Суурийн Ganglia-ийн үйл ажиллагааны алдагдал нь хэт таргалалтын үед бие махбодийн идэвхгүй байдалд нөлөөлдөг (2016)

29 арванхоёрдугаар сарын 2016 онлайнаар авах боломжтой

Дэлгэрэнгүй харуулах

http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2016.12.001

онцлох үйл явдлууд

• Таргалалт нь бие махбодийн идэвхгүй байдалтай холбоотой байдаг

• Таргалалттай хулганууд нь D2R-ийн бага нягтралтай байдаг бөгөөд энэ нь тэдний идэвхгүй байдлыг тайлбарлаж болох юм

• G-ийг сэргээх_i iMSN-д дохио өгөх нь таргалсан хулгануудын бие махбодийн үйл ажиллагааны түвшинг аврах явдал юм

• Биеийн идэвхгүй байдал бол жин нэмэхээс илүү үр дагавар юм

Дүгнэлт

Таргалалт нь бие махбодийн идэвхгүй байдалтай холбоотой бөгөөд энэ нь жин нэмсний эрүүл мэндийн үр дагаврыг улам хүндрүүлдэг. Гэсэн хэдий ч энэ холбоог зуучлах механизм нь тодорхойгүй байна. Допамин дохионы дутагдал нь таргалалтад бие махбодийн идэвхгүй байдалд нөлөөлдөг гэж бид таамаглаж байсан. Үүнийг судлахын тулд бид туранхай, таргалалттай хулгануудад допамин дохиоллын олон талыг тооцоолсон. Стратумд холбогддог D2 хэлбэрийн рецептор (D2R), харин D1 хэлбэрийн рецепторыг холбох эсвэл допамин түвшинг хэт таргалсан хулгануудад бууруулж байгааг олж мэдлээ. Гэдэсний хувьд D2R-ийг striatal дунд spiny neurons-ээс салгах нь туранхай хулгана дахь моторын үйл ажиллагааг бууруулахад хангалттай байсан бол G-ийг сэргээж өгдөг._i эдгээр мэдрэлийн эсүүдэд дохио өгөх нь таргалалттай хулгануудад идэвхжил нэмэгдсэн. Хачирхалтай нь, D2R-тэй бага хулгана бага идэвхитэй байсан ч хяналтын хулганатай харьцуулахад хоолны дэглэмээс үүдэлтэй жин нэмэгдэхэд илүү өртөмтгий биш байв. Стратиатын D2R дохиоллын дутагдал нь таргалалтад бие махбодийн идэвхгүй байдалд хувь нэмэр оруулдаг гэж бид дүгнэсэн боловч идэвхгүй байдал нь таргалалтын шалтгаанаас илүү үр дагавартай юм.

График хийсвэр

Зураг сонголтууд

Түлхүүр үг

таргалалт;
dopamine;
Идэвхтэй хөдөлгөөн хийх;
дасгал хийх;
D2;
striatum;
таргалалт;
Жин хасах

Оршил

Таргалалт нь бие махбодийн идэвхгүй байдалтай холбоотой (Браунсон нар, 2005 болон Ekkekakis et al., 2016чихрийн шижин, зүрх судасны өвчинд нэрвэгддэг.de Rezende et al., 2014 болон Шарма нар, 2015). Энэ холбоог бий болгох механизм нь тодорхойгүй байгаа нь таргалалттай хүн амын дунд бие махбодийн хөдөлгөөний түвшинг өөрчлөх үр дүнтэй арга хэмжээ аваагүй байгааг харуулж байна.Ekkekakis et al., 2016). Сонирхолтой нь, хэт таргалалт нь striatal dopamine (DA) дохионы өөрчлөлттэй холбоотой бөгөөд энэ нь таргалалтад шагналын үйл ажиллагааны алдагдал гэсэн таамаглал дэвшүүлжээ (Блум ба бусад, 2011, Кенни, 2011 болон Volkov ба Wise, 2005). Хэдийгээр цус харвалт DA нь моторын гаралттай хүчтэй холбоотой боловч цөөн тооны судалгаагаар хоолны дэглэмээс үүдэлтэй допаминергик өөрчлөлт нь бие махбодийн идэвхгүй байдалд хэрхэн нөлөөлж болохыг судалсан. Зөрчлийн DA дохиог хэт таргалалт бууруулж, энэ нь бие махбодийн идэвхгүй байдалд нөлөөлдөг гэж бид таамаглаж байна. Биеийн идэвхгүй байдлын биологийн шалтгааныг ойлгох нь таргалалттай хүмүүсийн идэвхжилийг нэмэгдүүлэх үр дүнтэй арга хэмжээ авах, улмаар эрүүл мэндийг сайжруулахад хүргэдэг.

Striatal DA нь моторын хяналтанд маш их оролцдог. Энэ нь Паркинсоны өвчин гэх мэт мотор эмгэгүүдэд илэрдэг бөгөөд энэ нь дунд тархины допаминергик мэдрэлийн эсүүд нас барж, улмаар цус харвалт DA-ийн алдагдалд ордог (Hornykiewiczz, 2010). DA-ийн модуляцласан стриатал проекцийн нейронуудын хоёр популяцийг шууд ба шууд бус замаар дунд зэргийн нурууны нейрон (dMSNs ба iMSNs) гэж нэрлэдэг.Александр ба Кратчер, 1990, DeLong, 1990 болон Герфен нар, 1990). dMSNs нь G-ийг илэрхийлдэг_s- D1 рецептор (D1R) ба бөмбөрцгийн паллидусын суурь, дотоод сегмент рүү чиглүүлдэг бол iMSNs нь G-ийг илэрхийлдэг._i- D2R-ийг угсарч, бөмбөрцөг палидус (GPe) -ийн гадаад сегментийг төсөвлөв (Герфен нар, 1990, Le Moine and Bloch, 1995 болон Левей нар, 1993). IXN-ээс D2R-ийг генетик устгах, эсвэл iMSN-ийн оптогенетик өдөөлт нь хөдөлгөөнийг бууруулахад хангалттай юм (Кравиц ба бусад, 2010 болон Лемос нар, 2016). D2R-ийн дисфункци ба таргалалтын хоорондын холбоог үндэслэн таргалалттай амьтад iMSN гаралтыг өөрчилсөн бөгөөд бие махбодийн идэвхгүй байдалд хүргэсэн гэж таамаглаж байна.

Энд, туранхай болон хоолны дэглэмээс үүдэлтэй таргалалттай хулгануудад DA дохиоллын олон талыг судалж үзлээ. Таргалсан хулгануудад D2R-ийн хүлцэл багассан бол D1R-ийн хүлцэх ба эсээс гадна эсийн DA түвшин өөрчлөгдөөгүй байв. Мөн хэт таргалсан хулганууд загатнах галын тасалдал үзүүлсэн бөгөөд хөдөлгөөн буурсан байна. IXN-ээс D2R-ийг генетик аргаар устгаснаар туранхай хулгануудын идэвхжил буурсан бол G-ийг сэргээсэн._i iMSN-д дохио өгөх нь таргалсан хулгануудад идэвхжил нэмэгдсэн. Эдгээр үр дүнгүүд нь iMSNs дэх D2R дохио нь бие махбодийн үйл ажиллагааг хоёр чиглэлтэй зохицуулж чаддаг болохыг тогтоов. Дараа нь бага D2R дохиотой хулгана нь тэдний идэвхжил багатайгаас болоод өөх тос ихтэй хоолны дэглэмээс жин нэмэгдэхэд илүү өртөмтгий эсэхийг асуусан. Үүнийг хийхийн тулд бид хулгануудын дунд D2R-ийн хоорондох хүлэмжийн байгалийн өөрчлөлт, түүнчлэн striatal D2R-ийн генетик устгалаар хийсэн хулгана дээр жингийн өсөлтийг шалгасан. Хэдийгээр D2R-ийн бага түвшинтэй хулганууд бие махбодийн идэвхжил бага байсан боловч бүрэн бүтэн D2R-тэй хулганатай ижил жинтэй болжээ. Энэ нь бие махбодийн үйл ажиллагаа болон жингийн өсөлтийн хоорондох хүчтэй учир шалтгааны харьцаатай холбоотой юм. D2R дохиоллын сулрал нь хэт таргалалтад бие махбодийн идэвхгүй байдалд хувь нэмэр оруулдаг гэж үздэг боловч идэвхгүй байдал нь жин нэмэхэд хүргэдэггүй гэж бид дүгнэж байна.

үр дүн

Хоолны дэглэмээс үүдэлтэй таргалалт нь бие махбодийн идэвхгүй байдалтай холбоотой байв

C57BL6 / J эр хулгана (3-4 сар) -ийг 8 долоо хоногийн турш стандарт чов (туранхай, n = 8) эсвэл өөх тос ихтэй хоол хүнсээр (таргалалт, n = 18) хооллосон (Зураг S1A). Таргалалттай хулганууд 2-р долоо хоногоос эхлэн 18-р долоо хоног хүртэл үргэлжилсэн туранхай хулгануудтай харьцуулахад биеийн жин, өөхний жин ихтэй байв (p <0.0001; Зураг 1А болон S1Б). Lean mass нь мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөөгүй ((Зураг S1C). Бид 2 долоо хоног тутамд 18 долоо хоногийн турш нээлттэй талбайд үйл ажиллагааны түвшинг хэмжсэн (Ethovision; Noldus Information Technologies). Таргалалттай хулганууд 4-р долоо хоногоос эхлэн туранхай хулгануудтай харьцуулахад бага идэвхжиж, 18-р долоо хоног хүртэл үргэлжилсэн (p <0.0001; Зураг 1B ба 1C). 18 дахь долоо хоногт тарган хулганууд хөдөлгөөн хийхэд бага цаг зарцуулсан (p = 0.005), цөөн хөдөлгөөнтэй (p = 0.0003), хөдөлж байхдаа хурд багатай байсан (p = 0.0002; Зураг 1D) туранхай хулгануудтай харьцуулахад. Арьсан болон үс засалт нь бараг өөрчлөгдөөгүй (Зураг 1D). Тарган хулганууд гэрийн тор ажиллуулах дугуйнд нэвтрэх үед туранхай хулганаас бага гүйдэг байсан (p = 0.0005; Зураг 1Э). Хөдөлгөөний хомсдол нь таргалалтын бүлгийн жингийн өсөлттэй холбоотой эсэхийг шалгасан. Жин нэмэх нь өөх тос ихтэй хоол хүнсэнд хэрэглэх илчлэгийн хамааралтай байсан (Зураг 1F), ил задгай талбай дахь хөдөлгөөний түвшин эсвэл өөх тос ихтэй хоолны дэглэмийн хугацаанд зарцуулсан энергитэй ямар ч хамааралгүй байсан (Зураг 1G ба 1H). Сонирхолтой нь туршилтын эхний долоо хоногт бид хүнсний хэрэглээг шалгаж үзэхэд эдгээр ижил хамаарал ажиглагдсан.Зураг 1Би – 1K) нь өөх тос ихтэй хоолны дэглэмийн эхний хэмжээ (гэхдээ хөдөлгөөн эсвэл энерги зарцуулалт биш) нь жингийн өсөлтийг урьдчилан таамаглаж байгааг харуулж байна.

Зураг 1.

Өөх тос ихтэй архаг хоол хүнс нь бие махбодийн идэвхгүй байдалд хүргэдэг

(A) Хулгана нь 2 долоо хоногоос эхлэн 18 (F долоо хоног) үргэлжилж байгаа хулгануудаас илүү их хэмжээний өөх тос агуулсан хооллодог байв_(18,252) = 62.43, p <0.0001).

(B ба C) (B) (C) таргалалттай хулганууд 4 долоо хоногоос эхлэн туранхай хулганатай харьцуулахад бие махбодийн идэвх буурсан болохыг харуулж байна._(10,140) = 4.83, p <0.0001).

(D) 18 долоо хоногт өөх тос ихтэй хоолны дэглэм барьсны дараа тарган хулганууд нүүдэллэх хугацаа багассан (t₍₁₄₎ = 3.32, p = 0.005), хөдөлгөөний давтамж буурсан (t₍₁₄₎ = 4.74, p = 0.0003), хөдөлж байхдаа хурд буурсан (t₍₁₄₎ = 4.69, p = 0.0002) туранхай хяналттай харьцуулсан. Таргалалттай хулганууд өсч бойжих хандлага ажиглагдсан (p = 0.07).

(E) Гэрийн торонд гүйдэг дугуйтай болоход таргалсан хулгана нь туранхай хулгана харьцангуй цөөн эргэлттэй байв (t).₍₁₄₎ = 4.55, p = 0.0005).

(F-H) Нийт жингийн өсөлт нь туршилтын явцад (F) эрчим хүчний хэрэглээтэй ихээхэн хамааралтай болсон (r = 0.74, p = 0.04), гэхдээ (G) эрчим хүчний зарцуулалт биш (r = 0.52, p = 0.19) (H) нээлттэй талбайн хурд (r = 0.19, p = 0.65).

(I – K) Нийт жингийн өсөлт нь эхний долоо хоногт (I) дундаж эрчим хүчний хэрэглээтэй харьцангуй хамааралтай болсон (r = 0.88, p = 0.004), гэхдээ (J) эрчим хүчний зардал биш (r = -0.19, p = 0.66) , мөн (K) нээлттэй талбайн хурд (r = 0.36, p = 0.38).

Статистикийн дүн шинжилгээ. (A ба C) Беновини-Хохбергийн хуурамч нээлтийн түвшинтэй ANOVA-ийн хоёр талын давтан хэмжүүр; (D ба E) Оюутны хосгүй т тест; (F – H) шугаман регресс; ^*p <0.05, ^∗∗p <0.01, ^***p <0.0001 ба туранхай. (I-K) шугаман регресс; ^***p <0.001, туранхай хулгана.

Зураг сонголтууд

Таргалалт DopNine D2R-ийн даралт бууралттай холбоотой байв

Физик идэвхгүй байдлын суурь механизмыг тодорхойлохын тулд туранхай ба таргалалттай хулгануудад DA дохионы олон талыг тодорхойлсон. Мэрэгчдийн өмнөх тайлангуудтай нийцүүлэн D2R-тэй адил рецепторыг холбох (аутографийн тусламжтайгаар ³H-spiperone, цаашид D2R холболт гэж нэрлэдэг) нь тарган хулгануудад туранхай хулганатай харьцуулахад бага байсан (p <0.0001; Зураг 2A ба 2B), гурван хэсгийн бүх дэд хэсэгт чухал ач холбогдолтой дүгнэлт (dorsomedial: p = 0.004; dorsolateral: p <0.0001; ventral: p <0.001; Зураг S2A ба S2B). Гэсэн хэдий ч D2R-ийн холболт нь туранхай эсвэл таргалалттай бүлгийн биеийн өөхтэй хамааралгүй байсан (хоёуланд нь p> 0.55; Зураг 2C), хэдийгээр D2R-ийн заавал байх ба өөхний хадгалалтыг архаг өндөр өөх тосны хоолны дэглэмээр сольж байгаа боловч эдгээр хувьсагчууд хоорондоо учир шалтгаалаагүй байж магадгүй юм.

Зураг 2.

Өөх тос ихтэй хоолны дэглэмийн дарангуйлагч Допамин D2R заавал байх

(A) Хэмжээгээр хэмжигдсэн хөрсний D2R-ийн зураг ³H-spiperone-ийн автографи.

(B) Striatal D2R-ийн нягтшил нь туранхай хулгануудтай харьцуулахад хэт таргалалттай байв (t₍₂₅₎ = 5.02, p <0.0001).

(C) Striatal D2R-ийн холболт нь туранхай (p = 0.95) эсвэл тарган хулгана (p = 0.56) дахь биеийн өөхний хувьтай хамааралгүй байв.

(D – F) (D) Strialal D1R нягт (t₍₂₄₎ = 1.31, p = 0.20), (E) допамины нийт агууламж (DA; t₍₁₃₎ = 0.85, p = 0.41) ба (F) тирозин гидроксилаза (TH) нягтрал (t₍₁₄₎ = 0.48, p = 0.64) нь хоолны дэглэмийн бүлгүүдээс ялгаатай биш байв.

Статистикийн дүн шинжилгээ. Хулгана тус тусдаа; n = 8-19 хулгана / бүлэг; Оюутны t тест (B ба D – F) эсвэл шугаман регресс (C); ^*p <0.01.

Зураг сонголтууд

D2R-ийн хүлцэл дэх таргалалттай холбоотой дарамтыг бууруулж буй механизмыг бид илрүүлэх гэж оролдлоо. Үүний тулд бид ялгаатай байдлыг хайж үзсэн Drd2 mRNA (in situ hybridization) ба энэ нь стратын гурван хэсэгт хувьсалгүй өөрчлөгдсөн болохыг тогтоов (dorsomedial: p = 0.92; dorsolateral: p = 0.90; ventral: p = 0.34; Зураг S2C). Бид D2R уургийн нийт түвшинг тодорхойлохын тулд барууны блотуудыг хийж, D50R-ийн өөр өөр гликозилизацийн төлөв байдлыг илэрхийлсэн гэж үзсэн 70- эсвэл 2-кДа хамтлагуудад өөрчлөлт ороогүйг тэмдэглэв (хоёулаа p> 0.95, Зураг S2D ба S2E) (Жонсон, Кенни нар 2010). Эцэст нь бид өмнө дурдсанчлан D2R-ийн бууралттай холбоотой эсэхийг харахын тулд туранхай ба тарган хулгануудад бодисын солилцооны үйл ажиллагааны алдагдлыг үнэлэв.Данн нар, 2012). Таргалалттай хулганууд мацаг барих холестерол (p <0.0001), лептин (p <0.0001), глюкоз (p = 0.0002), инсулин (p = 0.001), эсэргүүцэлд суурилсан гомеостатик загварын үнэлгээ (HOMA-IR) (p <0.001) , гэхдээ триглицерид эсвэл чөлөөт өөхний хүчил биш (Зураг S1D – S1J). Гэсэн хэдий ч эдгээр хүчин зүйлсийн аль нь ч таргалалттай хулганад D2R-тэй нягт уялдаатай байдаггүй (өгөгдөл харуулаагүй).

D1R-тэй төстэй хүлээлт (автографографийн тусламжтайгаар) ³H-SCH23390, цаашид D1R холболт гэж нэрлэгддэг) нь тарган, туранхай хулгануудын хооронд ялгаагүй (p = 0.20; Зураг 2D). Мөн судлын эдийн цоолтуурын өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографи (HPLC) -аар хэмжсэн судалт DA агуулгын хувьд ялгаа байхгүй (p = 0.41; Зураг 2E), эсвэл тирозин гидроксилазын иммуно тэмдэглэгээ (p = 0.64; Зураг 2F). Таргалалттай хулгануудад суурь DA-ийн ялгаа олон талаар мэдээлсэн тул (Карлин нар, 2013, Дэвис нар, 2008, Vucetic et al., 2012 болон Ван нар, 2014), бид энэ цэгийг цэвэр флюс микродиализ ашиглан (шинэ хулгана, n = 6 бүлэгт) ашиглан судлав. Бид эсийн гаднах DA (p = 0.99) эсвэл түүний хоёр метаболит болох 3,4-дигидроксифенил цууны хүчил (DOPAC) (p = 0.85) ба гомованилийн хүчил (HVA) (p = 0.68, Зураг S3) нь энэхүү туршилтаар хэт таргалалт нь эсийн гаднах DA ая буурсантай холбоогүй болохыг харуулж байна.

Хөдөлгөөнтэй холбоотой хиймэл буудалтыг хэт таргалсан хулгануудад салгасан байна

Бид стриаталь D2R холболтыг багасгах нь судлын мэдрэлийн эсийн гаралтыг хэрхэн өөрчилж, улмаар хөдөлгөөн буурахад хувь нэмэр оруулж буйг судлах зорилгоор in vivo электрофизиологи хийсэн. Бид туранхай ба тарган хулгануудын доромедиаль стриатумаас (нэг бүлэгт n = 3 хулгана, гистологи Зураг 3F). Таргалалттай хулганууд ерөнхийдөө бага хөдөлсөн боловч гүйцэтгэсэн хөдөлгөөнүүдийн хурд эдгээр бүлгүүдийн хооронд ялгаатай байсангүй (p = 0.55; Зураг 3A), туранхай ба тарган хулгануудын хоорондох хөдөлгөөнтэй холбоотой буудахыг харьцуулах боломжийг бидэнд олгоно. Суурийн олон нэгжийн баяжуулалтын хурд нь туранхай ба тарган хулгануудын хооронд ялгаагүй байв (туранхай, 2.1 ± 0.4 Гц; тарган, 2.0 ± 0.7 Гц; p = 0.93). Гэсэн хэдий ч хөдөлгөөнийг идэвхжүүлсэн нэгжүүдийн тархалт (Зураг 3B) тарган хулгануудад мэдэгдэхүйц бага байсан (p <0.0001; Зураг 3C). Энэ нь "хөдөлгөөнийг идэвхжүүлсэн" нэгжүүдийн талаарх статистик тодорхойлолтоос хамааралгүй байсан тул таргалалттай, туранхай хулгана бүхий бүх бүртгэгдсэн нэгжүүдийн дундаж хариу урвалын хөдөлгөөний бууралт ажиглагдсан (ANOVA-ийн харилцан үйлчлэл, p <0.0002; Зураг 3D ба 3E). Шүдний булчирхай дахь нийт эргэлтийн хэмжээ ялгаатай биш байсан боловч таргалсан хулгануудад хөдөлгөөний эргэн тойрон дахь хөдөлгөөний зохион байгуулалтыг тасалдуулав.

Зураг 3.

Таргалалттай хулганад хөдөлгөөнтэй холбоотой гал авалцаж байв

(A) Хөдөлгөөний үйл явдал нь туранхай ба таргалалттай хулгануудад ижил хурдтай байв.

(B) Хөдөлгөөний идэвхжсэн ба хариу үйлдэл үзүүлэхгүй бол загатнах мэдрэлийн эсүүд.

(D) Бүх бүртгэгдсэн нейронуудын хөдөлгөөнтэй холбоотой гал түймрийн дундаж хэмжээ.

(E) Хөдөлгөөнтэй холбоотой гал түймэр нь хоолны дэглэмийн өртөлтийн дараа мэдэгдэхүйц бага байв (хоолны дэглэмийн хөдөлгөөний харилцан үйлчлэл, F_(1,171) = 14.77, p <0.0002).

(F) Схемийн (дасан зохицсон Франклин ба Паксинс, 1997) электродын массивыг туранхай, таргалалттай бичлэгийн хулгануудад байрлуулахыг харуулсан (n = 3 тус бүр).

Статистикийн дүн шинжилгээ. (C) Фишерийн нарийн шинжилгээ. (D ба E) ANOVA-ийн хоёр талын давталтыг хэмжинэ.

Зураг сонголтууд

Таргалалттай хулганад iMSN-ийн гаралтыг сэргээсэн үйл ажиллагааны түвшинг хориглох

IMSN-ийн гаралтыг бууруулах нь таргалалттай хулгануудын хөдөлгөөнийг нэмэгдүүлэх боломжтой эсэхийг шалгахын тулд бид дарангуйлагч G-ийг илэрхийлэх зорилгоор Cre-rekombinase (Cre) хамааралтай стратеги ашигласан._iтаргалсан хулганын iMSN-д зөвхөн дизайнерын эмүүд (KOR-DREADD) идэвхжүүлсэн капа опиоид рецептор дизайнерын рецептороор хийсэн.Зураг 4А). Хэдийгээр аденозин 2A-рецепторын Cre (A2A-Cre) хулгана нь дархлаажуулалтаар урьд өмнө криптезийн iMSNs-тэй өвөрмөц болохыг харуулахын тулд дархлаажуулалтаар баталгаажсан байдаг.Cui et al., 2013 он болон Лемос нар, 2016), бид энэ шугамын нэмэлт баталгаажуулалтыг газар дээр нь давхар флюресцент аргаар хийсэн. Бараг бүх мэдрэлийн эсүүд (тоологдсон 98.7 мэдрэлийн 0.6% ± 1,301%) хоёулаа хоёуланг нь илэрхийлсэн Cre болон Drd2 mRNA, харин маш цөөхөн нь (1.3% ± 0.6%) хоёулаа илэрхийлэгддэг Cre or Drd2 mRNA, гэхдээ хоёулаа биш бөгөөд A2A-Cre шугам нь iMSN-ийг найдвартай чиглүүлж байгааг баталж байна ( Зураг S4).

Зураг 4.

Таргалалттай хулганад биеийн тамирын идэвхийг сэргээсэн iMSN-ийг дарангуйлдаг

(A) KOR-DREADD-ийн илэрхийлэл, гэрэл зураг (түүнд тохирсон) Франклин ба Паксинс, 1997) A2A-Cre хулгана дахь бүх KOR-DREADD-ийн вирусын тарилгын сайтуудыг дүрслэн харуулах; тунгалаг байдал нь тухайн байршилд вирусыг илэрхийлсэн хулгануудын тоог харуулна.

(B) DMSO (t) -тэй харьцуулахад SalB тарьсан үед таргалалттай хулганууд илүү их хөдөлсөн₍₇₎ = 3.056, p = 0.02).

(C – G) СалБ-ын удирдлагаас хойш таргалсан хулганууд DMSO-тай харьцуулахад (C) хөдөлгөөний давтамж, (D) хөдөлгөөний дундаж хугацаа, (E) хөдөлгөөний хурд зэрэгт мэдэгдэхүйц өөрчлөлт ороогүй байна. (F) Сал-В захиргаа нь өсгөн хүмүүжүүлэх давтамжийг нэмэгдүүлэв (т.)₍₇₎ = 3.116, p = 0.02), гэхдээ (G) үс засах давтамжийг мэдэгдэхүйц өөрчилсөнгүй.

(H) DMSO (t-тэй харьцуулахад SalB) тарьсан үед туранхай хулгана илүү их хөдөлсөн₍₉₎ = 3.3, p = 0.01).

(I) SalB нь KOR-DREADD-ийг илэрхийлээгүй зэрлэг маягийн хулгануудын хөдөлгөөнд нөлөөлөөгүй (p = 0.77).

Статистикийн дүн шинжилгээ. (B – I) Хосолсон оюутны t тест; тус тусдаа хулгана гэсэн үг; n = 6-10 хулгана / бүлэг.

Зураг сонголтууд

KOR-DREADD агонист сальвинорин-B (SalB) тарилга хийснээр KOR-DREADD-ийг илэрхийлсэн тарган хулгануудын туулсан зам нэмэгдсэн (p = 0.02; Зураг 4B). SalB нь өсгөх давтамжийг нэмэгдүүлсэн (p = 0.02; Зураг 4F) ба давтамжийн өсөлтийн хандлагыг үүсгэсэн (t.)₍₇₎ = 1.64, p = 0.12), гэхдээ хөдөлгөөний хурд, хурд биш (Зураг 4C – 4E). SalB тарилга нь туранхай хулганы хөдөлгөөнийг нэмэгдүүлсэн (p = 0.01; Зураг 4H), гэхдээ KOR-DREADD-ийг илэрхийлээгүй зэрлэг маягийн хулгана биш (p = 0.73; Зураг 4Би). IMSN-ийн гаралтыг бууруулах нь туранхай, таргалалттай амьтдын хөдөлгөөний түвшинг нэмэгдүүлэхэд хангалттай гэж бид дүгнэсэн.

D2R-ийн бага түвшин нь ирээдүйд жин нэмэхийн тулд амьтдыг урьдчилан сэргийлэх хэрэггүй

Эцэст нь хэлэхэд D2R дохиоллын өмнөх ялгаа нь хувь хүний хулгануудыг хоолны дэглэмээс үүдэлтэй таргалалтыг өдөөх эсэхийг шалгаж үзсэн. Энэ асуултыг шийдвэрлэхийн тулд бид микро позитрон ялгаруулах томографийг (micro-PET) хийсэн ¹⁸Өндөр өөх тосны хоолны дэглэмд өртөхөөс өмнө D2R-ийн бэлэн байдлыг тодорхойлохын тулд F-паллиприд (Зураг 5А). Бусад хүмүүсийн үзүүлсэн шиг хулганы дунд D2R холбох чадвар өндөр түвшинд байгааг бид тэмдэглэв (Константинеску ба бусад, 2011 он). D2R-ийн олдоцын хувь хүний ялгаа нь нээлттэй талбайн хөдөлгөөнтэй эерэг хамааралтай байв (p = 0.045; Зураг 5B), хөдөлгөөнд D2R-ийн үүрэг оролцоотой нийцдэг. Бичил PET сканнерын дараа амьтдыг 18 долоо хоногийн турш өөх тос ихтэй хоол хүнсээр байлгаж, D2R багатай хулганууд хоолны дэглэмээс үүдэлтэй жин нэмэхэд илүү өртөмтгий эсэхийг шалгаж үзсэн. Хачирхалтай нь бид a чиг хандлагыг олсон эерэг энэхүү туршилтын явцад эхний D2R олдоц ба жин нэмэгдэх хоорондын хамаарал (p = 0.10; Зураг 5С). Энэ хамаарал нь ач холбогдолгүй байсан ч D2R-ийн боломж бага эсвэл бие махбодийн идэвхгүй байдал нь амьтдыг жин нэмэхэд илүү эмзэг болгодог гэсэн таамаглалын эсрэг юм. Энэ нь манай туршилтын бүхэл бүтэн нээлттэй талбарын болон нээлттэй талбайн үйл ажиллагаа жингийн өсөлттэй уялдаагүй гэсэн үр дүнд хүрсэн байна.Зураг 1F – 1K).

Зураг 5.

Суурийн D2R хүлээс нь ирээдүйн жингийн өсөлтийг урьдчилан таамаглаагүй болно

(A) Striatum ба cerebellum-д D2R микро-PET-ийн ашиглалтын муруй жишээ. ¹⁸F-хуурамч.

(B ба C) (B) Суурийн нээлттэй талбайн хөдөлгөөнтэй хамааралтай холбох чадвар (r = 0.56, p = 0.045) ба (C) нь өөх тос ихтэй хоолны дэглэмээс үүдэлтэй жингийн эерэг хамааралтай (r = 0.50, p) = 0.10, n = 12-14 хулгана).

(D) D2R (дээд) ба iMSN- бүхий хулгана дахь D2R-ийн төлөөлөгчийн автографи.Drd2-KO хулгана (доод).

(E ба F) (E) iMSN-Drd2-КО хулгана задгай талбайд биеийн тамирын идэвх буурсан (t.)₍₈₎ = 2.99, p = 0.02) ба (F) гэрийн тор ажиллуулах дугуйнууд (p = 0.01, n = 5-19 хулгана / бүлэг).

(G) iMSN-Drd2-КО хулгана ба Drd2-Өвчин хог хаягдлыг хянах нь өөх тос ихтэй хоолны дэглэмд ижил хэмжээний жин авсан (F)_(5,70) = 1.417, p = 0.23; n = 6-10 хулгана / бүлэг).

(H – J) (H) iMSN-D0.60R-KO хооронд хэвийн эрчим хүчний хэрэглээ (p = 0.47), (I) эрчим хүчний зарцуулалт (p = 0.17), эсвэл (J) RER (p = 2) -т мэдэгдэхүйц ялгаа байхгүй байв. хулгана болон хог хаягдлын хяналт.

Статистикийн дүн шинжилгээ. (B ба C) Шугаман регресс; (E, F, H – J) Оюутны т сорилгүй; (G) ANOVA-ыг хоёр чиглэлээр давтсан, ^*p <0.05.

Зураг сонголтууд

Хөдөлгөөний түвшин ба жингийн өсөлтийн урьд өмнө үүссэн ялгаа хоорондын уялдаа холбоог илүү нарийвчлан судлахын тулд хулганын генетик загварыг давуу талтай, Drd2 iMSNs-ийн ген (iMSN-Drd2-KO) гэхдээ бусад эсийн төрлөөр хадгалсан илэрхийлэлийг ( Доббс нар, 2016 болон Лемос нар, 2016). Өмнө нь мэдээлж байсанчлан iMSN-Drd2-КО хулгана нээлттэй талбайд littermate удирдлагатай харьцуулахад бага хөдөлсөн (p = 0.02; Зураг 5E) ба гэрийн торны дугуй дээр (p = 0.01; Зураг 5F). Дээрх туршилтуудын дагуу iMSN-Drd2-КО хулганууд өөх тос ихтэй хоолонд орохдоо литмрататын хяналтаас илүү жин нэмээгүй (p = 0.23; Зураг 5G). Тэдний эрчим хүчний ашиглалтыг илүү нарийвчлан судлахын тулд iMSN- харьцуулахын тулд шууд бус калориметрийн туршилтыг явуулсан.Drd2-КО хулгана. Бид эрчим хүчний хэрэглээ (p = 0.60), эрчим хүчний зарцуулалт (p = 0.47), амьсгалын солилцооны харьцаа (RER) (CO-ийн харьцаа) зэрэгт мэдэгдэхүйц ялгаа илрүүлээгүй.₂ үйлдвэрлэл О хүртэл₂ хэрэглээ [VCO₂/ VO₂], p = 0.17) нь iMSN-Drd2-KO хулганууд ба тэдгээрийн хог хаягдлын хяналтуудын хоорондох харьцаа нь IMSN-Drd2-KO хулгануудын хөдөлгөөний бууралт нь эрчим хүчний ашиглалтад өөрчлөлт ороогүй болохыг харуулж байна (Зураг 5H – 5J). Эцэст нь, бид striatal D2R-ийн бага зэрэг бууралт (бидний таргалалттай хулгануудад ажиглагдсан гэх мэт) хөдөлгөөн, жингийн өсөлтийг зохицуулж чадах эсэхийг судлав. Үүнийг хийхийн тулд бид хулгана мөрийг 30% –40% бууруулж үр дүн үзүүлдэг. Drd2 mRNA (iMSN-Drd2-Het) ( Лемос нар, 2016). Эдгээр хулгана нь хөдөлгөөний бууралтыг харуулж, D2R-ийг хэсэгчлэн унагаах нь хөдөлгүүрийн алдагдлыг бий болгоход хангалттай гэдгийг харуулсан (p = 0.04; Зураг S5A). IMSN-Drd2-KO хулгануудтай адил iMSN-Drd2-het хулганууд нь өөх тос ихтэй өөхний нэмэгдэлд илүү өртөмтгий биш байсан (p = 0.89; Зураг S5Б). Хөшүүн дэх D2R-ийн өөрчлөлт нь хөдөлгөөнийг өөрчлөхөд хангалттай, гэхдээ хулганы илчлэгийн тэнцвэр эсвэл биеийн жин биш юм.

хэлэлцүүлэг

Таргалалт нь бие махбодийн идэвхгүй байдалтай холбоотой бөгөөд энэ нь жин нэмэхэд хувь нэмэр оруулдаг гэж үздэг. Үүнээс гадна хэт таргалалт нь таргалалттай хүмүүсийн идэвхжил бага түвшинд нөлөөлдөг гэсэн таамаглал дэвшүүлдэг.Ekkekakis ба Lind, 2006 болон Вестертерп, 1999) боловч энэ санааг шууд туршиж үзэхэд хэцүү байдаг. Сонирхолтой нь, хоолны дэглэмээр дамжуулан жин хасдаг хүмүүс (де Боер нар, 1986, де Гроот нар, 1989, Мартин нар, 2007 болон Редман ба бусад, 2009) эсвэл bariatric мэс засал (Берглинд нар, 2015, Берглинд нар, 2016, Бонд нар, 2010 болон Рамирез-Марреро нар, 2014) тэдний идэвхигүй байдлыг өдөөх жингийн эсрэг маргаж тэдний үйл ажиллагааны түвшинг нэмэгдүүлэхгүй байх. Энд бид хоолны дэглэмээс үүдэлтэй таргалалт нь striatal DA халдварын дутагдалаар бие махбодийн идэвхгүй байдлыг үүсгэдэг гэсэн таамаглалыг судалсан. Өмнөх ажлын үр дүнд өндөр өөх тос бүхий архаг хоолны дэглэм нь гэдэсний D2R-ийн даралтыг бууруулдаг болохыг тогтоов (Хажнал нар, 2008, Хуанг нар, 2006, Нараянасвами нар, 2013, ван де Гиссен нар, 2012 болон ван де Гиссен нар, 2013). Хэт таргалалттай хулгануудад хөргөлтийн мэдрэлийн нейронуудын мотортой холбоотой галын дутагдал ажиглагдсан. GMS бүхий iMSN-ийг хориглох_iТаргалсан хулгануудад DREADD-ийг аврах ажиллагаа нь илүүдэл өөх тос бүхий хулганууд хэвийн хөдөлгөөнтэй болоход хүргэдэг болохыг харуулж байна.. Гэсэн хэдий ч суурь туршилтын D2R хэмжилт, бие махбодийн үйл ажиллагаа жингийн өсөлттэй холбоогүй нь бидний олон туршилтаар ажигласан цэг юм. Энэ нь хархын талаархи судалгаанаас ялгаатай бөгөөд энэ нь төрөл зүйл эсвэл туршилтын ялгааг илэрхийлж болно (Майклидес нар, 2012). D2R-ийн бууралт ба бие махбодийн идэвхгүй байдал нь таргалалтын үр дагавар боловч хулганы жингийн цаашдын жингийн өсөлтөд заавал холбоотой байдаггүй гэж бид дүгнэж байна.

Өөрчлөгдсөн D2R дохио ба таргалалтын хоорондын холбоосыг хүн төрөлхтөнд анх олж тогтоосон бөгөөд үүнийг бусад хүмүүс хуулбарласан байдаг.de Weijer et al., 2011 он, Kessler et al., 2014, Volkow et al., 2008 болон Ван нар, 2001). Гэсэн хэдий ч, сүүлийн үеийн олон ажил нь энэ нээлтийг эргэлзээтэй гэж нэрлэсэн (Caravaggio et al., 2015, Cosgrove et al., 2015, Данн нар, 2012, Гуо нар, 2014, Karlsson et al., 2015, Karlsson et al., 2016, Стийл нар, 2010 болон Туоминен ба бусад., 2015). Эмнэлзүйн судалгааны явцад ажиглагдаж буй зөрүүг ойлгохын тулд нэмэлт судалгаа хийх шаардлагатай боловч клиник судалгаа, PET дүрслэлтэй холбоотой нарийн төвөгтэй байдлыг тусгаж болно. Жишээлбэл, олон судалгаануудад ашиглагддаг раклоприд, радио-лиганд нь эндоген DA-ээр нүүлгэж, улмаар хүлцэх суурь нь DA аяны зөрүүгээр нөлөөлж болно. (Хорстманн нар, 2015). Нэмж хэлэхэд D2R-ийн түвшин ба хэт таргалалтын хоорондын хамаарал шугаман бус байж болох тул D2R-ийн өөрчлөлт өөр өөр түвшний өвчтөнүүдэд өөр өөрөөр тохиолдож болно (Хорстманн нар, 2015). Эцэст нь унтах хугацаа гэх мэт хүчин зүйлүүд (Wiers et al., 2016 он) болон кофеины хэрэглээ (Volkow et al., 2015) нь D2R нягтшилд нөлөөлж болох бөгөөд ихэнх клиник судалгаанд бүртгэгдээгүй эсвэл хянадаггүй. Эдгээр ялгаатай байдлын эх үүсвэрийг D2R mRNA-ийн бууралтын тууштай зургийг харуулсан амьтны судалгаанд багасгаж болно (Матес нар, 2010 болон Zhang et al., 2015 он), уураг (уураг)Адамс нар, 2015 болон Жонсон, Кенни нар 2010) болон рецепторыг холбох (Хажнал нар, 2008, Хуанг нар, 2006, Нараянасвами нар, 2013, ван де Гиссен нар, 2012 болон ван де Гиссен нар, 2013) таргалалттай мэрэгч амьтдад. Бидний ажил нь DA дохионы бусад шинж чанарууд нь D2R-ийн бууралттай байсан ч таргалалттай хулгануудад өөрчлөгдөөгүй хэвээр байгааг мэдээлснээр энэ зохиолыг өргөжүүлдэг. Үүнээс гадна, бидний D2R-ийн нягтралын бууралтыг ажиглав ³H-spiperone, гэхдээ нийт D2R уургийн өөрчлөлт, эсвэл Drd2 mRNA, D2R-ийн өөрчлөлтөд рецепторын дотоод байдал зэрэг орчуулгын дараах өөрчлөлт орно. Тархин дахь бие махбодийн үйл ажиллагааг бууруулахад D2R-ийн хязгаарлалт багассан нь бие махбодийн үйл ажиллагаанд удамшил, хүрээлэн буй орчин зэрэг олон хүчин зүйлүүд нөлөөлдөг болохыг бидний тоо баримт харуулж байна. ( Бауман нар, 2012). D2R нь таргалалтад бие махбодийн идэвхгүй байдалтай холбоотой цорын ганц мэдрэлийн өөрчлөлт юм гэж бид итгэдэггүй. Жишээлбэл, грелин, лептин, инсулин зэрэг цусны эргэлтийн гормоны өөрчлөлт нь допаминерг мэдрэлийн эсүүдэд нөлөөлдөг бөгөөд үйл ажиллагаанд нөлөөлдөг (Мюррей нар, 2014). Эцэст нь хэлэхэд D1R-ийн өөрчлөлтийг бид ажиглаагүй ч бие махбодийн үйл ажиллагаанд нөлөөлж буй шууд замын нейронуудын нейрон галын өөрчлөлтийг бид үгүйсгэх аргагүй юм.

D2R-ийн хүртээмжийн өөрчлөлт нь хувь хүн жин нэмэхээс урьдчилан сэргийлэх эсэх нь тодорхойгүй байна. Хамт олонтой хүмүүс Drd2 Taq1A аллель нь D2R-ийн ашиглалтыг бууруулж, хэт таргалалтын эрсдлийг бууруулав ( Блум ба бусад, 1996, Carpenter et al., 2013 он, Noble et al., 1991, Stice et al., 2008 болон Томпсон нар, 1997). Нэмж дурдахад, D2R-г дэлхийн хэмжээнд устгадаг хулгана нь өөх тос ихтэй хоолны дэглэмд илүү их жин нэмсэн нь бие махбодийн идэвхгүй байдалтай холбоотой юм (Beeler et al., 2015 он). Үүний эсрэгээр, судалгаан дахь D2R-ийн бие даасан өөрчлөлт (байгалийн эсвэл генетикийн өдөөгдсөн) нь бидний судалгааны үйл ажиллагааны түвшинтэй харьцуулсан боловч жингийн өсөлттэй холбоогүй болно. Судалгааны нэг чухал ялгаа нь манай генетик загвар D2R-ийг зөвхөн iMSN-ээс устгасан явдал юм. Үүнээс гадна хоол хүнс хэрэглэх, эрчим хүчний зарцуулалтыг сайтар хэмжих нь эдгээр мэдрэлийн эсүүд дээрх D2R-ийг зохицуулах нь энергийн тэнцвэрт байдлыг алдагдуулаагүй болохыг тогтоожээ. Ийм учраас дэлхийн D2R функц ба энергийн тэнцвэрийн хоорондын холбоог харуулсан судалгаанууд бусад эсийн төрлүүдэд D2R-ийн нөлөөг ажиглаж байж магадгүй юм. Туршилт нь бие махбодийн идэвхгүй байдал нь хэт таргалалтын үр дагавар юм гэсэн дүгнэлтийг дэмжиж байгаа боловч жин нь өөрчлөгдөхөд хангалтгүй юм.

Бие махбодийн үйл ажиллагаа нь зүрх судасны байдал сайжирч, бусад архаг өвчний тархалт буурсантай холбоотой нотолгоо нэмэгдэж байгаа боловч таргалалттай хүмүүсийн биеийн тамирын идэвхжил бага хэвээр байна (Ekkekakis et al., 2016). Бие махбодийн үйл ажиллагааны түвшинг нэмэгдүүлэх үр дүнтэй арга хэмжээ авахгүй байгаа нь таргалалттай хүмүүсийн бие махбодийн идэвхгүй байдлын суурь эс, молекулын механизмын талаар ойлголтгүй байгаатай холбоотой юм. Энд бид бие махбодийн идэвхгүй байдлыг бие махбодийн идэвхгүй байдлыг суурь ганглиягийн үйл ажиллагааны өөрчлөлттэй холбож, хэт таргалалттай хүмүүст бие махбодийн үйл ажиллагааны дутагдлын талаар биологийн тайлбар өгдөг.

Туршилтын журам

Сэдвүүд ба хоолны дэглэм

Бүх судалгаагаар хулгануудыг стандарт нөхцөлд (12 цагийн гэрэл / харанхуй мөчлөг, 21-22 ° C) дор байрлуулж, ад libitum-д хоол хүнс, ус ашиглах боломжтой байв. Хулгануудад стандарт чо хоолны дэглэм (5001 мэрэгч амьтдын хооллолт; 3.00 ккал / г уургаас гаргаж авсан 29% энерги, өөх тосноос 13%, нүүрс уснаас 56%; LabDiet) эсвэл өөх тос ихтэй хоол хүнс (D12492; 5.24 ккал / г 20% нь уургаас, 60% нь өөх тос, 20% нь нүүрс уснаас гаргаж авдаг энерги; Судалгааны хоолны дэглэм). Бүх процедурыг Чихрийн шижин, хоол боловсруулах, бөөрний өвчин судлалын үндэсний хүрээлэнгийн Амьтан арчилгаа, ашиглалтын хорооны удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн.

Transgenic нөхцөлт нокаут iMSN-Drd2-KO хулгана нь аденозины 2A рецептор генийн зохицуулалтын элементүүдээр үүсгэгдсэн Cre-ийг илэрхийлэх замаар үүссэн (Adora2a) (B6.FVB (Cg) -Tg (Adora2a-Cre) KG139Gsat / Mmucd; GENSAT; 036158-UCD) нь болзолтой хулгана бүхий Drd2 null аллел B6.129S4 (FVB) -Drd2^{тм1.1Mrub / J}, JAX020631 (Bello et al., 2011 он).

Биеийн бүтэц, эрчим хүчний зардлын тооцоо

Биеийн найрлагыг бусад долоо хоног тутамд хэмжсэн ¹H-NMR спектроскопи (EchoMRI-100H; Echo Medical Systems). Эрчим хүчний зарцуулалтыг эрчим хүчний балансын тооцооллыг ашиглан тодорхойлсон (Гуо нар, 2009 болон Равуссин нар, 2013):

Эрчим хүчний зардал = Metabolizableenergyintake− (atfatmass + atfat-freemass).

MathJax-г асаана уу

Нээлттэй талбайн үйл ажиллагаа

Нээлттэй туршилтыг PhenoTyper торонд (30 × 30 см; Noldus IT) хийсэн бөгөөд туршилтын туршид хулгана мөшгихөд EthoVision видео анализын програмыг (Version 11; Noldus IT) ашигласан болно.

Гэрийн торны дугуй

Дугуйн гүйлтийг 72 долоо хоног тутамд 3 цагийн турш хулганы гэрийн торонд бага профайлтай утасгүй гүйдэг дугуй (Med Associates) байрлуулах замаар хэмжсэн (хоолны дэглэмээс үүдэлтэй таргалалтын туршилт) эсвэл тасралтгүй (iMSN-Drd2-КО туршилтууд).

Цусны хэмжүүр

Золиосолж буй амьтдын нүдний судасны цусыг 4 цаг хурдтай хийсний дараа ийлдэс дэх метаболит ба гормоны шинжилгээнд ашигласан.

Допамин рецепторын автоматограф

Баруун хагас зүсэлтийг стриатын түвшинд криосекци (.0.22, 0.14, 0.62, 1.18 мм-ээс брагагаас бүрэн хэмжээгээр бүрхсэн), 12 мм-ийн хэсгүүдэд хуваав. Слайдыг гэсгээн туршилтын буферт (20мМ HEPES, 154мМ NaCl, 0.1% үхрийн ийлдэсийн альбумин [BSA]; рН 7.4) 20 минутын температурт 37 минут байлгав. D1R холболтыг 1.5 нМ тритийн шошготой SCH-23390 (Перкин-Элмер) ба 100 нМ кетансерин агуулсан шинжилгээний буферт слайдыг 60 ° C-т 37 минутын турш өсгөвөрлөх замаар үнэлэв. D2R холболтыг слайдыг 600 pM тритий шошготой спиперон (Перкин-Элмер) ба 100 нМ кетансеринтай хамт 100 минутын турш 37 минутын турш өсгөвөрлөв. Тохирох радиолиганд инкубаци хийсний дараа слайдыг 10 минутын турш 4 минутын турш 10 удаа угаалгын буферт (154 mM Tris-HCl, 0 mM NaCl) угааж, дараа нь усанд (7 ° C) дүрж, нэг шөнийн дотор хатаана. Дараа нь слайдыг фосфор дүрслэх хавтангуудад 1 (D11R холболт) эсвэл 2 хоног (DXNUMXR холболт) байлгаж, фосфоимагер (Циклон; Перкин-Элмер) ашиглан боловсруулсан. Шинжилгээнд зориулж сонирхсон газруудыг тоймлон авч, Optiquant дүрсний шинжилгээний програм (Perkin-Elmer) ашиглан шинжилсэн болно.

Баруун Блоттинг

Барууны бөмбөлгүүд нь хулганы эсрэг D2DR эсрэгбие (1: 500; Santa Cruz; sc-5303) эсвэл хулганы эсрэг GAPDH эсрэгбиемтэй (1: 1,000; Santa Cruz; sc-32233) өдөөгдсөн ба үүний дараа ямааны эсрэг IgG- HRP (1: 1,000; Санта Круз; sc-2005). Өргөтгөсөн химилюминесцентын бараан толбо илрүүлэх урвалж (Bio-Rad) ашиглан химилюминесцентын дохиог гаргаж, Chemidoc Imaging System (Bio-Rad) ашиглан дүрслэн харуулав.

Situ эрлийзжүүлэлтэд

РНСкопын мультиплекс флюресцент сорилын хэрэгслийг газар дээр нь эрлийзжүүлэхэд (Advanced Cell Diagnostics) ашигласан болно. Товчхондоо формалинаар бэхлэгдсэн хэсгүүдийг этилийн спиртээр усгүйжүүлж дараа нь протеазын нөлөөнд оруулав. Үүний дараа хэсгүүдийг РНСкопын олигонуклеотидын сорьцоор эрлийзжүүлсэн Drd2Байна. Судалгааг эрлийзжүүлсний дараа слайдуудыг РНХ-ийн аргын протоколын дагуу дохионы өсгөгч ашиглан өсгөв. Слайдуудыг дараа нь RNAscope угаах буферээр угаав. Эцэст нь слайдуудыг DAPI countertain-тэй холбосон.

Электрохимийн илрүүлэлт бүхий өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматограф

Өмнө дурдсанчлан, электрохимийн илрүүлэлт (HPLC-EC) бүхий урвуу фазын өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийг ашиглан DA илрүүлэх зорилгоор зүүн тархийг боловсруулсан.Килпатрик нар, 1986).

Тирозин гидроксилаза иммуногистохими

Слайд суурилуулсан хэсгүүдийг 10% төвийг сахисан формалинд бэхлээд 0.1 M TBS (рН 7.5) -т зайлж, 3% хэвийн илжигний ийлдэс, 0.3% Triton X-100, туулайн эсрэг тирозин гидроксилазын эсрэгбие агуулсан анхдагч эсрэгбиеийн уусмалаар өсгөв. (1: 1,000; Millipore; MAB152) шөнийн турш 23 ° C-д. Дараагийн өдөр нь эд эсийг TBS-д зайлж, 3% -ийн хэвийн илжигний ийлдэс, 0.3% Triton X-100, ямааны туулайны эсрэг Alexa Fluor 555 (Millipore; AQ132F) -тай нийлсэн хоёрдогч эсрэгбиеийн уусмалаар өсгөв. Хулгана болгоны хувьд эд эсийн болон дүрсний чанар муу байсан тул зөвхөн нэг хэсгийг шинжилсэн дөрвөн хулгана (хоёр HFD, хоёр Chow) -аас бусад хоёр судлын хэсгийг шинжлэв.

Микро-ПЭТ

Хулгана тарьсан ¹⁸Изофлураны наркозын үед сүүлний судсаар 2.5 мкл-ийн эзэлхүүнтэй, 0.34 ± 130 mCi / nmol-ийн тодорхой үйл ажиллагаа бүхий F-fallypride. Микро-PET сканнерыг 2 цагийн турш хийсэн бөгөөд 25 фрэймийг дүн шинжилгээ хийх зорилгоор олж авсан. Цаг хугацааны үйл ажиллагааны муруй ¹⁸Сонирхолтой бүс нутагт F-флиприд (AFII) -ийг AFNI програм ашиглан олборлосон байна (https://afni.nimh.nih.gov/afni) болон кинетик параметрүүд нь D2R холбох чадварыг тодорхойлохын тулд тусгай MATLAB скриптийг ашиглан (тархины булчирхайг ашиглан) дөрвөн тасалгааны загварт тохирсон (Lammertsma and Hume, 1996).

Vivo Electrophysiology-д

Доромедийн стриатумд нэг талын суулгасан 32 тефлон бүрсэн вольфрамын богино долгионы (35 мм диаметртэй) электродын массиваас бичлэг хийсэн (урд / хойд [A / P]: +0.8; дунд / хажуугийн [M / L]: +1.5 ; нурууны / ховдолын [D / V]: −2.6 мм тутамд нэг брегма), арилжааны програмаар боловсруулсан (Offline Sorter and Neuroexplorer; Plexon).

Стереотаксик вирусын вектор тарилга

Хулганыг изофлуран өртөх замаар богино хугацаанд мэдээгүйжүүлсэн. Гүнзгий наркоз хийсний дараа дунд шугамын дагуу ганц зүсэлт хийж, гавлын ясыг ил гаргаж, хоёр талын краниотоми хийв (A / P: +0.5; M / L: bregma тутамд ± 1.5 мм). Дарангуйлагч KOR-DREADD (Syn-DIO-hKORD-IRES-mCit-WPRE; 0.5 μL) агуулсан вирусын векторыг доромедиаль стриатумд (D / V, −2.8 мм гавлын дээд хэсгээс) хоёр талт тарьж, илэрхийлэхийг зөвшөөрөв. Туршилт хийхээс 9 долоо хоногийн өмнө.

Цэвэр флюксгүй микродиализ ба допамин шинжилгээ

Хулганы нурууны стриатум дахь эсийн гадуурх DA, DOPAC, HVA-ийн хэмжилтийг цэвэр урсгалгүй микродиализийн аргаар хийсэн. Тархины нугасны шингэнийг (aCSF) хиймэл тариураар дээж авахаас өмнө 2 цагийн турш 18 мкл / минутын турш тасралтгүй хийснээр канул суулгаснаас 1 долоо хоногийн дараа стереотаксик аргаар нэг мм-ийн зонд (1 кДа мембраны тасалдалт) суулгасан. Туршилтын нэмэлт журам). DA эсийн гаднах түвшинг хэмжих цэвэр урсгал туршилтыг диализийн датчикаар дамжуулан aCSF дахь DA (0, 2.5, 5, 10, 20, 40 нМ) -ийн зургаан өөр концентрацийг санамсаргүй байдлаар цутгаж гүйцэтгэсэн. DA концентраци бүрийг 30 минутын турш шингээж, дараа нь катехоламины задралаас урьдчилан сэргийлэхийн тулд 2 мМ HCl-ийн 10 мкл-ээс 2.5 мкл-ээс 100 × 1 минутын дээжийг цуглуулж, -80 ° C-д хөлдөөсөн. Нейрохимийн шинжилгээнд амократометрийн илрүүлэлттэй хамт изократ HPLC системийг ашигласан (HPLC-EC; BASi LC-4C). Зөвхөн шинжилгээг зөв байрлуулсан хулгануудыг шинжилгээнд хамруулсан болно (Зураг S3Э).

Статистик

Статистик шинжилгээг GraphPad Prism (Version 6.07; GraphPad Software) ашиглан хийсэн. Хэрэв заагаагүй бол хоёр сүүлт Оюутны t тестийг ашигласан болно. Үгүй бол хоёр сүүлтэй хосолсон t тест, нэг талын давтан хэмжигч ANOVA эсвэл хоёр талын давтан хэмжигдэхүүн ANOVA-г тохиромжтой үед болон заасан тохиолдолд ашигласан болно. ANOVA-уудын дараа post hoc харьцуулалт хийх t тестийг хийв. Үр дүнг альфа үед p <0.05 буюу альфаг Бежамини-Хочбергийн хуурамч нээлтийн түвшин (FDR) -ээр тодорхойлсон тохиолдолд шаардлагатай гэж үзсэн.

Зохиогчдын оруулсан хувь нэмэр

DMF, KD, TJO, MS, AK, IPSGRVAA, MR, KDH, AVK нар туршилтыг зохион бүтээсэн. DMF, KD, TJO, MS, AVK нар зан үйлийн туршилтыг хийж, дүн шинжилгээ хийв. IP нь баруун талыг арилгах туршилтыг хийсэн. DMF, AVK нар in vivo электрофизиологийн өгөгдлийг хийж, дүн шинжилгээ хийв. DMF, J.-SL, JG, AVK нар микро-PET туршилтыг хийж, дүн шинжилгээ хийв. DMF, KD, TJO, AVK нар гар бичмэлийг бичсэн. Бүх зохиогчид үр дүнг хэлэлцэж, гар бичмэлийн талаар тайлбар хийв.

Талархал

Энэхүү ажлыг NIH-ийн Интрамураль судалгааны хөтөлбөр, Чихрийн шижин, хоол боловсруулах болон бөөрний өвчин судлалын үндэсний хүрээлэн (NIDDK) дэмжиж ажилласан. NIDDK-ийн Mouse Metabolism Core-д сийвэнгийн метаболит ба гормоныг үнэлж, Андрес Буананно допамин микродиализын туршилтыг зохиоход туслалцаа үзүүлсэн, доктор Жудит Уолтерс, доктор Кристин Дюпр, Доктор Клер Делавилл нар HPLC-д тусалсанд талархал илэрхийлье. допамин эд эсийн агууламжийн шинжилгээ. Лабораторийн багаж хэрэгслийг ашиглаж, заавал судлах ажилд туслалцаа үзүүлсэн доктор Скотт Янгт мөн талархал илэрхийлье. Мөн AVK лабораторийн гишүүд Марк Рейтман, Ник Риба нарт туршилтын зураг төсөл, гар бичмэлийг сайтар уншиж танилцуулсанд баярлалаа.

Нэмэлт мэдээлэл

S1 документ. Нэмэлт туршилтын журам, зураг S1 – S5.

PDF файлуудад тусална уу

сонголтууд

S2 документ. Нийтлэл, нэмэлт мэдээлэл.

PDF файлуудад тусална уу

сонголтууд

Ашигласан материал

Адамс нар, 2015
В.К. Адамс, Ж.С.Суссман, С. Каур, А.М.Доуза, Т.Киффер, КА Уинстанли
Хархны өөх тос ихтэй хоолны дэглэмийг удаан хугацаанд, богино хугацаанд хэрэглэх нь импульсийн хяналтыг бууруулж, ховдолын цус харвалт D2 рецепторыг нэмэгдүүлдэг.
Евро. J. Neurosci., 42 (2015), хуудас 3095 – 3104
CrossRef

Түргэн холбоосууд