Indeschen J Pharmacol. 2016 Jan-Feb; 48 (1): 53 – 58.
PMCID: PMC4778208
mythologesch
Zil:
Nucleus accumbens (NAcc) huet eng Roll an der Sucht an dem ingestive Verhalen. Fir dat an dësem involvéierten orexinergesche System ze bewäerten, hunn mir den Orexin A-Antagonist infuséiert an den Effekt op d'Liewensmëttelzufuucht an d'Alkoholpräferenz bei Wistar Ratten bewäert.
Material a Methoden:
Inbred Wistar Ratten (n = 54) goufen an Kontroll an experimentellen Gruppen (niddreg Dosis an héich Dosis) opgedeelt. Mat stereotaxescher Method gouf Guidekanula bilateral op der Plaz gesat fir den NAcc z'erreechen. Niddreg Dosis (3 ng) an Héich Dosis (6 ng) vum Orexin A Antagonist (SB-334867) gouf infuséiert, an de Liewensmëttelverbrauch, d'Waasserverbrauch an den Alkoholopnahm, an zwou Flasche frei Wielpréferenz Test fir Alkohol goufen an der experimentell Grupp. D'Kontrollgrupp krut Salz Salzinfusioun an de Rescht vun de Methode si duerno. D'Mesure goufen direkt no der Infusioun duerchgefouert, op 1 h, 2 h, 4 h, a fir de ganzen Dag a representéiert an der Figur an Dëscher.
Resultater:
Eng Ofsenkung vun der Waasserinnlag observéiert direkt no der Infusioun am 1st h (P & Si besteet;nd h (P & Si besteet; 0.01), déi méi an héich Dosis Grupp war am Verglach mat niddereg Dosis a Kontrollen. Alkohol ofgeroden war och nom selwechte Muster. An zwou Fläschen fräie Choix hu Ratten keng spezifesch Preferenz fir Alkohol gewisen.
Conclusioun:
Do war d'Dosisofhängeg Ofsenkung vun der Nahrungsaufnahm vu Flëssegkeeten an de behandelten Rat. Dëst huet eng méiglech Roll fir orexinergescht System am ingestive Verhalen proposéiert. Wéi och ëmmer, Orexin A kann keng Roll bei der Modulatioun vun Alkoholsucht duerch de belountende Zentrum NAcc spillen.
Aféierung
accumbens (NAcc) ass bekannt fir d'Ënnergangsverhalen an d'Sucht fir d'Stoffer ze beaflossen. [1,2] Et gouf och eng Belounung a Motivatioun agebonnen. [3] Zwee ënnerschiddlech Ënnerregiounen goufen am NAcc beschriwwen, an et hu vill Iwwerlappung am Fonctionnement vun dësen zwou Regioune erscheet. [4] Mikroinjektioun vun Suchtdrogen an NAcc weist eng Dosis-ofhängeg Erhéijung vun den Dopaminniveauen. Dopamin ass eng neurochemesch involvéiert am Belounungskreeslaf. Intranuclear Selbstverwaltung vun Amphetamin huet e erhéicht Belounungsgefill gewisen. [5] Aner Deeler an der subkortikaler Regioun beaflossen d'innegutt Verhalen, déi enk mat den Accumbens verbonne sinn. D'Iessen an d'Waasserverbrauch hunn gewisen, datt se vu verschiddenen Deeler vum Basal Gehir beaflosst goufen, sou wéi lateral Hypothalamus, [6] paraventrikuläre Käre, Septum pellucidum, [7] a basolateral Amygdala. [8] Et gëtt extensiv neural Netzwierker an der Reguléierung vun ingestive Verhalen. NAcc gouf gewisen datt se gutt mat de groussen subkortikalen Zentren verbonne sinn, wéi zum Beispill ventral tegmental Regioun (VTA); [9] basolateraler Amygdala an aner Zentren. [10] Major Neurotransmitteren, déi an der Modulatioun vun Alkoholakommes, Belounung, a Liewensmëttelinname involvéiert goufen, goufen aus den neuralen Circuiten an dëser Regioun gemellt.11]
Viru kuerzem goufen Hypokretine, eng Grupp vun heterogen Peptiden, aus dem Hypothalamus identifizéiert, Hypokretin 1 a 2 (Orexin A a B), Peptide déi 32 aa a 29 aa, respektiv. [12] Ursprénglech goufen dës Substanzen an der Reguléierung vum Schlof wakeful Zyklus implizéiert, wéi bewise gëtt de verstäerkten Orexin A fonnt am Hypothalamus während der aktiver Phas vun der Wakefulness.13] An eisem Laboratoire hu mir fonnt datt Orexin A erhéicht d'Liewensmëttel a Flëssegket beim Injektioun an der NAcc. [14] Déi zentral verwalteten orexin Antikörper hemmt Nahrungsaufnahmdosis-ofhängeg an 24 h fasten Ratten, an intraperitoneal Verwaltung vum orexin-Antikörper huet d'Nahrungsverbrauch net verdriwwen, representéiert datt den orexin-Antikörper am Zentralnervensystem wierkt awer net am periphere Tissu. [15] Weider hu se bestätegt datt endogen Orexine physiologesch Roll beim Fütungsverhalen hunn. Obwuel am Ufank Orexine postuléiert goufen fir eegene Verhalen ze beaflossen, sinn d'Beweiser fir d'Roll fir Orexin A am Fütungsverhalen an d'Alkoholzufuhr an och d'Alkoholpreferenz skizzy. An eiser viregter Studie hu mir bewisen datt Orexin A erhéicht Liewensmëttel a Flëssegkeetsaum bei fasten Ratten. [14] Fir d'Roll vum Orexin A an der Zwécksaktivitéit eestëmmeg z'erklären, hu mir dës Serie vun Experimenter bei männlechen Wistar Ratten agefaangen, déi iwwer Nuecht agefaangen hunn, andeems den Orexin A antagonist SB-334867 an den NAcc infuséiert.16] Mir hunn och d'Alkoholpräferenz bei behandelte Ratten getest fir den Effekt vum Orexin A-Antagonist op Alkoholopzuch z'erklären. D'Resultater vun den Experimenter iwwer Iessen, Waasser an Alkoholopnahm, an Alkoholpreferenz ginn hei diskutéiert.
Materialien an Methoden
Véierzeg a véierzeg männlech Wistar albino Ratten (n = 54) Gewiicht (250 ± 10 g), 3-4 Méint al goufen fir Studie ausgewielt. Si goufen an dräi Gruppen agedeelt, w.e.g. Waassergrupp, Alkoholgrupp an Zwee Flasche frei Wielgrupp (n = 18 all). Si goufen an dräi Ënnergruppen ënnerdeelt, d.h. Grupp 1 - Kontroll (Salzlinn Infusioun); Grupp 2 - Niddereg Dosis SB-334867 (3 NG); Grupp 3 - Héich Dosis SB-334867 (6 ng, n = 6 all). Iessen a Flëssegkeet gouf un all Gruppe geliwwert ad lib, ausser wou ernimmt fir d'Nuecht ze fasten.
All Déieren goufen individuell a Polypropylen-Käfeg gehag, mat properem Husk-Bettgezei an op engem 12-h Liicht / Däischter Zyklus a temperaturkontrolléiert Ëmfeld gehaalen. Déieren goufen no de Richtlinnen vum Comité fir den Zweck vun der Kontroll a Betreiung vun den Experimenter op Déieren a Richtlinne vun der Regierung vun Indien fir d'Benotzung vun Laboratoire gehale ginn. Institutional Déieren Ethesch Comité huet dëse Studieprotokoll guttgeheescht.
Drogen an Apparat
Salins 0.9%, SB-334867 (Aus: Tocris Bioscience) gouf an 2% Cyclodextran a steril Waasser opgeléist. Wann net a Gebrauch, goufen Léisunge bei 4 ° C bis 3 Wochen gelagert. Harvard Pico plus (USA) Infusiounspompel gouf benotzt fir Drogen ze liwweren. Krunnewaasser gouf a Plastiks-Drénkfläschen geliwwert, a Ratt Liewensmëttelpellets (Hindustan Unilever Ltd.,) goufe geliwwert. Ethylalkohol (Absolute) gouf opgestallt (Hayman Ltd., Eastways Park, Witham, Essex, CM83YE, UK) a verdënntem fir en 10% Alkohol ze maachen (Dës Konzentratioun gouf op Basis vun enger Pilotstudie iwwer d'Präferenz vun Alkoholkonzentratioun ausgewielt) An. Ketamine (NEON Laboratoiren limitéiert, Thane, MS) an Xylazin (Indeschen Immunologesch Ltd., Hyderabad) goufen fir Anästhesie benotzt.
Chirurgesch Prozedur
Männlech Wistar Albino Ratten goufen anästheséiert andeems eng Mëschung aus Ketaminhydrochlorid (60 mg / kg), Xylazin Hydrochlorid (6 mg / kg) gesprëtzt an op engem stereotaxeschen Apparat (Inco, Indien) montéiert. Eng Inzision gouf op der Kopfhaut gemaach, grëndlech desinfizéiert mat chirurgeschen Geescht. D'Géigend gouf gebotzt mat Koteng a Waasserstoffperoxid. Koordinatpunkte goufen op den Schädel an entspriechende Gebidder gezeechent fir NAcc z'erreechen, mat der Referenz vu Paxinos a Watson Gehiratlas [17] (Vum Bregma: Anteroposterior + 2.2 mm, lateral ± 1 mm a vertikal 7.4 mm). D'Burr Lach gouf gemaach, an Edelstahl Guidekanula (22 Gaze) gouf no de stereotaxesche Koordinaten implantéiert. Soubal d'Kanula op der Plaz ass, ass se mat Hëllef vu Schrauwen an Zänn Acryl geséchert. Guidekanula gouf mat Stylett gepasst, a Rat goufe erlaabt fir op d'mannst 7 Deeg virum Experiment z'erhalen. Infusiounskanula (intern Kanul) gouf aus Septoject Edelstol Zänn Nadel vun 30 Gauger fabrizéiert déi e Knascht huet, bequem fir ze handhaben. [18] Infusiounskanula verlängert 1 mm iwwer déi jeweileg Guidekanula. Virum Ufank vun den Experimenter kruten all Ratten zwee Trainingssitzungen, an deenen se op 24 h gehaalen hunn, duerno hunn se Liewensmëttel, Waasser kritt, an 10% Alkohol. Wärend dëser Sitzung hunn Ratten fasting geléiert.
Experimentell Prozedur
Normal Salzlinn a SB-334867 (an zwou Dosen) goufen, respektiv, a getrennte Gruppe vu Ratten nom 24 h fasten infuséiert; onanästetiséierter (fräi bewegt) Ratten duerch déi geséchert Guidekanula. D'Infusioun gouf duerch 10 μl Hamilton Sprëtz duerchgefouert mat Polyethylenröhre an interner Kanoun duerchgefouert. Dës Sprëtz ass op d'Harvard Pomp gepasst. Dunn ass de Stylett, deen an der Guidekanyul gesat gouf, geläscht. Déi bannenzeg Kanäl ass an d'Leedungskanula agebaut a geséchert. Dunn ass d'Pompel ugefangen d'Léisung an déi riets a lénks Säit vum NAcc eng no der anerer ze liwweren, 1 μl / min (no enger Infusioun interner Kanul lénks fir ongeféier 10 s fir d'Drogendiffusioun ze erlaben). Zwou Dosen SB-334867 goufe bei 3 ng (niddreg Dosis) an 6 ng (Héich Dosis) infuséiert. Um Enn vun der Infusioun gouf d'intern Kanul geläscht, an Stylett gouf erëm an d'Positioun gesat an d'Zäit gouf bemierkt. Post-Infusioun, direkt virgeheescht Betrag vu Liewensmëttel, Waasser, an 10% Alkohol goufen an de jeweilege Gruppe geliwwert. Den Effekt vum SB-334867 op de Verbrauch gouf gemooss a bemierkt, meticulously bei Infusiounsintervaller 1, 2, 4, a 24 h, respektiv. Lénks iwwer Pellets, Waasser, an Alkohol goufen ewechgeholl, an de Betrag konsuméiert gouf berechent (Betrag konsuméiert = virgeséchert Quantitéit-lénks iwwer d'Quantitéit, zB um Enn vum 1 h).
No der Fäerdegstellung vun der Studie goufen d'Ratten duerch eng fatal Dosis Anästhesie geaffert an de Gehir gouf ausgedeelt an erhale fir histologesch Veraarbechtung. Siwe Mikron Sektiounen goufen geschnidden a mat cresyl violett gestalt fir de Site vun der Infusioun ze bestätegen [Figure 1].
Statistesch Analyse
Analyse vun den Date gouf mat der statistescher Software SPSS Versioun gemaach - 16 (SPSS fir Windows, Versioun 16.0. Chicago, SPSS Inc. USA); One-Way ANOVA gouf gemaach fir de Konsumverhalen tëscht de Gruppen ze vergläichen. Inter Verglach gouf gemaach vun Post-hoc Tukey's Test (Stonne Konsum getrennt verglach, zB 1 h Kontroll Nahrungsaufnahme vs. 1 h SB-334867 behandelt Nahrungsaufnahme). Date goufen als mengen ± Standard Feeler vun mengen ausgedréckt P & Si besteet; 0.05, war bedeitendst als.
Resultater
Experiment ech
Liewensmëttel a Waasserverbrauch goufe gemooss (n = 18) an dëser Grupp, NAcc cannéiert Déieren (n = 18), goufen an Ënnergruppen opgedeelt, Grupp 1 (0.9% Salins Infusioun), Grupp 2 (SB-334867-3 ng), Grupp 3 (SB-334867-6 ng). Medikamenter goufen bilateral an NAcc injizéiert [Donnéeën hunn a gewisen Table 1 a Figur Figure1a, 1a, , Bb].
Nahrung ass
Am Verglach mat Kontroll um 1 h no der SB-334867 Behandlung huet e wesentleche Réckgang gewisen (F [2, 15] = 9.171 p = 0.003) an der Nahrungsaufgab (dh Group 1 vs. Group 3, p & Si besteet; wärend keng bedeitend Ännerung um 0.002 h bemierkt gouf (F [2, 2] = 15 p = 0.829); 4 h (F [2, 15] = 0.160 p = 0.854); 24 h Postinfusiounszäitintervalle (F [2, 15] = 4.873 p = 0.023) (Grupp 1 vs. Grupp 3, p <0.028; Grupp 2 géint Grupp 3, p & Si besteet;
Waasser ofgeroden
SB-334867 Behandlung huet keen Effekt op d'Waasserinngang bei 1 h gewisen (F [2, 15] = 0.957 p = 0.406); 2 h (Waasser 2 h F [2, 15] = 0.773 p = 0.479); 4 h (F [2, 15] = 0.288 p = 0.753) Postinfusiounsintervaller; awer insgesamt 24 h Waasserginn ofgeholl gouf (F [2, 15] = 10.688 p = 0.001) am Verglach mam Kontroll (Group 1 vs. Group 3, p <0.002; Grupp 2 géint Grupp 3, p & Si besteet;
Experiment II
Alkohol (10%) a Liewensmëttelverbrauch goufe gemooss [n = 18, Daten an Table 2 an Figure 2].
NAcc kanuléiert Ratten goufen an dräi Ënnergrupp agedeelt, Grupp 1 (0.9% Salins n = 6), Grupp 2 (SB-334867-3 ng, n = 6), a Grupp 3 (SB-334867-6 ng, n = 6).
10% Alkoholzufuitt Resultater
An 1 h an 2 h SB-334867 Behandlung bedeitend attenuéiert Alkoholkonsum bei 1st h (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030), (Grupp 1 vs. Grupp 3, p 0.004nd h (F [2, 15] = 11.122 p = 0.001) (Grupp 1 vs. Grupp 3, p <0.001; Grupp 2 géint Grupp 3, p <0.038). Wéi och ëmmer, et war keng signifikant Verännerung vum Alkoholkonsum bei 4 h (F [2, 15] = 0.709 p = 0.508) an 24 h (F [2, 15] = 2.631 p = 0.105) Intervalle, resp.
Nahrung ass
An 1 h an 2 h SB-334867 Behandlung wesentlech (F [2, 15] = 4.230 p = 0.035) gedämpft Nahrungsaufnahm (Group 1 vs. Group 3, p <0.03); (F [2, 15] = 16.558 p = 0.000) (Grupp 1 vs. Grupp 2, p <0.000; Grupp 2 géint Grupp 3, p & Si besteet; 0.021), respektiv, am Verglach zu Kontroll. Keng bedeitend Ännerunge goufe bei 4 Stonnen (F [2, 15] = 0.070 bemierkt p = 0.933). Woubäi d'Gesamtnahrungskonsommatioun erofgaang ass (0 – 24 h) (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030) (Grupp 1 vs. Grupp 3, p & Si besteet;
Experiment III
Iessen, 10% Alkohol, a Waasser [zwou Fläsch Präferenz, Table 2] Konsum goufe gemooss. NAcc kanuléiert Ratten goufen als Grupp 1 (0.9% Salz Salz,) n = 6), Grupp 2 (SB-334867-3 ng, n = 6), a Grupp 3 (SB-334867-6 ng, n = 6), goufen injektéiert.
Nahrung ass
SB-334867 Behandlung op 1 h (F [2, 15] = 5.111, p = 0.02) gedämpft Nahrungsaufnahm (Group 1 vs. Group 3, p & Si besteet; 0.011) awer kee groussen Ënnerscheed war bei 2 Stonnen, 4 Stonnen (F [2, 15] = 0.093 observéiert p = 0.911), (F [2, 15] = 0.797 p = 0.469), respektiv, a bei 24 h béid Dosis Antagonist hunn Ofsenkung vun der Nahrungsaufnahm gewisen (F [2, 15] = 12.698 p = 0.001) (Grupp 1 vs. Grupp 2 a Grupp 3, p <0.039, p & Si besteet; 0.000, respektiv), am Verglach zu Kontroll Grupp.
Waasser ofgeroden
SB-334867 Behandlung huet keng Ännerung vun der Waasserinnlag an all Grupp mat Zäitintervall um 1 h produzéiert (F [2, 15] = 0.584 p = 0.578), 2 h (F [2, 15] = 0.662 p = 0.530), 4 h (F [2, 15] = 1.655 P = 0.224) an 24 h (F [2, 15] = 0.513 p = 0.609).
Alkohol (10%) ofgeroden
SB-334867 Behandlung ofgeschwächt Alkoholopnahm um 1 h (F [2, 15] = 9.098 p = 0.003), (Grupp 1 vs. Grupp 2 a Grupp 3, p <0.004, p <0.008, respektiv). Keng Bedeitungsännerung an all Grupp um 2 h (F [2, 15] = 0.854 p = 0.446), 4 h (F [2, 15] = 0.931 p = 0.416) an 24 h (F [2, 15] = 0.349 p = 0.711), resp.
Total Flëssegket
Keng bedeitend Ännerung an enger vun de Gruppen, op 1st h (F [2, 15] = 2.064 p = 0.161), 2nd h (F [2, 15] = 1.023 p = 0.383), 4th h (F [2, 15] = 1.205 p = 0.327) an 24 h (F [2, 15] = 0.484, p = 0.626).
Diskussioun
Modulatioun vu Liewensmëttel a Waasserinngang vu verschiddenen Neurochemikalien gouf ënnersicht. Ënner verschiddene Kandidatmoleküle, déi gewisen ginn, datt se de Fudderverhalen beaflossen, och Alkohol enthalen, Orexine sinn och agebonne.19] Orexins goufen ursprénglech als Stimulanten vun der Nahrungsaufnahme gegleeft a Reguléierung vun der Intraktivaktivitéit; spéider goufe se fonnt datt si de Schlof beaflosst a waakreg Staaten.20] Dube et alAn. hu bewisen, datt zentral Verwaltung vun Orexins eng moduléierend Roll bei der ingestive Verhalen huet, haaptsächlech an Hypothalamus zentréiert.21] An eisem heitegen Experiment hu mir den Effekt vum Orexin A-Antagonist (SB-334867) op NAcc getest. D'Nacc huet eng pivotal Roll bei der Sucht an der Ernärungsaktivitéite kritt.22] Orexins goufen och an der Mediatioun vun dëser Aktioun vum NAcc implizéiert. [4] Allerdéngs huet NAcc zwee histologesch ënnerscheedend Distrikter gewisen, [23] déi funktionell Differenzen hunn [24] an hir Funktioune ware scheinbar iwwerlappt. [25] An eise fréiere Experimenter hu mir fonnt datt d'Infusioun vum Orexin A an NAcc mat der Mikroinjektiounstechnik d'Liewensmëttel an d'Waasserinnbrauch an de Stonnen direkt no der Infusioun erhéicht huet, awer et war keng besonnesch Preferenz fir Alkohol wann getest mat zwou Flaschenfräi Wiel. [14] Dofir hu mir probéiert den Orexin A-Antagonist an de NAcc ze sprëtzen an d'Iessen, d'Waasser- an d'Alkoholopgang bei Ratten analyséiert, déi iwwer Nuecht goufe.
De Verbrauch an 1st h ofgeleet an orexin antagonist-behandelten Déieren däitlech. Eis Studie beweist weider d'Roll vum Orexin A am Fütungsverhalen. Orexin Rezeptor Typ 1 (OX1R) Antagonist SB-334867 Infusioun attenuéiert d'Fudder an Drénken. Orexin A weist konsequent de stimuléierende Effekt op Ernierung an Drénken. OX1R Antagonist huet 10 Mol méi Affinitéit fir Orexin A wéi B. [26,27]
Orexinergic Neuronen Projet zum AccSh a béid Orexin Rezeptoren (OX1R an OX2R) si präsent am NAcc, mat OX2R zu engem gréissere Mooss ausgedréckt. [28,29] Orexin A erhéicht GABAergesch Stréimungen a verréngert N-Methyl-D-Aspartatstréim an isoléierten accumbens Neuronen. [30] Ausserdeem begeeschteren orexins dopaminergesch VTA Neuronen. [31] Zënter datt dopaminergesch VTA Neuronen innervéieren an excitéieren AccSh GABAergic (inhibitory) Neuronen, orexin Signaliséierung konnt d'lokal Hemmung an der Acc weider erhéijen andeems d'neuronal Aktivitéit an der VTA erhéicht, wat zu enger weiderer Verbesserung vum consummatoresche Verhalen féiert. Awer dëst war kontrovers zu Baldo a Kelley, [32] déi hu keen Effekt op Füttern oder Lokomotor Aktivitéit mat intra-AccSh Orexin A fonnt.
Mir getest d'Méiglechkeet vum Orexin A als Modulator vum Alkoholkonsum ze handelen [Table 2] zesumme mat Iessen. Vun eiser viregter Studie hu mir festgestallt datt Ratten léiwer Alkohol konsuméieren op 10% Léisung déi an eiser eegener fréierer Studie bestätegt gouf.33] Dofir hunn mir an dëser Etude Alkohol an dëser Verdünnung no der Infusioun vum Medikament an NAcc geliwwert. Mir hunn e wesentleche Réckgang an der Alkoholaféierung an de Stonnen direkt no der Infusioun vum Orexin A Antagonist fonnt. Den Ënnergang am Iessen a Waasserinngang war méi niddereg an der klenger Dosis (3 ng) Infusiounsgrupp, während et méi héich war an der Héichdosis (6 ng) Grupp. Fir den Alkoholpréferenz ze testen, hu mir d'Rotter mat zwou Flaschen Wielebedingung zur Verfügung gestallt, wou eng Fläsch Waasser an eng aner mat 10% Alkohol gläichzäiteg geliwwert goufen. No enger Infusioun vum Orexin A-Antagonist huet e wesentleche Réckgang an der Nahrungsaufnahm an der Alkoholakommes produzéiert. Dës Aart vu Réckgang gouf souwuel an der niddreger an der héijer Dosis fonnt awer limitéiert op 1st h no der Infusioun. Wéi och ëmmer, war de Réckgang vun der Nahrungsaufnahme méi markéiert am Verglach mam Waasser oder Alkohol. Dëse Beweis gëtt Ënnerstëtzung fir d'Bedeelegung vum Orexin A bei der Reguléierung vun entweder Nahrungsaufnahm awer ënnerstëtzt net d'Méiglechkeet vun Orexin A Engagement an der Präferenz fir Alkohol.
Finanzhëllef a Sponsoring
Departement Biotechnologie, Deel vum DBT finanzéierte Projet, Ref: Ref: BT / PR14012 / MED / 30 / 315 / 2010 datéiert 30.09.2010 Regierung vun Indien.
Conflicts of Interest
Et gi keng Interessekonflikter.
Dankbarkeet
D'Auteuren sinn dank dem Department of Biotechnology, Regierung vun Indien, fir déi finanziell Ënnerstëtzung. Kasturba Medical College, Mangalore, Manipal University, fir déi ugebuede Ariichtungen.
Referenze
;