PSMC5, e 19S Proteasomal ATPase, Reguléiert d'Kokain an der Nucleus Accumbens (2015)

PLoS One. 2015 Mee 11;10(5):e0126710. doi: 10.1371/journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ouni M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

mythologesch

ΔFosB ass e stabile Transkriptiounsfaktor deen am Nukleus accumbens (NAc) accumuléiert, e Schlësseldeel vun der Belounungsschaltung vum Gehir, als Äntwert op chronesch Belaaschtung fir Kokain oder aner Drogen vu Mëssbrauch. Wärend ΔFosB bekannt ass fir mat engem Jun Familljemember ze heterodimeriséieren fir en aktiven Transkriptiounsfaktor Komplex ze bilden, gouf et bis elo net eng oppe Exploratioun vun anere méigleche Bindungspartner fir ΔFosB am Gehir. Hei, duerch d'Benotzung vun Hef zwee-Hybrid Assays, identifizéieren mir PSMC5-och bekannt als SUG1, eng ATPase-enthale Ënnerunitéit vum 19S proteasomal Komplex-als en neien interagéierende Protein mat ΔFosB. Mir verifizéieren esou Interaktiounen tëscht endogenen ΔFosB an PSMC5 am NAc a weisen datt béid Proteine ​​​​och Komplexe mat anere Chromatin-Reguléierungsproteine ​​​​mat Genaktivéierung bilden. Mir ginn weider fir ze weisen datt chronesch Kokain nuklear, awer net zytoplasmatesch, Niveauen vum PSMC5 am NAc erhéicht an datt d'Iwwerexpressioun vum PSMC5 an dëser Gehirregioun d'Lokomotorreaktiounen op Kokain fördert. Zesummen beschreiwen dës Erkenntnisser en neie Mechanismus deen zu den Handlungen vun ΔFosB bäidréit an, fir d'éischte Kéier, PSMC5 an Kokain-induzéierter molekulare a Verhalensplastizitéit implizéiert.

Zitat: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, en 19S Proteasomal ATPase, Reguléiert Kokainaktioun am Nucleus Accumbens. PLoS EEN 10 (5): e0126710. doi:10.1371/journal.pone.0126710

Academic Editor: James Edgar McCutcheon, Universitéit vu Leicester, VÉIER KÉIER

Received: Dezember 10, 2014; Akzeptéiert: Abrëll 7, 2015; Verëffentlecht: Mee 11, 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Dëst ass en Open Access Artikel verdeelt ënner de Bedéngungen vun der Creative Commons Attribution License, wat en uneegente Gebrauch, Verdeelung a Reproduktioun an iergendeng Medium erbréngt, wann de ursprénglechen Auteur a Quell wäert uginn

Daten Disponibilitéit: All relevant Donnéeë sinn am Pabeier.

Finanzéierung: Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vu Stipendien vun den National Institutes of Health, dem National Institute on Drug Abuse, a vun der Ishibashi Foundation an der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI Zuelen: 24591735, 26290064, 25116010). D'Finanzéierer hu keng Roll am Studiedesign, Datensammlung an Analyse, Entscheedung fir ze publizéieren oder d'Virbereedung vum Manuskript.

Interessante Concerten: D'Autoren hu deklaréiert datt keng konkret Interessen existéieren.

Aféierung

ΔFosB, e ofgeschniddene Produkt vun der FosB Gen, gehéiert zu der Fos Famill vun Transkriptiounsfaktoren, déi och c-Fos, volllängt FosB, Fra-1 a Fra-2 enthalen. ΔFosB, wéi aner Fos Proteinen, heterodimeriséiert mat engem Jun Famill Protein - c-Jun, JunB oder JunD - fir en aktiven AP-1 (Activator Protein-1) Transkriptiounsfaktor Komplex ze bilden, deen den Ausdrock vu spezifesche Zilgenen induzéiert oder ënnerdréckt. [1,2].

ΔFosB gouf gewisen eng Schlësselroll an der Drogenofhängeger ze spillen [2]. Eenzegaarteg ënnert Fos Famill Proteinen, et accumuléiert an nucleus accumbens (NAc) an aner belount-verbonne Gehir Regiounen no widderholl Drogenofhängeger Administratioun wéinst sengem héijen Niveau vun Stabilitéit [1]3,4], wat duerch de Mangel u C-terminalen Degron Domainen an duerch Phosphorylatioun duerch verschidde Proteinkinasen vermëttelt gëtt [5-7]. Esou Induktioun vun ΔFosB am NAc vermëttelt verstäerkte Verhalensreaktiounen op Drogen vu Mëssbrauch. Also, Iwwerexpressioun vun ΔFosB an dëser Gehirregioun vun erwuessenen Déieren, entweder duerch d'Benotzung vu virale Vektoren oder inducible bitransgene Mais, erhéicht d'Sensibilitéit vun engem Déier fir d'Lokomotoraktivéierend a belountend Effekter vu Kokain an Opiaten wéi och d'Motivatioun vun engem Déier fir sech selwer ze administréieren. Kokain [7-11]. Ëmgekéiert, Iwwerexpressioun vun dominanten negativen Antagonisten vun ΔFosB verursaacht déi entgéintgesate Verhalensphenotypen [10-12].

Mir an anerer hu virdru bestätegt, duerch d'Benotzung vu Gel Shift Assays, datt JunD a vläicht aner Jun Famill Proteinen déi wichtegst Bindungspartner vun ΔFosB am Gehir in vivo sinn [13-15]. Wéi och ëmmer, bis elo gouf et keng oppe, onbestänneg Evaluatioun vun de bindende Partner vum ΔFosB am Gehir. Hei hu mir versicht nei Bindungspartner fir ΔFosB z'identifizéieren mat Hëllef vun engem Hef zwee-Hybrid Assay [16,17]. Eis Daten hunn opgedeckt datt PSMC5, och bekannt als SUG1, e robuste Partner vun ΔFosB souwuel in vitro an am NAc in vivo ass, wou et ΔFosB als Deel vun engem Kokain-induzéierten Transkriptiounsaktivéierungskomplex enthält, deen och CBP (CREB bindend Protein enthält) ) an p300 - souwuel Histon Acetyltransferases (HATs) - wéi och BRG1 (e Chromatin Remodeling Protein). Mir ginn weider fir ze weisen datt chronesch Belaaschtung fir Kokain d'Nuklearniveauen vum PSMC5 verännert, eng ATPase-enthale Ënnerunitéit vum 19S proteasomalen Komplex, am NAc an datt PSMC5 am Tour kontrolléiert Verhalensreaktiounen op Kokain.

Material a Methoden

Hef zwee-Hybrid Duerchmusterung

MaV203 Hefzellen (Invitrogen Life Technologies) goufen co-transfektéiert mat pDBLeu, déi verschidde Fragmenter vum ΔFosB Protein fueren, an eng Maus Gehirbibliothéik gouf an pPC86 (Invitrogen Life Technologies) subklonéiert. Transforméiert Zellen goufen op SC-Mëttel ugebaut ouni Leucin, Tryptophan, an Histidin, an enthält 10 mM 3-aminotriazol. Bindung tëscht FosB Fragmenter an engem Kandidat Partner induzéiert dräi Reporter Genen (His3, Ur3, an LacZ), an d'Induktioun mécht Transformanten fäeg ënner de benotzte kultivéierte Bedéngungen ze iwwerliewen. Positiv Klone goufen nei getest mat frësche pDBLeu-ΔFosB Fragmenter duerch Retransformatiounsassays a MaV203 Zellen.

Zell Linnen

Maus Neuro 2A Neuroblastoma Zellen (ATCC) goufen am Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC) erhale gelooss, ergänzt mat 10% Fetal Bovine Serum (FBS) bei 37 ° C a 5% CO2. Rat 1A Zellen waren e Kaddo vum Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] an ënnerhalen an Dulbecco's MEM (DMEM) (Life Technologies), ergänzt mat 10% FBS bei 37°C a 5% CO2. Transfektioun vun Zellen mat Plasmid DNA gouf mat Effectene (Qiagen) no den Instruktioune vum Hiersteller erreecht.

PSMC5 an ΔFosB Konstruktiounen

Verschidde mutant Forme vu PSMC5, all FLAG-tagéiert op hirem N-Terminus, goufen generéiert fir ze benotzen an Immunoprecipitatioun oder viral-mediéiert Gentransfer Experimenter. Dës enthalen: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil Domain (PSMC5-ΔCC, feelt Aminosäuren 27-68), PSMC5-NT (besteet aus dem N-terminale Fragment vum Protein, Aminosäuren 1-151), an PSMC5 -CT (besteet aus dem C-terminale Fragment vum Protein, 172 Aminosäuren) (kuckt Figur 1). Mir hunn och N-terminal MYC-tagged Forme vu Wildtype ΔFosB souwéi ΔFosB benotzt mat enger Mutatioun a sengem Leucin-Zipper Domain (Mutatioun vun Aminosäuren 182 bis 205, déi bekannt ass fir Heterodimeriséierung mat Jun Famill Proteinen ze läschen [6].

Vignette
Fig 1. ΔFosB bindt un PSMC5 in vitro.

 

A. Schema vun ΔFosB, ΔFosB-LZM an deem de Leucin Zipper Domain mutéiert ass fir ΔFosB Heterodimeriséierung mat Jun Proteinen ze läschen, an Δ2ΔFosB déi déi éischt 78 Aminosäuren vum ΔFosB N-Terminus feelen. B. Schema vun PSMC5, PSMC5-NT déi déi éischt 151 Aminosaier Saieren vun PSMC5 ëmfaasst, PSMC5-CT déi éischt 235 Aminosaier Saieren vun PSMC5 fehlt, an PSMC5-ΔCC déi de coiled-coil Domain fehlt (Aminosaier Saieren 28-68) . Den AAA Domain entsprécht engem Motiv, ATPases Associéiert mat diversen cellulären Aktivitéiten, präsent a ville ATPases. C. 2.4 μg vun pcDNA3.1-ΔFosB (Spuren 1-4) oder ΔFosB-LZM (Spuer 5) gouf mat 2.4 μg FLAG-tagged PSMC5 oder verschidde Läschmutanten an Neuro2a Zellen co-transfektéiert. Zwee Deeg no der Transfektioun goufen d'Zellen lyséiert an d'Immunoprecipitatioun mat engem Anti-FLAG Antikörper ënnerworf an duerno Western blotted mat Anti-ΔFosB oder Anti-FLAG Antikörper. Notéiert datt ΔFosB, awer net ΔFosB-LZM, robust un PSMC5 oder PSMC5-NT bindt, awer net PSMC5-CT oder PSMC5-ΔCC. D'Daten an der Figur gewisen goufen an triplicate replizéiert an jiddereng vun dräi getrennten Experimenter.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Déieren

Néng bis 11 Wochen al C57BL / 6J männlech Mais (The Jackson Laboratory) goufen fir all Experimenter benotzt. D'Déieren goufen op engem 12-h Liicht-donkel Zyklus mat Zougang zu Iessen a Waasser ënnerbruecht ad libitum a goufen 1 Woch virum Experiment gewunnt. Zwee Kokainbehandlungsregime goufe benotzt. Fir d'biochemesch Effekter vu Kokain ze studéieren, goufen d'Déieren 7 deeglech Dosen Kokain (20 mg / kg) oder Salins gegeben, an ëmbruecht duerch Entkapung 24 Stonnen no der leschter Injektioun. Dëst ass e Standardprotokoll, dee gewise gouf fir vill molekulare a cellulär Äntwerten op d'Drogen ze produzéieren.7]. Fir den Afloss vum PSMC5 am Nukleus accumbens op Verhalensreaktiounen op Kokain ze studéieren, hu mir eng Ënnerschwelldosis vum Medikament benotzt (7.5 mg / kg; kuckt Locomotor Sensibiliséierung hei drënner) baséiert op der Hypothese datt PSMC5, wéi ΔFosB, d'Sensibilitéit vun engem Déier op erhéijen. Kokain [8]. All Déierexperimenter goufen vum Institutional Animal Care and Use Committee um Mount Sinai guttgeheescht.

Immunoprecipitatioun a Western Blotting

Neuro 2A Zellen sech mat wildtype oder mutant Formen vun PSMC5 transfected. Zwee Deeg no der Transfektioun goufen d'Zellen an PBS gewäsch, an RIPA-Puffer lyséiert (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% Natriumdeoxycholat, 10 mM Natriumbutyrat, Protease-Inhibitor Cocktail) . Lysate goufen opgedeelt an inkubéiert mat entweder nonimmune IgG (Sigma) oder Anti-FLAG Antikörper (Sigma) fir 3 Stonnen bei 4 ° C. Immunoprecipitation gouf mat Protein G Perlen (Invitrogen) gemaach wéi beschriwwen [19]. Kuerz, immunoprecipitéiert Proteine ​​goufen SDS-PAGE ënnerworf an duerch Western Blotting analyséiert mat Anti-FosB / ΔFosB Antikörper (Cell Signaling Technology) baséiert op publizéierte Protokoller [7]. Fir in vivo Proteinbindende Assays hu mir gereinegt nuklear Fraktiounen aus punch-dissected NAc vu Mais no chronescher Kokainbehandlung benotzt (20 mg / kg IP deeglech fir 7 Deeg, mat Mais benotzt 24 Stonnen no der leschter Injektioun). Co-immunoprecipitation vun nuklear Fraktiounen war mat der Nuclear Complex Co-IP Kit (Aktiv Motiv) no den Hiersteller d'Instruktioune gesuergt. Déi folgend Antikörper goufen benotzt: MYC oder ß-Actin, Zell Signaltechnologie (Danvers, MA), PSMC5 an Histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 a BRG1, Santa Cruz Biotechnologie (Santa Cruz, CA), an FLAG M2, Sigma.

Immunhistochemie

Immunhistochemie gouf no publizéierte Prozedure gemaach [20]. Mais goufen anästhetiséiert an intracardially mat 4% Paraformaldehyd am PBS perfuséiert. Gehir goufe mat 30% Saccharose cryoprotectéiert, an duerno gefruer a bei -80 ° C bis zum Gebrauch gelagert. Coronal Sektiounen (40 μm) goufen op engem Kryostat geschnidden a fir Immunhistochemie veraarbecht. Free-floating Sektiounen goufen pre-incubated an engem Spär Puffer mat 0.3% Triton an 3% normal Iesel Serum. ΔFosB gouf festgestallt mat engem Geess polyklonalen Antikörper opgeworf géint den N-terminalen Deel vum Protein (1/1000 Santa Cruz Biotechnologie). PSMC5 war mat engem Kanéngchen polyclonal antibody fonnt (1/100 Abcam, Cambridge, MA). D'Biller goufen mat engem konfokale Mikroskop (60x Vergréisserung; Zeiss) geholl.

Locomotor Sensibiliséierung

All Mais kruten alldeeglech IP Injektiounen vu Salzlinn fir 3 Deeg fir se un de Stress vun den Injektiounen ze habituéieren. Den nächsten Dag goufen d'Mais IP mat Salins oder enger Ënnerschwelldosis Kokain (7.5 mg / kg; kuckt ënner Déieren uewen) injizéiert an direkt an neie Lokomotorboxen plazéiert. D'Lokomotoraktivitéit vun de Mais gouf mat engem Photobeam-System opgeholl wéi ambulant Strahlpausen fir 30 min. Dës Behandlungen goufen all Dag fir 3 Deeg widderholl.

Viral-mediéiert Gentransfer

Mir hunn extensiv publizéiert Methoden fir viral-mediéiert Gentransfer benotzt [7,8,11,19]. Kuerz gesot, Ausdrocksplasmide fir PSMC5 oder fir e puer vu senge Mutanten (kuckt PSMC5 an ΔFosB Konstrukter hei uewen) goufen an de bicistronesche p1005 (+) HSV Plasmid subklonéiert, deen GFP ënner der Kontroll vum CMV Promoteur ausdréckt, an PSMC5 oder seng Mutanten ënner deem vum IE4/5 Promoteur. Ënnert Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) Anästhesie, goufen Mais an engem klengen-Déier stereotaxic Instrument positionéiert, an der cranial Uewerfläch war ausgesat. Drësseg-dräi Jauge Sprëtznadelen goufen benotzt fir bilateral 0.5 μl vun engem HSV-Vektor an den NAc bei engem 10 ° Wénkel (AP +1.6; ML +1.5; DV -4.4) mat enger Rate vun 0.1 μl / min. Déieren, déi HSV Injektiounen kréien, konnten sech fir 2 Deeg no der Operatioun virum Experimenter erholen.

Statistiken

ANOVAs an T-Tester vum Student goufe benotzt, korrigéiert fir méi Vergläicher, mat Bedeitung gesat op p <0.05.

Resultater

PSMC5: Roman Bindungspartner vum ΔFosB

Mir hunn virleefeg Experimenter gemaach fir e passend Fragment vun ΔFosB z'identifizéieren dat als Köder an enger Hef zwee-Hybrid Assay gedéngt huet ouni de System automatesch ze aktivéieren. Holo-ΔFosB induzéiert Reporter Genaktivitéit eleng, sou wéi dat N-terminal 1-78 Aminosaier Fragment vum Protein. Wéi och ëmmer, en N-terminal ofgeschnidden ΔFosB (Figur 1A), genannt Δ2ΔFosB, deen déi éischt 78 Aminosäuren vum Protein fehlt, huet dësen Effekt net. Dofir hu mir Δ2ΔFosB als Köderprotein benotzt.

Fir potenziell bindend Partner ze screenen, hu mir eng Maus Gehirbibliothéik benotzt, déi am pPC86 subklonéiert ass. Mir identifizéiert 11 Kandidaten fir verbindlech Partner. Och wann dës Proteinen dem ΔFosB bekannte Heterodimeriséierungspartner abegraff hunn, c-Jun a JunD (Table 1), de meeschte verbreete Kandidat bei wäitem war PSMC5. Wärend iwwerraschend war dëst eng interessant Entdeckung, well PSMC5 viru Joeren an engem eenzege Bericht gewisen gouf fir un c-Fos in vitro ze binden [21]. Wéi och ëmmer, et gi keng virdru Berichter iwwer PSMC5 Engagement an der Kokainaktioun. Trotzdem, wéinst der Stäerkt vum PSMC5 Signal an der Hef zwee-Hybrid Assay, hu mir eis virgestallt fir méiglech ΔFosB-PSMC5 Interaktiounen weider ze studéieren.

Vignette
Table 1. Resultater vun Yeast Two-Hybrid Screening mat Δ2ΔFosB.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Als éischt, fir déi kierperlech Interaktioun tëscht ΔFosB an PSMC5 ze bestätegen, hu mir in vitro Co-Immunoprecipitatiounsexperimenter gemaach. Mir hu fonnt datt de FLAG-tagged PSMC5 (Figur 1B), transfektéiert an Neuro 2A Zellen, effektiv erofgezunn ΔFosB (Figur 1C). Zweetens, fir d'Regioun am PSMC5 z'identifizéieren déi verantwortlech ass fir seng Bindung un ΔFosB, hu mir verschidde FLAG-tagged PSMC5 Mutanten generéiert (Figur 1B) a widderholl de Co-Immunoprecipitatiounsexperiment. ΔFosB gouf effektiv mat den N-terminalen 151 Aminosäuren vum PSMC5 (PSMC5-NT) erofgezunn, awer net mam C-terminal 172 Aminosaier Fragment vum Protein (PSMC5-CT) (Figur 1C). PSMC5 fehlt säi opgerullte Spule Domain (PSMC5-ΔCC) war och ineffektiv fir ΔFosB auszeschléissen. Dës Erkenntnisser suggeréieren datt PSMC5 ΔFosB iwwer säi opgerullt-Spiral-Domän (Aminosäuren 27-68) bindt. Ausserdeem huet de FLAG-tagged PSMC5 keng mutant Form vun ΔFosB mat engem mutéierte Leucin Zipper Domain (ΔFosB-LZM) ausgefall (Figur 1C), wat beweist datt ΔFosB entweder PSMC5 duerch dëst Domain bindt oder, méi wahrscheinlech, datt ΔFosB Heterodimeriséierung erfuerderlech ass fir PSMC5 Bindung.

PSMC5-ΔFosB bindend an NAc no chronescher Kokainverwaltung

Baséierend op dës Erkenntnisser in vitro, hu mir studéiert ob PSMC5 Niveauen am NAc geännert ginn an Äntwert op chronesch Kokainverwaltung. Mir hu fonnt duerch subzellulär Fraktionéierung a Western Blotting datt chronesch Kokain d'Nuklearniveauen vum PSMC5 an dëser Gehirregioun erhéicht ouni eng Verännerung vun den zytoplasmesche Niveauen (Figur 2A). Dësen Effekt gouf net no eenzel Dosen Kokain gesinn (Donnéeën net gewisen). Mir hunn d'Lokaliséierung vu PSMC5 an ΔFosB an NAc duerch konfokal Immunfluoreszenzmikroskopie ënnersicht. Mir hunn d'Mais 24 Stonnen no der leschter widderholler Dosis Kokain analyséiert, en Zäitpunkt wou ΔFosB deen eenzegen detektéierbar ass FosB Genprodukt (kuckt Nestler 2008). Mir hunn staark PSMC5 Immunreaktivitéit am NAc fonnt, dorënner e staarkt nuklear Signal. ~85% vun ΔFosB+ Käre co-faarweg fir PSMC5 (Figur 2B). Zousätzlech hu mir Co-Immunoprecipitatiounsexperimenter op NAc Extrakter gemaach a fonnt datt, no chronescher Kokainbehandlung, ΔFosB effektiv vun engem Anti-PSMC5 Antikörper erofgezunn gouf (Figur 2C). Am Géigesaz, Analyse vun Drogen-naiven NAc (no widderholl Salinsinjektiounen) huet keen detektéierbaren ΔFosB Pull erof (Donnéeën net gewisen). Dës Donnéeë sinn konsequent mat eise Befunde an der Zellkultur a bestätegen datt ΔFosB an PSMC5 interagéieren am NAc in vivo.

Vignette
Fig 2. PSMC5 Regulatioun an Maus NAc.

 

A. Western Blotting vun nuklearen a zytosolesche Fraktiounen vun NAc vu Mais, déi all Dag mat Salins oder Kokain (20 mg / kg) fir 7 Deeg behandelt ginn, mat Déieren analyséiert 24 Stonnen no der leschter Injektioun. Kokain erhéicht nuklear awer net zytosolesch Niveaue vu PSMC5. Histone H3 a ß-Actin, déi net vu Kokain betraff waren, goufen als Luedekontrolle benotzt. D'Date si mëttler ± SEM (n = 8-10/Grupp, *p<0.05). B. Co-Lokaliséierung vun endogene PSMC5 (gréng) an ΔFosB (blo) an NAc vu Mais, déi chronesch mat Kokain behandelt goufen wéi an AC Nuklear Lysate vu Maus NAc no chronescher Kokainbehandlung goufen Immunoprecipitatioun mat Anti-PSMC5 Antikörper oder Maus IgG als Kontroll ënnerworf. , an dann Western blotted mat Anti-FosB / ΔFosB Antikörper. D'Figur weist PSMC5-ΔFosB Interaktiounen am NAc in vivo. Daten zu B a C goufen an triplicate replizéiert an jiddereng vun dräi getrennten Experimenter.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 verbessert den ΔFosB Ausdrock in vitro

Zënter PSMC5 e bekannte Member vum Proteasomkomplex ass, hu mir getest ob et ΔFosB Niveauen mat Rat 1A Zellen reguléiert. PSMC5 Iwwerexpressioun hat keen Effekt op Basalniveauen vun ΔFosB, awer verursaacht eng kleng awer bedeitend Verbesserung vun der ΔFosB Induktioun op Serum Stimulatioun vun den Zellen (Figur 3A). En ähnlechen Trend gouf fir voll Längt FosB gesi, awer den Effekt huet keng statistesch Bedeitung erreecht. Ëmgekéiert huet d'Ënnerdréckung vum endogene PSMC5 Ausdrock a Rat 1A Zellen, erreecht duerch d'Benotzung vu siRNAs déi PSMC5 zielen, net basal ΔFosB Niveauen beaflosst awer staark ΔFosB Induktioun duerch Serum Stimulatioun hemmt (Figur 3B). Ähnlech Effekter goufen fir voll Längt FosB gesinn. Dës Donnéeë suggeréieren datt PSMC5 d'Proteasomal Degradatioun vun ΔFosB net fördert, sou wéi als Kär Ënnerunitéit vum Proteasom erwaart gëtt, awer amplaz fir maximal Akkumulation vun FosB Genprodukter in vitro, vläicht duerch d'Stabiliséierung vun de Proteinen.

Vignette
Fig 3. PSMC5 Reguléierung vum FosB / ΔFosB Ausdrock a Rat 1A Zellen.

 

A. Rat 1A Zellen sech mat 4 μg vun PSMC5 oder Kontroll DNA transfected. PSMC5 Iwwerexpressioun hat keen Effekt op Basal Ausdrockniveauen vum FosB oder ΔFosB Protein wéi bestëmmt duerch Western Blotting, awer produzéiert eng kleng awer bedeitend Erhéijung vun der Induktioun vun ΔFosB duerch Serum Stimulatioun (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Rat 1A Zellen sech mat 5 pmol vun entweder vun zwee siRNAs oder scrambled RNS (Kontroll) transfected. Béid siRNAs ofgeholl effektiv PSMC5 Protein Niveauen am Verglach zu Kontroll Konditiounen (siRNA #1, 23 ± 5% vun Kontroll; siRNA #2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5 Knockdown hat keen Effekt op de Basalniveau vu FosB oder ΔFosB awer huet d'Induktioun vu béide FosB an ΔFosB duerch Serum Stimulatioun attenuléiert (FosB: F(2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F(2,6) = 22.83. , p = 0.002).

Doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB a PSMC5 bilden Komplexe mat CBP, p300, a BRG1 an NAc

Fir d'Transkriptiounsmechanismen besser ze verstoen, duerch déi PSMC5 d'ΔFosB Funktioun beaflosse kéint, hu mir méiglech zousätzlech Bindungspartner fir déi zwee Proteinen am NAc ënner chronesche Kokain-behandelte Bedéngungen ënnersicht. Et gëtt ee Bericht datt PSMC5 sech un CBP bindt - en HAT - a vergréissert d'Histone H3 Acetylatioun am MHC-II proximale Promoteur an HeLa Zellen.22]. Ausserdeem weisen d'Mais, déi am CBP defizit sinn, reduzéiert Verhalensempfindlechkeet fir Kokain wéi och reduzéiert Histonacetylatioun op der FosB Promoteur [23]. Mir hunn also getest ob PSMC5 mat ΔFosB binde kéint als Deel vu Komplexen déi och CBP enthalen a vläicht aner Transkriptiounsaktivatoren.

Mir hunn als éischt bewisen datt ΔFosB effektiv souwuel CBP wéi och p300 erofgezunn huet, e verwandte HAT, an Neuro2A Zellen (Figur 4A). Am Géigesaz, huet d'Leucin Zipper mutant Form vun ΔFosB, wéi erwaart, dës Aktivitéit net gewisen. Ähnlech huet PSMC5 effektiv CBP a p300 erofgezunn (Figur 4B). Interessanterweis gouf dësen Effekt och fir PSMC5-ΔCC gesinn, deen den ΔFosB net erofgezunn huet, wat beweist datt PSMC5 mat CBP an p300 interagéiert iwwer aner Beräicher vum Protein an onofhängeg vu senger Bindung un ΔFosB.

Vignette
Fig 4. ΔFosB an PSMC5 interagéieren mat CBP, p300, a BRG1 in vitro an in vivo.

 

A. Neuro2A Zellen goufen transfektéiert mat 2.4 μg MYC-tagged ΔFosB oder MYC-tagged ΔFosB-LZM. Zellextrakter goufen immunoprecipitéiert mat Anti-CBP oder Anti-p300 Antikörper, an Ausfäll goufen Western blotted mam selwechten Antikörper oder mat Anti-MYC Antikörper. Béid CBP an p300 interagéieren mat ΔFosB an esou Interaktiounen erfuerderen en intakt Leucin Zipper. B. Neuro2A Zellen goufen mat 2.4 μg vun FLAG-tagged PSMC5 oder FLAG-tagged PSMC5-ΔCC transfected. Zellextrakter goufen immunoprecipitéiert mat Anti-CBP oder Anti-p300 Antikörper, an Ausfäll goufen Western blotted mam selwechten Antikörper oder mat Anti-FLAG Antikörper. Béid CBP an p300 interagéieren mat PSMC5 an esou Interaktiounen erfuerderen net den CC Domain. C. Nuklear Lysate vu Maus NAc no chronescher Kokainbehandlung goufen Immunoprecipitatioun mat Anti-CBP oder Anti-p300 Antikörper ënnerworf. Duerno Western Blotting vu resultéierende Nidderschlag mat Anti-FosB / ΔFosB Antikörper huet endogen Interaktiounen tëscht ΔFosB a CBP / p300 gewisen. D. Aliquots vun de selweschten nuklear Lysate goufen Immunoprecipitatioun mat Anti-BRG1 oder Anti-PSMC5 Antikörper ënnerworf, gefollegt vu Western Blotting vun Ausfäll mat Anti-FosB / ΔFosB oder Anti-BRG1 Antikörper. D'Resultater weisen endogene Interaktiounen tëscht ΔFosB a BRG1, an BRG1 a PSMC5. E. Schematesch Illustratioun vum transkriptionellen Aktivéierungskomplex aus ΔFosB: JunD Heterodimeren interagéieren mat CBP / p300, BRG1, a PSMC5.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Fir ze bestätegen datt dës Interaktiounen och in vivo optrieden, hu mir Kokain chronesch verwalt fir ΔFosB an nuklear PSMC5 Niveauen ze induzéieren, dann immunoprecipitéiert NAc Extrakten mat Anti-CBP oder Anti-p300 Antikörper. Konsequent mat eisen Zellkulturdaten, Immunoprecipitatioun vu CBP oder vu p300 effektiv erofgezunn ΔFosB (Figur 4C). Mir hunn getest ob BRG1, eng Kär Ënnerunitéit vum SWI-SNF Chromatin Remodeling Komplex, och un ΔFosB a PSMC5 ka bindelen, baséiert op eiser fréierer Entdeckung datt BRG1 a bestëmmte ΔFosB Zilgenen a Konzert mat hirer Aktivatioun am NAc no chronesche Kokain rekrutéiert gëtt [24]. Mir hu fonnt datt d'Immunoprecipitatioun vu BRG1 ΔFosB an NAc Extrakten erofgezunn huet, an datt d'Immunoprecipitatioun vum PSMC5 och endogene BRG1 coprecipitéiert huet (Fig 4D). Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater datt ΔFosB-PSMC5 Komplexe an NAc bilden déi och CBP / p300 a BRG1 enthalen (Fig 4E).

PSMC5 Iwwerexpressioun erhéicht Lokomotorreaktiounen op Kokain

Déi prominent Bindung vu PSMC5 mat ΔFosB an NAc huet eis opgefuerdert z'ënnersichen ob d'Erhéijung vun PSMC5 Niveauen an dëser Gehirregioun Verhalensreaktiounen op Kokain reguléiert. Mir hunn en Herpes Simplex Virus (HSV) Vektor generéiert deen entweder Wildtype PSMC5 oder ee vu senge Mutanten iwwerausdréckt an d'Vektoren am NAc in vivo validéiert hunn (Figur 5A). Viral-mediéiert Ausdrock vu PSMC5 dominéiert am Zellkär (Figur 5B). Mais, déi Wild-Typ PSMC5 iwwerausdrécken, hu keng verännert Äntwerten op initial Dosen Kokain gewisen, awer hunn eng verstäerkte Lokomotoraktivéierung an Äntwert op widderholl Kokaindosen am Verglach mat GFP-ausdréckende Kontrollmais gewisen. Am Géigesaz, Mais, déi eng mutant Form vu PSMC5 iwwerausdrécken, déi säi coiled-coil Domain (PSMC5-ΔCC) feelt, hunn dësen Effekt net gewisen (Figur 5B). Interessanterweis huet d'Iwwerexpressioun vu PSMC5-K196M, déi d'ATPase Aktivitéit vum Wildtype Protein fehlt, och d'Lokomotorreaktiounen vum Kokain potentiéiert.

Vignette
Fig 5. PSMC5 Iwwerexpressioun am NAc erhéicht Lokomotorreaktiounen op Kokain.

 

A. Vertrieder HSV-mediéiert Transgen Ausdrock am medialen NAc. AC, anterior Kommissioun. NAc Kär a Shell Ënnerregiounen ginn op der Figur bemierkt. B. Representativ méi héich Vergréisserungen (60x) vun der immunhistochemescher Faarf vum PSMC5 an NAc Neuronen no der HSV-PSMC5 Injektioun, déi weist datt de Protein haaptsächlech nuklear ass, wéi duerch DAPI-Faarwen markéiert ass. C. Mais kruten bilateral HSV Injektiounen an NAc gefollegt vun alldeegleche IP Injektiounen vun Ënnerschwelldosen vu Kokain (7.5 mg / kg). Locomotor Äntwerte ginn als Äntwert op déi éischt a lescht vun 3 deeglechen Dosis vum Medikament gewisen. Iwwerexpressioun vu PSMC5 oder PSMC5-K196M erhéicht Lokomotorreaktiounen op widderholl Kokain, en Effekt net mat PSMC5-ΔCC gesi ginn. Et gouf kee signifikanten Effekt vun den Transgenen op Lokomotorreaktiounen op initial Kokaindosen. ANOVA F(3,125) = 4.163, *p<0.05 vum Dunnett's posthoc Test.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Diskussioun

D'Resultater vun der aktueller Studie weisen en neie Mechanismus op, duerch deen ΔFosB seng Effekter op d'Gehir vermëttelt an en neie Mechanismus involvéiert an der Kokainaktioun. Duerch d'Benotzung vun enger onparteiescher Approche, eng Hef zwee-Hybrid Assay, hu mir PSMC5 als e neie Bindungspartner fir ΔFosB identifizéiert. Mir hunn dës Erfindung souwuel a kultivéierten Zellen in vitro an am NAc in vivo validéiert andeems se robust PSMC5-ΔFosB Bindung demonstréieren. Wichteg sinn nuklear Niveaue vu PSMC5 an NAc duerch chronesch Kokainverwaltung induzéiert. Mir hunn weider gewisen datt PSMC5-ΔFosB Bindung a Konzert mat verschiddenen aneren transkriptionalen Aktivatorproteine ​​​​optrieden, nämlech CBP a p300 (zwee HATs) a BRG1 (e Schlësselbestanddeel vun SWI-SNF Chromatin Remodeling Komplexen). Zesummen ënnerstëtzen eis Erkenntnisser d'Hypothese datt PSMC5 Deel vum transkriptionellen Aktivéierungskomplex ass deen op d'mannst bestëmmte ΔFosB-induzéiert Genen rekrutéiert gëtt während engem Cours vun der chronescher Kokainverwaltung (Fig 4E). Konsequent mat dëser Hypothese ass déi zousätzlech Erkenntnis datt Iwwerexpressioun vu PSMC5 an NAc, wéi d'Iwwerexpressioun vun ΔFosB selwer, Verhalensreaktiounen op Kokain fördert. Et wier interessant an zukünfteg Studien dës in vivo Observatioune mat Charakteriséierung vu PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 Interaktiounen duerch d'Benotzung vun in vitro Reporter Assays ze verfollegen.

D'Bedeelegung vum PSMC5 an der Kokainaktioun ass komplett nei. Ufanks identifizéiert als Member vun enger grousser Famill vun ATPases, déi de Proteasom ausmaachen, gouf PSMC5 iwwer d'Jore gewisen fir mat verschiddenen Transkriptiounsfaktoren ze interagéieren, dorënner c-Fos, p53, nuklear Hormonrezeptoren, a Bestanddeeler vum Basal Transkriptiounskomplex [25], awer wéineg funktionell Studien goufen iwwer d'Jore gemaach [26]. Seng bescht etabléiert Handlung ass d'Aktivitéit vu MYC Transkriptiounsfaktoren a kultivéierten Zellen ze förderen [27]. D'Implikatioun vu PSMC5 an Transkriptiounsmechanismen huet eng potenziell Roll fir Ubiquitinatioun-Proteasomal Aktivitéit an der Reguléierung vun der Gen-Transkriptioun proposéiert, awer d'Bedeelegung vum PSMC5 an esou Reguléierung bleift quasi ongetest bis haut [28,29].

Ganz wéineg ass iwwer PSMC5 Funktioun am Gehir bekannt. Eng fréier Etude huet verbreet Ausdrock vu PSMC5 mRNA am ganze Gehir bewisen.30], awer seng funktionell Aktivitéit ass onstudéiert bliwwen. Eis Erkenntnisser fuerderen elo weider Ermëttlungen vun dësem interessante Protein fir seng Roll bei der Reguléierung vun der Gen-Transkriptioun a seng Relatioun zu der Ubiquitinatioun-Proteasomal Funktioun am Gehir besser ze verstoen. D'Bindung vu PSMC5 op ΔFosB gëtt vum PSMC5's coiled-coil Domain mediéiert. Ausserdeem erfuerdert d'Fäegkeet vum PSMC5 fir Lokomotorreaktiounen op Kokain ze förderen, wärend d'Spiral-Coil Domain erfuerdert, net d'ATPase Aktivitéit erfuerdert déi intrinsesch zum Protein ass. Dës Resultater erhéijen d'Méiglechkeet datt, op d'mannst an eisem System, d'Haaptaktivitéit vum PSMC5 duerch seng Bindung un ΔFosB an aner transkriptional Reguléierungsproteine ​​​​vermittelt ka ginn an net duerch seng proteasomal-relatéiert Aktivitéit per se. Weider Aarbecht ass néideg fir dëst an alternativ Méiglechkeeten direkt ze testen. D'Hypothese datt viral-mediéiert Iwwerexpressioun vu PSMC5 erhéicht Lokomotorreaktiounen op Kokain iwwer Interaktioune mat ΔFosB ass plausibel, trotz der Notzung vun engem 3 Deeg Kokainbehandlungsregime, well et bekannt ass datt bemierkenswäert Niveauen vun ΔFosB am Gehir an dësem Zäitframe accumuléieren [3].

Déi haiteg Erkenntnisser ënnersträichen d'Nëtzlechkeet vun onbestëmmten, oppenen experimentellen Approche bei der Studie vun der molekulare Basis vun der Gehirreguléierung. Eis initial Opmierksamkeet op PSMC5 war eleng baséiert op senger prominenter Bindung un ΔFosB an engem Hef zwee-Hybrid Assay, awer et schéngt e wichtege Bestanddeel vun Transkriptiouns Verännerungen ze sinn, déi an NAc duerch widderholl Kokainverwaltung rekrutéiert ginn. E bessert Verständnis vun den detailléierte Mechanismen, duerch déi nuklear Niveaue vu PSMC5 duerch Kokain induzéiert ginn an, ofwiesselnd, duerch déi PSMC5 dann zu Kokain-induzéierten Transkriptiounsaktivéierungskomplexe bäidréit, sinn de Fokus vun den aktuellen Ermëttlungen. Mëttlerweil huet eis Hef zwee-Hybrid Assay e puer zousätzlech putative Bindungspartner vun ΔFosB (Table 1) déi och elo direkt Untersuchung a Kokainmodeller berechtegen. Zesummen dréit dës Aarbecht zu engem verstäerkte Verständnis vun de komplexe molekulare Mechanismen bäi, duerch déi Kokain d'NAc Funktioun verännert.

Arbeschterlidder

Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vu Stipendien vum Nationalen Institut fir Drogenmëssbrauch, a vun der Ishibashi Foundation an der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI Zuelen: 24591735, 26290064, 25116010).

Autor Contributeuren

Den Experimenter konzipéiert an entworf: YHO YNO EJN. D'Experimenter gemaach: YHO YNO PJK RN. Analyséiert d'Donnéeën: YHO YNO EJN. Contribuéiert reagents / Material / Analyse Tools: TN MO OY AN RN TT. De Pabeier geschriwwen: YHO EJN.

Referenze

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Direkt-fréi Genen: zéng Joer op. Trends Neurosci 18: 66-67. pmid:7537412 doi: 10.1016/0166-2236(95)80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkriptiounsmechanismen vun der Sucht: Roll vun DeltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245-3255. doi: 10.1098/rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Artikel kucken
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Léier
  6. Artikel kucken
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Léier
  9. Artikel kucken
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Léier
  12. Artikel kucken
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Léier
  15. Artikel kucken
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Léier
  18. Artikel kucken
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Léier
  21. Artikel kucken
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Léier
  24. Artikel kucken
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Léier
  27. Artikel kucken
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Léier
  30. Artikel kucken
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Léier
  33. Artikel kucken
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Léier
  36. Artikel kucken
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Léier
  39. Artikel kucken
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Léier
  42. Artikel kucken
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Léier
  45. Artikel kucken
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Léier
  48. Artikel kucken
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Léier
  51. Artikel kucken
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Léier
  54. Artikel kucken
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Léier
  57. Artikel kucken
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Léier
  60. Artikel kucken
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Léier
  63. Artikel kucken
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Léier
  66. Artikel kucken
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Léier
  69. Artikel kucken
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Léier
  72. Artikel kucken
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Léier
  75. Artikel kucken
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Léier
  78. Artikel kucken
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Léier
  81. Artikel kucken
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Léier
  84. Artikel kucken
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Léier
  87. Artikel kucken
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Léier
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Induktioun vun engem laang dauerhafte AP-1 Komplex aus geännerten Fos-ähnlechen Proteinen am Gehir duerch chronesch Kokain an aner chronesch Behandlungen. Neuron 13: 1235-1244. pmid:7946359 doi: 10.1016/0896-6273(94)90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Proc Natl Acad Sci USA 1997: 94-10397. pmid:10402 doi: 9294222/pnas.10.1073
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Reguléierung vun ΔFosB Stabilitéit duerch Phosphorylatioun. J Neurosci 26: 5131-5142. pmid:16687504 doi: 10.1523/jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) D'Feele vu konservéierter C-terminal Degron Domain dréit zu der eenzegaarteger Stabilitéit vun ΔFosB bäi. Eur J Neurosci 25: 3009-3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Verhalens- a strukturell Äntwerten op chronesch Kokain erfuerderen eng Feed-Forward Loop mat ΔFosB a CaMKII an der Nukleus accumbens Shell. J Neurosci 33: 4295-4307 doi: 10.1523/JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Ausdrock vum Transkriptiounsfaktor ΔFosB am Gehir kontrolléiert d'Sensibilitéit fir Kokain. Natur 401: 272-276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB verbessert Ureiz fir Kokain. J Neurosci 23: 2488-2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Reguléierung vum Genausdrock a Kokainbelounung duerch CREB an DFosB. Nat Neurosci 11: 1208-1215. pmid:14566342 doi: 10.1038/nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: Eng wesentlech Roll fir ΔFosB am Nukleus accumbens an der Morphinaktioun. Natur Neurosci 9: 205-211. pmid:16415864 doi: 10.1038/nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Induzéierbar, Gehirregioun spezifesch Ausdrock vun engem dominanten negativen Mutant vum c-Jun an transgene Mais reduzéiert d'Sensibilitéit fir Kokain. Brain Res 970: 73-86. pmid:12706249 doi: 10.1016/s0006-8993(03)02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Reguléierung vun Delta FosB a FosB-ähnleche Proteine ​​​​duerch elektrokonvulsive Krampfadern a Kokainbehandlungen. Mol Pharmacol 48: 880-889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Wesentlech Roll vum FosB-Gen a molekulare, celluläre a Verhalensaktiounen vun elektrokonvulsive Krampelen. J Neurosci 18: 6952-6962. pmid: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonismus gëtt begleet vu persistent Ausdrock vun engem D-FosB-ähnlechen Protein an dopaminergesche Weeër. Mol Gehir Res 53: 41-52. pmid:9473580 doi: 10.1016/s0169-328x(97)00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Ëmwandlung vun engem eukaryoteschen Transkriptiounsinhibitor an en Aktivator. Zell 55: 443-446. pmid:3180218 doi: 10.1016/0092-8674(88)90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Déi zwee-Hybrid System: eng Method fir Genen fir Proteinen z'identifizéieren an ze klonen, déi mat engem Protein vun Interessi interagéieren. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578–9582. pmid:1946372 doi: 10.1073/pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferativ Aktivatioun vu roueg Rat-1A Zellen duerch Delta FosB. Mol Zell Biol 13:4157-4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Wesentlech Roll vun der Poly (ADP-Ribosyl)atioun an der Kokainaktioun. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005–2010. doi: 10.1073/pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Distinct Mustere vun ΔFosB Induktioun am Gehir duerch Drogen vu Mëssbrauch. Synapse 62: 358-369. doi: 10.1002/syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 an c-Fos am nuklearen 26S proteasom. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236–8240. pmid:8710853 doi: 10.1073/pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Reguléierung vun Acetylatioun am Haapthistokompatibilitéitskomplex Klass II proximal Promoteur vum 19S proteasomalen ATPase Sug1. Mol Zell Biol 28: 5837-5850. doi: 10.1128/MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-bindende Protein kontrolléiert d'Äntwert op Kokain duerch Acetyléierung vun Histonen am fosB Promoteur am Mausstriatum. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186–19191. pmid:16380431 doi: 10.1073/pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Chromatin Remodeling ass e Schlësselmechanismus deen Kokain-induzéiert Plastizitéit am Striatum ënnersträicht. Neuron 48: 303-314. pmid:16242410 doi: 10.1016/j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Dual Funktiounen fir transcriptional reegler: Mythos oder Realitéit. J Zell Biochem Suppl 32/33: 32-40. doi: 10.1002/(sici)1097-4644(1999)75:32+<32::aid-jcb5>3.0.co;2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Reguléierungssubunit Interaktiounen vum 26S Proteasom, e komplexe Problem. Trends Biochem Sci 25:83-88. pmid:10664589 doi: 10.1016/s0968-0004(99)01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implikatioun vum Ubiquitin / Proteasom System an der myc-reguléierter Transkriptioun. Zell Zyklus 2-5: 403-407. doi: 10.4161/cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin a Proteasomen an der Transkriptioun. Annu Rev Biochem 81: 177-201. doi: 10.1146/annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) De Proteasom: en Utility-Tool fir Transkriptioun? Curr Op Genet Dev 16: 197–202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997). Dev Neurobiol 1: 33-877. doi: 890/(sici)10.1002-1097(4695)199712:33<7::aid-neu877>2.co;3.0-2