Hypocretin (Osexin) erlaabt d'Belounung duerch Dämpfung vun den Antirevral-Effekter vum Cotransmitter-Dynorphin am ventralen Tegmentalgebitt (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b an William A. Carlezon, Jr.^a

Auteur Informatiounen ► Copyright an Lizenzinformatioun ►

Hypocretin (Orexin) an Dynorphin sinn Neuromodulatoren déi eng wichteg Roll spillen an der Reguléierung vun Affekt a Motivatioun. Orexin ass kritesch fir d'Belounung an ass an der Drogesicht implizéiert, wärend Dynorphin negativ Stëmmung vermëttelt an an depressivähnleche Staaten implizéiert ass. Wann Dir dës opposéierend Effekter berücksichtegt, bericht datt béid Peptiden an de selwechte Neuronen ausgedréckt ginn a coreleased sinn kontraintuitiv. Hei beweise mir datt Orexin an Dynorphin an de selwechte synaptesche Vesikel coexpresséiert sinn an datt dës Kolokaliséierung e groussen Afloss op Belounung, Drogen huelen an impulsiv-ähnlech Verhalen huet. D'Tatsaach, datt Orexin déi depressiv-ähnlech Antibelounungseffekter vum Dynorphin verstoppt, ännert wesentlech wéi mir d'funktionell Roll vum Orexin am Gehir gesinn.

Hypocretin (Orexin) an Dynorphin sinn Neuropeptide mat opposéierend Handlungen op motivéiert Verhalen. Orexin ass an Staaten vun Erhuelung a Belounung implizéiert, wärend Dynorphin an depressivähnleche Staaten implizéiert ass. Mir weisen datt, trotz hiren opposéierende Handlungen, dës Peptiden an de selwechte synaptesche Vesikel am Hypothalamus verpackt sinn. Ënnerbriechung vun der Orexinfunktioun stompt d'belountend Effekter vun der lateraler Hypothalamescher (LH) Stimulatioun, eliminéiert Kokain-induzéiert Impulsivitéit a reduzéiert d'Kokain Selbstverwaltung. Begleedend Stéierung vun der Dynorphinfunktioun reverséiert dës Verhalensverännerungen. Mir weisen och datt Orexin an Dynorphin opposéierend Handlungen iwwer d'Excitabilitéit vun de ventralen tegmentale Beräich (VTA) Dopaminneuronen hunn, e prominent Zil vun Orexin-enthaltende Neuronen, an datt den intra-VTA Orexin Antagonismus Verloschter vun der Kokain Selbstverwaltung a LH Selbststimulatioun verursaacht. déi duerch Dynorphin-Antagonismus ëmgedréit ginn. Eis Erkenntnisser identifizéieren en eenzegaartegen celluläre Prozess, duerch deen Orexin d'Belounungsschwelle-erhéijende Effekter vum coreleased Dynorphin ka verstoppen an doduerch op eng permissiv Manéier handelen fir d'Belounung ze erliichteren.

Orexin an Dynorphin sinn Cotransmitter.

Mir bestätegt Coexpressioun vun Orexin an Dynorphin bannent de selwechte Neuronen vun der Maus lateralen, periforneschen an dorsomedialen Hypothalamus mat der Fluoreszenzmikroskopie (18) (Figebam. 1A). D'Existenz vun Neuronen déi multiple Sender ausdrécken ass an anere Gehirkreesser beschriwwe ginn a kënnen d'neural Basis fir Filtermechanismus duerstellen, duerch déi d'Verëffentlechung vu coexpresséierten Neurotransmitter bei differentiellen Feierraten geschitt (19). Mat EM hu mir awer fonnt datt Orexin an Dynorphin an de selwechte synaptesche Vesikel kolokaliséiert sinn. Déi meescht Fäll vu Copackaging goufen an onmyelinéierten, varicose axonalen Prozesser observéiert, wou Immunolabeling an oder no bei Vesikel fonnt gouf. Bannent neuronalen Zellkierper war bedeitend Etikettéierung mam Golgi Komplex assoziéiert, wärend keng an ugrenzend Käre fonnt gouf (Figebam. 1 B an C). Dendriten enthalen och vesikel-assoziéiert Etikettéierung fir béid Peptiden, wat potenziell dendritesch Verëffentlechung vun dëse Sender suggeréiert. Eng kleng Zuel vu mikrostrukturelle Profiler hunn Axonterminaler ageholl mat Label fir béid Peptiden, déi a grousse (~100 nm) Vesikelen ausserhalb vun der Verëffentlechungszon vun asymmetresche Synapsen lokaliséiert sinn (Figebam. 1 B an C), déi Ënnerstëtzung fir d'Konklusioun ubitt datt Orexin an Dynorphin als Cotransmitter funktionnéieren an datt se ënner normale Bedéngungen zesummen anstatt differenziell als Funktioun vun der Zellbrennfrequenz fräigelooss ginn.

 

Figur. 1.

Orexin an Dynorphin sinn Cotransmitter an Neuronen vum Hypothalamus. (A, wäit lénks) Bright-field photomicrograph weist d'Gebitt vum Hypothalamus iwwerpréift fir Orexin (rout) an Dynorphin (gréng) Immunreaktivitéit. (A, wäit riets) Fusioun zwee-Kanal Bild ...

Belounungsschwell-Erhéijung Effekter vun der Orexin Blockade ginn ëmgedréit duerch Dynorphin Blockade.

Fir d'funktionell Bedeitung vun dësem eenzegaartege Muster vum Senderausdrock z'entdecken, hu mir iwwerpréift ob Stéierungen an der Orexin- an Dynorphin-Signalisatioun komplex Verhalen beaflosse kënnen, déi normal an aberrant Motivatioun reflektéieren. An C57BL/6 Mais trainéiert fir intrakranial Selbststimulatioun (ICSS) auszeféieren, verstäerkt mat lateraler Hypothalamus (LH) Stimulatioun (20), Blockade vun OX₁Rs vun N-(2-Methyl-6-Benzoxazolyl)-N″-1,5-naphthyridin-4-yl urea (SB334867) während der Liichtphase verursaacht dos-ofhängeg Erhéijung vun de Belounungsschwellen (Figebam. 2A; een-Wee widderholl Moossname ANOVA fir Dosis: F_3,12 = 4.44, P < 0.02). D'Erhéijung vun den ICSS-Schwellen reflektéiert Behandlung-induzéiert Reduktiounen am belountende Impakt vun der Stimulatioun, en depressivähnlechen Zeechen, deen indikativ fir eng verréngert Empfindlechkeet fir Belounung (20). Dësen Effekt war net wéinst Sedatioun oder aner net spezifesch Verhalensbehënnerungen, well d'ICSS Äntwertraten net beaflosst waren (Figebam. 2B; een-Wee widderholl Moossname ANOVA fir Dosis: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Figur. 2.

Belounungsschwell-erhéijende Effekter vun der Orexin-Blockade ginn ëmgedréit duerch Dynorphin-Blockade. (A) Blockade vun Orexin Signaliséierung bei OX₁R vum SB334867 (0-30 mg / kg, ip) erhéicht Belounungsschwellen am ICSS Test, wat eng reduzéiert Belounung ugeet. Dësen Effekt ...

D'Erhéijung vun de Belounungsschwelle verursaacht duerch SB334867 goufe verhënnert duerch Virbehandlung mat Nor-Binaltorphimin (norBNI) [zwee-Wee widderholl Moossnamen ANOVA fir Drogen (tëscht Sujeten Faktor) × Dosis SB (bannent Sujet Faktor) Interaktioun: F_3,24 = 3.98, P <0.01], wat eng laang dauerhaft Blockade vun Dynorphinaktiounen bei KORs produzéiert (10). Dës Donnéeë suggeréieren datt de Verloscht vun der Orexin-Signaliséierung latente Antibelounungseffekter vum coreleased Dynorphin weist. Administratioun vun norBNI eleng huet d'Belounungsschwellen net reduzéiert. Och wann dësen Effekt mat der eenzegaarteger Pharmakodynamik vun norBNI an aner prototypesch KOR-Antagonisten verbonne ka sinn (10), kann et och uginn datt et Redundanz a Prozesser gëtt, déi d'Aktivitéit vu Gehirbelounungskreesser moduléieren oder datt phasesch Erhéijunge vum Orexin-Toun eleng (unopposéiert vu coreleased Dynorphin) net genuch sinn fir e Belounungssignal vun der Stimulatiounsplaz am lateralen Hypothalamus ze vermëttelen. Dës Erkenntnisser kënnen am Ufank net konsequent mat der Aarbecht vun aneren schéngen, déi SB334867 op der ICSS-Schwell während der donkeler Phase ënnersicht hunn (21). Wéi och ëmmer, et gëtt bedeitend Beweiser datt d'Ofsenkung vun der Orexinfunktioun Konsequenzen kann hunn, déi ofhängeg sinn ob Déieren während hirer hell oder donkeler Phase getest ginn. Zum Beispill, Liewensmëttel a Waasser behalen hir belountend Effekter an Orexin KO Mais wann d'Tester während der donkeler Phase gemaach ginn, awer net während der Liichtphase (22), d'Zäit wou mir all eis Verhalenstester gemaach hunn.

Fir d'Effekter vun der systemescher SB334867 an der norBNI Administratioun op ICSS ze lokaliséieren, gouf eng separat Kohort vu Mais mat LH stimuléierend Elektroden a VTA Guide Cannulae implantéiert. Mikroinfusioun vu SB334867 an VTA huet däitlech Erhéijunge vun de Belounungsschwelle verursaacht, wat eng reduzéiert Belounungsempfindlechkeet beweist. Och wann intra-VTA norBNI eleng keen Effekt op ICSS-Schwellen hat, huet et d'Schwell-erhéijende Effekter vun der spéider SB334867-Infusioun blockéiert (Figebam. 2C; een-Manéier widderholl Moossname ANOVA fir Drogen: F_3,9 = 10.98, P < 0.01). Och wann intrakranial Drogeninfusiounen éischter bescheiden Reduktioune vun de maximalen Reaktiounsraten am Verglach mat systemeschen Drogeninjektiounen hunn, hunn dës Effekter keng statistesch Bedeitung erreecht (Figebam. 2D; een-Manéier widderholl Moossname ANOVA fir Drogen: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulsivitéit Reguléiert vun Orexin an Dynorphin Transmissioun.

Impulsivitéit ass charakteriséiert duerch Defiziter an der Ënnerdréckung vu Belounungssich Verhalen, mat héijen Niveaue vun Impulsivitéit eng gemeinsam Feature vu ville psychiatresche Krankheeten (23). Drogen vu Mëssbrauch, dorënner Kokain, kënnen och Erhéijunge vun der Impulsivitéit ausléisen, wat hypothetesch ass fir d'Entwécklung vun der Sucht ze féieren (24). Bedenkt d'Schlësselroll fir coreleased Orexin an Dynorphin bei der Kontroll vun der Sensibilitéit fir de belountende Effekt vun der LH Stimulatioun am ICSS Test, hu mir hypothetiséiert datt Interaktiounen tëscht dësen zwee Neuropeptiden d'Basisimpulsivitéit a Kokain-induzéiert Defiziter an dësem Verhalen beaflosse kënnen. Impulsivitéit kann bei Nager quantifizéiert ginn andeems virzäiteg Äntwerten an der 5-Choice Serien Reaktiounszäit Task (5-CSRTT) gemooss ginn (25), en Déiermodell analog zum kontinuéierleche Leeschtungstest benotzt fir Opmierksamkeet bei Mënschen ze studéieren. Virzäiteg Äntwert an dësem Test tendéiert niddereg ënner normale Bedéngungen a gëtt verschäerft duerch Medikamenter déi d'DA Transmissioun erhéijen (26). Mir hunn den 5-CSRTT benotzt fir de Bäitrag vum Orexin-Dynorphin System fir spontan a Kokain-induzéiert impulsiv Verhalen z'ënnersichen. Wann eleng verwalt, huet SB334867 déi scho geréng Zuel vu spontane virzäitegen Äntwerte weider reduzéiert (Figebam. 3A; F_3,21 = 4.89, P < 0.01). Dës Reduktioune koumen an der Verontreiung vun Effekter op d'Äntwertgenauegkeet (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), Pellet Retrieval latency (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), oder d'Zuel vun de Stimulusstudien ofgeschloss (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), wat beweist datt se net wéinst der degradéierter Vigilance oder Motorfäegkeeten waren. D'Verwaltung vun norBNI huet awer d'Effekter vum SB334867 op virzäiteg Äntwert ëmgedréit (Figebam. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), suggeréiert datt onopposéiert Dynorphin Iwwerdroung kritesch ass fir dës antiimpulsiv Effekter ze vermëttelen. Gitt eleng oder a Kombinatioun mat SB334867, huet norBNI keng Effekter op Moossname vun der Äntwertgenauegkeet produzéiert (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latency (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), oder d'Zuel vun de Stimulusstudien ofgeschloss (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Virbehandlung mat SB334867 verhënnert och déi zweefach Erhéijung vun der virzäiteger Äntwert induzéiert vu Kokain (Figebam. 3C; F_6,24 = 5.84, P < 0.01). Dës Donnéeë liwweren Beweiser datt d'Orexin Neurotransmission impulsiv Verhalen ënner béide Baseline a Kokain-stimuléierte Bedéngungen op eng dynorphin-sensibel Manéier reguléiere kann.

 

Figur. 3.

Impulsivitéitsverhalen reglementéiert duerch Gläichgewiicht vun Orexin an Dynorphin. (A) SB334867 attenuéiert virzäiteg Äntwerten am 5-CSRTT Ratmodell vun der Motorimpulsivitéit. Genauegkeetsmoossnamen, Latenz fir d'Liewensmëttelpellet z'erhalen, an d'Zuel vun den ausgeliwwerten Tester goufen ...

Dynorphin vermëttelt reduzéiert Kokain Selbstverwaltung an OX₁R-Null Mais.

Schwachstelle fir Sucht ass däitlech erhéicht bei impulsive Individuen, a Kokain-induzéiert Erhéijunge vun der Impulsivitéit ginn hypothetiséiert fir zum Entstoe vun der Sucht bäizedroen (23, 27). Ausserdeem, Orexin Iwwerdroung an Dynorphin Iwwerdroung goufen onofhängeg implizéiert an der Reguléierung vun de belountende Effekter vu Kokain an aner Drogen vu Mëssbrauch (28-32). Mir hunn hypothetiséiert datt Interaktiounen tëscht Orexin an Dynorphin Iwwerdroung direkt Medikamenter huelen kënnen. Fir dës Méiglechkeet z'entdecken, hu mir iv Kokain Selbstverwaltung bei genetesch modifizéierten Mais ënnersicht déi OX feelen₁Rs (OX₁R^{- / -}). Mais vun dësem Genotyp weisen wesentlech méi niddereg Kokain Selbstverwaltung iwwer eng breet Palette vun Dosen (0.1-1 mg / kg pro Infusioun) awer weisen onverännert Äntwert op Liewensmëttelbelounungen ënner de selwechte Verstäerkungspläng (33), suggeréiert datt d'Reduktiounen vun der Kokain huelen net sekundär fir Defiziter an der Verhalensleeschtung. Ausserdeem, OX₁R^{- / -} Mais weisen normal Tariffer vu Kokain Selbstverwaltung während den ongeféier dräi initial Sessiounen vum Kokain Zougang awer weisen dann séier Ofsenkungen am Kokain huelen (33). Mir bestätegt dëse Phänotyp bei enger Dosis vun 0.3 mg / kg pro Infusioun, wat beweist datt d'Signalisatioun iwwer OX₁Rs spillt eng kritesch Roll bei der Grënnung an Erhalen vun Kokain Selbstverwaltungsverhalen [Figebam. 4; zwee-Wee widderholl Moossnamen ANOVA, Genotyp (tëscht Sujeten Faktor) × Drogenbehandlung (bannent Sujeten Faktor): F_1,12 = 12.91, P < 0.01]. Just wéi d'Virbehandlung mat norBNI normal ICSS an impulsiv-ähnlech Verhalen bei Mais SB334867 restauréiert huet, huet et och deelweis d'Kokain Selbstverwaltung an OX restauréiert₁R^{- / -} Mais, déi en eenzegaartegt Beispill ubidden, an deem e Verhalensdefizit produzéiert duerch genetesch Ablatioun an der Funktioun vun engem Neurotransmittersystem duerch Blockade vun engem aneren gerett gëtt. Dës Erkenntnisser suggeréieren datt, an OX₁R^{- / -} Mais, d'onopposéiert Handlungen vum Dynorphin ofschwächen déi belountend Eegeschafte vu Kokain, an doduerch d'Selbstverwaltung vum Medikament reduzéieren. Interessanterweis an OX₁R^{+ / +} (Kontroll) Mais, norBNI onerwaart reduzéiert Kokain Selbstverwaltung. Eng méiglech Erklärung fir dësen Effekt ass datt Dynorphin, deen vun Nonorexin Neuronen verëffentlecht gëtt, sou wéi déi sougenannte "direkten" striatonigral mëttel spiny Neuronen, déi entgéintgesate Effekter op d'Kokainopnahm huet a vläicht déi belountend Effekter vu Kokain erliichteren. D'Existenz vun zwou Populatiounen vu KORs mat entgéintgesate Rollen an der Kokainbelounung géif och erkläre firwat norBNI nëmmen deelweis d'Defiziter am Kokain-Verhalen, deen am OX festgestallt gouf, ëmgedréit huet₁R KO Mais. Alternativ reduzéiert de KOR-Antagonismus d'aversive oder stresseg Effekter vum Kokain-Entzug (34), déi zu Drogekonsummuster bäidroen (17). Egal, dës Donnéeën suggeréieren datt déi depressivähnlech Effekter vum Dynorphin an der Verontreiung vun intakten Orexin-Signaliséierung herrschen, wat d'Reduktioune vun de belountende Effekter vu Kokain produzéieren, wärend d'Effekter vum Orexin d'belountend Effekter vum Kokain erliichteren, hir Dauer an der Verontreiung vu Kokain verlängeren. Dynorphin Signalisatioun.

 

Figur. 4.

Reduzéiert Kokain Selbstverwaltung am OX₁R KO Mais ginn duerch KOR Blockade restauréiert. Behënnerung vun Orexin Signaliséierung bei OX₁R duerch genetesch Läschung vun dësem Rezeptor reduzéiert iv Selbstverwaltung vu Kokain (0.3 mg / kg pro Infusioun). Dësen Defizit ass deelweis ...

Orexin an Dynorphin kënne balancéiert opposéierend Effekter op Excitabilitéit vu VTA DA Neuronen ausüben.

Gehirstrukturen déi Input vun hypothalameschen Orexin an Dynorphin Neuronen kréien, si potenziell u béid Peptiden ausgesat, an domat ënnerleien hir opposéierend Effekter op neuronal Excitabilitéit (35, 36). D'Ausmooss wéi d'Effekter vun engem Peptid iwwer déi vun deenen aneren herrschen hänkt wahrscheinlech vu ville Faktoren of, dorënner de relativen Heefegkeet vun all Peptid, d'Längegkeet am extrazelluläre Raum, an d'Rezeptorausdrock a verschiddene Populatiounen vun Zilneuronen, souwéi Interaktiounen tëscht d'Rezeptoren an hir intrazellulär Signalmechanismen an postsynapteschen Zellen. Impulsivitéit a Kokainbelounung ginn op d'mannst deelweis vun DA Neuronen an der VTA geregelt (26), e prominent Zil vun hypothalamesche Orexin-enthaltende Zellen (37). Ausserdeem, Infusioun vun Orexin an de VTA verbessert d'Droge Sich (6). Fir d'relative Bäiträg vun all Peptid op d'Aktivitéit vu VTA Neuronen ze bewäerten, hu mir elektrophysiologesch Opzeechnunge vun DA Zellen an C57BL / 6 Maus Gehir Scheiwen gemaach, déi op Orexin an Dynorphin ausgesat sinn eenzel oder zesummen applizéiert. Wéi erwaart, wann se getrennt applizéiert ginn, war Orexin eenheetlech excitatoresch, wärend Dynorphin nëmmen hemmende Effekter produzéiert huet (Figebam. 5 A an B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). An der Bevëlkerung vun DA Neuronen opgeholl, hunn déi meescht op saturéierende Konzentratioune vu béide Peptiden geäntwert, obwuel eng kleng Minoritéit selektiv nëmmen op Orexin oder Dynorphin reagéiert huet (Figebam. 5B). Bemierkenswäert, wa béid Peptiden op déi dual-reaktiounsfäeg Neuronen applizéiert goufen (n = 10), et war keen Nettoeffekt op d'Feierrate (Figebam. 5A), suggeréiert datt déi opposéierend Effekter vun all Peptid bei saturéierende Konzentratioune effektiv géigesäiteg op Corelease annuléieren. Véier vun den 10 Neuronen hunn préférentiell Hemmung vum Dynorphin trotz der Präsenz vun Orexin gewisen, wärend eng Zell préférentiell opgereegt gouf (> 1.5-fach Ännerung) vun Orexin trotz der Präsenz vun Dynorphin (Figebam. 5 A an C). Insgesamt, obwuel méi Zellen op Orexin reaktiounsfäeger waren wéi Dynorphin, déi Zellen, déi op béid Peptiden reaktiounsfäeger waren, haten keng Nettoännerung am Feierrate wann Orexin an Dynorphin coapplizéiert goufen, wat suggeréiert datt déi opposéierend Aflëss vun all Peptid am Set vu VTA DA ausgeglach sinn. Neuronen studéiert.

 

Figur. 5.

Orexin an Dynorphin üben equilibréiert awer opposéierend Effekter op VTA DA Neuronen. (A, lénks) Co-applizéiert Orexin an Dynorphin resultéieren an keng Netto-Ännerung am Feierrate vu VTA DA Neuronen (n = 10). Eenzel ugewannt, Dynorphin war inhibitoresch an Orexin war excitatoresch. ...

Fir d'potenziell Orexin-Dynorphin Interaktiounen bannent VTA DA Neuronen weider ze klären, déi sensibel fir Orexin an Dynorphin waren, hu mir alternativ probéiert d'inhibitoresch Effekter vum Bad-applizéierten Dynorphin duerch Behandlung mat SB334867 ze vergréisseren (Fig. S2A; F_5,25 = 2.13, P < 0.01) oder fir d'excitatoresch Effekter vum Bad applizéierten Orexin ze verbesseren duerch Behandlung mat norBNI (Fig. S2B; F_3,27 = 5.48, P < 0.01). A béid Experimenter, OX₁R a KOR Blockade hunn dës Effekter net produzéiert, wat suggeréiert datt SB334867 an norBNI keng Effekter iwwer net spezifesch Handlungen ausüben. Méi wichteg, suggeréieren dës Donnéeën datt den Toun vun all Peptid in vitro net genuch ass fir beaflosst ze ginn duerch Uwendung vu klengmolekül Antagonisten wéi SB334867 an norBNI. Dës Entdeckung ass konsequent mat fréierer Aarbecht, déi beweist datt Exozytose vu groussen, Peptid-enthale Vesikel typesch nëmme bei héijen nohaltege Feierfrequenzen optrieden, déi net normalerweis a Slicepräparatiounen präsent sinn (38).

Fir z'iwwerpréiwen datt norBNI net d'Verhalen beaflosst duerch "Off-Zil" Aktiounen direkt bei OX₁Rs, mir hunn als nächst d'Effekter vun dësem Antagonist op OX ënnersicht₁R Signalisatioun. Spezifesch hu mir e fluorometric Imaging Plate Lieser (FLIPR) Assay benotzt fir d'Fäegkeet vum Bad applizéierten Orexin A, SB334867 oder norBNI ze bestëmmen fir intrazellulär Kalziumtransienten a kultivéierte CHO Zellen ze induzéieren, déi mënschlech OX ausdrécken.₁Rs. Och wann Orexin A déi erwaart Erhéijunge vum intrazelluläre Kalzium produzéiert huet (EC₅₀ = 0.01 μM) an SB334867 hunn dosabhängig dësen Effekt ofgeschwächt (EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI huet keng Effekter op entweder Baseline oder Orexin A-evokéiert Erhéijunge vum intrazelluläre Kalzium produzéiert. Dëst hindeit datt d'Effekter vun norBNI op VTA DA neuronal Physiologie eleng iwwer proposéiert KOR Signalmechanismen sinn an d'Drogen huet keen direkten Effekt op OX₁R (39) (Fig. S3 A-C).

Orexin-Dynorphin Interaktiounen am VTA Reguléiere Kokain Selbstverwaltung.

Eis Elektrophysiologesch Studien weisen datt dynamesch Interaktiounen tëscht Orexin an Dynorphin d'VTA DA Aktivitéit reguléieren, an datt VTA Neuronen méiglecherweis als Schlësselsubstrat fir d'Effekter vum Orexin-Dynorphin System op motivéiert Verhalen déngen. Fir dës Hypothese direkt ze testen, hu mir d'Effekter vun der intra-VTA Infusioun vu SB334867 op iv Kokain Selbstverwaltung bei Ratten iwwerpréift. Am Verglach mat intra-VTA Gefier Infusioun, intra-VTA SB334867 verursaacht eng däitlech Reduktioun vun der Kokainzufuhr, déi vum norBNI blockéiert gouf (Figebam. 6; One-way ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), suggeréiert datt onopposéiert Dynorphinaktiounen an dësem Gehirgebitt d'Kokainbelounung ofschwächen. Dës Resultater schéngen am Ënnerscheed mat deenen ze sinn, déi d'Feele vun intra-VTA SB334867 op Kokain Selbstverwaltung an engem nidderegen Effort fixe Verhältnis 1 (FR1) Zäitplang vun der Verstäerkung bewisen hunn (40). Wéi och ëmmer, verschidde Berichter hu gewisen datt wann d'Aufgabefuerderunge eropgoen, SB334867 méi effektiv ass fir d'Drogen ze reduzéieren (2, 33). Well Ratten an dësem Experiment e méi héijen Effort FR5 Zäitplang ausféieren, sinn déi aktuell Erkenntnisser konsequent mat dëser Literatur. Dës Donnéeë liwweren direkt Beweiser datt d'opposéierend Natur vun Orexin an Dynorphin op VTA DA neuronal Physiologie bedeitend Effekter op belount-gedriwwe Verhalen ausüben kann.

 

Figur. 6.

Orexin-Dynorphin Interaktiounen am VTA mediéieren Drogen huelen. Kokain Selbstverwaltung gëtt reduzéiert duerch intra-VTA SB334867 (3 μg pro Säit), wärend dësen Effekt ëmgedréit gëtt duerch Virbehandlung mat norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Déieren.

Déi erwuesse männlech C57BL / 6J Mais (8 wk vum Alter; Jackson Laboratoire), déi an EM Experimenter benotzt goufen, goufen Grupp gehal (dräi bis fënnef pro Käfeg); déi fir ICSS benotzt goufen eenzeg no Chirurgie ënnerbruecht. Erwuessene männlech (350 g) Sprague-Dawley Ratten (Charles River Laboratories) goufen an den 5-CSRTT a Kokain Selbstverwaltungsexperimenter benotzt a goufen a Gruppe vu véier gehal. Déi erwuesse männlech C57BL / 6J Mais (postnatal Deeg 19-21), déi fir d'Elektrophysiologie Experimenter benotzt goufen, goufen Grupp gehal (dräi bis fënnef pro Käfeg). Den OX1^{- / -} Mais an hir OX1^{+ / +} Littermates (6 wk vum Alter), déi fir d'Selbstverwaltungsstudien benotzt goufen, goufen vum Jackson Laboratory kritt a goufe méi wéi siwe Generatiounen op C57BL / 6 Mais zréckkräizt. Dës Mais goufen Grupp gehal (zwee pro Käfeg). All Déieren goufen ënner Temperatur-kontrolléiert haten Konditiounen op engem 12-h Liicht / donkel Zyklus ënnerbruecht, a Verhalenstestung geschitt 4-5 h an de Liicht Zyklus; Iessen a Waasser waren ad libitum verfügbar, wann net anescht uginn. Prozedure goufen am Aklang mat den National Institutes of Health duerchgefouert Guide fir d'Betreiung an d'Benotzung vun Laboratoiren (50) a goufen vun den Institutional Animal Care and Use Committees vum McLean Hospital, der University of British Columbia a Scripps Florida guttgeheescht.

Immunhistochemie a Mikroskopie.

Fluoreszenz a Sëlwer-verstäerkt Gold Immunolabeling fir Orexin A oder Prodynorphin gouf op alternativ Maus Gehir Sektiounen no virdru gemellt Prozeduren duerchgefouert (51), a veraarbecht no Standard EM Protokoller. Nonoverlapping Regioune vun immunolabeled Tissue goufen dunn zoufälleg ausgewielt a fotograféiert fir d'Quantifizéierung vu Partikelen mat ImageJ Software (National Instituter vun der Gesondheet) (SI Materialien a Methoden, Immunhistochemie a Mikroskopie).

Elektrophysiologie.

Patchpipetten (3-5 MΩ) goufen mat 143 mm Kaliumgluconat, 10 mm Hepes, 0.2 mm EGTA, 2 mm MgATP, 0.3 mm NaGTP (mat engem pH vun 7.2) an 270-280 mm mOsmol gefëllt. D'Donnéeë goufen op 20 kHz erfaasst a bei 2 kHz gefiltert mat pClamp 10.0 Software (Molecular Devices). Nom Acquisitioun vun enger ganzer Zellkonfiguratioun goufen d'Zellen bei -70 mV Spannung ageklemmt an eng Serie vu Spannungsschrëtt (250 ms, vun -60 bis -130 mV an 10 mV Schrëtt) goufen applizéiert fir Hyperpolariséierung z'entdecken (I_h) Strom. I_h gouf als Ännerung vum Stroum tëscht ~30 ms an 248 ms no der Spannungsschrëtt ugewannt. Intrinsesch Aktivitéit vu VTA DA Neuronen gouf am Stroumklemmmodus gemooss. Experimenter hunn ugefaang wann e stabile Baseline-Feierrate erreecht gouf; Substrate goufen duerno fir 5 min applizéiert an duerno mat künstlechen zerebrospinal Flësseg gewascht. Déi lescht 3 min vun all 5-min Segment goufen fir Daten Analyse benotzt. Dynorphin A (1-17; 200 nM) an Orexin A (100 nM) goufen aus American Peptide kritt an an destilléiert Waasser opgeléist. Dës Konzentratioune goufe virdru fonnt fir saturéierend Effekter op VTA Zellaktivitéit auszeüben (5, 52). Thiorphan (1 μM) a bestatin (10 μM) goufen aus Sigma-Aldrich kritt, an destilléiert Waasser opgeléist, an zesumme mat Dynorphin A (A) applizéiert.SI Materialien a Methoden, Elektrophysiologie).

FLIPR Assay.

OX₁R Aktivitéit gouf bewäert andeems intrazellulär Kalziumniveauen duerch FLIPR Assay gemooss goufen wéi virdru beschriwwen (53) (SI Materialien a Methoden, Fluorometric Imaging Plate Reader Assay).

ICSS.

Mais goufen mat monopolare stimuléierende Elektroden oder Kanülen (PlasticsOne) ënner Ketamin / Xylazin implantéiert (80 an 10 mg / kg, respektiv, ip; Sigma) stereotaktesch op d'LH (resp.18) an / oder contralateral VTA [vu bregma: anteroposterior (AP), -3.2 mm; mediolateral (ML), -0.5 mm; dorsoventrale (DV), -4.7 mm vun dura]. No enger 7-d Erhuelungsperiod goufen d'Mais trainéiert fir op Gehirstimulatioun ze reagéieren wéi virdru beschriwwen (18). Déi niddregst Frequenz déi d'Äntwert ënnerstëtzt (Schwell) gouf berechent mat der mannst Quadrat Linn-vun-best-Fit Analyse. Wann d'Mais Stabilitéitskriterien fir ICSS-Schwellen erfëllt hunn (± 10% iwwer 5 Deeg hannereneen), goufen d'Effekter vun Drogenbehandlungen gemooss. SB334867 (Scripps Florida) oder DMSO Gefier gouf op alternativ Deeg mat enger Hamilton Sprëtz (0.1 mL / kg ip) gegeben, an d'Schwellen goufen direkt a 15-min Testsessiounen quantifizéiert. Den norBNI (10 mg / kg ip; Sigma) gouf a Salzlinn (10 ml / kg) 48 Stonnen virum Start vun ICSS Tester gegeben.

5-CSRTT.

Ratten ware Liewensmëttelbeschränkt (op 85% vum fräie Fütterungsgewiicht) an trainéiert a computerkontrolléierten Operatiounskammeren, déi a gelüfteten, Schalldämpfungskabinetten ënnerbruecht sinn (Med Associates), a 5-CSRTT Prozeduren duerchgefouert wéi beschriwwen (25). SB334867 (am DMSO, 0.1 ml / kg) an / oder Kokain (am Salins, 1 ml / kg; Sigma) gouf duerch IP Injektioun 10 Minutte virum Test gegeben, wéi an aneren Experimenter, an norBNI gouf op d'mannst 48 Stonnen virum Ufank vum Test (SI Material a Methoden, d'5-Wiel Serial Reaktioun Zäit Aufgab).

IV Kokain Self-Administratioun.

Ratten a Mais goufen mat enger Isofluran (1-3% Vol / Vol) Sauerstoffdampmëschung anästhetiséiert a chirurgesch virbereet mat Silastic (VWR Scientific) Katheter an der Jugularven no etabléierte Prozeduren (54). Direkt no der Katheterimplantatioun an de Ratten goufen bilateral Edelstahl-Guidekanülen (23 Jauge, 17 mm an der Längt) an der VTA implantéiert (vu Bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm vun dura) ). Testen mat SB334867 oder norBNI während 60-min deegleche Sessiounen gouf gemaach nodeems d'stabil Kokainopnahm erreecht gouf (<20% Variatioun an der Äntwert fir 3 Deeg hannereneen; SI Material a Methoden, IV Kokain Selbstverwaltung).

Statistiken.

D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SEM ausgedréckt. Fir ICSS Experimenter, zwee-Wee widderholl Moossnamen ANOVA gouf benotzt Mëttel tëscht SB334867-behandelt an norBNI + SB334867-behandelt Konditiounen ze vergläichen. One-Manéier widderholl Moossnamen ANOVA mat Newman-Keuls Post hoc Tester gouf benotzt fir Mëttelen bannent SB334867 an norBNI + SB334867 Bedingungen ze vergläichen. One-way widderholl Moossnamen ANOVA an Newman-Keuls Tester goufen och benotzt fir Mëttelen an all 5CSRTT Experimenter ze vergläichen. Zwee-Wee widderholl Moossnamen ANOVA gouf benotzt fir Mëttelen tëscht Behandlungsgruppen a Kokain Selbstverwaltungsexperimenter mat OX ze vergläichen₁R KO Mais. One-way widderholl Moossnamen ANOVA an Newman-Keuls Tester goufen benotzt fir mëttlere Reaktiounen op Orexin an Dynorphin vu VTA DA Neuronen ze vergläichen. One-way widderholl Moossnamen ANOVA an Newman-Keuls Tester goufen och benotzt fir d'Moyene vun der Kokainopnahm bei Ratten ze vergläichen, déi mat SB334867 an norBNI behandelt goufen. Differenzen goufen bedeitendst considéréiert wann P <0.05.

Mir soen dem Dr. Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vun National Instituter vun Gesondheet Subventiounen F32-DA026250 an K99-DA031767 (zu JWM), F32-DA024932 an K99-DA031222 (zu JAH), R01-DA023915 (zu. PJK), an R01-MH063266AC ) a vun engem Naturwëssenschaften an Ingenieursfuerschungsrot Entdeckungssubventioun (zu SLB).

Interessekonflikterklärung: WAC hält e Patent (US Patent 6,528,518; Assignee: McLean Hospital) am Zesummenhang mat der Notzung vu Kappa-Opioid Antagonisten fir d'Behandlung vun depressive Stéierungen. All aner Auteuren erklären keng konkurréiere finanziell Interessen.

Dësen Artikel ass e PNAS Direkte Soumissioun.

Gesinn Commentaire op Säit 5765.

Dësen Artikel enthält Informatioun iwwer Internet op www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.