mythologesch
Psychostimulant-induzéierter Verännerung vun dendritesche Wirbelen op dopaminoceptive Neuronen an nucleus accumbens (NAcc) gouf als eng adaptiv neuronal Äntwert hypothetiséiert, déi mat laangjährege Suchtfaktor Verhalen ass. NAcc besteet gréisstendeels aus zwee ënnerschiddleche Ënnerpopulatiounen vu mëttelgrousse Schwäin Neuronen, déi héich Niveaue vun entweder Dopamin D1 oder D2 Rezeptoren ausdrécken. An der aktueller Etude analyséiert mir dendritesch Wirbelsätheit no chronescher Kokainbehandlung an ënnerscheedlecher D1 oder D2 Rezeptor-enthale mëttelgrousse Schwäin Neuronen am NAcc. Dës Studien hunn transgenic Musse gemaach, déi EGFP ausgedréckt hunn ënner der Kontroll vun entweder den D1 oder den D2 Rezeptor Promoteur (Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP). No 28 Deeg Kokainbehandlung an 2 Deeg Réckzuch, huet d'Wirbelsdicht an béid Drd1-EGFP- an Drd2-EGFP-positiven Neuronen erhéicht. Allerdings war d'Erhéijung vun der Wirbelsätheit nëmmen an Drd1-EGFP-positiven Neuronen 30 Deeg nom Drogentank. Notamment, erhéicht ΔFosB Ausdrock gouf och an Drd1-EGFP- an Drd2-EGFP-Positiv Neuronen observéiert no 2 Deeg vun der Medikament Réckzuch awer nëmmen an Drd1-EGFP-Positiven Neuronen no 30 Deeg vum Drogenofhängegen Réckgang. Dës Resultater hindeit datt d'Erhéijung vun der Wirbelsäule no observéierter chronescher Kokainbehandlung stabil ass nëmmen an D1-Rezeptor-enthale Neuronen an datt ΔFosB Ausdrock ass verbonne mat der Bildung an / oder den Ënnerhalt vun dendritesche Wirbelen an D1 souwéi D2 Rezeptor-enthalen Neuronen zu NAcc.
De mesolimbesche dopaminergesche Wee besteet aus Neuronen an der ventrale tegmentaler Regioun déi den Nukleus accumbens (NAcc), olfaktoresch Tuberkel, prefrontal Cortex, an amygdala (1), wärend nigrostriatal dopaminergesch Neuronen an der substantia nigra (pars compacta) eng opsteigend Projektioun op dorsal Striatum stellen (2). Psychostimulanten erhéijen synaptesch Konzentratioune vun Dopamin am NAcc: Kokain, andeems d'Dopaminopnahm vum synaptesche Spalt blockéiert gëtt, an Amphetamin, andeems d'Dopamin Fräiloossung aus Nerve-Terminaler gefördert gëtt (3-5). Widderhuelend, intermittierend Verwaltung vu Psychostimulanten féiert zu erhöhte Verhalensreaktiounen (Sensibiliséierung) op déi akut stimuléierend Effekter vun dësen Drogen (6-8). Déi meescht Zeile vu Beweiser suggeréieren datt adaptiv Ännerungen am ventrale tegmental Beräich – NAcc dopaminergesche System zentral sinn fir Verännerungen an der erfahrungsofhängeger Plastizitéit, déi dem Drogen-induzéierten Verhalen ënnersträichen.
Zousätzlech zu Dopamin, Glutamat ass néideg fir d'Entwécklung vu Verhalensensibiliséierung an Äntwert op Psychostimulanten (9, 10). Mëttelgréisst spiny Neuronen (MSNs) am ventrale Striatum kréien excitatoresch glutamatergesch Projektioune vu prefrontale Cortex déi op de Kapp vun dendritesche Wirbels synapse. MSNs sinn och d'Haaptziel fir dopaminergesch Axonen, déi sech op Wirbelsäulen synapséieren (1, 11, 12). Dofir stellen dendritesch Pickelen a MSNs dat Zellular Fach wou dopaminergesch a glutamatergesch Iwwerdroung am Ufank integréiert sinn.
Dopamine wierkt op zwou grouss Rezeptor-Ënnerfamillen, d'D1 Subfamilie (D1 an D5 Subtypen) an d'D2 Ënnerfamilie (D2, D3, an D4 Subtypen) (13). Am dorsale Striatum hunn anatomesch Studien gewisen datt striatonigral MSNs héich Niveaue vun D1 Rezeptoren enthalen (zesumme mat Substanz P an Dynorphin), wärend striatopallidal MSNs haaptsächlech D2 Rezeptoren ausdrécken (zesumme mat Enkephalin) (14-17). D'Projektioune vum NAcc si méi komplex wéi an dorsal Streatum, mat der Schuel an de Kärendeeler vum NAcc vir ze ënnerscheede Subregiounen vum ventrale Pallidum an dem ventrale tegmental Gebitt an substantia nigra (18). Wou D2 Rezeptoren an Enkephalin héich ausgedréckt sinn an Projektiounen zum ventrale pallidum, ginn D1 Rezeptoren an der Substanz P gläich a verdeelt an Projektioune bis ventral pallidum a ventralt tegmental Gebitt (19). Studien vun Agonisten an Antagonisten selektiv fir D1 oder D2 Rezeptoren hunn ugewisen datt béid D1 an D2 Rezeptoren fir psychostimulant-ofhängeg Verhalensverännerungen noutwendeg sinn (20-25). Wéi och ëmmer, d'Roll vun dësen Rezeptoren schéngt anescht ze sinn. Zum Beispill, Stimulatioun vun D1 Rezeptoren attenuéiert Kokain Sich induzéiert duerch Kokain Priming Injektiounen a Kokain-verbonne Ëmweltkouen, wärend Stimulatioun vun D2 Rezeptoren erliichtert Kokain-induzéierter Erhuelung (26-28).
De Verhalensabnormalitéiten verbonne mat der psychostimuléierter Sucht ass extrem laang geliewt. Dofir ass et bedeitend Interesse gewiescht fir laang dauernd Medikament-induzéiert Verännerungen um molekulare a strukturellen Niveau an neuronalen Circuiten ze identifizéieren, déi vun Dopamin a Glutamat geregelt goufen (29-32). Notamment ass eng laangfristeg Belaaschtung fir Kokain oder Amphetamin fonnt datt d'Zuel vun den dendritesche Branche Punkten an d'Spine vu MSNs am NAcc erhéijen (33-35). Dës strukturell Ännerunge gouf gewisen fir bestänneg bis zu ≈1 – 3.5 Méint no der leschter Medikamentekspositioun (30, 35) a si proposéiert fir laang dauerhaft Ännerungen an der synaptescher Plastizitéit mat psychostimulantem Belaaschtung ze verbannen.
D'Zil vun der aktueller Etude war d'Kokain-induzéierter strukturell Ännerunge vun dendritesche Wirbels ze ënnersichen an Ënnerpopulatiounen vun akkumuléierte MSNs, déi entweder D1 oder D2 Rezeptoren ausdrécken. An dësen Studien hu mir bakteriell kënschtlech Chromosome (BAC) transgener Musse benotzt déi EGFP ënner der Kontroll vun entweder den D1 (Drd1-EGFP) oder D2 (Drd2-EGFP) Dopamin Rezeptor Promoter (36). D'Resultater weisen datt, obwuel eng verstäerkte Wirbelsätheit ufanks am D1 Rezeptor-enthale MSNs an D2 Rezeptor-enthale MSNs optrieden, déi verännert Spinnensdicht ass stabil nëmmen an D1 Rezeptor-enthaltende Neuronen. Ausserdeem fanne mir ähnlech Verännerungen am Ausdrock vum Transkriptiounsfaktor ΔFosB, wat suggeréiert datt ΔFosB an der Formation an / oder Ënnerhalt vun dendritesche Wirbelen am D1 souwéi D2 Rezeptor-enthalen Neuronen am NAcc involvéiert ka sinn.
Resultater
Analyse vun MSNs an Drd1-EGFP an Drd2-EGFP BAC Transgenen Mais.
De Projektiounsmuster vun MSNs aus dorsalen a ventrale Striatum an Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP BAC transgenen Mais ass charakteriséiert duerch Analyse vum GFP Ausdrock (36). Den Ënnerscheedungsausdrock vu GFP a MSNs vum Dorsalstreatum entsprécht allgemeng dee vun endogene D1 oder D2 Rezeptoren, respektiv (36). Mir analyséiert weider Differentialausdrock vun GFP an NAcc an Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP Mais (Figebam. 1a an b). Och wann ≈58% vun Neuronen an NAcc ausgedréckt GFP an Drd1-EGFP Mais (Figebam. 1a), ≈48% vun Neuronen an NAcc ausgedréckt GFP an Drd-2-EGFP Mais (Figebam. 1b). MSNs representéieren 90 – 95% vun all Neuronen am NAcc (12, 37). D1 Rezeptoren ginn nëmmen a MSNs ausgedréckt, an D2 Rezeptoren ginn an MSNs an a cholinergesche interneuronen ausgedréckt, déi 1 – 3% vun de streatal Neuronen representéieren (37). Wann dës Facteure berücksichtegt ginn, proposéiere d'Resultater datt, minimal, ≈10 – 15% vun MSNs am NAcc méiglecherweis souwuel D1 an D2 Rezeptoren ausdrécken.
Analyse vun Dendritesche Spines an Drd1-EGFP an Drd2-EGFP Mais.
GFP Ausdrock an den Drd1-EGFP an Drd2-EGFP Mais waren nëtzlech fir neuronal Zellkierper ze stain. Wéi och ëmmer, war de GFP Signal bei Dendriten an Dendritesche Wirbels ze schwaach fir hir Analyse z'erméiglechen no Immunostaining mat Anti-GFP Antikörper. Partikel-mediéiert ballistesch Liwwerung vu fluoreszenten Faarfstoffer gouf viru kuerzem benotzt fir neuronal Populatiounen op eng séier an effizient Manéier ze labeléieren (38). Voll Neuronen kënnen mat dëser Technik bezeechent ginn, an d'Method schéngt vergläichbar mat Golgi – Cox staining ze sinn. Fir d'dendritesch Morphologie vun Neuronen am NAcc ze analyséieren, goufe fixe cumuläre Scheiwen mat der Lipophilic Fluoreszenzfaarf 1,1′-Diotadecyl-3,3,3 ′, 3′-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI) mat Hëllef vun engem Genpistool gezeechent. E Beispill vun engem DiI-fiicht MSN ass gewisen Figebam. 1cAn. Ënnert de benotzten Bedéngungen hu mir meeschtens gezeechent Neuronen observéiert ouni iwwerlappend Dendriten vun aneren etiketten Neuronen. Bei méi héijer Vergréisserung, konnt detailléiert dendritesch Morphologie, och dendritesch Wirbelen observéiert ginn (Figebam. 1d).
Mir hunn duerno eng Kombinatioun vun DiI Etikettéierung an Immunohistochemie fir GFP an entweder Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP Transgenic Mais benotzt, wat méiglech gemaach gouf andeems eng niddreg Konzentratioun vu Spullmëttel fir Tissue-Permeabiliséierung benotzt gouf (kuckt Methoden). Duerch e suergfältege Verglach vum DiI Fleck an GFP Ausdrock an den Zellkierper vun MSNs, konnte mir DiI- a GFP-Positiv oder DiI-Positiv a GFP-Negativ Neuronen an Drd1-EGFP identifizéieren (Figebam. 2a) oder Drd2-EGFP (Figebam. 2b) Mais. Fir déi folgend Studien, analyséiert mir dendritesch Morphologie an nëmmen DiI- a GFP-Positiv Neuronen aus Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP Mais.
Chronesch Kokainbehandlung Resultater an enger Erhéijung vun der Wirbelsäitegkeet an akkumbal MSNs ausdrécken entweder Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP.
Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP Mais goufen wiederholend mat Kokain (30 mg / kg) oder Salz gesalzt fir véier opfolgend Wochen (kuckt) Methoden). Zwee Deeg (2WD) oder 30 Deeg (30WD) no der leschter Medikamentbehandlung goufen Gehore fir DiI Etikettéierung an Immunohistochemie verschafft wéi hei uewen beschriwwen. Eng fréier Studie huet gemellt datt chronesch Behandlung mat Amphetamin eng Erhéijung vun der Wirbelsäit op distale awer net proximal Dendriten vun MSNs am NAcc (35). Mir limitéieren eis Analyse also zu distalen Dendriten (dh déi mat Second- oder Drëtt-Ordnungszweigungen), och Terminalregiounen. Wann op 2WD analyséiert, gouf d'Wirbelsätheet fonnt zu Drd1-EGFP-positiven MSNs erhéijen (128% vun Salz Salzgrupp) (Figebam. 3a an c) an zu engem klengen Ausmooss an Drd2-EGFP-positiven Neuronen (115% vun Salz Salzgrupp) (Figebam. 3 b an d). Nom 30WD, erhéicht verstäerkte Wirbelsäule war Drd1-EGFP-Positiv Neuronen (118% vun der Salzwaasser Kontroll) (Figebam. 3 a an c) awer net an Drd2-EGFP-positiven Neuronen (Figebam. 3 b an d).
D’Morphologie vun dendritesche Wirbelen ass variabel wat hir Längt an der Breet vum Wirbelspëtzt sinn. Mir hunn dofir dendritesch Protrusiounen a véier Wirbelspëtzeklassen (Stubb, Champignon, Dënn a Filopodia) op 2WD vu Kokain (Donnéeën net gewisen) klassifizéiert. D'Dicht vu Pilzentyp (119.7 ± 4.0%, P <0.01) an dënn Wirbelen (120.0 ± 3.4%, P <0.01) gouf duerch Kokainbehandlung an Drd1-EGFP-positiven MSNs erhéicht, wärend d'Dicht vu stompeg (182.4 ± 21.6%, P & Si besteet; & Si besteet; 0.05) an mushroom Pick (122.5 ± 5.0%, P & Si besteet; 0.01) war zu Drd2-EGFP-positiv MSNs fräi. Et war keng signifikant Erhéijung vun de stëpsege Wirbelen an Drd1-EGFP-positiven Neuronen oder vun dënnen Dornen an Drd2-EGFP-positiven Neuronen.
Chronesch Kokain induzéiert ΔFosB Ausdrock an Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Positiv MSNs an NAcc.
ΔFosB ass e Member vun der Fos Famill vun Transkriptiounsfaktoren. Wou d'akute Verwaltung vu Kokain eng séier a transient Induktioun vu verschiddene Fos Isoformen an der NAcc induzéiert, widderhëlt eng Belaaschtung fir Kokain de Niveau vun ΔFosB erop. Ausserdeem ass d'Erhéijung vun der ΔFosB Ausdrock an der NAcc fir Wochen bis Méint no der Stéierung vun der Medikamentbelaaschtung bestoe bliwwen a gouf proposéiert fir eng laang dauerhaft Reguléierung vum Genexpressioun ze bedeelegen, och nodeems d'Drogen opgehalen huet (29, 39, 40).
Fir d'Induktioun vun ΔFosB an NAcc vun Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP Musse no Kokainbehandlung ze iwwerpréifen, analyséiere mir FosB an GFP Ausdrock duerch Duebel Etikettéierung (Figebam. 4 an Table 1) Den Anti-FosB Antikörper erkennt all Form vu FosB, awer mir huelen un datt de verstäerkten Immunofestig representsFosB duerstellt (kuckt Methoden fir weider Diskussioun). An Salzlinn behandelte Mais, hunn 16% vun Drd1-EGFP-positiven Neuronen an 15% vun Drd2-EGFP-positiven Neuronen ausgedréckt FosB Immunreaktivitéit mat relativ schwaacher Intensitéit (Figebam. 4 a an b an Table 1). Widderholl Kokainbehandlung gefollegt vu 2WD huet zu enger däitlecher Erhéijung vun der Unzuel vun Drd1-EGFP-Positiven Neuronen gefouert, déi ΔFosB (55% vun GFP-positiven Neuronen) coexpresséiert hunn (Figebam. 4c an Table 1). Eng méi kleng, awer ëmmer bedeitend Erhéijung vun ΔFosB Ausdrock gouf an Drd2-EGFP-Positiv Neuronen (25% vun GFP-positiven Neuronen) fonnt (Figebam. 4d an Table 1). Wéi mat de Verännerunge vun der Wirbelsäthet, war de verstäerkten Ausdrock vun ΔFosB an Drd1-EGFP-Positiv Neuronen (46% vun GFP-positiven Neuronen) awer net an Drd2-EGFP-positiven Neuronen (15% vun GFP-positiven Neuronen) nach 30WD (Figebam. 4 e an f an Table 1). Notiz datt de verstäerkten ΔFosB Ausdrock observéiert gouf Figebam. 4f ass an Drd2-EGFP-negativ Neuronen präsent.
Diskussioun
Méi laang dauerhafter Adaptatiounen an der dopaminergescher Neurotransmissioun ginn gegleeft datt se Suchtfaktiver Behuelen mat psychostimulantem Drogen assoziéiert. Besonnesch psychostimulant-induzéiert Erhéigung vun der dendritescher Wirbelsätheet vun MSNs am NAcc goufen hypothese gelooss fir mat der Reorganisatioun vun der synaptescher Konnektivitéit ze verbannen (30). De NAcc besteet gréisstendeels aus zwee ënnerschiddleche Subpopulatiounen vu MSNs, déi héich Niveaue vun entweder D1 oder D2 Dopamin Rezeptoren ausdrécken. An der heiteger Etude hu mir d'Wirbelsätheet an ënnerscheedlecher D1 oder D2 Rezeptor-enthale MSNs an NAcc no chronescher Kokainbehandlung analyséiert. D'Resultater, déi erzielt hunn, weisen datt, obwuel eng Erhéijung vun der Wirbelsäischheet am Ufank bei D1 Rezeptor-enthale MSNs an D2 Rezeptor-enthale MSNs optrieden, déi verännert Spinnensdicht ass stabil nëmmen an D1-Rezeptor-enthaltende Neuronen. Ausserdeem fanne mir en ähnlecht Muster vu Verännerunge vum Ausdrock vum Transkriptiounsfaktor ΔFosB an D1 an D2 Rezeptor-enthale MSNs.
Dës Studien hunn d'BAC transgener Musse gemaach, déi GFP a spezifesche Subpopulatioune vu MSNs ausdrécken ënner der Kontroll vun entweder den D1 oder den D2 Rezeptor Promoteur. Ausserdeem hu mir eng Duebel-Etikettungsmethod entwéckelt, déi d'Immunohistochemie fir GFP mat ballistescher Etikettéiere vun Neuronen kombinéiert mat DiI. Virdrun Studien hunn d'Golgi-Cox Method benotzt fir den Effekt vu Psychostimulanten op der Wirbelsdicht ze analyséieren (34), an d'DiI Method benotzt hei hunn Resultater ginn déi quantitativ vergläichbar waren. Mir hunn d'duebel Etikettéierungsmethod entwéckelt well d'Golgi Färzen net kompatibel mat der Immunohistochemie ass. Immunostaining verlaangt normalerweis Tissue-Permeabiliséierung mat Botzmëttelen, e Prozess, deen typesch zur Solubiliséierung vu lipophilen Faarwen aus der Membran féiert (38). Wéi och ëmmer, an eisen aktuellen Studien huet d'GFP Immunostaining net eng héich Konzentratioun vu Spullmëttel fir Tissue-Permeabiliséierung erfordert an sou konnt a Verbindung mat der lipophiler Faarfzeechen benotzt ginn. Eis Duebellabelungsmethod soll allgemeng nëtzlech si fir Studie vu strukturelle Verännerunge vun dendritesche Wirbelen, zum Beispill wann se fir d'Analyse vun BAC transgenen Mauslinnen benotzt ginn, wou GFP a spezifesche Populatiounen vun Neuronen am Cortex ausgedréckt gëtt (36).
Och wann et nach e bësse kontrovers ass, gëtt et ugeholl datt D1 an D2 Rezeptoren gréisstendeels anatomesch mat den direkten (striatonigral) an indirekten (striatopallidal) striatal Projektioun Neuronen getrennt sinn, respektiv (17, 41). Ufanks Charakteriséierung vun der Lokaliséierung vun GFP an den Drd1-EGFP an Drd2-EGFP Mais war konsequent mat dëser Konklusioun (36). Ausserdeem ass eis Analyse vun der Unzuel vun GFP-positiven Neuronen an NAcc vun Drd1-EGFP an Drd2-EGFP Musse konsequent mat der Conclusioun datt ≈50% vun MSNs nëmmen D1 Rezeptoren ausdrécken, datt ≈35 – 40% nëmmen D2 Rezeptoren ausdrécken, an datt ≈10 – 15% souwuel D1 an D2 Empfänger coexpresséieren. Dëse Wäert vun der Coexpressioun ass ähnlech wéi dee implizéiert duerch Studien iwwer dorsal Striatum, déi eng Patch-Clamp Analyse vun eenzel Striatal Neuronen mat RT-PCR Techniken kombinéiert fir mRNAs ze isoléieren an ze amplifizéieren (≈17% Coexpression vun Enkephalin a Substanz P) (42). Et sollt bemierkt datt eis aktuell Studien net d'Fro vum Ausdrock vun D3, D4, an D5 Rezeptoren adresséieren, an och net op d'Fro vum nidderegen Ausdrockniveau vun D1 Rezeptoren an MSNs ausdrécken, déi héich Niveaue vun D2 Rezeptoren ausdrécken oder vice versa.
Verschidde fréier Studien hunn d'neuronal Lokaliséierung vu psychostimulant-induzéierter Fos Ausdrock an d'Roll vun D1 an D2 Rezeptoren ënnersicht (43-45). Dës Studien hunn d'Conclusioun ënnerstëtzt datt Fos an ΔFosB Induktioun duerch Aktivatioun vun D1 Rezeptoren mediéiert sinn. Allerdings ass d'zellular Lokaliséierung vum Fos Ausdrock beaflosst vum Ëmweltkontext an deem psychostimulant Medikamenter verwaltet ginn (46, 47). Zum Beispill, Amphetamin oder Kokain, déi an der Heembeschäftegung ginn, induzéiert direkt fréi Genen (inklusiv Fos) léiwer an der Substanz P-positiven Zellen, déi D1 Rezeptoren zesummekompresséieren. Am Géigesaz, kënnen dës Medikamenter Fos-Ausdrock a béid D1 an D2 Rezeptor-enthale MSNs induzéieren wann se an engem neie Ëmfeld verwaltet ginn. De Protokoll, deen an eisen aktuellen Studien benotzt gëtt, huet keng Plo-Medikamentinjektioun mat Belaaschtung fir e Roman Ëmfeld enthalen. Wéi och ëmmer, mir kënnen net eng Zort Kontext-ofhängeg Stress ausgeschloss déi verantwortlech ass fir ΔFosB Ausdrock an D2 Rezeptor-enthale MSNs.
Eng bemierkenswäert Feature vun den aktuellen Resultater war d'parallel Muster vun der verstäerkter Wirbelsätheet an ΔFosB Ausdrock. Erwuessene Wirbelsätheet an ΔFosB Ausdrock koum Ufank bei MSNs ausdrécklech Drd1-EGFP an Drd2-EGFP. Wéi och ëmmer, dës Ännerunge ware stabil nëmmen an D1 Rezeptor-enthale Neuronen. Eng méiglech Erklärung fir d'Observatioun datt d'Erhéijung vun der Wirbelsäule an ΔFosB Ausdrock transiently an D2 Rezeptor-enthale Neuronen fonnt gouf, ass datt dëst an der klenger Fraktioun vu MSNs geschitt ass, déi souwuel D1 an D2 Dopamin Rezeptoren zesummekompresséieren. Also, déi transient Natur vun dësen Erhéijunge ka mat antagonisteschen Effekter vun der D2 Rezeptor Aktivatioun op D1-ofhängeg Signaliséierungsweeër verbonne sinn (48). Et ass interessant datt d'Verännerunge vun der Wirbelsätheet an ΔFosB Ausdrock reversibel waren, wat d'Fäegkeet vun D2 Rezeptor-ofhängeg Signaliséierungsweeër reflektéiert fir d'Stabilitéit vun ΔFosB ze beaflossen.
D'Observatioun datt et Parallel Ännerungen am Ausdrock vun ΔFosB an der Wirbelsähegkeet sinn, ass konsequent mat der Iddi datt ΔFosB an der initialer Formation involvéiert ass an dem spéideren Ënnerhalt vun dendritesche Wirbelen am D1 Rezeptor-enthaltende Neuronen am NAcc. Ausdrock vun ΔFosB gëtt kontrolléiert vun der D1 / DARPP-32 / PP1-ofhängeg Signaléierungswee an MSNs (49). Verschidde Studie hu gewisen datt ΔFosB eng wichteg Roll spillt an déi belountend an locomotoraktiverend Aktiounen vu Psychostimulanten (39), méiglecherweis andeems en Ausdrock vu multiple Genen beaflosst, déi Neurotransmitter Rezeptoren, Signalproteine an Proteinen involvéiert an der Reguléierung vun der neuronaler Morphologie involvéiert sinn (50). Wéi och ëmmer, déi spezifesch molekulär Mechanismen involvéiert an der chronescher Kokain-induzéierter Wirbelsailung sinn aktuell net bekannt. Eis fréier Studien hu gewisen datt intraaccumbal Infusioun vum Cdk5 Inhibitor Roscovitin attenuéiert Kokain-induzéierter Erhéijung vun der Wirbelsätheet (51). Ausserdeem ass Cdk5 en downstream Zilgen fir ΔFosB a gouf an kompenséierend adaptiven Ännerungen agebonne mat chronescher Kokainbehandlung (52). Dofir ass d'Verännerung an der Cdk5-ofhängeg Phosphorylatioun e plausibele Mechanismus ënner Basis vu Kokain-induzéierter Wirbelsetzung an / oder der Wirbelsähegkeet Stabilitéit. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), a Spinophilin (56) si Substrater fir Cdk5 a si sinn all an der Reguléierung vun der Wirbelsmorphogenese involvéiert (57-60). Weider Karakteriséierung vun dësen an aneren Cdk5 Substraten a Pickelen wäerten hoffentlech Liicht op d'Mechanismen ausmaachen, déi an der Reguléierung vun der Wirbelsbildung duerch Psychostimulanten involvéiert sinn.
Methoden
Déieren.
Mais déi en EGFP Transgen ënner der Kontroll vun entweder den D1 oder den D2 Dopamin Rezeptoren droen, goufe vum Gensat BAC transgenen Projet generéiert (36). Déi transgen Méis, déi an dëser Etude benotzt goufen, ware 4 – 5 Wochen al a waren op engem Schwäizer – Webster Hannergrond. Mais goufen an engem 12: 12-h Liicht / donkel Zyklus gehaalen an a Gruppe vu 2 – 5 mat Iessen a Waasser verfügbar ad libitum gehal. All Déierprotokoller waren am Aklang mat National Instituter fir Gesondheetsguide fir d'Betreiung an d'Benotzung vun Laboratoire Déieren a goufen vum Rockefeller University Institutional Déierenfleeg- a Benotzungscomité genehmegt.
Drogenbehandlung.
Chronesch Kokainbehandlung (30 mg / kg, deeglech) gouf bericht fir eng robust Erhéijung vun der Wirbelsäitegkeet vu MSNs a béid Kär a Schuel vun der NAcc vu Rat ze produzéieren, awer eng méi niddreg Dosis (15 mg / kg) erhéicht d'Wirbelsdicht nëmmen an D'Schuel (61). Mir hunn dofir déi méi héich Dosis Kokain benotzt fir strukturell Modifikatioun a béid Deeler vum NAcc ze induzéieren. Méis kruten eng Injektioun (ip) vun 30 mg / kg Kokain-HCl (oder Salz) all Dag fir 5 opfolgend Deeg, gefollegt vun 2 Injektiounsfräi Deeg, an dës Prozedur gouf fir 4 opfolgend Wochen widderholl. D'Injektioune goufen am Hauskäreg duerchgefouert. 2WD oder 30WD, Maus Hirn goufe fir DiI Etikettéierung an / oder Immunohistochemie verschafft.
Ballistesch Etikettéiere mat der Luuchtstoffeier DiI.
Mais goufen mat 80 mg / kg Natrium pentobarbital anästheséiert an transkardiell mat 5 ml PBS perfludéiert, gefollegt vu schneller Perfusioun mat 40 ml 4% paraformaldehyd an PBS (20 ml / min). Hirne goufe séier vum Schädel geläscht an an 4% paraformaldehyd fir 10 min postfixéiert. Braineschneiden (100 μm) goufen duerch ballistesch Liwwerung vun der fluoreszenter Faarf DiI (Molekular Proben) bezeechent wéi an der Ref beschriwwen. 38An. Eng kombinéiert DiI Etikettéierung-Immunohistochemie Method gouf mat enger gerénger Konzentratioun vu Wäschmëttel entwéckelt. DiI-markéierter Sektioune goufe mat 0.01% Triton X-100 an PBS fir 15 min permeabiliséiert an dann an 0.01% Triton X-100 an 10% normal Geesserum an PBS fir 1 h inkuptéiert fir netonspezifesch Etikettéierung ze minimiséieren. Tissue Sektioune goufen duerno mat 1% normal Geesserum / 0.01% Triton X-100 an Anti-GFP Antikörper (Abcam, Cambridge, MA) fir 2 h bei Raumtemperatur inkubéiert, gewascht an an engem 1: 1,000 Verdünschung vun FITC- konjugéiert sekundär Antikörper (Molekular Proben). Sektioune goufen op mikroskop Rutschen geluecht an mat Montéierungsmëttel gespaant. Déi ballistesch Etikettéierungsmethod huet detailléiert Analyse vun der dendritescher Wirbelsstruktur erlaabt, an d'Resultater, déi kritt goufen, qualitativ a quantitativ vergläichbar mat fréiere Studien mat der Golgi-Cox Imprägnatiounsmethod a Ratten-Gehinsschneiden34). Wéi och ëmmer, am Géigesaz zu fréiere Studien, hu mir selten zwou Kappwirbeleie bei DiI-faarweger Neuronen observéiert. Dësen Ënnerscheed kann duerch d'Sensibilitéit vu Faarfmethoden oder Verännerlechkeet vun der Maus verursaacht ginn (dës Studie) versus Rottwiss34).
Immunhistochemie.
Déieren goufen wéi uewen beschriwwen anästheséiert an perfuséiert. Gehir goufen ewechgeholl an iwwer Nuecht am 4% paraformaldehyd bei 4 ° C gelagert. Gehirer goufen op 30% sucrose an der PBS-Léisung fir Kryprotektioun iwwerginn. Coronal Sektiounen (12 μm) goufen op engem Gefrierungsmikrotom (Leica) geschnidden an duerno fir Immunohistochemie verschafft. Gehir Sektioune goufen dunn an 0.3% Triton X-100 an PBS fir 15 min permeabiliséiert an zweemol an PBS gereinegt. D'Sektiounen goufen am 10% normal Geesserum an PBS fir 1 h bei 37 ° C virincubéiert, mat primäre Antikörper ausgesat (verdënntem am 1% normal Geesserum an PBS) Iwwernuechtung bei 4 ° C, an duerno an PBS gereinegt a mat Sekundär incubéiert antibodies fir 1 h bei 37 ° C. Déi folgend Antikörper goufe benotzt: Kaninchen Anti-Pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), Maus Anti-NeuN (Chemicon), Kaninchen Anti-GFP, FITC-konjugéiert Anti-Kanéngchen IgG, a Rhodamin- konjugéiert Anti-Maus IgG (Molecular Probes). Fir Triple Etikettéierung (ΔFosB, NeuN, an GFP) goufen Gehirnsektioune fir d'éischt mat Anti-Pan FosB Antikörper an Anti-NeuN Antikörper immunostained an duerno mat sekundären Antikörper incubéiert (rhodamine-konjugéiert Anti-Kanéngchen IgG an Cyan-konjugéiert Anti-Maus IgG ). Duebelfleegeg Gehir Sektioune goufe weider fir GFP Immunostaining mat Hëllef vun Zenon Etikettechnologie (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes) veraarbecht. Den Anti-Pan-FosB-Antikörper gouf op den N-Kappgare vum FosB erhéicht an erkennt ΔFosB a Volllängt FosB (62). Baséierend op fréiere Studien déi gewisen hunn datt ΔFosB awer net FosB oder aner Fos-relatéiert Antigene stabil no expressiver chronescher Kokainbehandlung ausgedréckt gëtt, gi mir un datt déi laang dauerhafter Erhéijung vun der Immunreaktivitéit e stabile Ausdrock vun ΔFosB duerstellt. Allerdings ass d'Identitéit vum immunoreaktive FosB Signal bei Salzbehandlung behandelte Mais observéiert net bekannt. Statistesch Analyse an Table 1 benotzt de Student seng t Test.
Dendritesch Pick Analyse.
Individuell MSNs am NAcc goufen fir Wirbelsäitsanalyse op Basis vu verschidde Critèren gewielt. (i) Et gouf minimal oder guer keng Iwwerlappung mat anere Labelzellen fir ze garantéieren datt Prozesser aus verschiddenen Zellen net verwiesselt ginn. (ii) Op d'mannst dräi primär Dendriten waren noutwendeg fir Zellen ze gesinn fir d'Analyse ze benotzen. (iii) Distal Dendriten (terminal Dendriten oder no beim Terminal Dendrit) goufen ënnersicht. Dendritte vu béiden MSNen am Kär an der Schuel vum NAcc goufen analyséiert. Och wa mir spinnend spinnéiert MSNs observéiert hunn (spiny type II), hu mir nëmmen dicht spined MSNs (spiny type I) analyséiert. Fir d'Wirbelsdensitéit ze berechnen, gouf eng Längt vun Dendrit (> 20 μm laang) mat engem Konfokalmikroskop (Zeiss LSM 510) mat enger Uelech-Tauchobjektiv (× 40) verfollegt. All Biller vun Dendrite goufen a verschiddene geholl z Niveauen (0.5 – 1 μm Déiftintervalle) fir d'Morphologie vun dendritesche Wirbelen z'ënnersichen. All Miessunge goufe mat Metamorph Image Analys Software (Universal Imaging, Downingtown, PA) gemaach. Statistesch Analyse huet de Kolmogorov – Smirnov Test benotzt.
Protrusions aus Dendriten goufen a véier Aarte klasséiert op Basis vun hirer Längt wéi an de Refs beschriwwen. 63 an 64. Klasse 1 Vorsprung, och nach stumpf Protuberanzen genannt, waren <0.5 μm an der Längt, hunn e grousse Wirbelsäikapp gefeelt an hunn keen Hals geschéngt; Klass 2, oder champignonfërmeg Wirbelen, waren tëscht 0.5 an 1.25 μm laang a ware charakteriséiert duerch e kuerzen Hals a grousse Wirbelsäit; Klass 3, oder dënn Wirbelen, louchen tëscht 1.25 an 3.0 μm an haten länglëch Wirbelsäck mat klenge Käpp; Klass 4, oder filopodial Extensiounen, ware laang filamentös Vorspréngungen, déi e erkennbaren Wirbelskop gefeelt hunn.
Arbeschterlidder
Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vun den USA Public Health Service Grant DA10044 (zu PG an ACN) an vun The Simons Foundation, der Peter J. Sharp Foundation, der Picower Foundation, an der FM Kirby Foundation.
Ofkierzungen
- NAcc
- Nukleus accumbens
- MSN
- mëttelgrouss spiny Neuron
- BAC
- bakteriell kënschtlech Chromosom
- Drd1
- dopamine Rezeptor D1 Promoteur-Undriff
- Drd2
- dopamine Rezeptor D2 Promoteur-Undriff
- DiI
- 1,1′-Diotadecyl-3,3,3 ′, 3′-Tetramethylindokarbocyaninperchlorat
- 2WD
- 2 Deeg no der leschter Drogenbehandlung
- 30WD
- 30 Deeg no der leschter Drogenbehandlung.
Referenze
;
