Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Verëffentlecht online 2017 Mee 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1mythologesch
Ziler / Hypothese
Iwwerschoss vun Diätfetter verursaacht Adipositas bei Mënschen a Nager. Rezent Studien a Mënschen a Nager hunn bewisen datt Sucht un Fette e gemeinsame Mechanismus deelt mat Sucht un Alkohol, Nikotin an Narkotika a punkto enger Dysfunktioun vu Gehirbelounungssystemer. Et gouf beliicht datt eng héich-Fett Diät (HFD) Dopamin D2 Rezeptor (D2R) Signaliséierung am Striatum, e pivotal Reguléierer vum Gehir Belounungssystem, dréit zu hedonesche Iwwerschoss. Mir hu virdru gemellt datt de brong Reis-spezifesche bioaktive Bestanddeel γ-oryzanol d'Präferenz fir en HFD iwwer hypothalamesch Kontroll ofgeschwächt huet. Mir hunn dofir d'Méiglechkeet exploréiert datt γ-oryzanol de Fonctionnement vum Gehir Belounungssystem bei Mais moduléiere géif.
Methoden
Männlech C57BL / 6J Mais, déi en HFD gefiddert goufen, goufen mëndlech mat γ-oryzanol behandelt, a striatal Niveaue vu Moleküle involvéiert an D2R Signaliséierung goufen evaluéiert. Den Impakt vum γ-oryzanol op d'DNA Methylatioun vum D2R Promoteur a spéider Ännerungen an de Virléiften fir Diätfett gouf iwwerpréift. Zousätzlech goufen d'Effekter vum 5-aza-2'-Deoxycytidin, e mächtege Inhibitor vun DNA Methyltransferasen (DNMTs), op Nahrungspräferenz, D2R Signaliséierung an d'Niveaue vun DNMTs am Striatum ënnersicht. D'inhibitoresch Effekter vum γ-oryzanol op d'Aktivitéit vun DNMTs goufen enzymatesch in vitro bewäert.
Resultater
Am Striatum vu Mais, déi en HFD gefiddert goufen, gouf d'Produktioun vun D2Rs duerch eng Erhéijung vun der DNA Methylatioun vun der Promoteurregioun vum D2R ofgeholl. Oral Administratioun vu γ-oryzanol huet den Ausdrock an d'Aktivitéit vun DNMTs ofgeholl, doduerch den Niveau vun D2Rs am Striatum restauréiert. Pharmakologesch Hemmung vun DNMTs duerch 5-aza-2'-Deoxycytidin huet och d'Präferenz fir Diätfett verbessert. Konsequent mat dësen Erkenntnisser hunn enzymatesch in vitro Assays bewisen datt γ-oryzanol d'Aktivitéit vun DNMTs hemmt.
Conclusiounen / Interpretatioun
Mir hunn bewisen datt γ-oryzanol d'HFD-induzéiert DNA Hypermethylatioun vun der Promoteurregioun vun D2R am Striatum vu Mais verbessert. Eist experimentellt Paradigma beliicht γ-oryzanol als villverspriechend Antiobesitéit Substanz mat der ënnerschiddlecher Eegeschaft fir en neien epigeneteschen Modulator ze sinn.
Elektronesch Ergänzungsmaterial
D'Online Versioun vun dësem Artikel (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) enthält peer-reviewed awer net editéiert Zousazmaterial, dat fir autoriséiert Benotzer verfügbar ass.
Aféierung
Overeating an fettleibeg Individuen deelt, op d'mannst deelweis, gemeinsam Mechanismen mat Sucht un Alkohol, Nikotin an Narkotika [1]. Wéi och d'hypothalamesch an hormonell Reguléierung vum Appetit, ass de Gehir Belounungssystem, besonnesch Dopamin Rezeptor Signaliséierung, enk verbonne mat Suchtfaktor oder hedonesch Ernärungsverhalen.2]. Eng fréier Studie bei Ratten huet gewisen datt d'Knockdown vum striatal Dopamin D2 Rezeptor (D2R) duerch lentivirus-mediéierte kuerze Haarnadel interferéiert RNA séier induzéiert Sucht-ähnlech Belounungsdefiziter a Zwangsähnlech Nahrungssich [3]. Wéinst der reduzéierter D2R Dicht ass den dorsale Striatum manner reaktiounsfäeger op d'Liewensmëttelbelounung am Verglach mat schlanke Kontrollgruppen bei fettleibeg Mënschen a Nager [3-5]. Am Aklang mat dëser Notioun, der TaqIA Allele vun der ANKK1 Genlocus (kodéiert DRD2 / Ankyrin Widderhuelung a Kinase Domain mat 1), wat d'Striatal D2R Produktioun reduzéiert, ass mat engem fettleibege Phänotyp bei Mënschen assoziéiert.6], während d'Effekter vum Gewiichtsverloscht no bariatrescher Chirurgie mat enger erhiewter striataler D2R Dicht verbonne sinn [7]. Dës Donnéeë proposéiere staark d'Wichtegkeet vum striatal D2R als en neit therapeutescht Zil fir d'Behandlung vun Adipositas. Wéi och ëmmer, e puer Medikamenter, déi entwéckelt goufen, déi op de Gehirbelounungssystem handelen, hunn erheblech negativ Auswierkunge verursaacht, dorënner sérieux psychiatresch Probleemer, wat zu hirem eventuellen Réckzuch aus de Kliniken resultéiert [.8].
Epigenetesch Modifikatioune si kritesch net nëmme fir d'Entwécklung an d'Differenzéierung, awer och well se entstinn als Resultat vun Ëmweltverännerungen, och an der Diät a Liewensstil.9]. DNA Methylatioun ass e wichtegst epigenetesch Event fir d'Stabilitéit vum Genausdrock.9]. Bei Ratten verännert d'Mutterbelaaschtung fir eng héich Fett Diät (HFD) intergenerationell d'DNA Methylatioun am zentrale Belounungssystem am Nofolger, wat zu Iwwerkonsum vun HFD vun de Welpen féiert [10]. Besonnesch, DNA Methyltransferases (DNMTs) spillen kritesch Rollen an der Reguléierung vu béiden Ernärungsverhalen a kierperlecher Aktivitéit.10, 11], suggeréiert datt DNMTs verspriechend therapeutesch Ziler fir d'Therapie vum Adipositas-Diabetes Syndrom kéinte sinn. Wichteg ass, datt e puer natierlech Liewensmëttel ofgeleet Substanzen, dorënner Kaffisäure an Epigallocatechin, bekannt sinn als DNMT-Inhibitoren ze handelen.12, 13].
Mir hu viru kuerzem gewisen datt de bioaktiven, brong Reis-spezifesche Komponent γ-oryzanol, eng Mëschung aus Ferulinsäureester a verschidde Phytosterole, d'Präferenz fir Diätfett duerch eng Ofsenkung vum hypothalamesche endoplasmatesche Retikulum (ER) Stress ofschwächt.14]. Bei Mais an Huesen, mëndlech administréiert γ-oryzanol gouf séier aus dem Darm absorbéiert an haaptsächlech an d'Gehir verdeelt.15, 16]. Dës Erkenntnisser zesummen ze huelen, natierlech Liewensmëttel ofgeleet Produkter, déi op den Zentralnervensystem handelen, kéinten eng Alternativ sinn fir behënnert Ernärungsverhalen an der Adipositas sécher ze verbesseren. An dësem Kontext hu mir d'Hypothese getest datt γ-oryzanol den DNA Methylatiounsstatus am Gehir Belounungssystem ännere géif, wat zu enger Dämpfung vun der Präferenz fir en HFD bei Mais resultéiert.
Methoden
Déieren
Siwe-Woch-al männlech C57BL / 6J Mais kritt aus Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japan) sech (3-4 pro Käfig) an spezifesch-pathogen-gratis Konditiounen op 24 ° C ënner engem 12 h / 12 h Liicht / ënnerbruecht. donkel Zyklus. No enger Woch vun der Acclimatiséierung goufen 8 Wochen al Mais mat Gewiicht ugepasst an an zwou oder dräi Gruppen opgedeelt fir all Experiment ze maachen. D'Mais kruten gratis Zougang zu Iessen a Waasser. All Déierexperimenter goufen vum Animal Experiment Ethics Committee vun der University of the Ryukyus (Nr. 5352, 5718 an 5943) guttgeheescht.
Administratioun vu γ-oryzanol a 5-aza-2'-Deoxycytidin
Fir d'Präferenz fir den HFD ze evaluéieren, gouf γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) op 8-Wochen-ale Mais duerch Gavage während dem Liewensmëttelwahltest verwalt wéi virdru beschriwwen [14, 17]. Fir déi aner Experimenter gouf en HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) mat 0.4% γ-oryzanol als Pellets hiergestallt. D'Komponente vun der Ernährung ginn an elektroneschen Zousazmaterial (ESM) Tabell gewisen 1. No 12 Wochen Ernierung gouf Tissue vum Striatum an Hypothalamus gesammelt. Déi deeglech Intake vu γ-oryzanol, geschat aus der mëttlerer Nahrungsaufnahme vun de Mais, war ongeféier 320 μg / g Kierpergewiicht. D'Dosis vum γ-oryzanol goufe festgeluecht wéi virdru beschriwwen [14]. De 5-aza-2'-deoxycytidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) gouf intraperitoneal injizéiert (0.25 μg / g Kierpergewiicht) dräimol d'Woch fir 12 Wochen.18].
Schätzung vun der Präferenz fir Diätfett
Fir Virléiften fir Diätfett ze evaluéieren, hunn d'Liewensmëtteltester e Choix tëscht Chow an HFD (D12450B an D12451; Fuerschungsdiäten) geliwwert wéi virdru beschriwwen [14]. D'Komponente vun der Diät ginn an der ESM Table gewisen 1. Kuerz gesot, goufen d'Mais fräi Zougang zu Chow an HFD erlaabt. D'Intake vu Chow an HFD goufen wöchentlech gemooss an analyséiert fir Ännerungen an der Präferenz fir Diätfett. HFD Präferenz gouf no der Formel berechent: HFD Präferenz = [(HFD Intake / Gesamt Nahrungsaufnahme) × 100].
Bisulfit Sequenzéierung fir DNA Methylatioun
DNA gouf mat engem DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan) gereinegt. D'DNA-Léisung gouf mat frësch preparéierten 3 mol/l NaOH gemëscht, bei 37°C fir 15 min inkubéiert an zu 5.3 mol/l Harnstoff, 1.7 mol/l Natriumbisulfit a 4.9 mmol/l Hydroquinon hinzugefügt. D'Léisung gouf 15 Zyklen vun Denaturatioun bei 95 ° C fir 30 s an Inkubatioun bei 50 ° C fir 15 min ënnerworf.19]. D'Bisulfit-behandelt DNA gouf mat MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) gereinegt an duerch PCR verstäerkt mat engem KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) a Primer ronderëm de CpG Site vun der Promoteur Regioun vun D2R. . D'primer Haaptrei waren wéi follegt: Forward primer, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3'; ëmgedréint primer, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3'. Als nächst goufen d'Adapter Sequenzen derbäigesat a gebotzt mat Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Echantillon goufen dann zesummegefaasst an op e GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan) gelueden fir Sequenzéierung no dem Hiersteller Protokoll. D'methylation Niveau war wéi de Prozentsaz vun methylated cytosines an all cytosines Reschter ausgedréckt.
DNMT Aktivitéit Assay
Den DNMT enzymatesch Aktivitéit assay gouf mat engem EpiQuik DNA Methyltransferase Aktivitéit / Inhibitioun Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) an EPIgeneous Methyltransferase Assay Kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) no de Protokoller vum Hiersteller gesuergt.
Fir d'inhibitoresch Aktivitéit vun all Verbindung op DNA Methylatioun ze bewäerten, d'Bildung vu S-adenosyl-l-homocysteine (SAH) gouf a Präsenz vun all Verbindung gemooss (20 μmol / l fir Duerchmusterung assays), S-adenosylmethionin (SAM; 10 μmol/l) an DNMT-Substrat (4 ng/μl) bei 37°C fir 90 min. Fir d'Michaelis-Menten Kinetik ze evaluéieren, gouf DNMT1 (20 μmol / l) mat γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) an der uginner Konzentratioun vu Poly dI-dC bei 37 ° C fir 90 min inkubéiert. DNMT3a (100 μmol /l) an DNMT3b (100 μmol /l) goufen mat γ-oryzanol, SAM (5 μmol /l) an der uginn Konzentratioun vun poly dG · dC bei 37 ° C fir 120 min incubated. D'Assays goufen a véiermol gemaach. Extraitéiert Protein (0.75 mg / ml) gouf mat SAM (5 μmol / l), Poly dI-dC (5 μg / ml) a Poly dG · dC (5 μg / ml) bei 40 ° C fir 120 min inkubéiert, an D'SAH-Bildung gouf gemooss.
Östrogen-verbonne Rezeptor-γ Aktivitéit Assay
D'potenziell antagonistesch Aktivitéit vun γ-oryzanol op der estrogen-Zesummenhang receptor-γ (ERRγ) gouf mat der Human Estrogen-Related Receptor Gamma Reporter Assay System (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) no dem Hiersteller Protokoll bewäert. Kuerz gesot, net-mënschlech Mamendéieren-Reporterzellen, déi aktiv ERRγ konstitutiv ausdrécken, goufen op déi ugewise Konzentratioune vun all Verbindung fir 24 Stonnen an triplicate ausgesat.
Western blotting
Dëst gouf gemaach wéi virdru beschriwwen [20] mat Antikörper géint D2R (1:500, Kanéngchen), Dopamintransporter (DAT; 1:500, Kanéngchen), Tyrosinhydroxylase (TH; 1:1000, Kanéngchen) (AB5084P, AB1591P an AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), Signaltransducer an Aktivator vun der Transkriptioun 3α (STAT3α; 1:1000, Kanéngchen), DNMT1 (1:1000, Kanéngchen), DNMT3a (1:1000, Kanéngchen) (Nr. 8768, 5032 an 3598; Zell Signal Technologie Tokyo, Japan), DNMT3b (1 μg/ml, Kanéngchen), ERRγ (1:1000, Kanéngchen) a β-Actin (1:10,000, Maus) (ab16049, ab128930 an ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
Quantitative Echtzäit PCR
Genausdrock gouf iwwerpréift wéi virdru beschriwwen [14]. mRNA Niveauen goufen normaliséiert rn18s (18S rRNA). D'Primersets, déi fir déi quantitativ Echtzäit PCR Analysen benotzt ginn, ginn an der ESM Table zesummegefaasst 2.
Statistesch Analyse
D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SEM ausgedréckt. Een-Manéier ANOVA a Widderhuelungsmoossnamen ANOVA gefollegt vu multiple Verglach Tester (Bonferroni-Dunn Method) goufen benotzt wou zoutrëfft. Student senger t Test gouf benotzt Differenzen tëscht zwou Gruppen ze analyséieren. D'Ënnerscheeder goufen als bedeitend ugesinn p <0.05.
Resultater
Pharmakologesch Hemmung vun DNMTs duerch 5-aza-dC huet d'Präferenz fir Diätfett bei Mais ofgeschwächt
Bei Mais, déi den HFD gefüttert goufen, gouf d'DNA Methylatioun an der Promoteurregioun vum D2R am Striatum wesentlech vergréissert am Verglach mat Mais, déi eng Chow Diät gefüttert hunn (Fig. (Fig.1a).1a). Op der anerer Säit, hypothalamesch DNA Methylatioun an der Promoteur Regioun vun D2R war scheinbar méi héich wéi déi am Striatum ënner enger Chow Diät (p < 0.01) (Fig. (Fig. 1a, 1a, f) a gouf net vum HFD geännert (Fig. (Fig.1f).1f). Bei Mais, déi den HFD gefüttert goufen, gouf d'augmentéiert DNA Methylatioun an der Promoteurregioun vun D2R am Striatum normaliséiert duerch Behandlung mat 5-aza-dC, e potenten DNMT Inhibitor (Fig. (Fig.1a).1a). Am Géigesaz, DNA Methylation an der Promoteur Regioun vun D2R am Hypothalamus war net vill vun Behandlung mat 5-aza-dC geännert (Figebam. (Fig.1f).1f). Am Striatum vun 20-Wochen-ale männleche Mais, déi den HFD fir 12 Wochen gefüttert hunn, goufen mRNA a Proteinniveauen vun D2R wesentlech reduzéiert (Fig. (Bild 1b, 1b, k, l). Am Géigesaz, Niveauen vun Dopamin D1 Rezeptoren (D1Rs, kodéiert duerch Drd1), déi op eng Géigendeel Manéier wéi D2Rs op Adenylyl Cyclase a cAMP-mediéiert intrazellulär Signaliséierung handelen, waren onverännert (Figebam. (Fig.1c).1c). Ausserdeem gouf et keng Ännerung an den Niveauen vun anere Molekülen am Zesummenhang mat D2R Signaliséierung, wéi TH an DAT um mRNA an /oder Proteinniveau (Figebam. (Fig. 1d, 1d, e, k, m). Op der anerer Säit goufen keng scheinbar Ännerungen am Hypothalamus observéiert, och fir D2R (Figebam. (Fig.1g-m).1g-m). Notamment waren d'Proteinniveauen vun D2R an TH am Hypothalamus vill méi niddereg wéi déi am Striatum (Fig. (Fig. 1l, 1l, m), reflektéiert méiglecherweis d'relativ Wichtegkeet vun Dopamin-Rezeptor-Signalisatioun am Gehir Belounungssystem am Verglach mam Hypothalamus.
Fir z'iwwerpréiwen ob d'DNA Methylatioun an der Promoteurregioun vun D2R d'Präferenz fir Diätfett verännert, gouf d'Fütterungsverhalen vu 5-aza-dC behandelte Mais analyséiert. Wéi erwaart huet 5-aza-dC däitlech erhéicht mRNA a Proteinniveauen fir D2R am Striatum vun HFD-gefütterte Mais (Fig. (Bild 1b, 1b, k, l). Op der anerer Säit gouf et keen Effekt op Niveauen vun Drd1, Th an slc6a3 (Kodéierung DAT) am striatum, oder op Niveau vun Drd2, Drd 1, Th an slc6a3 am Hypothalamus (Fig. (Fig.1c–e,1c–e, g–m). Wärend Vehikel-behandelte Mais d'HFD léiwer maachen, Präferenz fir den HFD gouf wesentlech reduzéiert bei 5-aza-dC-behandelte Mais (88% vun de Wäerter fir Gefier-behandelt Mais) (Figebam. (Fig.1n).1n). Dofir huet d'Behandlung mat 5-aza-dC de Gewënn am Kierpergewiicht reduzéiert (Fig. (Bild 11o).
γ-oryzanol reduzéiert Niveauen vun DNMTs am Striatum vun HFD-gefütterte Mais
Wéi mir virdru gemellt hunn [14], mëndlech Administratioun vun γ-oryzanol zu männleche Mais duerch Gavage däitlech d'Präferenz fir en HFD ofgeschwächt (93% vun de Wäerter fir Gefier-behandelt Mais) (Fig. (Fig. 2a), 2a), wat zu enger scheinbarer Dämpfung vum Kierpergewiichtsgewënn resultéiert (Fig. (Fig.2b).2b). Mir hunn dofir de potenziellen Impakt vum γ-oryzanol op epigenetesch Modulatioun vun D2Rs am Striatum exploréiert.
Bei Mamendéieren ginn et dräi grouss DNMTs - DNMT1, 3a an 3b. DNMT1 Funktioun fir DNA Methylatioun z'erhalen, während DNMT3a an 3b eng Roll spillen fir de novo DNA Methylatioun z'erliichteren.21]. Fir de potenziellen Impakt vum γ-oryzanol op DNMTs in vivo z'entdecken, hu mir Niveauen vun DNMTs an de Gehirer vun HFD-gefütterte Mais evaluéiert. Och wann d'HFD per se keen Effekt op mRNA a Proteinniveauen vun DNMTs am Striatum oder am Hypothalamus hat, huet d'Ergänzung mat γ-oryzanol d'Niveaue vun den DNMTs am Striatum wesentlech reduzéiert, awer net am Hypothalamus (Fig. (Fig.2c–e,2c–e, g–i, k–n). Dës Donnéeë erhéijen d'Méiglechkeet datt γ-oryzanol Niveauen vun DNMTs op eng striatum-spezifesch Manéier reguléiere kann. Op enger ähnlecher Manéier huet 5-aza-dC d'mRNA Niveauen vun DNMT3a an 3b wesentlech am Striatum reduzéiert (ESM Fig. 1a–d).
Op der Basis vun enger fréierer Etude déi weist datt den mRNA Niveau vun DNMT1 positiv geregelt gouf, op d'mannst deelweis, vum nuklearen Rezeptor ERRγ [22], iwwerpréift mir de potenziellen Effekt vun γ-oryzanol op ERRγ Aktivitéit. An net-mënschleche Mamendéierenzellen, déi aktiv ERRγ konstitutiv ausdrécken, huet 4-Hydroxytamoxifen, e mächtege inverse Agonist vun ERRγ, däitlech reduzéiert d'ERRγ Aktivitéit. Notéiert datt γ-oryzanol deelweis d'ERRγ Aktivitéit reduzéiert huet (eng ongeféier 40% Reduktioun vum gebiertege Wäert) (Fig. (Fig.3a).3a). Wichteg war ERRγ héich am Striatum ausgedréckt awer net am Hypothalamus (Fig. (Fig.3b–d).3b-d). Am Géigesaz zu der Situatioun fir de Striatum huet γ-oryzanol däitlech Proteinniveauen vun DNMT1 nëmmen am Hypothalamus erhéicht (Fig. (Bild 2k, 2k, l). Dës Resultater konnten op d'mannst deelweis duerch eis Erklärung erkläert ginn datt STAT3α, e positiven Reguléierer vum DNMT1 Niveau [23], gouf reichlech am Hypothalamus ausgedréckt awer net am Striatum (Fig. (Bild 33e-g).
Fir den Impakt vum γ-oryzanol op d'Aktivitéit vun DNMTs in vivo weider ze bewäerten, gouf d'Bildung vu SAH, e Nebenprodukt vun der DNA Methylatioun an och e potenten Inhibitor vun DNMTs, an γ-oryzanol-behandelte Mais evaluéiert, déi den HFD gefüttert hunn. Et waren keng bedeitend Verännerungen an der SAH-Bildung entweder am Striatum oder am Hypothalamus tëscht HFD-gefüttert a chow-fed Mais (Fig. (Fig. 2f, 2f, j). Bemierkbar huet γ-oryzanol däitlech d'SAH-Bildung am Striatum reduzéiert (Fig. (Fig.2f)2f) awer net am Hypothalamus (Fig. (Fig. 2j), 2j), suggeréiert datt γ-oryzanol d'Aktivitéit vun DNMTs op eng striatum-spezifesch Manéier an HFD-gefütterte Mais ënnerdrécke kann.
Enzymatesch Analysen iwwer inhibitoresch Eegeschafte vum γ-oryzanol fir DNMTs in vitro
Mir bewäerten nächst den Impakt vum γ-oryzanol op d'Aktivitéit vun DNMTs in vitro. D'inhibitoresch Potenz vun γ-oryzanol, ferulinsäure, 5-aza-dC, haloperidol (e representativen D2R-Antagonist), Quinpirol (e representativen D2R-Agonist) an SAH géint DNMTs goufen bewäert. Als positiv Kontroll huet d'SAH d'Aktivitéite vun DNMTs op eng dosisofhängeg Manéier staark ofgeschwächt (Figebam. (Fig.4a–f).4a–f). Wéi erwaart hunn Haloperidol a Quinpirol keen Effekt op d'Aktivitéite vun DNMTs gewisen (ESM Fig. 2). Opgepasst huet γ-oryzanol d'Aktivitéite vum DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol/l), 3a (IC50 = 22.3 μmol/l) an 3b (maximal Hemmung 57%) (Fig. (Fig.4d–f).4d-f). Am Géigesaz, war d'inhibitoresch Aktivitéit vu Ferulinsäure, e Metabolit vum γ-oryzanol, vill méi niddereg wéi déi vum γ-oryzanol (Fig. (Bild 44d-f).
Mir ënnersicht weider d'inhibitory Eegeschafte vun γ-oryzanol op DNMTs. D'Bildung vu SAH gouf gemooss fir d'inhibitoresch Aktivitéit vum γ-oryzanol op DNMTs in vitro ze bewäerten. D'Donnéeën iwwer d'SAH-Bildung wärend der DNMT-mediéierter DNA-Methylatioun weisen op e saturable Muster vun der Michaelis-Menten Kinetik fir d'Präsenz an d'Feele vu γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g–i).4g-i). Bei DNMT1-mediéierten DNA Methylatioun huet d'Eadie-Hofstee Analyse bewisen datt γ-oryzanol keng Auswierkungen op d'DNA weist. V max SAH-Bildung (Gefier, 597 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 619 pmol/min; γ-oryzanol 20 μmol/l, 608 pmol/min), während γ-oryzanol anscheinend d' K m (Gefier, 0.47 μg/ml; γ-oryzanol 2 μmol/l, 0.67 μg/ml; γ-oryzanol 20 μmol/l, 0.89 μg/ml) (Fig. (Fig.4j).4j). Dës Resultater suggeréieren datt γ-oryzanol DNMT1 op d'mannst deelweis op eng kompetitiv Manéier hemmt. Op der anerer Säit, fir DNMT3a- an 3b-mediéiert DNA Methylatioun, huet γ-oryzanol den V max der Bildung vu SAH (DNMT3a: Gefier, 85.3 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 63.1 pmol/min; γ-oryzanol 20 μmol/l, 42.5 pmol/min; DNMT3b: Gefier, 42.3 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 28.0 pmol/min; -oryzanol 20 μmol/l; 15.0 pmol/min, γ-oryzanol XNUMX μmol/l, XNUMX pmol/min) an ähnlech K m fir dës Reaktioun (DNMT3a: Gefier, 0.0086 μg/ml; γ-oryzanol 2 μmol/l, 0.0080 μg/ml; γ-oryzanol 20 μmol/l, 0.0058 μg/ml; DNMT3b/0.0122; μg/2; μg/0.0097; μ-ml; oryzanol 20 μmol/l, 0.0060 μg/ml; γ-oryzanol XNUMX μmol/l, XNUMX μg/ml) (Fig. (Bild 4k, 4k, l). Dës Resultater suggeréieren datt γ-oryzanol DNMT3a an 3b op d'mannst deelweis op eng net kompetitiv Manéier hemmt.
γ-oryzanol erhéicht d'Niveaue vun D2R am Striatum vun HFD-gefütterte Mais
Mir hunn als nächst d'Méiglechkeet getest datt γ-oryzanol den striatal D2R Inhalt duerch eng Inhibitioun vun DNMTs géif erhéijen. Bei HFD-gefütterte Mais huet d'mëndlech Verwaltung vu γ-oryzanol d'Striatal DNA Methylatioun an der Promoteurregioun vun den D2Rs wesentlech reduzéiert (Fig. (Fig. 5a), 5a), wärend et dëst net am Hypothalamus gemaach huet (Fig. (Fig.5f).5f). Am Aklang mat dësen Erkenntnisser goufen mRNA a Proteinniveauen vun D2R géigesäiteg erhéicht (Figebam. (Bild 5b, 5b, g, k, l). Ähnlech wéi d'Donnéeën iwwer d'Behandlung mat 5-aza-dC (Fig. (Fig. 1), 1), et waren keng scheinbar Effekter op d'RNA a Proteinniveauen vun Drd1, Th an slc6a3 (DAT) am striatum, a keng Auswierkungen op Niveau vun Drd1, Th an slc6a3 am Hypothalamus (Fig. (Fig.5c–e,5c–e, h–k, m).
Virdrun Studien hu gewisen datt Niveauen vun D2R an DNMT1 duerch ER Stress an Entzündung op d'mannst deelweis iwwer NF-κB geregelt ginn [17, 24, 25]. Mir hunn dofir d'Niveaue vun ER Stress-verbonne an inflammation-verbonne Genen iwwerpréift. Wéi virdrun bewisen [26], den HFD erhéicht Ausdrock vun den Genen, déi TNF-α codéieren (Tnfa), Monocyte chemoattraktant Protein-1 (MCP-1) (Ccl2), C/EBP homologt Protein (Kabbel), ER-lokaliséiert DNAJ 4 (ERdj4) (dnjb9) an déi geschleeft Form vum X-Box bindend Protein 1 (xbp1s) am Hypothalamus awer net am Striatum (Fig. (Fig.6).6). Notamment huet d'Ergänzung vun der HFD mat γ-oryzanol de verstäerkten Ausdrock vun Ccl2, Kabbel, dnjb9 an xbp1s exklusiv am Hypothalamus awer net am Striatum (Fig. (Bild 66).
Diskussioun
D'Haaptfunktioun an der heiteger Studie ass datt γ-oryzanol als potenten DNMT-Inhibitor am Striatum vu Mais wierkt, an doduerch, op d'mannst deelweis, d'Präferenz fir en HFD iwwer d'epigenetesch Modulatioun vu striatal D2R ze attenuéieren. Am Striatum vun HFD gefütterte Mais goufen d'Niveaue vun D2R wesentlech erofgaang, wärend déi vun D1R, TH an DAT net geännert goufen (Fig. (Fig.1b–e,1b–e, k–m). Dës Donnéeë sinn konsequent mat der Notioun datt d'Dysreguléierung vum striatal D2R eng kritesch Roll an der Perceptioun vu Liewensmëttelbelounung spillt wann Dir op engem HFD ass, wat zu hedonesche Iwwerkonsum vun HFD bei fettleibeg Déieren féiert [3]. An der heiteger Studie huet d'Behandlung vun HFD-gefütterte Mais mat 5-aza-dC wesentlech d'Niveaue vum striatal D2R erhéicht (Fig. (Bild 1b, 1b, k, l) méiglecherweis duerch eng Reduktioun vum DNA-Methylatiounsniveau an der Promoteurregioun vun D2R (Figebam. (Fig. 1a), 1a), an doduerch d'Präferenz fir Diätfett ofgeschwächt (Fig. (Fig.1n).1n). Dës Entdeckung ënnerstëtzt och eng kritesch Roll vu striatal D2Rs an der Perceptioun vu Liewensmëttelbelounung wann Dir op engem HFD sidd.
Eis in vitro Assay huet bewisen datt d'inhibitoresch Aktivitéit vum γ-oryzanol géint DNMTs anscheinend méi staark war wéi déi vu senger Metabolit Ferulinsäure (Fig. (Fig. 4d–f), 4d-f), suggeréiert d'Wichtegkeet vun der kompletter Struktur vum γ-oryzanol fir seng inhibitoresch Handlung op DNMTs. Bei HFD-gefütterte Mais suggeréieren eis Studien datt, no mëndlecher Verwaltung, γ-oryzanol d'Gehir als eng komplett Struktur erreecht an d'Niveauen an d'Aktivitéite vun DNMTs preferentially am Striatum reduzéiert, mat enger konsequenter Ofsenkung vun der DNA Methylatioun an der Promoteurregioun vun D2R am Striatum. Ausserdeem hunn eis In vitro Studien bewisen datt γ-oryzanol als partiellen Antagonist géint ERRγ handelt, wat haaptsächlech als positiven Reguléierer fir DNMT1 Produktioun déngt.22], an doduercher d'Aktivitéit vun DNMT1 ofgeholl (Figebam. (Fig.3a).3a). Notéiert datt ERRγ héich am Striatum ausgedréckt gouf awer net am Hypothalamus bei Mais (Fig. (Fig.3b).3b). Dës Donnéeë suggeréieren datt γ-oryzanol de Potenzial huet fir den mRNA Niveau vun DNMT1 ze reduzéieren, op d'mannst deelweis, duerch d'Inhibitioun vun ERRγ. Am Géigesaz zum Striatum huet γ-oryzanol keen Effekt op den Niveau vum D2R am Hypothalamus vun HFD-gefütterte Mais gewisen (Fig. (Fig. 5g, 5g, k, l).
Op der anerer Säit hu mir bewisen datt γ-oryzanol d'Niveaue vun DNMT1 am Hypothalamus wesentlech erhéicht huet, awer net am Striatum (Fig. (Bild 2k, 2k, l). Et gouf gewisen datt STAT3 den Inhalt vun DNMT1 an bösartigen T-Lymphomzellen erhéicht [23]. Notamment hu mir virdru bewisen datt γ-oryzanol wesentlech d'leptin-induzéiert STAT3 Phosphorylatioun am Hypothalamus vun HFD gefütterte Mais erhéicht huet.14]. Et sollt och bemierkt ginn datt STAT3α wesentlech am Hypothalamus ausgedréckt gouf awer net am Striatum an de Mais (Fig. (Fig.3e–g).3e-g). Dës Donnéeën verlaangen eis ze spekuléieren datt de scheinbaren Ënnerscheed am Effekt vum γ-oryzanol op Niveauen vum DNMT1 tëscht dem Hypothalamus an dem Striatum op d'mannst deelweis un de Regiounspezifesche Inhalt vu STAT3α an ERRγ am Gehir vu Mais zougeschriwwe ka ginn ( Fig. (Fig.3b–g).3b-g). Zesummen schéngt et e géigesäitege Muster vum Ausdrock vun ERRγ an STAT3α tëscht dem Striatum an dem Hypothalamus bei Mais ze sinn. Op Basis vun eise Resultater ass et dofir raisonnabel ze spekuléieren datt am Striatum, wou d'ERRγ Produktioun reichend ass, γ-oryzanol de mRNA Niveau an d'Enzymaktivitéit vun DNMT1 als negativ Reguléierer vun ERRγ preferentiell erofgoe kann. Am Géigesaz, am Hypothalamus, wou d'STAT3α Produktioun dominant ass, kann γ-oryzanol d'Niveaue vun DNMT1 preferentiell erhéijen.
Eng rezent Studie huet bewisen datt eng Dämpfung vun der striataler D2R Signaliséierung induzéiert duerch en HFD d'Fütterungsverhalen dysreguléiert.3], suggeréiert d'potenziell Wichtegkeet vun der Inhibitioun vu striatal DNMTs fir d'Behandlung vun Adipositas. Op der anerer Säit huet eng viregt Studie eng Méiglechkeet bewisen datt de Status vun der DNA Methylatioun vum Melanokortin Rezeptor 4 Gen ausgedréckt a spezifesche hypothalamesche Käre transgenerational Formen vun Adipositas an agouti viabel giel Mais moduléiere kéint [27]. Och wa weider Studien gerechtfäerdegt sinn fir d'Basismechanismus z'erklären, suggeréieren dës Studien d'Wichtegkeet vun Tissue-, Gen- a Sequenzspezifesch DNA Methylatioun an der Pathophysiologie vun HFD-induzéierter Adipositas.
Mir hunn viru kuerzem gemellt datt HFD den Niveau vun D2R an de Bauchspeicheldrüs Insele vu Mais erhéicht huet [17, 24]. Et ass méiglech datt sou Vergréisserung op d'mannst deelweis duerch ER Stress an Entzündung iwwer NF-KB vermittelt gëtt, well et e puer NF-KB-reaktiounsfäeger Elementer an der Promoteurregioun vun D2R sinn [17, 24]. Ausserdeem huet eng rezent Etude gewisen datt TNF-α an IL-1β den Niveau an d'Aktivitéit vun DNMT1 am Fettgewebe vun HFD-gefütterte Mais erhéijen.25]. Wichteg ass datt déi aktuell Studie bewisen huet datt HFD ER Stress an Entzündung präferenz am Hypothalamus induzéiert huet awer net am Striatum (Fig. (Fig.6).6). Déif Mechanismen vun Tissue-, Regioun- a Sitespezifesch DNA Methylatioun an Demethylatioun an eisem experimentelle Paradigma musse weider Enquête waarden.
Zesumme mat eisem fréiere Bericht weist datt γ-oryzanol d'Präferenz fir en HFD duerch hypothalamesch Reguléierung vum ER Stress bei Mais attenuéiert [14], γ-oryzanol duerstellt och eng eenzegaarteg Eegeschafte fir souwuel hedonesch a metabolesch Dysreguléierung vum Fütterungsverhalen ze verbesseren. Well e puer Antiobesitéit Medikamenter déi entwéckelt gi sinn bekannt fir kritesch negativ Effekter ze verursaachen [8], eng natierlech Nahrungsbaséiert Approche zum Gehir Belounungssystem gëtt erwaart fir Adipositas-Diabetes Syndrom sécher ze behandelen [16]. An dësem Paradigma ass γ-oryzanol e verspriechende Antiobesitéitskandidat mat enger markanter Eegeschafte fir en epigenetesch Modulator ze sinn.
Dankbarkeet
Mir sinn dankbar dem S. Okamoto (Universitéit vun der Ryukyus, Japan) fir d'Iwwerpréiwung vum Manuskript. Mir soen M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato an C. Noguchi (Universitéit vun der Ryukyus, Japan) fir Sekretariatshëllef Merci.
Ofkierzungen
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-deoxycytidine |
| D1R | Dopamin D1 Rezeptor |
| D2R | Dopamin D2 Rezeptor |
| Dat | Dopamin Transporter |
| DNMT | DNA Methyltransferase |
| ER | Endoplasma Reticulum |
| ERR | Östrogen-verbonne Rezeptor |
| HFD | Héich-Fett Ernährung |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocysteine |
| SAM | S- Adenosylmethionin |
| STAT3α | Signaltransducer an Aktivator vun der Transkriptioun 3α |
| TH | Tyrosinhydroxylase |
Notes
Datenverfügbarkeet
Datesets generéiert an / oder analyséiert während der aktueller Etude si vum entspriechende Auteur op raisonnabel Ufroen verfügbar.
Finanzéiere
Dës Aarbecht gouf deelweis ënnerstëtzt vu Grants-in-Aid vun der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 an 24591338), dem Conseil fir Wëssenschaft, Technologie an Innovatioun (CSTI), Cross-Ministerial Strategic Innovation Promotion Program (SIP) 'Technologien fir d'Schafe vun der nächster Generatioun Landwirtschaft, Bëschaarbecht a Fëscherei', d'Lotte Foundation, d'Japan Foundation for Applied Enzymology, New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), de Project for Formation of Life Science Network (Pharmaceutical Field) ) (Okinawa Prefecture, Japan) an de Promotion Project of Medical Clustering vun Okinawa Prefecture, Japan, zesumme mat engem Subventioun vun der Okinawa Prefecture fir Promotioun vun fortgeschratt Medizin (Okinawa Prefecture, Japan).
Dualitéit vun Interesse
D'Auteuren erklären datt et keng Dualitéit vun Interesse mat dësem Manuskript assoziéiert ass.
Bäitrag Ausso
CK an HM entworf der Fuerschung. CK an TK hunn d'Experimenter gemaach an d'Donnéeën analyséiert. TK, CS-O, CT, MT, MM a KA hunn zur Interpretatioun vun Daten bäigedroen. CK an HM hunn d'Manuskript geschriwwen. All Autoren hunn zu Dateninterpretatioun bäigedroen. All Autoren hu sech bei der Revisioun vum Manuskript bäigedroen a seng final Versioun guttgeheescht. HM ass de Garant vun dëser Aarbecht, hat vollen Zougang zu all den Donnéeën an iwwerhëlt voll Verantwortung fir d'Integritéit vun den Donnéeën an d'Genauegkeet vun der Datenanalyse.
Noten
Elektronesch Ergänzungsmaterial
D'Online Versioun vun dësem Artikel (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) enthält peer-reviewed awer net editéiert Zousazmaterial, dat fir autoriséiert Benotzer verfügbar ass.
Referenze
;
