体制剂中的DA-D2R和DA-D1R水平（图。 3）。 与MPTP小鼠相比，MPTP +运动小鼠纹状体DA-D48.8R的2％增加（图3B），以及运动和MPTP损伤对DA-D2R蛋白水平的显着相互作用（F(1,8) = 6.0; P <0.05）。 相反，两组之间的运动对DA-D1R蛋白水平没有影响（图3A; F(1,8) = 0.1， P = 0.78）。 单独MPTP损伤并未显着改变DA-D2R（F(1,8) = 0.0; P = 0.88）或DA-D1R表达式（F(1,8) = 0.0; P = 0.92）。 此外，中脑多巴胺能纤维完整性，酪氨酸羟化酶（TH; 图3C）和多巴胺转运蛋白（DAT; 图3D），表明MPTP显着降低纹状体TH蛋白（F(1,8) = 757.3; P <0.05）和DAT表达（F(1,8) = 218.0; P <0.05）。
高强度跑台运动增加纹状体[18F] Fallypride结合潜力（BP）
虽然受体蛋白表达的Western免疫印迹分析测量了总抗体表位（表面和内部细胞储存）， 体内 使用高亲和力DA-D2R特异性放射性配体进行PET成像[18F] fallypride可以描述运动对DA-D2R结合配体的可用性的影响（图。 4）。 统计分析显示运动有显着效果（F(1,16) = 12.3; P <0.05）以及MPTP病变（F(1,16) = 160.3; P <0.05），MPTP与运动之间无显着相互作用（F(1,16) = 3.5; P = [0.07] on [18F] fallypride BP。 Bonferroni事后分析显示MPTP和MPTP加运动小鼠的血压值有显着差异（t = 1.1，Df = 1，16; P <0.01），生理盐水和生理盐水加上运动小鼠之间无显着差异（t = 4.1，Df = 1，16； P > 0.05）。 具体来说，MPTP加运动小鼠的[18F] fallypride BP与MPTP小鼠相比（MPTP加运动的平均BP值：7.1±0.7; MPTP小鼠的平均BP值：4.1±0.3）（图4B）。 此外，生理盐水加运动小鼠的[8.2％]增加了[18F] fallypride BP（13.2±1.0）与盐水小鼠（12.2±0.3）相比。 与这些发现一致的“效应大小”计算显示MPTP组（ES = 2.61）之间的运动效果大于盐水组之间观察到的运动效果（ES = 0.94）。
讨论
这项研究表明，高强度跑台运动导致[18F] fallypride BP（DA-D2R可用性）在MPTP处理的小鼠的纹状体中。 相反，与MPTP无运动小鼠相比，MPTP加运动之间的总纹状体多巴胺水平没有显着变化。 [18F] fallypride是一种高度选择性的DA-D2 / D3R拮抗剂，其BP反映了 体内 可用受体的测量（B最大）/结合亲和力（Kd）。 由于DA-D2Rs是背侧纹状体内主要的多巴胺受体亚型，因此运动引起的增加[18F] fallypride BP代表DA-D2R数量的增加，并且通过使用Western免疫印迹和我们先前的研究表明使用原位杂交组织化学增加纹状体DA-D2R mRNA转录物表达来支持蛋白质表达的增加。5 这种对血压升高的解释进一步得到了[俯卧位]的支持。18由于多巴胺水平仍然很低，因此多巴胺的Fallypride不太可能在MPTP小鼠中发生。24 因此，表观结合亲和力的变化（Kd）可以忽略不计，不太可能影响BP。 MPTP小鼠运动的增强作用可能反映了受损大脑通过增加受体数量来优化多巴胺能神经传递的尝试，同时多巴胺水平仍然耗尽。 MPTP小鼠对运动的反应性增强表明受伤者与完整大脑相比具有更大的潜在神经可塑性，当纹状体电路完整时这可能不是必需的。 多巴胺水平在MPTP小鼠运动中没有显着变化这一事实表明，DA-D2R的代偿性变化对于运动相关的运动性能改善至关重要。
使用PET成像，我们观察到相对于盐水处理的小鼠，MPTP损伤后DA-D2R BP降低。 这与Western免疫印迹相反，其中未观察到DA-D2R蛋白表达的变化。 DA-D2R以表面和细胞内区室之间的动态平衡存在，后者通常不能与PET放射性配体结合。 在多巴胺耗尽状态下，补偿机制可能导致DA-D2R的细胞内池变化，这可能无法用于[18F] fallypride结合但可用于Western免疫印迹中的检测。
与我们的研究结果不同，DA-D2R的代偿性增加已经报道在患有PD的个体和在非人灵长类动物中施用MPTP或在大鼠中施用6-OHDA之后。25 在文献中，据报道DA-D2R的丧失是由于多巴胺能神经元的退化，而DA-D2R的增加是由于保留的多巴胺能末端的表达增加和/或纹状体内神经元或胆碱能中间神经元内的合成增加所致。 我们的PET研究与文献研究之间的这种差异可能是由于研究之间病变严重程度的差异。11 具体而言，通过MPTP诱导的细胞损失导致更多数量的突触前DA-D2R的损失可能足以抵消由病变单独诱导的任何突触后代偿性变化。 或者，我们无法观察到MPTP（非运动）小鼠DA-D2R BP和表达水平的增加可能是由于研究结束时多巴胺水平适度恢复（82天10％多巴胺消耗与68相比）在术后42天消耗％。 然而，这不太可能，因为MPTP加运动小鼠也显示出多巴胺的小恢复（与没有运动小鼠的MPTP没有显着差异），DA-D2R BP增加。
大多数DA-D1R和D2R在MSN的树突棘上表达，其中额外的受体分别在来自皮质（或丘脑）和黑质致密体的谷氨酸能和多巴胺能神经元的胆碱能中间神经元和末端上表达。26 多巴胺的主要作用是调节MSN的皮质纹状体或丘脑纹状体谷氨酸能神经传递。 谷氨酸能神经传递通过DA-D1R增强，并通过DA-D2R减少。27–29 在多巴胺耗尽的条件下，在含有间接途径的MSN的DA-D2R上选择性地丢失脊柱和突触连接。30 由于谷氨酸能皮质纹状体神经传递增加，这种丧失伴随着MSN内的过度兴奋状态。31–33 在PD的动物模型中，这种增加的谷氨酸能驱动与帕金森样运动行为相关。34 通过应用多巴胺或其激动剂来减弱这种过度兴奋状态导致帕金森病运动障碍的逆转。35,36 根据这些报告和我们的研究结果，我们假设高强度运动的好处是通过增加DA-D2R在间接途径（但不是DA-D1R直接途径）中的表达来增强多巴胺能信号传导，并通过改善运动功能来改善运动功能。抑制谷氨酸能兴奋性。
我们研究的主要结论是，以强化跑步机运行形式的运动通过增加纹状体DA-D2R的表达来促进神经可塑性，这是受损脑中最明显的过程。 根据我们的研究结果，一种无创PET成像方法[18F] fallypride可用于研究强化平板运动是否也会导致PD患者DA-D2R的变化。 我们的研究强调了临床前研究在多巴胺耗竭动物模型中的价值以及转化研究对于理解PD患者的成像和运动研究的理论和见解的重要性。
致谢
这项工作得到了南加州大学CTSI全程试点资助计划的资助，以及帕金森病基金会，帕金森队（洛杉矶），帕金森联盟，惠蒂尔帕金森病教育小组，NINDS RO1 NS44327-1，NIA的慷慨资助。 AG 21937）和美国陆军NETRP W81XWH-04-1-0444。 MGV是USC神经科学研究生课程优异奖学金的获得者。 我们要感谢USC小动物成像核心的Ryan Park和Peter Conti博士对微型PET成像的帮助以及Saban研究所小动物成像研究核心的Rex Moats博士对鼠标MRI的帮助。 我们要感谢Yi-Hsuan（Lilian）Lai在跑步机运动方面的帮助，感谢Avery Abernathy在HPLC分析方面的专业知识。 我们感谢南加州大学帕金森病研究小组的朋友，包括George和MaryLou Boone，Walter和Susan Doniger以及Roberto Gonzales的慷慨支持。
脚注
潜在的利益冲突：无需报告。
注释中添加了注释： 本文发布于19十月2010上。 随后发现了一个错误。 此通知包含在在线和打印版本中，表示两者均已更正。
财务披露： USC神经科学研究生课程优异奖学金（MV），NINDS RO1 NS44327-1（MV，CW，JW，MJ和GP），USC CTSI全面试点资助计划（QL，AN，MJ，GP）。
作者角色： 所有作者都有助于制作这份手稿。 研究项目构想：GP，BF，MJ，RL，JW。 执行项目：MV，QL，AN，CW，MJ，GP。 数据收集，处理，统计分析：MV，QL，BF，AN，RL，MJ，GP。 稿件准备：MV，QL，BF，RL，JW，MJ，GP。
参考资料
36。 Calabresi P，Pisani A，Centonze D，Bernardi G.突触可塑性和多巴胺与谷氨酸之间的生理相互作用
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