Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Нийтэлсэн онлайн байна 2017 May 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
Чисайо Козука,1 Тадаши Канаме,2 Чигуса Шимизу-Окабе,3 Читоши Такаяма,3 Масато Цуцуй,4 Масаюки Мацушита,5 Кэйко Абэ,6,7 болон Хироаки Масузаки
1
Товч
Зорилго / таамаглал
Хоолны өөх тосыг хэт их хэмжээгээр хэтрүүлэн хэрэглэх нь хүн, мэрэгч амьтдын таргалалт үүсгэдэг. Хүн, мэрэгч амьтдын сүүлийн үеийн судалгаагаар өөх тосонд донтох нь тархины шагналын тогтолцооны үйл ажиллагааны хувьд архидан согтууруулах ундаа, никотин, мансууруулах бодисонд донтох нь нийтлэг механизм гэдгийг харуулдаг. Өөх тос ихтэй хоолны дэглэм (HFD) нь допамин D2 рецепторыг (D2R) идэвхижүүлдэг бөгөөд тархины хөнгөлөлтийн тогтолцооны гол зохицуулагч болох striatum-д дохио өгдөг. Хүрэн будаатай өвөрмөц био идэвхит бүрэлдэхүүн болох or-oryzanol нь гипоталамик хяналтаар HFD-ийн давуу талыг бууруулдаг гэж бид өмнө мэдээлж байсан. Тиймээс γ-oryzanol нь хулгануудад тархины шагналын тогтолцооны үйл ажиллагааг зохицуулах боломжийг судалж үзсэн.
арга
HFD-ээр тэжээгддэг эрчүүдэд C57BL / 6J хулгана ally-оризанолоор амаар эмчилсэн бөгөөд D2R дохиололд оролцдог молекулуудын стриатын түвшинг үнэлсэн. D2R-ийг өдөөгч ДНХ-ийн метиллянд yz-oryzanol-ийн нөлөөлөл ба хоолны дэглэмийн өөхний дараагийн өөрчлөлтийг судлав. Нэмж дурдахад, ДНХ метилтрансферазын (DNMTs) хүчтэй дарангуйлагч болох 5-aza-2yc-deoxycytidine-ийн хоол хүнс, D2R дохиолол, хөрс хуулалт дахь DNMT-ийн түвшинг бууруулах нөлөөг судалсан. DNMT-ийн идэвхжил дэх γ-oryzanol-ийн дарангуйлах нөлөөг in vitro-д ферментатив үнэлгээ хийсэн.
үр дүн
HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудаас үүссэн striatum-д D2R-ийн үйлдвэрлэл нь D2R-ийн сурталчлагч бүсэд ДНХ метилляци нэмэгдсэний улмаас буурчээ. Or-oryzanol-ийн аман эмчилгээ нь DNMT-ийн илэрхийлэл, үйл ажиллагааг бууруулж, улмаар striatum дахь D2R-ийн түвшинг сэргээдэг. DNMT-ийн фармакологийн дарангуйллыг 5-aza-2′-deoxycytidine нь хоолны дэглэмийн өөх тосны хэрэглээг сайжруулав. Эдгээр олдворуудтай нийцүүлэн ферментийн in vitro шинжилгээ нь γ-oryzanol нь DNMT-ийн үйл ажиллагааг дарангуйлж байгааг харуулж байна.
Дүгнэлт / тайлбар
Бид γ-oryzanol нь хулганын striatum дахь D2R-ийн промоторын бүсэд HFD-ийн өдөөгдсөн ДНХ-ийн гиперметилляцийг сайжруулдаг болохыг бид харуулсан. Манай туршилтын парадигм нь ig-oryzanol-ийг шинэ төрлийн эпигенетик модулятор болох өвөрмөц шинж чанар бүхий антибиотик нөлөөтэй бодис болгон онцолж өгдөг.
Цахим нэмэлт материал
Энэ нийтлэлийн онлайн хувилбар (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) нь хянагдсан боловч хянагдаагүй нэмэлт материалыг агуулсан бөгөөд үүнийг эрх бүхий хэрэглэгчдэд ашиглах боломжтой юм.
Оршил
Хэт таргалалттай хүмүүст хэт их идэх нь архи, никотин, мансууруулах бодисонд донтох нийтлэг механизмыг дор хаяж хэсэгчлэн хуваалцдаг.1] Вэ. Хоолны дуршилыг бууруулах гипоталамик ба гормоны зохицуулалттай холбоотойгоор тархины шагналын систем, ялангуяа допамин рецепторын дохио нь донтох эсвэл гедоник хооллох зан үйлтэй нягт холбоотой байдаг.2] Вэ. Хархнууд дээр хийсэн өмнөх судалгаагаар хараат бус допамин D2 рецепторыг (D2R) бууруулж, РНХ руу түргэн нөлөөлдөг донтохтой төстэй шагналын хомсдол, албадан шахалт бүхий хоол хайж байдаг.3] Вэ. D2R нягтрал буурч байгаа тул хэт таргалалт нь хэт таргалалттай хүн, мэрэгч амьтдын туранхай бүлгийн хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хоолны шагналд бага хариу үйлдэл үзүүлдэг.3-5] Вэ. Энэхүү ойлголтын дагуу TaqIA-ийн бүх аллель ANKK1 генийн локус (кодчилсон DRD2 / анкирины давталт ба 1 агуулсан киназийн домайн), энэ нь striatal D2R үйлдвэрлэлийг бууруулдаг нь хүний хэт таргалалттай холбоотой юм.6bariatric мэс засал хийсний дараа жин хасахад үзүүлэх нөлөө нь ихэссэн D2R нягтралтай холбоотой юм.7] Вэ. Эдгээр мэдээлэл нь хэт таргалалтын эмчилгээнд шинэ эмчилгээний зорилго болох striatal D2R-ийн ач холбогдлыг санал болгож байна. Гэсэн хэдий ч тархины урамшууллын тогтолцоонд ажилладаг зарим эмүүд ихээхэн сөрөг үр дагавар, түүний дотор сэтгэцийн эмгэгийн ноцтой асуудлуудыг үүсгэж, улмаар эмнэлгээс гарахад хүргэсэн [8].
Эпигенетик өөрчлөлт нь зөвхөн хөгжих, ялгахад чухал ач холбогдолтой төдийгүй хүрээлэн буй орчны өөрчлөлт, түүний дотор хоолны дэглэм, амьдралын хэв маягаас үүдэлтэй байдаг.9] Вэ. ДНХ метилляци нь генийн илэрхийлэл тогтвортой байдлыг хангах гол эпигенетик үйл явдал юм.9] Вэ. Хархны үед эхийн өөх тос ихтэй хоолонд (HFD) хордох нь үр удамд нь ДНХ метилляци өөрчлөгдөж үр удамд нь HFD-ийг хэтрүүлэн хэрэглэхэд хүргэдэг.10] Вэ. Ялангуяа ДНХ метилтрансферазууд (DNMTs) нь хооллох зан үйл, бие махбодийн үйл ажиллагааг зохицуулахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.10, 11], DNMTs нь таргалалт-чихрийн шижингийн хам шинжийн эмчилгээнд үр дүнтэй эмчилгээний зорилт болж чадна гэж үзэж байна. Нэн чухал нь хүнсний гаралтай зарим бодис, кофейны хүчил, эпигаллокатехин зэрэг нь DNMT дарангуйлагчаар ажилладаг нь мэдэгдэж байна.12, 13].
Биологийн идэвхит, бор будаатай өвөрмөц бүрэлдэхүүн хэсэг болох or-oryzanol, исгэлэн хүчил эфир болон хэд хэдэн фитостеролын холимог нь гипоталамик эндоплазмын торлог (ER) стресс буурснаар хоол тэжээлийн өөхний хэмжээг бууруулдаг болохыг бид саяхан харууллаа.14] Вэ. Хулгана, туулайнд амаар хийдэг or-oryzanol нь гэдэснээс хурдан шингэж тархинд тархдаг байв.15, 16] Вэ. Эдгээр судалгааг нэгтгэн харвал төв мэдрэлийн системд ажилладаг байгалийн гаралтай хүнс гаралтай бүтээгдэхүүн нь таргалалтын үед хоол тэжээлийн хомсдолыг сайжруулж болох юм. Энэ хүрээнд γ-oryzanol нь тархины шагналын систем дэх ДНХ метилляцийн статусыг өөрчилнө гэсэн таамаглалыг туршиж үзсэн бөгөөд ингэснээр хулганад HFD-ийг сонгох нь буурчээ.
арга
амьтад
Японы Чарльз Ривер Лабораториас (Япон, Канагава) олж авсан долоон долоо хоногийн настай эрэгтэй C57BL / 6J хулганыг эмгэг төрөгчгүй, 3 градусын температурт 4 цаг / 24 цаг гэрэлд байрлуулсан / харанхуй мөчлөг. Долоо хоногийн дараа дасан зохицсоны дараа 12 долоо хоногтой хулгануудыг жинтэй харьцуулж, хоёр, гурван бүлэгт хувааж туршилт бүрийг хийлгэсэн. Хулгануудад хоол хүнс, ус үнэгүй нэвтрэх эрх олгожээ. Бүх амьтдын туршилтыг Рюкюсийн Их сургуулийн Амьтдын туршилтын ёс зүйн хорооноос батлав (12, 8, 5352 дугаарууд).
Or-oryzanol ба 5-aza-2′-deoxycytidine-ийн захиргаа
HFD-ийн давуу талыг үнэлэхийн тулд described-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япон) нь өмнө дурдсанчлан хүнсний сонголтын туршилтыг хийх үеэр хоол хүнсээр дамжуулан 8 долоо хоногийн настай хулгануудыг удирддаг байсан [14, 17] Вэ. Бусад туршилтуудын хувьд 12079% γ-oryzanol агуулсан HFD (D0.4B; Судалгааны дэглэм, Нью-Брунсвик, АНУ, АНУ) үрлэн хэлбэрээр үйлдвэрлэсэн. Хоолны бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг цахим нэмэлт материал (ESM) Хүснэгтэнд харуулав 1. 12 долоо хоног хооллосны дараа стриатум ба гипоталамусаас эд эс цуглуулсан. Γ-оризанолын өдөр тутмын хэрэглээ нь хулганы дундаж хооллолтын хэмжээнээс ойролцоогоор 320 мкг / г жинтэй байв. Γ-оризанолын тунг өмнө нь тайлбарласны дагуу тодорхойлов.14]. 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC; Сигма-Олдрич, Сент-Луис, АНУ, MO) нь 0.25 долоо хоногийн турш долоо хоногт гурван удаа хэвлийн хөндийд (биеийн жин 12 мкг / г) тарьсан [.18].
Хоолны өөхний давуу талыг тооцоолох
Хоолны өөхний хэрэглээг үнэлэхийн тулд хүнсний тестүүд нь өмнө дурдсанчлан chow ба HFD (D12450B ба D12451; Судалгааны хоолны дэглэм) хоорондох сонголтыг өгсөн [14] Вэ. Хоолны бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ESM хүснэгтэд үзүүлэв 1. Товчхондоо, хулганууд chow болон HFD-д үнэгүй нэвтрэх боломжтой болсон. Chow ба HFD-ийн хэрэглээг долоо хоног бүр хэмжиж, хоолны дэглэмийн өөх тосны өөрчлөлтөд дүн шинжилгээ хийв. HFD-ийн давуу эрхийг дараахь томъёогоор тооцоолов: HFD-ийн давуу эрх = [(HFD хэрэглээ / нийт хоол хүнсний хэмжээ) × 100].
ДНХ-ийн метилизацийн бисульфитийн дараалал
ДНХ-ийг DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Токио, Япон) ашиглан цэвэршүүлсэн. ДНХ-ийн уусмалыг шинэхэн бэлтгэсэн 3 моль / л NaOH-тай хольж, 37 15С-т 5.3 минутын турш өсгөвөрлөж, 1.7 моль / л мочевин, 4.9 моль / л натри бисульфит, 15 ммоль / л гидрохинон нэмнэ. Уусмалыг 95 секундын турш денатурацид 30 циклийн турш 50 секундын турш, 15 ° С температурт XNUMX минутын турш инкубаци хийв.19] Вэ. Бисульфитээр боловсруулсан ДНХ-ийг MinElute PCR-ийн цэвэршүүлэлтийн хэрэгсэл (QIAGEN) ашиглан цэвэрлэж, KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR иж бүрдэл (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) болон D2R-ийн сурталчлагч мужийн CpG сайтын эргэн тойронд праймерыг ашиглан PCR-ээр сайжруулсан. Байна. Энэхүү праймер дараалал нь дараахь байсан: урагшлах праймер, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; урвуу праймер, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Дараа нь Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, АНУ) ашиглан адаптерийн дарааллыг нэмж, цэвэрлэв. Дараа нь дээжүүдийг цуглуулж GS Junior (Roche оношлогоо, Токио, Япон) компанид үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу дарааллын дагуу байрлуулсан. Метилляцийн түвшинг бүх цитозины үлдэгдэл дэх метилжсэн цитозинуудын эзлэх хувь болгон илэрхийлсэн.
DNMT үйл ажиллагааны шинжилгээ
DNMT ферментийн идэвхжилийн шинжилгээг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу EpiQuik ДНХ метилтрансферазын үйл ажиллагаа / дарангуйлах шинжилгээний иж бүрдэл (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) болон EPIgeneous Methyltransferase Assay иж бүрдлийг (Cisbio Japan, Chiba, Japan) ашиглан гүйцэтгэсэн.
ДНХ-ийн метилляци дахь нэгдэл бүрийн дарангуйлах үйл ажиллагааг үнэлэх, үүсэх S-adenosyl-l-homocysteine (SAH) -ийг нэгдэл тус бүрээр нь хэмжинэ (скрининг шинжилгээнд 20 мкмоль / л), S- аденозил метионин (SAM; 10 мкмоль / л) ба DNMT субстрат (4 нг / мкл) 37 90С-т 1 минутын турш. Michaelis-Menten кинетикийг үнэлэхийн тулд DNMT20 (5 мкмоль / л) -ийг γ-оризанол, SAM (37 мкмоль / л) ба поли dI-dC-ийн заасан концентрацийг 90 3 минутын турш өсгөв. DNMT100a (3 мкмоль / л) ба DNMT100b (5 мкмоль / л) -ийг γ-оризанол, SAM (37 мкмоль / л) -аар өсгөвөрлөж, поли dG · dC-ийн концентрацийг 120 0.75С-т 5 минутын турш өсгөв. Шинжилгээг дөрвөн удаа хийсэн. Олборлосон уураг (5 мг / мл) -ийг SAM (5 мкмоль / л), поли dI-dC (40 мкг / мл), поли dG · dC (120 мкг / мл) -ээр XNUMX XNUMXС-т XNUMX минутын турш өсгөвөрлөв. SAH формацийг хэмжсэн.
Эстрогентэй холбоотой рецептор-идэвхжилийн шинжилгээ
Эстрогентэй холбоотой рецептор-γ (ERRγ) дээрх γ-оризанолын антагонист үйл ажиллагааг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу Хүний Эстрогентэй холбоотой рецептор гамма сурвалжлагчийн шинжилгээний систем (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) ашиглан үнэлэв. Товчхондоо идэвхитэй ERRγ-ийг илэрхийлэх хүний бус хөхтөн амьтдын сурвалжлагч эсүүд нэгдэл тус бүрийн концентрацид 24 цагийн турш гурван удаа үйлчилсэн болно.
Баруун бүслүүр
Үүнийг өмнө тайлбарласны дагуу гүйцэтгэсэн [20] D2R (1: 500, туулай), допамин тээвэрлэгч (DAT; 1: 500, туулай), тирозин гидроксилаза (TH; 1: 1000, туулай) (AB5084P, AB1591P ба AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, АНУ), 3α (STAT3α; 1: 1000, туулай), DNMT1 (1: 1000, туулай), DNMT3a (1: 1000, туулай) (дугаар 8768, 5032 ба 3598; эсийн дохиоллын технологи, Токио, Япон), DNMT3b (1 мкг / мл, туулай), ERRγ (1: 1000, туулай) ба β-актин (1: 10,000, хулгана) (ab16049, ab128930 ба ab6276; Абкам, Кэмбридж, АНУ, АНУ).
Бодит цаг үеийн ПГУ
Генийн илэрхийлэлийг өмнө дурьдсанчлан шалгаж үзсэн болно [14] Вэ. mRNA түвшинг хэвийн болгосон Rn18-ууд (18S rRNA). Бодит цаг үеийн ПГУ-ын шинжилгээнд ашигласан праймерын багцыг ESM хүснэгтэд нэгтгэн харуулав 2.
Статистикийн дүн шинжилгээ
Өгөгдлийг дундаж ± SEM гэж илэрхийлнэ. Боломжтой бол нэг талын ANOVA ба давтан хэмжигдэхүүн ANOVA, дараа нь олон харьцуулалтын тест (Bonferroni-Dunn арга) ашигласан. Оюутны t тестийг хоёр бүлгийн ялгааг шинжлэхэд ашигласан. Ялгааг дараахь байдлаар ач холбогдолтой гэж үзсэн p <0.05.
үр дүн
DNMT-ийн фармакологийн дарангуйллыг 5-aza-dC-ийн нөлөөгөөр хулганад өөх тосны хэрэглээг бууруулдаг.
HFD-ээр хооллодог хулгануудад стриатум дахь D2R-ийн сурталчилгааны бүс дэх ДНХ метилляци нь chow хоолны дэглэмээр хооллодог хулгануудтай харьцуулахад мэдэгдэхүйц ихэссэн байна. (Зураг. 1a) .1а). Нөгөө талаар, D2R-ийн сурталчлагч бүсэд гипоталамик ДНХ метилляци нь chow хоолны дэглэмийн дагуу striatum-ээс өндөр байсан нь харагдаж байна (p <0.01) (Зураг. (Зураг. 1a, 1a, f) ба HFD-ээр өөрчлөгдөөгүй (Зураг. (Зураг. 1f) .1е). HFD-ээр хооллодог хулгануудад DriNumXR-ийн тархалтын бүс дэх ДНХ-ийн метилляцийг DNMT-ийн хүчтэй дарангуйлагч болох 2-aza-dC-тай эмчилгээ хийснээр хэвийн болгосон. (Зураг. 1a) .1а). Үүний эсрэгээр гипоталамус дахь D2R-ийн промоторын бүс дэх ДНХ метилляци нь 5-aza-dC-тай эмчилгээ хийснээр мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөөгүй (Зураг. (Зураг. 1f) .1е). 20 долоо хоногийн турш HFD-ийг тэжээж байсан 12 долоо хоногийн настай эр хулганы стриатумд mRNA ба D2R-ийн уургийн хэмжээ мэдэгдэхүйц буурсан байна (Зураг XNUMX-р зураг). (Зураг. 1b, 1б, к, л). Үүний эсрэгээр, допамин D1 рецепторын түвшин (D1Rs-ээр кодлогдсон) Drd1), аденилийн циклаза ба CAMP-ийн зуучлагч эсийн дохиолол дээр D2R-тэй эсрэг үйлдэл хийдэг байсан нь өөрчлөгдөөгүй байв (Зураг. (Зураг. 1c) .1в). Цаашилбал mRNA ба уургийн түвшинд TH, DAT гэх мэт D2R дохиотой холбоотой бусад молекулуудын түвшинд өөрчлөлт гарсангүй. (Зураг. 1d, 1г, э, к, м). Нөгөө талаар гипоталамус, түүний дотор D2R-ийн хувьд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт ажиглагдаагүй (Зураг. (Зураг. 1g – m) .1г – м). Тодруулбал, гипоталамус дахь D2R ба TH-ийн уургийн хэмжээ нь хөргөгчинд агуулагдах хэмжээнээс хамаагүй бага байв (Зураг. (Зураг. 1l, 1би бол), магадгүй гипоталамустай харьцуулахад тархины шагналын систем дэх допамин рецепторын дохиоллын харьцангуй ач холбогдлыг тусгаж магадгүй юм.
D2R-ийн сурталчилгааны бүс дэх ДНХ метилляци нь хоолны өөхний хэрэглээг өөрчлөх эсэхийг өөрчлөхийн тулд 5-aza-dC-тай харьцуулсан хулгануудын хооллох зан чанарыг шинжлэв. Хүлээгдэж буйчлан, 5-aza-dC нь HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудын striatum-д D2R-ийн mRNA болон уургийн түвшинг ихээхэн нэмэгдүүлжээ (Зураг. (Зураг. 1b, 1б, к, л). Нөгөө талаар, түвшингүүдэд ямар ч нөлөө үзүүлээгүй Drd1, Th болон Slc6a3 програм (DAT кодчилох) нь striatum, эсвэл түвшинд Drd2, Drd1, Th болон Slc6a3 програм гипоталамус дотор (Зураг. (Зураг. 1c – e, 1c – e, g – m). Тээврийн хэрэгсэлтэй эмчлэгдсэн хулгана нь HFD-ийг илүүд үздэг байсан бол 5-aza-dC-тай харьцуулсан хулгануудад HFD-ийн давуу байдал харьцангуй буурсан байна (тээврийн хэрэгсэлд эмчлэгдсэн хулгануудын үнийн дүнгийн 88%). (Зураг. 1n) .1n). Иймээс 5-aza-dC-тай эмчилгээ хийлгэх нь биеийн жингийн өсөлтийг бууруулав (Зураг. (Зураг 11)о).
γ-oryzanol нь HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудын striatum дахь DNMT-ийн түвшинг бууруулдаг
Өмнө нь мэдээлж байсанчлан [14], or-оризанолыг эр эмийн хулгануудад амны хөндийн хэрэглээ нь HFD (тээврийн хэрэгслийн эмчилгээний зориулалттай хулгануудын үнийн дүнгийн 93%) -ийг эрс нэмэгдүүлжээ. (Зураг. 2a), 2а), улмаар биеийн жин нэмэгдэх нь илт уналтад орно. (Зураг. 2b) .2б). Тиймээс striatum дахь D2R-ийн эпигенетик модуляцид γ-oryzanol-ийн нөлөөллийг судлав.
Хөхтөн амьтдын хувьд DNMT1, 3a ба 3b гэсэн гурван том DNMT байдаг. DNMT1 нь ДНХ метилляцийг хадгалах үүрэгтэй байдаг бол DNMT3a ба 3b нь ДНХ-ийн метилляцийг хөнгөвчлөх үүрэг гүйцэтгэдэг.21] Вэ. V-in-oryzanol-ийн DNMTs-д үзүүлэх нөлөөллийг судлахын тулд бид HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудын тархи дахь DNMT-ийн түвшинг үнэлэв. Хэдийгээр HFD нь striatum эсвэл гипоталамусын аль алинд нь mRNA болон DNMT-ийн уургийн түвшинд нөлөөлөөгүй боловч or-oryzanol-ийн бэлдмэл нь striatum-д DNMT-ийн түвшинг мэдэгдэхүйц бууруулсан боловч гипоталамусад ороогүй байна (Зураг. (Зураг. 2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Эдгээр өгөгдөл нь or-oryzanol нь DNMT-ийн түвшинг striatum-д тохируулан зохицуулах боломжийг нэмэгдүүлдэг. Үүнтэй ижил төстэй байдлаар 5-aza-dC нь striatum-д DNMT3a ба 3b-ийн mRNA түвшинг мэдэгдэхүйц бууруулсан (ESM зураг). 1a – d).
DNMT1-ийн mRNA түвшинг дор хаяж хэсэг нь цөмийн рецептороор ERR by эерэгээр зохицуулж байгааг өмнөх судалгааны үндсэн дээр тогтоожээ.22], бид γ-oryzanol-ийн ERRγ үйл ажиллагаанд үзүүлэх нөлөөллийг судлав. Хүний бус хөхтөн эсүүд нь ERR In-ийг идэвхтэй илэрхийлдэг, ERRγ-ийн хүчтэй урвуу агонист болох 4-гидрокси тамоксифен нь ERRγ-ийн идэвхжил буурсан байна. Тэмдэглэхэд, γ-oryzanol нь ERRγ-ийн үйл ажиллагааг хэсэгчлэн бууруулсан (төрөлхийн утгын ойролцоогоор 40% -иар буурсан) (Зураг. (Зураг. 3a) .3а). Чухал зүйл бол ERRγ нь гипоталамусын бус харин хөргөгчинд ихээр илэрхийлэгддэг байв (Зураг. (Зураг. 3b – d) .3b – d). Шөрмөсөний төлөв байдлаас ялгаатай нь or-oryzanol нь зөвхөн гипоталамус дахь DNMT1-ийн уургийн түвшинг ихээхэн нэмэгдүүлдэг (Зураг. (Зураг. 2k, 2к, л). Эдгээр үр дүнг дор хаяж хэсэг нь DNMT3 түвшний эерэг зохицуулагч STAT1α олж байгааг бид тайлбарлаж болно.23], гипоталамус дээр элбэг дэлбэг хэлбэрээр илэрхийлэгддэг боловч хөрс хуулалтад ороогүй (Зураг. (Зураг 33)e – g).
Iv-Oryzanol-ийн DNMT-ийн vivo-ийн идэвхжилд үзүүлэх нөлөөллийг цаашид үнэлэхийн тулд ДНХ-ийн метилляцийн нэмэлт бүтээгдэхүүн болох SAH үүсэх, мөн DNMT-ийн хүчтэй дарангуйлагч HFD-ээр тэжээгдсэн γ-oryzanol эмчлэгдсэн хулгануудад үнэлэгдэв. HFD-ээр тэжээгддэг ба chow-тэжээгддэг хулгануудын хоорондох стрипатум эсвэл гипоталамусын аль алинд нь SAH үүсэхэд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гарсангүй (Зураг. (Зураг. 2f, 2е, ж). Сонирхолтой нь or-oryzanol нь striatum дахь SAH формацийг эрс бууруулсан болохыг харуулж байна. (Зураг. 2f) 2е) харин гипоталамус дотор биш (Зураг. (Зураг. 2j), 2j), γ-oryzanol нь HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудад хөргөгчинд өвөрмөц байдлаар DNMT-ийн үйл ажиллагааг дарангуйлдаг болохыг харуулж байна.
In-vitro-ийн DNMT-ийн хувьд γ-oryzanol-ийн дарангуйлах шинж чанарын ферментатив шинжилгээ
Дараа нь бид N-oryzanol-ийн нөлөөг in vitro-ийн DNMTs-ийн идэвхжилд үнэлэв. DNMT-ийн эсрэг γ-oryzanol, ferulic acid, 5-aza-dC, haloperidol (D2R антагонистын төлөөлөгч), quinpirole (D2R agonist-ийн төлөөлөгч), SAH-ийн дарангуйлах потенциалуудыг үнэлэв. Эерэг хяналт болохын тулд SAH нь DNMT-ийн үйл ажиллагааг тунг хараат байдлаар эрс сайжруулж чадсан (Зураг 8). (Зураг. 4a – f) .4a – f). Хүлээгдэж буйгаар галоперидол ба quinpirole нь DNMTs-ийн үйл ажиллагаанд ямар ч нөлөө үзүүлээгүй (ESM Зураг. 2). Анхаарах зүйл бол or-oryzanol нь DNMT1 (IC) -ийн үйл ажиллагааг ихээхэн дарангуйлдаг50 = 3.2 мкмоль / л), 3а (IC50 = 22.3 мкмоль / л) ба 3b (хамгийн их дарангуйлал 57%) (Зураг. 4d – f) .4г – f). Үүний эсрэгээр fer-oryzanol-ийн метаболит болох ферулийн хүчлийн дарангуйлах идэвх нь γ-oryzanol-ийнхээс хамаагүй бага байв (Зураг. (Зураг 44)г – f).
Бид DNMT дээр γ-oryzanol-ийн дарангуйлах шинж чанарыг илүү нарийвчлан судлав. SAH үүсэхийг in-vitro-д DNMTs дээр γ-oryzanol-ийн дарангуйлах идэвхийг үнэлэхэд хэмжсэн. DNMT-р зуучлуулсан ДНХ метилизацийн үед SAH үүсэх мэдээлэл нь Майкл-Ментен кинетикийн хувьд yz-oryzanol байх ба байхгүй аль алинд нь ханасан хэлбэрийг харуулж байна. (Зураг. 4g – i) .4г – i). DNMT1-ийн зуучлагдсан ДНХ-ийн метилизацид Eadie-Hofstee-ийн шинжилгээгээр yz-oryzanol нь ямар ч нөлөө үзүүлээгүй болохыг харуулж байна. V хамгийн их SAH үүсэх (тээврийн хэрэгсэл, 597 пмоль / мин; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 619 пмоль / мин; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 608 пмоль / мин), харин γ-оризанол нь K m (тээврийн хэрэгсэл, 0.47 мкг / мл; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 0.67 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.89 мкг / мл) (Зураг. (Зураг. 4j) .4j). Эдгээр үр дүнгээс харахад γ-oryzanol нь DNMT1-ийг дор хаяж хэсэгчлэн өрсөлдөх чадваргүй болгодог. Нөгөө талаар, DNMT3a- болон 3b-ийн зуучлагдсан ДНХ метилляцийн хувьд γ-oryzanol нь буурчээ V хамгийн их SAH үүсэх (DNMT3a: тээврийн хэрэгсэл, 85.3 пмоль / мин; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 63.1 пмоль / мин; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 42.5 пмоль / мин; DNMT3b: тээврийн хэрэгсэл, 42.3 пмоль / мин; γ -oryzanol 2 мкмоль / л; 28.0 пмоль / мин, γ-оризанол 20 мкмоль / л, 15.0 пмоль / мин) ба үүнтэй адилаар K m энэ урвалын хувьд (DNMT3a: тээврийн хэрэгсэл, 0.0086 мкг / мл; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 0.0080 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.0058 мкг / мл; DNMT3b: тээврийн хэрэгсэл, 0.0122 мкг / мл; γ- оризанол 2 мкмоль / л, 0.0097 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.0060 мкг / мл) (Зураг. (Зураг. 4k, 4к, л). Эдгээр үр дүнгээс харахад γ-oryzanol нь DNMT3a ба 3b-ийг дор хаяж хэсэгчлэн өрсөлдөх чадваргүй байдлаар дарангуйлдаг.
or-oryzanol нь HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудын стрриатум дахь D2R-ийн түвшинг нэмэгдүүлдэг.
Дараа нь N-oryzanol нь DNMT-ийг дарангуйлах замаар striatal D2R-ийн агууламж нэмэгдэх боломжийг бид туршиж үзсэн. HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудад or-oryzanol-ийн аман эмчилгээ нь D2R-ийн сурталчилгааны бүсэд тархсан ДНХ-ийн метилляцийг ихээхэн бууруулдаг (Зураг. (Зураг. 5a), 5а) харин гипоталамус дотор үүнийг хийж чадаагүй байна (Зураг. (Зураг. 5f) .5е). Эдгээр олдворуудын дагуу mRNA болон D2R-ийн уургийн түвшин харилцан бие биенээ нэмэгдүүлсэн байна (Зураг). (Зураг. 5b, 5б, г, к, л). 5-aza-dC-тай эмчилгээний талаархи мэдээлэлтэй төстэй. (Зураг. 1), 1), РНХ, уургийн түвшинд тодорхой нөлөө үзүүлээгүй Drd1, Th болон Slc6a3 програм (DAT) нь хөргөгчинд байдаг ба түвшинд ямар ч нөлөө үзүүлдэггүй Drd1, Th болон Slc6a3 програм гипоталамус дотор (Зураг. (Зураг. 5c – e, 5c – э, h – k, m).
Өмнөх судалгаануудаас харахад D2R ба DNMT1-ийн түвшинг ER стресс, үрэвсэл дор хаяж хэсэг NF-κB-ээр зохицуулдаг.17, 24, 25] Вэ. Тиймээс бид стресс, үрэвсэлтэй холбоотой генийн түвшинг судаллаа. Өмнө нь үзүүлсэн шиг [26], HFD нь TNF-α кодлодог генүүдийн илэрхийлэлийг нэмэгдүүлэв (Тнфа), моноцитын химиатритант уураг - 1 (MCP-1) (Ccl2 байна), C / EBP-ийн нэгэн төрлийн уураг (Цавчих), ER-нутагшуулсан DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9 байна) ба XN boxX уураг агуулсан уусмал хэлбэртэй (Xbp1-ууд) гипоталамус дотор байрладаг боловч хөргөгчинд байдаггүй (Зураг. (Зураг. 6) .6). Тодруулбал, HFD-ийг or-oryzanol агуулсан бэлдмэлийн агууламж нэмэгдсэнээр илэрхий нэмэгдсэн байна Ccl2 байна, Цавчих, Dnajb9 байна болон Xbp1-ууд зөвхөн гипоталамусын бус харин хөргөгчинд биш (Зураг. (Зураг 66)).
хэлэлцүүлэг
Энэхүү судалгааны гол илрэл нь γ-oryzanol нь хулганы хөргөгчинд DNMT-ийн дарангуйлагчийн үүрэг гүйцэтгэдэг бөгөөд ингэснээр дор хаяж хэсэгчилсэн байдлаар стриатал D2R-ийн эпигенетик модуляцаар HFD-ийг илүүд үздэг. HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудаас үүссэн striatum-д D2R-ийн түвшин мэдэгдэхүйц буурсан бол D1R, TH, DAT-ийн хэмжээ өөрчлөгдөөгүй байна (Зураг. (Зураг. 1b – e, 1б – э, к – м) байна. Эдгээр өгөгдөл нь хэт таргалалттай D2R-ийн дисфункц нь хэт таргалалттай амьтдад HFD-ийн хэт авиаг хэтрүүлэн хэрэглэхэд хүргэдэг тул HFD-д хоол хүнс өгөх урамшууллыг ойлгоход чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэсэн үзэл баримтлалтай нийцэж байна.3] Вэ. Одоогийн судалгаагаар HFD-тэй хооллогдсон хулгануудыг 5-aza-dC-тай эмчлэх нь striatal D2R-ийн түвшинг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлжээ (Зураг. (Зураг. 1b, 1б, к, л) магадгүй D2R-ийн сурталчлагч муж дахь ДНХ метилляцийн түвшинг бууруулж магадгүй юм. (Зураг. 1a), 1а), улмаар хоолны дэглэмийн өөх тосыг илүүд үздэг болохыг тогтоожээ. (Зураг. 1n) .1n). Энэхүү олж мэдэл нь HFD-тай байхдаа хоол хүнсний урамшууллыг ойлгодог striatal D2Rs-ийн чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.
Бидний in vitro шинжилгээ нь or-oryzanol-ийн DNMT-ийн эсрэг дарангуйлах идэвхжил нь түүний метаболит ферулын хүчилтэй харьцуулахад илүү хүчтэй болохыг харуулж байна. (Зураг. 4d – f), 4d – f) нь DNMT дээр дарангуйлах үйл ажиллагааны хувьд or-оризанолын бүрэн бүтэц чухал болохыг харуулж байна. HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудад бидний хийсэн судалгаагаар аман эмчилгээ хийсний дараа γ-oryzanol нь тархинд бүрэн бүтэц болж, хөргөгчинд DNMT-ийн түвшин, үйл ажиллагаа буурч, улмаар промоторын бүсэд ДНХ метилляци буурч байна. Striatum дахь D2R. Цаашилбал, бидний in vitro судалгаагаар γ-oryzanol нь ERRγ-ийн эсрэг хэсэгчилсэн антагонист болох нь DNMT1 үйлдвэрлэхэд эерэг зохицуулагч үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулав.22], улмаар DNMT1-ийн идэвхжил буурсан (Зураг. (Зураг. 3a) .3а). Анхаарах зүйл бол ERRγ нь хулгана дахь гипоталамус биш харин хөргөгчинд ихээр илэрхийлэгддэг байжээ (Зураг. (Зураг. 3b) .3б). Эдгээр өгөгдөл нь or-oryzanol нь DNMT1-ийн mRNA түвшинг дор хаяж хэсэгчлэн ERRγ дарангуйлах замаар бууруулж болзошгүйг харуулж байна. Стратиумаас ялгаатай нь F-oryzanol нь HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудаас гипоталамус дахь D2R-ийн түвшинд ямар ч нөлөө үзүүлээгүй (Зураг. (Зураг. 5g, 5г, к, л).
Нөгөө талаар, γ-oryzanol нь гипоталамус дахь DNMT1-ийн түвшинг мэдэгдэхүйц ихэссэн боловч хөрс хуулалтад ороогүй болохыг бид харуулав. (Зураг. 2k, 2к, л). STAT3 нь хортой Т-лимфома эсэд DNMT1-ийн хэмжээг нэмэгдүүлдэг болохыг харуулав.23] Вэ. Өмнө нь F-oryzanol нь HFD-тэй хооллодог хулганаас гипоталамус дахь лептинээр үүсгэгдсэн STAT3 фосфоржилтыг ихээхэн хэмжээгээр нэмэгдүүлдэг болохыг бид өмнө нь харуулсан.14] Вэ. STAT3α нь гипоталамусад ихээхэн хэмжээгээр илэрхийлэгддэг болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй. (Зураг. 3e – g) .3e – g). Эдгээр мэдээлэл нь гипоталамус ба хөрсний хоорондох DNMT1-ийн түвшин дэх γ-oryzanol-ийн нөлөөгөөр илэрхий ялгаа нь дор хаяж хэсэгчлэн, тухайн бүс нутгийн онцлог шинж чанартай STAT3α ба ERRγ зэрэг хулганын тархинд хамааралтай гэж таамаглахад хүргэдэг. Зураг. (Зураг. 3b – g) .3b – g). Хамтдаа хулгана дахь striatum ба гипоталамусын хоорондох ERRγ ба STAT3α-ийн харилцан бие биенээ илэрхийлэх хэлбэр харагдаж байна. Тиймээс бидний үр дүнгээс харахад ERRγ үйлдвэрлэл нь элбэг байдаг striatum-д or-oryzanol нь mRNA түвшин, DNMT1-ийн ферментийн идэвхийг ERRγ-ийн сөрөг зохицуулагч гэж бууруулдаг гэж таамаглах нь үндэслэлтэй юм. Үүний эсрэгээр, STAT3α үйлдвэрлэл давамгайлдаг гипоталамусад or-oryzanol нь DNMT1-ийн түвшинг нэмэгдүүлдэг.
Саяхны судалгаагаар HFD-ийн хоол тэжээлийн үйл ажиллагааг алдагдуулдаг хөрсний D2R дохиог бууруулж байгааг харуулж байна.3], хэт таргалалтыг эмчлэхэд striatal DNMT-ийг дарангуйлах магадлалын ач холбогдлыг санал болгож байна. Нөгөө талаар, урьд нь хийсэн судалгаагаар тодорхой гипоталамик цөмд илэрхийлэгдсэн меланокортины рецептор 4 генийн ДНХ метилляцийн төлөв байдал нь агиутийн амьдрах чадвартай шар хулгануудад таргалалтын трансгенерацын хэлбэрийг өөрчлөх боломжтой болохыг харуулж байна.27] Вэ. Цаашдын судалгаанууд нь үндсэн механизмыг тодруулах баталгаа болж байгаа боловч эдгээр судалгаанууд HFD-ийн таргалалтын эмгэг жам дахь эд, ген, дарааллын онцлог ДНХ метилляцийн ач холбогдлыг харуулж байна.
Бид саяхан HFD нь хулганын нойр булчирхайн арлууд дахь D2R-ийн түвшинг нэмэгдүүлснийг мэдээлсэн билээ.17, 24] Вэ. D2R-ийн сурталчилгааны мужид хэд хэдэн NF-κB-хариу урвал бүхий элементүүд байдаг тул ийм нэмэгдэлтийг дор хаяж хэсэг нь ER стресс, үрэвсэлээр дамжуулж байгаа юм.17, 24] Вэ. Цаашилбал, саяхан хийсэн судалгаагаар TNF-α ба IL-1β нь HFD-ээр тэжээгддэг хулгануудын өөх тосны эдэд DNMT1-ийн түвшин, идэвхжил нэмэгддэг болохыг харуулж байна.25] Вэ. Чухал ач холбогдолтой нь энэхүү судалгаагаар HFD нь өтгөн хаталтанд биш харин гипоталамусын халдварыг илүүд үздэг болохыг харуулж байна. (Зураг. 6) .6). Туршилтын парадигм дахь эд эс, бүс нутаг, талбайн онцлог ДНХ метилляци ба деметилляцийн гүнзгий механизм нь цаашдын судалгааг хүлээх ёстой.
Previous-oryzanol нь хулганад ER-ийн стрессийг гипоталамик зохицуулалт хийснээр HFD-ийн давуу байдлыг бууруулдаг болохыг бидний өмнөх тайлантай хамт харуулав.14], γ-oryzanol нь хоол тэжээлийн зан үйлийн хэт авианы болон бодисын солилцооны дарангуйллыг сайжруулж өвөрмөц шинж чанартай байдаг. Учир нь боловсруулсан антибиотик эмийн зарим эм нь чухал гаж нөлөө үзүүлдэг болохыг мэддэг.8], тархины хөнгөлөлтийн тогтолцоонд суурилсан байгалийн гаралтай хоол хүнс нь хэт таргалалт - чихрийн шижингийн синдромыг аюулгүй эмчлэх шаардлагатай гэж үзэж байна.16] Вэ. Энэхүү парадигмын хувьд or-oryzanol бол эпигенетик модулятор болох өвөрмөц шинж чанартай антибиотикийн ирээдүйтэй нэр дэвшигч юм.
Талархал
Гар бичмэлийг нягталж үзсэнд С.Окамото (Япон улсын Рюкьюсийн их сургууль) талархаж байна. М.Хирата, Х.Канеширо, И.Асато, С.Ногучи (Япон улсын Рюкюусын их сургууль) нар нарийн бичгийн дарга нарт тусламж үзүүлсэнд талархаж байна
Товчилсон
| 5-aza-dC хэмжээтэй | 5-aza-2′-deoxycytidine |
| D1R | Допамин D1 рецептор |
| D2R | Допамин D2 рецептор |
| DAT | Допамин дамжуулагч |
| DNMT | ДНХ метилтрансфераза |
| ER | Эндоплазмын торлог |
| ERR | Эстрогентэй холбоотой рецептор |
| HFD | Өөх тос ихтэй хоолны дэглэм |
| SAH | S-Аденозил-л-гомоцистеин |
| Сам | S-Аденозил метионин |
| STAT3α | 3α дамжуулалтын дохио дамжуулагч ба идэвхжүүлэгч |
| TH | Тирозин гидроксилаза |
тэмдэглэл
Өгөгдлийн хүртээмж
Одоогийн судалгааны явцад бий болсон ба / эсвэл дүн шинжилгээ хийсэн мэдээллийн саналыг үндэслэл бүхий хүсэлтийн дагуу холбогдох зохиогчоос авах боломжтой.
Санхүүжилт
Энэхүү ажлыг Японы Шинжлэх ухааныг дэмжих нийгэмлэгийн буцалтгүй тусламжаар оруулсан (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 ба 24591338), Шинжлэх ухаан, технологи, инновацийн зөвлөл (CSTI), салбар хоорондын стратегийн шинэчлэлийг дэмжих хөтөлбөр (SIP) 'Дараагийн үеийн хөдөө аж ахуй, ойн аж ахуй, загас аж ахуйг бий болгох технологи', Лотте сан, Японы Хэрэглээний энзимологийн сан, Шинэ эрчим хүч, аж үйлдвэрийн технологийг хөгжүүлэх байгууллага (NEDO), Амьдралын шинжлэх ухааны сүлжээг бий болгох төсөл (Эм үйлдвэрлэлийн талбар) ) (Окинава муж, Япон), Окинава мужийн эмнэлгийн кластерийг дэмжих төсөл, Окинава мужаас дэвшилтэт анагаах ухааныг дэмжих төслийн санхүүжилт (Окинава муж, Япон).
Сонирхлын хоёрдмол байдал
Зохиолчид энэхүү гар бичмэлтэй холбоотой хоёрдмол сонирхол байхгүй гэж мэдэгдэв.
Оруулсан мэдэгдэл
CK ба HM судалгааг боловсруулсан. CK, TK нь туршилтыг хийж, өгөгдлийг задлан шинжилжээ. TK, CS-O, CT, MT, MM, KA нь өгөгдлийг тайлбарлахад хувь нэмэр оруулсан. CK, HM нь гар бичмэлийг бичсэн. Бүх зохиогчид өгөгдөл тайлбар хийхэд хувь нэмрээ оруулсан. Бүх зохиогчид гар бичмэлийг шинэчлэн найруулж, эцсийн хувилбарыг нь баталлаа. HM нь энэ ажлын баталгаатай бөгөөд бүх мэдээлэлд бүрэн нэвтрэх эрхтэй бөгөөд мэдээллийн бүрэн бүтэн байдал, өгөгдлийн шинжилгээний үнэн зөв байдалд бүрэн хариуцлага хүлээнэ.
Хөл тэмдэглэл
Цахим нэмэлт материал
Энэ нийтлэлийн онлайн хувилбар (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) нь хянагдсан боловч хянагдаагүй нэмэлт материалыг агуулсан бөгөөд үүнийг эрх бүхий хэрэглэгчдэд ашиглах боломжтой юм.
Ашигласан материал
;