Жаздын Natl Acad Илимий АКШ A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.
Жарыяланган онлайн Apr 15, 2014. чтыкта: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Teruko Danjo,a Kenji Ешими,b Кадзуо Funabiki,a Сатоши Yawata,a жана Shigetada Nakanishia,1
Бул макала болду тарабынан келтирилген КУП башка макалалар.
маани
Тинейджер (DA) ventral tegmental аянттын (VTA) менен нейрондор негизинен убактылуу токтотуу боюнча aversive стимулдарга жооп беришет. Бул түздөн-түз жооп чычкандар жүрө-жылы aversive жооп алдыруучу же жокпу, азырынча белгисиз бойдон калууда. Биз optogenetically VTA жылы DA нейрондорду башкарып, бул маселени карап жана DA нейрон inactivation aversive жооп жана окутуунун натыйжасында табылган. ядро accumbens (УИА), VTA DA нейрондордун негизги чыгаруу ядро, бул жооп үчүн жооптуу болуп эсептелет, ошондуктан биз НАК негизги жолдорунун кайсы D1 же D2 кабылдагычтын далил аркылуу бул жүрүм-туруму үчүн катуу сындаган эле карап, жана D2 кабылдагыч-бир жолу бул жүрүм-туруму үчүн өтө маанилүү деп табылган.
жалпылаган
Тинейджер (DA) ventral tegmental аянттын (VTA) чейин берүү пайдалуу жана aversive жүрүм-турумуна да контролдоо үчүн абдан маанилүү болуп саналат. DA нейрон убактылуу токтотуу эле aversive стимулдарга жооп бири болуп саналат, ал эми aversive жооп жана окутуу жөнүндөгү анын кесепеттери жана нейрон механизмдери негизинен кыял бойдон калды. Бул жерде, Биз ядросу accumbens менен VTA DA нейрондордун optogenetic inactivation дароо түшүп-жөнгө DA көлөмүн нейрон иши жана чейин жөнгө көндүрүшкөн (УИА айтышкан) Катары FOS сөз менен бааланат. Tдароо ок DA нейрондун анын optogenetic бөгөт мурда караңгы бөлмөдө артык үчүн aversive жооп туудурган жана optogenetically шартталган жерден aversive билим алып келген. Маанилүүсү, бул жер жийиркенүү тинейджер D2 кабылдагыч далил менен жоюлган, бирок НАК жылы D1 кабылдагычтардын деп эмес,. VTA жылы DA нейрондордун токтотуу aversive жоопторду жүргүзүп, УАК менен тинейджер D2 кабылдагыч аркылуу үйрөнүү үчүн ушундай зарыл болгон.
mesolimbic dopaminergic системасы өрчүтүшүн жана окутуу боюнча бир катар гана негизги ролду ойнойт жок (1-3), Бирок анын бузулушу, ошондой эле Паркинсон оорусу, шаблон, жана наркомания ооруулары менен үлгү болуп катуу neuropsychiatric башаламандыктарга катышкан жатат. Тинейджер (DA) ventral tegmental аянттын (VTA) менен нейрондор .Суигон атышуудан, бул атышуудан негизги милдети алдын ала сыйлык ортосундагы наркынын "сыйлык алдын ката" айырмасын кодду изденүүнүн тарабынан стимул сыйлап жооп чыныгы сыйлык (4). пайдалуу сигналга жооп айырмаланып, aversive стимулдарга алардын сезимге тектеш алыс; башкача айтканда, бир нече DA нейрондун көпчүлүгү башкалар убактылуу өз бактериялык басып кылышат, ал эми aversive стимулдарга жооп жандандырылган болушат (5-9). Чындыгында, акыркы изилдөөлөр GABAergic нейрондор жана DA нейрондор пайда inactivation боюнча optogenetic жандантуу бир aversive жооп сыйлык керектөөсүн жана азгыра бөгөт көрсөттү (10, 11). Бирок, негизинен нейрон чынжырларын механизми турган DA нейрон VTA жылы inactivation төмөнкү aversive билим алуу үчүн жана сыйлык колдонууну токтотууга aversive жүрүш инсанга карата кандай жүрүш-жооптор көзөмөлдөнөт үчүн маанилүү үчүн кыял бойдон калууда.
Топтолгон далилдер оң жана терс стимулдарга жооп умтулуучулук жана таанып-окутуу негизинен базалдык ganglia ичинде нейрон чынжырларын менен жөнгө салынат экенин аныктады (12) Midbrain тартып dopaminergic долбоорлоо көп кабыл алып. striatum эки негизги бөлүктөр көрсөтүлгөн орто бадал нейрон (MSNs) менен түзгөн болсо, ар бир билдирүү DA кабылдагычы бир-биринен айырмалуу түрү (13).
- Бир райондук базалдык ganglia көлөмү ядролору үчүн MSNs түздөн-түз долбоорлоого турган, түз жолдору болуп саналат, substantia Nigra үлүшү reticulata (SNR), жана негизинен тинейджер D1 кабылдагычтарга билдирген (D1Rs).
- Долбоорго SNR кыйыр үчүн ГЛОБУС pallidus аркылуу MSNs жана биринчи кезекте, экспресс-тинейджер D2 кабылдагыч (D2Rs) турган башка, кыйыр жолу болуп саналат.
DA D1Rs жана D2Rs аркылуу карама-каршы тартипте midbrain сигналдар динамикалуу бул эки окшоштук жол менен байытып, бул Модулатион Жүйөлүү окутууну камсыз кылуу болжолдонууда (3, 14).
- пайдалуу сигналдар болсо, үзүрлүү сигналдар аркылуу жасалма чейин жөнгө DA баскычтарында ядросу accumbens түз жол D1Rs Ошентип, негизинен көмөк жандантууга эсептелет (УИА).
- Башка жагынан алганда, aversive стимулдарга жооп DA нейрон бактериялык бөгөт НАК жылы DA санда кыскарышы; жана бул мамиле атайын жандырылган D2Rs аркылуу кыйыр жолуна белги берүүнү камсыз кылуу болжолдонууда.
дары-дармек менен стратегияларды жана калыбына neurotransmission тосуулар менен изилдөөлөр да (RNB) ыкмасын НАК жөнгө бул механизмди колдоого (15, 16), Ал DA нейрон атылышынын бөгөт кыйыр жолуна ишин алдыга жылдыруу жана андан качкан, жүрүм-турумун, оокат үчүн жетиштүү эмес экенин, туура же белгисиз бойдон калууда. Бул изилдөөдө, биз optogenetically кабыкча-hyperpolarizing Arch белок бурмалап VTA менен тандап DA нейрондорду inactivating менен бул маселени чечүү (17) Жана айкын VTA жылы DA нейрон бөгөт кийин НАК жылы DA өлчөмдө азайган экенин жана aversive жооп берүүнүн жана окутуунун азгырган. Мындан тышкары, биз бул кабыл жөнгө салуу механизмдерин изилденип, бул aversive жооп атайын НАК жылы D2Rs тарабынан контролго алынып келген деп билдирди.
натыйжалары
DA Нейрондор Blocks Dark-бөлмө артыкчылык Optogenetic Inactivation.
тандап DA нейрон бактериялык кылуу үчүн, биз CRE-inducible adeno байланышкан ээледи курган коддоо Arch-eGFP [AAV-эки-floxed алуу ачык окуу режиминде озунорго (ОПО) -Arch] ийне (17) Бойго жеткен тирозин гидроксилаз VTA салып бир тараптуу (TH) -Cre чычкандардын (18) Жана жапайы түрү (WT) ОДНОПОМЕТНИКИ жана VTA жогоруда оптикалык жайгаштырылган (Сүрөт. S1 A жана C). хирургиялык эки жума өткөндөн кийин, Арка-eGFP чектелген VTA белгиленди (Сүрөт. S1B). Биз electrophysiological жазуу менен Arch белок hyperpolarizing таасир сыналган жана AAV-ОПО-Арча саюудан TH-CRE чычкандардын VTA оптикалык стимулдаштыруу таасир ченеди. Эллисон TH-CRE чычкандардын VTA тартып Vivo electrophysiological жазуулар-жылы алыскы DA нейрон оптикалык дем алардын бактериялык бөгөт ачып берген (Сүрөт. S2), Оптикалык дем жетиштүү DA клеткалардын Arch-билдирүү кабыкча дараметин hyperpolarized жана алардын башаламан атышууну бөгөт көрсөтөт.
Бул чычкандар пайдалануу менен, биз кийинки VTA жылы DA нейрондордун оптикалык inactivation жүрүш окутуу үчүн aversive белги катары кызмат жокпу каралат. Чычкандар кара чөйрөнү артык үчүн тубаса жакын ээ (19). Биз чычкандар эркин караңгы бөлмөгө изилдөө жана жаркыраган мейкиндикти көрүү мүмкүн болгон жүрүм-турум аппаратты арналган (Анжир. 1A). көнүгүшүп кийин, WT чычкандар караңгы бөлмөдө менен да караңгы бөлмөдө же оптикалык дем жок айрыкча калды (Сүрөт. S1D), Өзү да, алардын кара-бөлмө-артык жүрүм-турумуна эч кандай таасирин тийгизгендигин оптикалык дем камсыз кылуу. Биз алардын жүрүм-турумуна да нейрондордун оптикалык inactivation таасирин текшерүү үчүн жаныбарлардын жүрүм-турумдук эксперимент пландаштырылууда (Сүрөт. S1E). көнүгүшүп жана pretest кийин, чычкандар тилке алар караңгы бөлмөдө жашап жатканда VTA жылы DA нейрондорду дем менен шартталган болчу. Ал тургай, Пропаганда биринчи 5 мин учурунда, TH-CRE чычкандар мурда караңгы бөлмөдө артык чыгып калып, амалкөйлүк Пропаганда бою караңгы бөлмөгө (качууАнжир. 1B). TH-CRE чычкандар, алар тесттөөдөн эч кандай оптикалык дем алды да, караңгы бөлмөдө каршы макулдашуулардын негизинде жокко эмес (Анжир. 1C). Бул маалыматтар DA нейрон hyperpolarization гана убактылуу aversive жүрүм жасалма эмес экенин көрсөтүп турат, бирок ошондой эле караңгы бөлмөдө каршы aversive окутуу үчүн белги катары кызмат кылып, ошондой эле DA нейрон inactivation убактылуу aversive жүрүм-туруму жана узакка созулган aversive билим да себеп ролду ойногон деп көрсөткөн.
Optogenetic NAC жылы DA гээлдеги жана Down-жөнгө салуу.
Биз кийинки DA VTA нейрондордун inactivation, чынында, анын негизги дарект ‰‰ аймактагы Д.А. топтолушун өзгөртүлгөн, УАК, жокпу, изилденген. Биз тез-сканер туруучу voltammetry (FSCV) AAV-ОПО-Арча, алардын VTA салып саюудан болгон Эллисон TH-CRE чычкандар менен НАК-жылы да көлөмүн ченеди. НАК жылы DA денгейй токтоосуз VTA электрдик сигналдар менен жогору, ал статуя DA релизи кыйла VTA учурда оптикалык сигналдар менен кыскарган (Сүрөт. S3). Биз анда VTA оптикалык дем НАК жылы тоник DA көлөмүн азайтышы мүмкүн, жокпу, сынап. Ошол эле эксперименталдык орнотуулар, биз НАК жылы DA деңгээл убактылуу 20 VTA оптикалык стимулдаштыруу с азайган эле байкалган (Анжир. 2) Aversive сигналдар каршы билдирди FSCV иретинде (менен шайкеш болгон,20). Бул маалыматтар VTA оптикалык дем VTA DA нейрондорду кылуу үчүн, ошондой эле жүрүм-турум эксперимент учурунда НАК жылы DA денгээлин азайтам жетиштүү натыйжалуу эмес экенин көрсөтүп турат.
VTA жылы DA Нейрондор оптикалык Inactivation тарабынан FOS Джин Ой-Up-жөнгө салуу.
VTA жылы DA нейрондордун коюлтулган inactivation улам-турумду өзгөртүү оптикалык дем берүү түздөн-түз нейрон ишин өзгөртүп жана жүрүш-аткаруу алмашуудан алып сунуштады. Ошентип, биз кийинки FOS эркбилдирүүсүнө, тез арада башында ген карап DA нейрон нейрон иши коюлтулган inactivation тарабынан жогору турган региондор изилденген. аналоги кара-бөлмө сыноо ишке ашырылган көп өтпөй, чычкан тез -табыгый гибриддештирүү талдоо боюнча сандык менен FOS сөз көлөмүн аныктоо үчүн иштелип чыкты (Анжир. 3 жана Сүрөт. S4). УАК, VTA тартып dopaminergic прогноздук көп алат району, TH-CRE чычкандардын FOS сөз бир кыйла көбөйгөн көрсөтүштү (Анжир. 3). Бул өйдө-жөнгө салуу, ошондой эле калп деп капталга вирус жуктуруп бир аз себеп болгон оптикалык өбөлгөлөө каршылык к³ч³ тараптан табылып жатты. Ошондой болсо да, өйдө-жөнгө салуу НАК боюнча DA нейрон түздөн-түз жөнгө нейрон ишин ошол оптикалык inactivation деген, оптикалык өбөлгөлөө каршылык к³ч³ жагына караганда ipsilateral жагында кыйла жогору болгон. көбөйдү FOS сөз айкашы башка мээ аймактарда бункердин ичинде байкалган, striatum, basolateral amygdala (BLA) жөнүндө periventricular аймактарында жана каптал гипоталамус, бирок жанынан habenula же prefrontal ошо ёткёндъгъ жёнъндё (mPFC болгон эмес; Сүрөт. S4). Бул жыйынтыктар DA нейрон оптикалык inactivation жандандырылган аймактар VTA DA нейрон түз максаттуу региондор менен чектелген эмес, тескерисинче, кыйыр түрдө бир нейрон райондук-каранды абалда ишке мүмкүн аймактар бар экенин көрсөтүп турат. Бул байкоо DA нейрон оптикалык inactivation барак райондук жалпы нейрондордун кыймыл-аракет менен гана aversive кабыл маанайын алган жок, бирок ошондой эле, мисалы, тынчсыздануу, коркуу, стресс жооп катары бир нече башка мээнин иштеши боюнча демилге (деп божомолдоого болот21).
DA белги аркылуу D2R Optogenetically азгырган шартталган Place келбөө үчүн чечүүчү мааниге ээ.
VTA тартып dopaminergic сигналдар көпчүлүгү MSNs НАК жылы DA кабылдагыч аркылуу жеткирилет, D1R жана D2R. D1R дээрлик зат P (Tac1 ген тарабынан код) айтылат MSNs -expressing жана D2R негизинен enkephalin менен (Penk ген тарабынан код) -expressing MSNs; MSNs ар бир түрү түздөн-түз жана кыйыр жол менен түзүп, тиешелүүлүгүнө жараша, УАК-жылы (3). Э үчүн төп D2R үчүн кыйла жогору болгондуктан (Н.М. тартиби) D1R (мкм тартиби) караганда (22, 23), DA катмарын азайтуу G-жылдын inactivation алып ойлонуп жататi-coupled D2R бирок D1R эч кандай байкалаарлык таасирин тийгизет (3, 24), Ошону менен кыйыр жолуна атайын нейрон ишин жөнгө салуучу чейин. Мындан тышкары, FOS жандантуу дагы Penk- же Drd2 айкын байкалган (D2R) -expressing Tac1- же Drd1a (D1R) караганда клеткалар -expressing клеткалар болгон (Сүрөт. S5). Ушул байкоолордун негизинде, биз D2R аркылуу DA белги байкалган aversive шарттаган негизги ролду ойной ала тургандыгы гипотеза.
Бул божомолду сынаш үчүн, үч бөлмө коюлтулган жер махаббатка жасаган (ПАК) сыноо (Сүрөт. S6). Биз дээрлик бирдей шарттарда жана кичинекей бир коридор менен эки бөлмөлөрдү камтыган жүрүм-турумдук аппаратты даярдалган. Бул калыс экологиялык абалы ПАК сыноого ары VTA DA нейрон inactivation aversive жооп жүргүзүп, үйрөнүп, караңгы бөлмө артыкчылык тосуп тышкары жөндөмдүү экендигин текшерүүгө эмне жардам берген. жаныбарлар эркин толугу менен аппарат жылууга жол жүргөндө, алардын көпчүлүгү pretest кандай мүнөздүү жүрүш-туруш айырмачылык жок эки бөлмөсүндө калды. оптикалык аналоги бир туруктуу палатасы менен оптикалык стимулдун жупташуу менен аткарылган. бөлмөлөрдүн да шарттаган үчүн колдонулган да, TH-CRE чычкандар көшөрүп жана олуттуу Пропаганда учурунда жана тесттөөдөн боюнча тилке шартталган бөлмөсүнө жашап качышкан (Сүрөт. S6 B-E). Статистикалык анализ WT чычкандардын токтоочу убакыттын өтүшү менен салыштырганда тесттөөдөн боюнча тилке коюлтулган бөлмөдө TH-CRE чычкандардын убакыт болуу олуттуу кыскартуу тастыкталды (Сүрөт. S6F).
Биз атайын НАК жылы DA кабылдагычтардын ар бир басуу менен бул aversive жүрүм-тартылган DA сезгич чакан көрсөтүүгө аракет (Анжир. 4 жана Сүрөт. S7). Биз иштеп жана mCherry уюмдаштыруу сөз менен ар бир DA кабылдагычы үчүн белгилүү бир кыска hairpin РНК (shRNA) камтыган lentiviral багыттарын тастыкталды. Үч апта НАК салып lentivirus сайгандан кийин, mCherry ишенимдүү сөздөр НАК менен ооздукталган (Анжир. 4B). Ар бир кабылдагыч менен РНК сөз натыйжалуу далил сандык реалдуу убакыт ПКО талдоо (сүрөт менен тастыкталды. S7A). Батыш өчүрөм аркылуу белок көлөмүн өлчөө, ошондой эле тандап lentiviruses ар деген сайма ачып DA кабылдагычы башка типтин-ниетин билдиришине таасир эткен жок, анын максаттуу протеин продукт кыскарган (Анжир. 4C жана Сүрөт. S7 B-G). башкаруу илдет үчүн көлөмүнө салыштырмалуу shD1R- жана shD2R-билдирген lentiviruses, тиешелүүлүгүнө жараша, алардын максаттуу белок көлөмүн ± 46.2% 1.1 жана 38.4 4.9% ± чейин азайган (Анжир. 4C). Бул жыйынтыктар lentiviral алардын максаттуу РНКлар D1R жана D2R боюнча конкреттүү shRNA билдирген тандап жана жетиштүү тыюу багыттары жана тиешелүү белок заттарын суммасын-жөнгө да тастыкталды. Биз ошондой эле mCherry менен вирус-кыйыр сөз lentivirus-кыйыр shRNA түздөн-түз VTA таасир мүмкүндүгүн эске албаганда, VTA аныкталган жок экенин ырастады.
shRNA камтыган бул lentiviruses пайдаланып, биз DA кабылдагычы түрү DA нейрон optogenetic inactivation менен азгырган aversive жүрүм-туруму үчүн жооптуу болгон сыналган. Биз менен бирге эки тараптуу НАК салып lentivirus же контролдук lentivirus shRNA камтыган AAV-ОПО-Арча TH-CRE чычкандын сол VTA ыроолонот. оптикалык да VTA жогоруда киргизилген болчу (Анжир. 4A). үч-бөлмө ПАК тест үч жума хирургия кийин жүргүзүлгөн учурда, Lenti саюудан TH-CRE чычкандар: shD1R-mCherry дагы сайылып TH-CRE чычкандардын салыштырылганы оптикалык дем-жупташкан бөлмөгө каршы ачык ПАК көрсөттү башкаруу lentivirus (Lenti: mCherry). Ал эми, Lenti саюудан TH-CRE чычкандар: shD2R-mCherry Пропаганда учурунда ачык ПАК көрсөтүшкөн эмес (Анжир. 4D). Lenti саюудан TH-CRE чычкандар өзгөчө окутуу тартыштыгы: shD2R-mCherry тесттөөдөн ары aversive окуу анализи боюнча негиздүү болгон (Анжир. 4E). Бул жыйынтыктар НАК жылы DA нейрон inactivation менен шартталган жерге aversive жүрүм-туруму, атап айтканда D2R аркылуу жана D1R аркылуу эмес, угулган жок экенин көрсөтүп турат.
талкулоо
striatum, изилдөөлөр көрсөткөндөй, G деп жанданганын ачып бердимs-coupled D1R G ишке, ал эми анын атышууну көмөктөшөтiтыюу атууга натыйжалуулугун -coupled D2R натыйжалары (25). AcDA кабылдагыч сөз мүнөздүү билингендей, DA нейрондордун .Суигон бактериялык негизинен DA нейрон бактериялык-жылы убактылуу төмөндөшү негизинен D1R аркылуу кыйыр жолу жөндөмсүздүгү өбөлгө түзөт, ал эми D2R аркылуу түздөн-түз жол жандантууга (3, 26). жөнгө салуу Бул механизмдин негизинде, ал, негизинен, aversive жүрүм кыйыр жолуна жана учураралык жыйынтыктар аркылуу иштетилет aversive стимулдарга жооп DA нейрон деп токтотуу сунуш кылынды (3). Акыркы изилдөөлөр кыйыр жолуна жана кичинекей берүү блокада электр таасирлерине кашайтып aversive жүрүм-алуу начарлатса экенин көрсөттү (15), Бул баанын D2R-арачылыгы сигнал берүү тыюу салуу менен шартталган деп (16). менн тышкары, кыйыр жолуна MSNs D2R-билдирүү optogenetic чейин жөнгө жүрүш макулдашуулардын негизинде пайда (27). Бирок, DA нейрондор aversive стимулдарга жооп жана башка шок байланышкан сезүү маалымат учурда мээ менен иштелип чыгат да, күчөтүлгөн жана тыюу бактериялык көрсөтүү, анткени ал дагы эле DA нейрон токтотуу түздөн-түз aversive жооп жана окутууну эле жаратышы мүмкүн же аныкталууга тийиш болгон бойдон калууда, бул сезим аркылуу жөнгө салынат же кыйыр жолуна MSNs D2R-билдирүү.
Бул макалада биз эки жүрүш-тесттер менен DA нейрон бактериялык-жылдын optogenetic көзөмөл пайдалануу: кара-бөлмө артыкчылыктуу тест, үч-бөлмө ПАК сыноо. Биздин optogenetic оюндар НАК жылы DA ченемдерин VTA жана ылдый-жөнгө DA нейрон бактериялык натыйжалуу бөгөт көрсөттү. Биздин так убактылуу DA түздөн-түз катышпай качкан, жүрүм-турумун улам токтотуу экенин көрсөтүп optogenetic жаныбарлар DA нейрон бактериялык гана мезгил ичинде inactivation ачык шартталган бөлмөгө калды бир aversive кабыл жана окутуунун туудурду. Мындан тышкары, бул тергөө D2R-арачылыгы сигналдарды иштеп чыгуу бул aversive буруу жана окуу кошулуу үчүн негизги аныктоочу экенин түшүндүрүп берди.
Биздин маалыматтар D1R ПАК шооласын жүрүш эксперименттердин эч кандай таасир эткен деп көрсөткөн да, бир нече изилдөөлөр DA нейрон .Суигон атууга коркуу жооп жана aversive окутуу талап кылынат (бул документалдуу28, 29). Бул айырма сынамык шарттарга байланыштуу болот; башкача айтканда, биздин optogenic мамиле DA нейрондор aversive-турум жана окутуу түрткөнүн жетиштүү inactivating көрсөтөт aversive жүрүм-турумун, стуктурасын ишке DA нейрондор менен сигналдаштыруунун мүмкүндүк бербейт. aversive сигналдар менен апрел айында ишке DA атышуудан милдети жана сигналдарды иштеп жерде окуган адамдардан aversive жүрүм-ар кандай салым кошо алат жана келечекте аныкталууга тийиш керек.
DA нейрондор да mPFC, amygdala жана Hippocampus, анын ичинде ар кандай башка аймактарына ойлойбуз. Жакында эле жүргүзүлгөн бир изилдөөгө айткан VTA жылы DA нейрон менен долбоордук каптал habenula нейрон optogenetic жандантуу aversive жүрүм-кылдыра алган жана бул DA нейрондор mPFC негизинен жана атайын максаттуу (30), Алардын optogenetic дем бир аналоги жыйынында узартылышы эле алардын optogenetic аналоги, азыркы изилдөө деп башкача да. mPFC үчүн dopaminergic киргизүү aversive сигналдар менен гана эмес, ошондой эле өнөкөт стресс жандандырылат деп билдирди, анткени (31, 32), Ал mPFC-барктын да нейрондордун өз үзгүлтүксүз жандантуу өтө оор чөйрөсүнөн сигнал катары кабылданат турганын мүмкүн; жана оор аналоги топтоо натыйжасында, жаныбарлар шартталган бөлмөсүнө aversive жүрүм-турумун көрсөтүп келет. Ал эми, жаныбарлардан айырмаланып, биз шартталган бөлмөсүндө отурган эле, ал эми DA нейрон атышууну бөгөт коёт. убакыт-дал шарттаган колдонуп, биздин жүрүм-турумдук эксперименттердин натыйжалары DA сигналдардын бир заматта бөгөт коюу, алардын тез aversive жооп алып, күтүлбөгөн жерден бир aversive киргизүү катарында кабыл алынат, деп айткан.
DA нейрондор да amygdala, проект, негизинен коркуу жооп өбөлгө аймакты. Чынында эле, amygdala үчүн белги DA коркуу эс коркуу жооп жана сатып алууга катышкан жатат (33, 34). Биздин изилдөөдө, VTA менен маркалоо DA нейрондор Эйсиз үчүн долбоордук DA бир нейрон жыйындысы аныктады, бирок бул прогноздук көлөмү НАК үчүн долбоордук алда канча төмөн болгон. Биз байкалган aversive жүрүм amygdala-болжолдонгон DA сигналдаштыруунун кылдат таасирин жокко мүмкүн эмес болсо да, DA нейрондордун биздин optogenetic inactivation негизги таасир НАК жылы D2R конкреттүү далил менен эксперименттер кескин азайып, анткени УАК, болушу керек aversive жүрүм-туруму. максаттуу-айкын DA белги чечүүгө Future иликтөө aversive стимулдарга жана коркуу шарттаган DA нейрон райондук элдик өзгөртүүлөрдү кесепеттерин аныктайт талап кылынат.
Материалдар жана ыкмалар
Сабактар.
Тирозин гидроксилаз :: Ires-CRE (TH-CRE) чычкандардын (ЭМ: 00254)-жылы уруп (18) European Mouse Мутант Archive алынган. Бардык эксперименталдык жаныбарлар 57 муундарга караганда C6BL / 10J штаммына backcrossed болчу. Чычкандар C57BL / 6J WT чычкандар менен стандарттуу 12-ч жарык менен бир жайда / 12-ч кара айлампасынын жана тамак-аш жана суу ад либитум берген менен аргындашып кетип жатышты. CRE+ жана CRE- Ошол эле литрди (жашы 3-6 мо) тартып, чычкан тажрыйба жасоо үчүн колдонулган. Бардык мал эксперименттер жаныбарлардын эксперименттер колдонмолору астындагы Осака биобилим институтунун мал комитети тарабынан кабыл алынган.
Жүрүш-туруш Тесттер.
бардык жүрүш-сыноолордун учурунда, чычкан бир оптикалык байланыш менен байланышкан жана бүтүндөй аппаратты айланасында көчүп кетүүгө уруксат беришти. чычкандын кыймылы алар баштарына боюнча оптикалык байланыш менен байланышкан да эч кандай тоскоолдуктар жок айланасында кыймылдай алышы үчүн көзөмөлгө алынган. чычкандай абалы жүрүш аппаратынын үстүнөн убактылуу токтотулган жана Labview программалык каражаттарды пайдалануу, салт-түзгөн программа боюнча талдоо камерасы менен табылды.
Dark-бөлмө артыкчылыктуу сыноо.
сыноо колдонулган бажы жасалган жүрүм-турумдук аппараты бир караңгы бөлмөдө курамында болгон (15 × 9.5 см) жана жаркын ачык космосто (15 × 11 см). караңгы бөлмө дубалдарын, пол, бардык кара түстүү бир чатыры, ачык жана ачык космоско бир кириш (4.5 см чейин) болгон. ачык ачык космоско бир эллипс жана металл торчо полу жана чатыры жок так дубалдарын болуп калыптанган. сыноо алдында, бардык чычкандар аппарат 10 мүн имаратта өрт чыкты. тест үч нөөмөткө турган: 1 күнү алгачкы жарымында (pretest: 5 мин), чычкан бүт аппаратты изилдөө үчүн уруксат берилген. 1 үчүн күн кеч жарым From 4 (Пропаганда: бардыгы 35 мин), чычкан, алар караңгы бөлмөдө жашап жатканда оптикалык дем алды. On күнү 5, кара-бөлмө артыкчылык оптикалык дем (тесттөөдөн жок сыналган: 5 мин; Сүрөт. S1E).
Үч-бөлмө ПАК сыноо.
сыноо колдонулган салт-үч-бөлмө шартталган жер артыкчылык / ПАК аппараты эки палатадан курамына (10 × 17 см) жана байланыштыруучу коридор. тест үч нөөмөткө турган. Day 1 (pretest: 15 мүн): Mice эркин толугу менен аппаратты изилдөө үчүн уруксат берилген. башка бир бөлмөгө 1.5 эсе узун калды Mice сыноо алынып салынды. Days 2 жана 3 (аналоги: 15 мүн ар бир): Mice жарык-жупташкан бөлмөгө токтогонун оптикалык дем алды. нур-жупташкан бөлмөгө тандоо боюнча эл болгон. Day 4 (тесттөөдөн: 15 мүн): сыноо pretest эле шарттарда жүргүзүлгөн (Сүрөт. S6A).
аналоги жыйынында, оптикалык дем 30 с чычкандар тынымсыз 30 күйүп калбашы үчүн караңгы бөлмөдө же жеңил-жупташкан бөлмөсүнө анын үстүндө кийин токтотулган. Лазердик бийлик бардык жүрүш-тест боюнча оптикалык байланыш учунда болжол 5 MW болуп көзөмөлгө алынды.
Vivo Fast-Scan Мезгил Voltammetry-жылы.
FSCV эксперименттер, мурунку өткөрүлгөн изилдөөлөрдүн негизинде баяндалган чен ыкмасын колдонуу менен ишке ашырылган (35-37). Чычкандар бир кетамин / xylazine аралашмасы менен Эллисон болгон сүрөттөлгөндөй SI материалдар жана ыкмалар жана stereotaxic алкагында жайгаштырылган. DA нейрондорду Арка-билдирүү дем үчүн колдонулуучу оптикалык була стимул токту жакын жайгашкан. дем optrode анда VTA (bregma чейин: место-арт, -3.2 мм; жанынан, 0.5 мм жана көкүрөк-ventral, 3.5 мм) жайгаштырылган жана 0.25-мм аралыкта түшүрүштү. voltammetric жазуу үчүн көмүр-була токту (узундугу 300 мкм) НАК салып түшүрүшкөн (bregma чейин: место-арт, 1.0 мм; жанынан, 1.0 мм жана көкүрөк-ventral, 3.5 мм). Voltammetric өлчөө (V -100 үчүн + 0.4 V үчүн -1.3 V каршы Ag / AgCl, 0.4 V / сек менен) үч бурчтуктун толкундун колдонуу менен ар бир 400 НТА болгон көмүртек-була токту үчүн. Колдонуучу түзгөн potentiostat толкундун обочо жана учурдагы зайым үчүн колдонулган. DA чыгарылыш DA нейрон электрдик сигналдар менен 24-ангелы стимулдун (100 ООО, 5 мс узактыгы, 30 Hz) колдонуу менен угулган жок. Оптикалык DA нейрон дем берүү (532 нм, ~5 була учундагы бийликти MW) 10 с баштап 5 с үчүн электрдик сигналдар түшкөнгө чейин колдонулган. Carbon-була microelectrodes Д.А. белгилүү байытуу менен чечим (0.2 мкм, 0.5 мкм жана 1.0 мкм) менен курулду алынган. Бардык voltammetry маалыматтар Labview мисалдарды программалык каражаттарды пайдалануу менен бажы жараткан программаларды текшерилген. оптикалык сигналдар менен DA баскычтарда азайтуу негизги компоненти талдоо, электрдик сигналдар VTA алынган шаблон DA сигналдар аркылуу тинейджер сигналдарды ажырата менен чечилген (35, 36).
Статистикалык анализ.
Статистикалык анализ GraphPad призмасы 5.0 (GraphPad Программа) колдонуу менен жүргүзүлдү. Маалыматтар кайталап чаралар текшерилген Дисперс (Инжир. 1B, , 4D,4D, жана Сүрөт. S6 D жана E) Же бир жактуу Дисперс (Инжир. 1C, , 3D,3D, 4 C жана E, жана Инжир. S4 K-M, S6F, жана S7A), Жана туз анализдер Bonferroni тест аркылуу жатышты. Бардык белгилер / мамычаны бекиткичтерин тиешелүүлүгүнө жараша, орточо жана ± Шемдин билдирет.
Башка эксперименталдык жол-жоболор, анын ичинде вирус даярдоо жана инжектордук, electrophysiological жазып, жана иммуногистохимиялык жана РНК талдоо менен майда-чүйдөсүнө чейин баяндалат SI материалдар жана ыкмалар.
Acknowledgments
Биз E. Бойден аркасынан куруу рахмат, lentivirus өндүрүү жана тазалоо боюнча техникалык сунуштаманы Р. Т., жана маалымат талдоо программалоого техникалык сунуштаманы Хайаши. Бул иш гранттардын-жылы жардам 22220005 (ЖПТ чейин) тарабынан колдоого алынган, 23120011 (SY жана С.Н. чейин), 24700339 (TD) жана 25871080 Билим берүү жана илим министрлиги, маданият, спорт чейин (SY чейин), илим, жана эле ООО Science корунун келген Япониянын технологиясы жана грант (ЖПТ чейин).
Шилтемелер
Жазуучулар кызыкчылыктардын эч кандай чыр-жар.
Бул макалада онлайн маалыматты колдоо бар www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
шилтемелер
;