Cdk5 Fosforilati Dopamine D2 Riċettur u Attenwati Is-Sinjalazzjoni Downstream (2013)

Kummenti: Jidher li juri li Cdk5 jikkawża r-regolazzjoni baxxa tar-riċetturi tad-dopamine D2. B'mod tal-għaġeb, il-fattur tat-traduzzjoni deltafosb jinduċi l-produzzjoni ta 'Cdk5.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLoS ONE 8(12): e84482. doi:10.1371/journal.pone.0084482

Astratt

Ir-riċettur tad-dopamina D2 (DRD2) huwa riċettur ewlieni li jimmedja l-funzjonijiet tal-moħħ assoċjati mad-dopamina bħall-burdata, il-premju u l-emozzjoni. Kinase 5 dipendenti fuq iċ-ċiklin (Cdk5) huwa serine/threonine kinase dirett mill-proline li l-funzjoni tiegħu ġiet implikata fiċ-ċirkwit tal-premju tal-moħħ. F'dan l-istudju, aħna żvelaw li r-residwu tas-serine 321 (S321) fit-tielet loop intraċellulari ta 'DRD2 (D2i3) huwa sit regolatorju ġdid ta' Cdk5. Fosforilazzjoni dipendenti fuq Cdk5 ta 'S321 fid-D2i3 kienet osservata fi vitro u sistemi ta' kultura taċ-ċelluli.

Aħna osservajna wkoll li l-fosforilazzjoni ta 'S321 imfixkla l-espressjoni tal-wiċċ stimulata mill-agonist ta' DRD2 u naqqset l-akkoppjar tal-proteini G ma 'DRD2. Barra minn hekk, il-mogħdija tal-cAMP downstream ġiet affettwata fis-sistema eterologa u f'kulturi newronali primarji minn embrijuni knockout p35 x'aktarx minħabba l-attività inibitorja mnaqqsa ta 'DRD2. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 ta 'S321 tinibixxi l-funzjoni DRD2, u tipprovdi mekkaniżmu regolatorju ġdid għas-sinjalar tad-dopamine.

Figuri

Ċitazzjoni: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Riċettur u Attenuates Downstream Signaling. PLoS ONE 8(12): e84482. doi:10.1371/journal.pone.0084482

Editur: James Porter, Università ta’ North Dakota, l-Istati Uniti tal-Amerika

Irċieva: Mejju 20, 2013; Aċċettata: Novembru 14, 2013; Ippubblikat: Diċembru 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Dan huwa artikolu b'aċċess miftuħ imqassam taħt it-termini tal- Liċenzja tal-Attribuzzjoni tal-Commons Creative, li tippermetti użu, distribuzzjoni, u riproduzzjoni bla restrizzjonijiet fi kwalunkwe mezz, sakemm l-awtur u s-sors oriġinali jiġu kkreditati.

Finanzjament: Dan ix-xogħol kien appoġġjat mill-għotjiet (NRF-2012R1A2A2A01012923 u NRF-2012R1A4A1028200) mill-gvern Korean (MSIP) u appoġġjat ukoll taħt il-qafas ta 'programm ta' kooperazzjoni internazzjonali ġestit mill-NRF tal-Korea (2012K2A1A2033117K2031A415A2004 Istitut tar-Riċerka u l-Korea) Programm ta’ Riċerka Bażika tal-MSIP (2006-XNUMX). SKP kien riċevitur tal-Premjijiet għall-Investigaturi Żgħażagħ tal-Alleanza Nazzjonali għar-Riċerka dwar l-Iskizofrenija u d-Depressjoni (NARSAD) tal-XNUMX u l-XNUMX. Il-finanzjaturi ma kellhom l-ebda rwol fid-disinn tal-istudju, il-ġbir u l-analiżi tad-dejta, id-deċiżjoni li jippubblikaw, jew il-preparazzjoni tal-manuskritt.

Interessi kompetittivi: L-awturi ddikjaraw li ma jeżistux interessi kompetittivi.

introduzzjoni

Is-sinjalar tad-dopamina huwa involut f'diversi funzjonijiet tal-moħħ inklużi l-koordinazzjoni tal-mutur, il-kontroll tal-burdata u l-mekkaniżmi ta 'premju [1]. Komponent ewlieni tas-sinjalar tad-dopamina fil-vertebrati huwa eżerċitat minn newroni spini medji strijatali (MSNs) li jesprimu b'mod selettiv subsett ta' riċetturi tad-dopamina u jirċievu input dopaminerġiku prinċipalment miż-żona tegmentali ventrali (VTA) u substantia nigra (SN).) [2]. Ir-riċetturi tad-dopamina huma riċetturi akkoppjati mal-proteini G (GPCR) b'seba' oqsma transmembrane u jikkonsistu f'żewġ sottotipi, Riċetturi bħal D1 u D2, li jimmedjaw azzjonijiet reċiproċi fis-sinjalar tad-dopamina [1]. Pereżempju, riċetturi simili tad-dopamina D1 (D1, D5) jattivaw adenylyl cyclase permezz ta' Gαs u żżid il-livell intraċellulari ta 'cAMP, iżda riċetturi li jixbħu d-dopamina D2 (D2, D3, D4) jinibixxu adenylyl cyclase permezz ta' Gαi u tnaqqas il-livell intraċellulari ta 'cAMP [1], [3].

Fost ir-riċetturi tad-dopamina, ir-riċettur D2 (DRD2) huwa implikat fil-patofiżjoloġija ta’ diversi disturbi psikjatriċi kbar inklużi l-iskiżofrenja u l-vizzju tad-droga. [4], b'tali mod li ħafna mediċini antipsikotiċi mill-inqas jimmiraw parzjalment għal DRD2. Huwa magħruf ukoll li l-attività DRD2 tikkorrelata sew mal-konsegwenzi tal-imġieba tad-drogi tal-abbuż f'mudelli tal-annimali. [5]. L-antidipressanti u l-effikaċja tal-istabbilizzatur tal-burdata ġew ukoll marbuta ma’ alterazzjonijiet fl-espressjoni tal-wiċċ taċ-ċelluli ta’ DRD2 jew sinjalazzjoni intraċellulari downstream medjata minn PKA, ERK u GSK3 [1], [4], [6]. Minkejja dawn ir-rwoli kritiċi għal DRD2 fil-moħħ, il-mekkaniżmi regolatorji dettaljati li jagħtu eteroġeneità u kumplessità lill-proprjetajiet DRD2 mhumiex kompletament mifhuma.

Linji konverġenti ta 'evidenza jindikaw li modifiki multipli ta' wara t-traduzzjoni huma involuti fl-irfinar tal-attività DRD2. Glikosilazzjoni estensiva ta’ DRD2 ġiet żvelata fi studji bikrija ta’ tikkettar ta’ foto-affinità [7], u l-formazzjoni ta 'bonds disulfide fi ħdan DRD2 ġiet identifikata wkoll bħala modifika importanti għall-irbit tal-ligand [8]. Barra minn hekk, siti ta 'fosforilazzjoni ta' DRD2 kienu inizjalment identifikati minn vitro assaġġ b'radjuisotopi, li jipprovdi rotot għal diversi mogħdijiet regolatorji medjati minn diversi kinases [9]. Tabilħaqq, protein kinase C (PKC) jirregola l-mobilizzazzjoni medjata minn DRD2 tal-kalċju intraċellulari u jimmodula l-interazzjoni ta 'DRD2 ma' proteini ċitoskeletali [10]. Il-fosforilazzjoni permezz ta' GPCR kinase 2 (GRK2) tirregola l-mudelli ta' resensitization indotti minn agonisti ta' DRD2 [11].

Kinase 5 dipendenti fuq iċ-ċiklin (Cdk5) huwa serine/threonine kinase dirett lejn il-prolina li għandu attività preferenzjali minħabba l-espressjoni speċifika għall-moħħ tal-attivaturi essenzjali tagħha, p35 u p39 [12]. Cdk5 huwa involut f'diversi proċessi newronali inklużi l-migrazzjoni newronali u l-gwida tal-axon, u l-ġrieden nulli Cdk5 u p35 juru difetti fis-saffi kortikali [13]. Riċentement, intwera li l-fosforilazzjoni ta 'WAVE1 u ephexin minn Cdk5 tirregola l-morfoġenesi tas-sinsla dendritika [14]. Barra minn hekk, Cdk5 jirregola wkoll il-livelli tal-espressjoni tal-wiċċ tar-riċettur NMDA, NR2B, u kurrenti NMDA medjati minn NR2A [15], [16]. Ta 'min jinnota li biċċiet multipli ta' evidenza jissuġġerixxu relazzjoni intima bejn Cdk5 u s-sistema tad-dopamina. Cdk5 phosphorylates tyrosine hydroxylase (TH), jirregola l-istabbiltà tiegħu, u b'hekk iżżomm l-omeostażi dopaminerġika [17]. F'newroni postsinaptiċi, meta r-residwu T75 ta' dopamina u fosfoproteina-32kD regolata mill-AMP ċikliku (DARPP-32) hija fosforilata minn Cdk5, jista' jinibixxi l-attività PKA u b'hekk jantagonizza s-sinjalar PKA medjat mid-dopamina DRD1 [18]. Interessanti, meta l-kokaina, agonist indirett tar-riċetturi tad-dopamina, tiġi amministrata b’mod kroniku fil-firien, l-mRNA u l-livelli ta’ proteina ta’ Cdk5 jiżdiedu fin-newroni tax-xewka medji. [19]. B'mod kollettiv, Cdk5 jidher li huwa involut f'adattamenti sinaptiċi kkaġunati mid-droga. F'dan l-istudju, aħna nuru interazzjoni funzjonali ta 'DRD2 u Cdk5 li testendi aktar ir-rwol ta' Cdk5 fis-sinjalar tad-dopamine.

Materjali u Metodi

Antikorpi

Serums kontra l-fniek tqajmu kontra peptidi li kien fihom phospho-serine 321 (pS321) tat-tielet loop intraċellulari ta 'DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), intuża biex jagħmel kolonna peptide-konjugata għal purifikazzjoni ta 'affinità (20401, PIERCE). Antikorp anti-pS321 kien arrikkit b'sistema ta 'purifikazzjoni affinità wara l-istruzzjoni tal-manifattur. Il-fosfo-antikorp purifikat kien maħżun f'PBS b'0.1% sodium azide u 0.1% ġelatina. Antikorp anti-ġurdien anti-Cdk5 (sc-249) u antikorp anti-fenek anti-p35 (sc-820) intużaw għall-Western blotting u immunocytochemistry ta 'Cdk5/p35. Antikorp kontra l-ġurdien kontra l-GFP (sc-9996) intuża għall-immunopreċipitazzjoni u Western blotting ta 'DRD2-GFP. Antikorp kontra l-fenek kontra l-BANDIERA (sc-807), l-antikorp kontra l-fenek kontra l-HA (sc-805), l-antikorp kontra l-ġrieden kontra l-GST (sc-138), u l-antikorp kontra l-ġrieden kontra l-GAPDH (sc- 32293) inxtraw minn Santa Cruz Biotechnologies.

annimali

Il-ġurdien knockout p35 kien rigal tip minn Dr Katsuhiko Mikoshiba fl-Istitut tax-Xjenza tal-Moħħ RIKEN fil-Ġappun u użat għall-kultura tan-newroni primarji. Settijiet tal-primer għall-ġenotipar kienu 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC u 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT kif deskritt qabel [20]. Ġrieden ICR u firien Sprague Dawley intużaw għall-preparazzjoni tal-lisat tal-moħħ. Il-proċeduri kollha tal-annimali ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università tax-Xjenza u t-Teknoloġija ta 'Pohang.

Kostrutti tal-Plasmid

Intużaw iżoforma twila DRD2 umana f'vettur tal-plażmidu EGFP-N1 u t-tielet loop intraċellulari ta 'DRD2 (212-373 residwi ta' aċidu amminiku inklużi 29 residwi addizzjonali ta 'aċidu amminiku uniċi għal isoforma twila DRD2) f'vettur tal-plażmidu pFLAG-CMV-2. Cdk5 uman ġie mdaħħal f'vettur tal-plażmidu pCMV-HA u p35 uman ġie mdaħħal f'vettur tal-plasmid pcDNA 3.1. Cdk5 uman ġie mdaħħal taħt promotur ta 'cytomegalovirus (CMV) flimkien ma' p35 uman f'vettur pcDNA 3.1 biex jagħmel kostruzzjoni ta 'espressjoni doppja (Cdk5/p35) għall-immunoċitokimika, assaġġ ta' internalizzazzjoni tar-riċetturi, [35S]-GTPγAssaġġ tal-irbit S, analiżi tal-irbit tar-radjuligand u immunoassay tal-enżima cAMP.

In Vitro Kinase Assay

Konness mal-IP vitro assay kinase sar kif ġej. Moħħ sħiħ tal-ġurdien ġie lysed fi 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) b'20 puplesija ta 'omoġenizzatur Dounce biex tikseb moħħ omoġenizzat. . Il-lysates ġew inkubati fuq is-silġ għal 30 minuta, ivvibrati, u ċentrifugati f'16,000 × g għal 10 min. Is-supernatanti ġew immunoprecipitati b'antikorp anti-fenek anti-p35 biex jinkiseb kumpless Cdk5/p35 attiv. Proteina tal-fużjoni GST kumplessa u purifikata Cdk5/p35 tħallat ma 'adenosine 5′-triposphate, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) u inkubati f'kinase buffer (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) għal siegħa f'temperatura tal-kamra [18], [21]. Il-kumpless Cdk5/p25 purifikat (14–516, Millipore) intuża wkoll għal vitro kinase assay kif deskritt hawn fuq. Il-buffer tat-tagħbija tal-kampjun 2 × ġie miżjud mat-taħlita ta 'reazzjoni u mgħollija f'100 ° C. Il-kampjuni mbagħad ġew soġġetti għal SDS-PAGE u l-ġel imnixxef ġie vvalutat bl-awtoradjografija.

Kromatografija Likwida (LC)-Spettrometrija tal-Massa (MS)/MS Analiżi

Il-proteina GST-D2i3 rikombinanti ġiet analizzata b'LC-MS/MS wara IP-linked vitro assaġġ tal-kinażi. Aħna wettaqna identifikazzjoni tal-peptidi tad-dejta LC-MS/MS bl-użu ta 'X!!Tandem (verżjoni Diċ-01-2008). Kull fajl tad-dejta RAW l-ewwel ġie kkonvertit għal mzXML bl-użu tal-pipeline trans-proteomic (TPP; verżjoni 4.3). MS/MS scans fl-mzXMLs konvertiti mbagħad ġew soġġetti għal tfittxija kontra d-database tas-sekwenza tal-proteini tal-ġurdien UniProt (rilaxx 2010_07) inkluża s-sekwenza GST-D2i3 bl-użu ta 'X!!Tandem. It-tolleranza ġiet issettjata għal 3 Da għal jonji prekursuri u 2 Da għal jonji frammentati. Intużat l-ispeċifiċità ta' l-enzima għat-trypsin. Intużaw għażliet ta 'modifika varjabbli għall-karbamidomethylation ta' cysteine ​​(57.021 Da), l-ossidazzjoni ta 'methionine (15.995 Da), l-idrolisi ta' asparagine (0.987 Da) u l-fosforilazzjoni ta 'serine (79.966 Da).

Immunopreċipitazzjoni

Twettqet immunopreċipitazzjoni fuq lisati taċ-ċelluli fil-buffer tal-liżi ELB. Antikorp anti-GFP ġie miżjud mal-lysates u inkubat għal 3 sigħat f'4 ° C. L-immunokumplessi ġew ippurifikati bl-użu ta 'proteina-A agarose. Il-preċipitati ġew inkubati b'buffer tat-tagħbija tal-kampjun SDS għal 30 min f'37 ° C, u soġġetti għal SDS-PAGE u Western blots.

GST Pull-down Assay

10 µg ta 'GST purifikat u GST-D2i3 ġew inkubati b'lisat tal-moħħ tal-firien għal 1.5 sigħat f'4 ° C. Ġew miżjuda 30 µL ta' żibeġ Sepharose 4B konjugati bil-glutathione (GSH) (17-0756-01, GE Healthcare) ekwilibrati b'liżi buffer u ġew inkubati għal siegħa addizzjonali. Żibeġ inġabru permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'1 ×g u laħlaħ b'lysis buffer 4 darbiet [22], [23]. Il-preċipitati ġew analizzati permezz ta 'Western blotting bl-użu ta' antikorpi anti-Cdk5 u anti-p35.

Immunoċitokimika

Ċelloli HEK 293 trasfettati u newroni strijatali kkultivati ​​fuq coverslips ġew maħsula darba b'salina buffered phosphate (PBS) u ffissati b'immersjoni f'4% paraformaldehyde / PBS kiesaħ għal 30 min. Antikorp primarju ġie dilwit fis-soluzzjoni ta 'imblukkar (2% serum taż-żwiemel u 1% Triton X-100 f'PBS). Antikorp anti-ġurdien konjugat Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) u antikorp anti-fenek konjugat Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) intużaw bħala antikorpi sekondarji. Hoechst intużaw għat-tbajja tan-nukleu. Immaġini nkisbu permezz ta 'mikroskopija konfokali (Olympus, FluoView-1000).

Assaġġ ta' Internalizzazzjoni tar-Riċetturi

24 siegħa wara t-trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'1 µM quinpirole (Q102, Sigma) għal 30 min u 90 min f'37 ° C. Iċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid f'2 mL PBS kiesaħ u 200 µL alikwoti ġew użati għal kull reazzjoni. It-trattamenti tad-droga saru f'temperatura tal-kamra għal 3 sigħat fil-konċentrazzjonijiet li ġejjin; 3 nM [3H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 µM sulpiride (895, TOCRIS), 10 µM haloperidol (H1512, Sigma). Idrofobiku [3H]-spiperone intuża biex jittikketta r-riċetturi totali espressi u sulpiride idrofiliku ntuża biex jissostitwixxi riċettur membranuż marbut [3Sinjali H]-spiperone. Is-sinjali tar-riċetturi assoċjati mal-membrana ġew ikkalkulati billi jitnaqqsu l-valuri tar-riċetturi intraċellulari mill-valuri totali espressi tar-riċetturi. Iċ-ċelloli ġew iffiltrati fuq filtru GF/B (Millipore) u maħsula 3 darbiet b'buffer tal-ħasil (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Il-filtri ġew imnixxfa u r-radjuattività residwa ġiet imkejla bl-użu ta 'counter ta' tpetpet likwidu [24].

Preparazzjoni tal-Membrana taċ-Ċellola

Ċelloli konfluwenti f'platti tal-kultura ta' 100 mm wara t-trasfezzjoni ġew maħsula b'PBS kiesaħ bis-silġ u maħsuda f'1 mL HME buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Lisati omoġenizzati ġew ċentrifugati b'500 × g għal 15-il minuta u s-supernatanti ġew sussegwentement ċentrifugati b'36,000 × g għal 30 min. Pellets sospiżi mill-ġdid fil-buffer HME ġew użati għall-analiżi.

[35S]-GTPγS Assaġġ tal-Irbit

Il-frazzjonijiet tal-membrana taċ-ċelluli ġew inkubati minn qabel b'1 µM quinpirole (Q102, Sigma) fil-buffer tal-assaġġ (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA u 0.01 mM GDP) għal 10 min. [35S]-GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) ġie miżjud mal-konċentrazzjoni finali ta '3 nM fi 30 µL u inkubat aktar għal 90 min. 170 µL ta' buffer kiesaħ bis-silġ (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, u 0.1 mM GTP) ġie miżjud biex iwaqqaf ir-reazzjoni. Il-membrani ġew iffiltrati fuq filtru GF/B (Millipore) u maħsula 3 darbiet b'buffer tal-ħasil (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Il-filtri ġew imnixxfa u r-radjuattività ġiet imkejla bl-użu tal-counter ta' tpetpet [25], [26].

Assaġġ tal-Irbit tar-Radjuligand

Membrani taċ-ċelluli ppreparati ġew inkubati b'0.01 nM [3H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer) u konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta' quinpirole (Q102, Sigma) għal 30 min fil-buffer tal-assaġġ (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Il-membrani ġew iffiltrati fuq filtru GF/B (Millipore) u maħsula 3 darbiet b'buffer tal-ħasil (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Ir-reazzjoni ġiet mitmuma b'filtrazzjoni rapida permezz ta' filtri GF/C. Ir-radjuattività residwa ġiet imkejla bl-użu ta' counter ta' tpetpet likwidu [27]-[29].

cAMP Enżima Immunoassay

Ċelloli HEK 293 trasfettati ġew ittrattati minn qabel b'10 µM rolipram (R6520, Sigma) għal siegħa, u mbagħad ittrattati b'1 µM forskolin (F0.1, Sigma) u konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta 'quinpirole (Q6886, Sigma) għal 102 min. Newroni strijatali kkultivati ​​primarji ġew ittrattati b'30 µM rolipram għal siegħa, u mbagħad 10 µM dopamine għal siegħa [22]. Lisati taċ-ċelluli ġew ippreparati b'0.1 M HCl u l-livelli ta 'cAMP ġew skoperti permezz ta' kit ta 'immunoassay ta' enzima cAMP (Sapphire Bioscience) wara l-istruzzjoni tal-manifattur.

Neuron Striatal Kulturat Primarju

Iż-żona striatali kienet iżolata mill-moħħ embrijoniku tal-ġurdien (E15). Tessut dissettjat kien dissoċjat f'medja essenzjali minima (MEM) (11095, Invitrogen) li kien fih 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) u 0.1% DNase I għal 6 min f'37 ° C. Iċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid fil-midja tal-kisi (MEM b'0.01 M HEPES (pH 7.4) u 10% (vol/vol) serum taż-żiemel (16050-122, GIBCO)). In-newroni ġew ikkultivati ​​għal 7 ijiem vitro (DIV 7) f'MEM b'suppliment B27 (17504-044, Invitrogen) qabel ma jiġi applikat għal immunoassays tal-enżimi cAMP.

Riżultati

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 fit-Tielet Loop Intraċellulari ta' DRD2 vitro

Biex nidentifikaw sottostrati ġodda ta' Cdk5, għamilna tfittxija sistematika bl-użu ta' (S/T)PX(K/H/R) bħala s-sekwenzi ta' kunsens ta' rikonoxximent Cdk5. [30] u identifikat DRD2 bħala sottostrat kandidat. Is-sekwenza ta' kunsens, inkluża serine 321, tinsab fit-tielet loop intraċellulari ta' DRD2 (D2i3) fejn ġew implikati diversi mekkaniżmi regolatorji [3], [10], [11]. Is-sekwenza hija kkonservata b'mod evoluttiv f'DRD2 fil-vertebrati, li timplika importanza funzjonali tar-residwu (Fig. 1A).

thumbnail

Figura 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 fit-tielet loop intraċellulari ta 'DRD2 in vitro.

(A) Allinjament ta 'sekwenza ta' aċidi amminiċi li juri reġjuni kkonservati tad-DRD2 minn speċi varji (sfumaturi). Is-sit potenzjali ta' fosforilazzjoni ta' Cdk5 huwa indikat b'asterisk. (B) Konness mal-IP vitro kinase assay bi proteini mutanti GST-D2i3 u GST-D2i3 rikombinanti. Il-kumpless Cdk5/p35 arrikkit minn estratt tal-moħħ tal-ġurdien permezz ta 'immunoprecipitation anti-p35 intuża għal reazzjonijiet kinase. Awtoradjografu ta 'proteini fosforilati huwa muri flimkien ma' Coomassie tbajja blu brillanti ta 'l-istess ġel. Arrowhead tindika sinjal radjuattiv li jikkorrispondi għal GST-D2i3s u arrowhead miftuħa tindika sinjali radjuattivi minn p35. (C) Spettru MS/MS tal-framment tal-peptide fosforilat ta 'D2i3. Il-mudelli teoretiċi ta 'frammentazzjoni huma murija taħt l-ispettru. Fost il-joni tal-frammenti kollha, il-jonji y- u b misjuba huma indikati fl-ispettru. Il-y6 u y7 joni jindikaw bil-qawwa l-fosforilazzjoni tas-serine 321. (D) In vitro assay kinase b'kumpless purifikat Cdk5/GST-p25 bl-użu ta 'proteini mutanti GST-D2i3 u GST-D2i3. Proteini fosforilati ġew murija f'awtoradjografu, flimkien ma 'Coomassie tbajja blu brillanti. Arrowhead tindika sinjal radjuattiv li jikkorrispondi GST-D2i3 u arrowhead miftuħa tindika sinjali radjuattivi minn GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Biex nevalwaw il-kapaċità ta 'Cdk5 li fosforilata D2i3, għamilna IP-linked vitro Assays kinase bl-użu ta 'kumpless Cdk5/p35 attiv arrikkit minn lisat tal-moħħ tal-ġurdien permezz ta' immunopreċipitazzjoni p35 b'proteini GST-D2i3 rikombinanti purifikati (residwi amino acids 212-373) bħala sottostrati. Aħna osservajna sinjali ta 'fosforilazzjoni fil-proteini purifikati GST-D2i3 u GST-D2i3 S297A, iżda s-sinjal naqas b'mod sinifikanti bl-użu ta' GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Biex nivverifikaw aktar il-fosforilazzjoni tas-serine 321 fil-GST-D2i3, għamilna analiżi LC-MS/MS tal-kampjuni minn IP-linked vitro assays kinase bl-użu ta' spettrometrija tal-massa LTQ XL. B'mod konsistenti, il-fosfo-peptidi li jikkorrispondu mal-massa tal-fosfo-serine 321 peptidi ġew irkuprati (Fig. 1C). Meta wieħed iqis li l-akkwist li jiddependi mid-dejta waqt l-analiżi LC-MS/MS għandu tendenza li jikxef proteini abbundanti fil-kampjun [31], din id-dejta tissuġġerixxi li r-residwu tas-serine 321 huwa s-sit dominanti ta 'fosforilazzjoni ta' Cdk5 fir-reġjun D2i3. Biex tipprova fosforilazzjoni diretta tas-serine 321 fil-GST-D2i3 minn Cdk5, vitro Twettaq assay kinase bl-użu ta 'kumpless Cdk5/GST-p25 purifikat ma' proteini GST-D2i3 rikombinanti purifikat. Aħna identifikajna sinjal ta 'fosforilazzjoni sinifikanti fil-GST-D2i3 li kien assenti fil-GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jindikaw li r-residwu D2i3 S321 huwa mira preferenzjali għal fosforilazzjoni medjata minn Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 fit-Tielet Loop Intraċellulari ta' DRD2 fiċ-Ċelloli

Biex tidentifika l-fosforilazzjoni ta 'serine 321, qajjajna antikorp speċifiku għal fosfo-serine 321 (pS321). Kampjuni mill-IP-linked vitro kinase assay ġew analizzati minn Western blotting bl-użu ta 'antikorp anti-pS321. Blots wrew medda distinta fir-reazzjoni tal-kinażi li kienet dipendenti fuq GST-D2i3 (Fig. 2A). Biex tivverifika l-fosforilazzjoni potenzjali ta 'serine 321 f'DRD2 minn Cdk5 fiċ-ċelloli, immunoprecipitati anti-GFP minn ċelloli HEK 293 li jesprimu DRD2-GFP u DRD2 S321A-GFP bi jew mingħajr HA-Cdk5 u p35 ġew analizzati permezz ta' Western blotting bl-użu ta 'anti-GFP u antikorpi kontra pS321. Sinjali karatteristiċi tal-banda smeared minn antikorp anti-GFP li huma magħrufa li huma dovuti għal glycosylation eċċessiv ta 'DRD2 huma osservati biss fil-preżenza ta' DRD2-GFP, u antikorp anti-pS321 skopra sinjali DRD2 simili biss b'koespressjoni Cdk5/p35 (Fig. 2B) [7]. Biex tivverifika aktar il-fosforilazzjoni ta 'serine 321 minn Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) u forma mutanti ta' D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) ġew iġġenerati. FLAG-D2i3 u FLAG-D2i3 S321A espressi bi jew mingħajr HA-Cdk5 u p35 fiċ-ċelloli HEK 293 ġew analizzati permezz ta 'assaġġ ta' bidla tal-mobilità SDS-gel. Ġiet osservata bidla sinifikanti fil-mobilità dipendenti fuq Cdk5 għal FLAG-D2i3, iżda mhux għal FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Aħna vvalutajna wkoll il-livell ta 'fosforilazzjoni ta' DRD2 f'Ser321 fuq stimulazzjoni agonista. Iċ-ċelloli HEK 293 li jesprimu l-kumpless DRD2-GFP u Cdk5/p35 ġew stimulati minn quinpirole, u immunoprecipitates anti-GFP mill-lysates taċ-ċelluli ġew analizzati permezz ta 'Western blotting bl-użu ta' anti-GFP u anti-pS321 antikorpi. Sibna li l-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 ta 'DRD2 f'Ser321 ma kinitx affettwata minn stimulazzjoni agonista, li tidher differenti minn fosforilazzjoni medjata minn GRK u PKC (Fig. 2D) [32], [33]. Flimkien, dawn ir-riżultati jindikaw li Cdk5 jista 'fosforila r-residwu tas-serine 321 ta' DRD2 fl-ambjent ċellulari.

thumbnail

Figura 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 fit-tielet loop intraċellulari ta 'DRD2 fiċ-ċelloli.

Il-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 tas-serine 321 ġiet analizzata bl-użu ta 'antikorp anti-pS321. (A) Kampjuni minn IP-linked vitro assay kinase bl-użu ta 'proteini GST-D2i3 ġew analizzati permezz ta' Western blotting (WB) b'antikorpi indikati. Arrowheads jindikaw GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP u DRD2 S321A-GFP ġew espressi bi jew mingħajr HA-Cdk5 u p35 f'ċelloli HEK 293. L-immunoprecipitati anti-GFP ġew analizzati permezz ta 'Western blotting bl-użu ta' antikorpi anti-GFP u anti-pS321. Il-parentesi tindika sinjali DRD2 u arrowhead miftuħa tindika sinjali mhux speċifiċi mill-immunoprecipitati anti-GFP. '% input' huwa % volum ta' lisat totali għal reazzjoni IP. Sinjali Cdk5 endoġeni dgħajfa kienu indikati b'asterisks. (C) Assaġġ tal-bidla tal-mobilità tal-ġel. Iċ-ċelloli HEK 293 trasfettati kif indikat ġew analizzati permezz ta' Western blotting. (D) Ċelloli HEK 293 trasfettati ġew ittrattati b'quinpirole u immunoprecipitati anti-GFP ġew analizzati permezz ta 'Western blotting b'antikorpi anti-GFP u anti-pS321. Il-vleġġa miftuħa tindika sinjali mhux speċifiċi minn immunoprecipitati anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5/p35 Complex u DRD2 huma Assoċjati Fiżikament

Aħna investigajna l-interazzjoni fiżika potenzjali bejn il-kumpless Cdk5/p35 u DRD2 minħabba li ħafna sottostrati Cdk5 huma magħrufa li huma assoċjati fiżikament mal-kumpless Cdk5/p35 [23], [34], [35]. L-ewwel, l-esperiment GST pull-down sar. Proteina GST-D2i3 rikombinanti purifikata ġiet inkubata b'lisat tal-moħħ tal-firien u l-preċipitati pull-down GST ġew analizzati għal Western blotting. Kif muri fi Fig. 3A, Cdk5 u p35 endoġeni ġew identifikati fil-preċipitati pull-down, li jindika interazzjoni fiżika bejn DRD2 u l-kumpless Cdk5/p35 (Fig. 3A). Barra minn hekk, HA-Cdk5 u p35 ġew skoperti fl-immunoprecipitati anti-GFP minn lisati taċ-ċelluli HEK 293 li jesprimu DRD2-GFP u Cdk5/p35 (Fig. 3B). Barra minn hekk, wettaqna analiżi immunoċitokimiċi u osservajna li DRD2-GFP, HA-Cdk5 u p35 juru sinjali sinifikanti ta’ ko-lokalizzazzjoni fiż-żona membranuża taċ-ċelloli HEK 293 (Fig. 3C, pannelli ta’ fuq). Aħna investigajna wkoll il-ko-lokalizzazzjoni ta 'DRD2 u Cdk5/p35 fil-kuntest newronali. B'mod konsistenti, DRD2-GFP wera wkoll ko-lokalizzazzjoni sinifikanti ma' Cdk5 u p35 endoġenu fin-newroni strijatali kkultivati ​​(DIV7), li jappoġġjaw aktar rabtiet funzjonali bejn DRD2 u Cdk5/p35 (Fig. 3C, pannelli tal-qiegħ). Ir-riżultati jindikaw li DRD2 u Cdk5/p35 jistgħu jiffurmaw kumpless u għalhekk, jappoġġjaw il-kunċett li DRD2 huwa sottostrat fiżjoloġiku ta 'Cdk5.

thumbnail

Figura 3. Cdk5/p35 jistgħu jiffurmaw kumpless ma DRD2.

(A) GST pull-down assay bl-użu ta 'proteina GST-D2i3 rikombinanti purifikata b'estratt tal-moħħ tal-firien. Il-preċipitati pull-down tal-GST ġew soġġetti għal analiżi tal-Western blotting. 'Xoffa' tindika l-preċipitat pull-down mingħajr proteini GST. (B) Immunopreċipitazzjoni tal-kumpless DRD2 u Cdk5/p35. Anti-GFP IP minn lysates minn ċelluli trasfettati ġew soġġetti għal analiżi ta 'Western blotting. Il-parentesi tindika sinjali DRD2 u arrowhead miftuħa tindika sinjali mhux speċifiċi mill-immunoprecipitati anti-GFP. Blot esposta żżejjed għall-inputs tidher ukoll fil-lemin. (C) Analiżi immunoċitokimiċi ta 'DRD2 u Cdk5/p35. Iċ-ċelloli HEK 293 li jesprimu DRD2-GFP u Cdk5/p35 kienu mtebbgħin b'antikorpi anti-Cdk5 u anti-p35 (Panewijiet ta 'fuq). DRD2-GFP ġie espress waħdu fin-newroni strijatali kkultivati ​​u mtebba b'antikorpi anti-Cdk5 u anti-p35 (Panewijiet ta' isfel). Hoechst intużaw għat-tbajja tan-nukleu. Il-bar tal-iskala hija 5 µm. L-immaġini kollha nkisbu bl-użu ta 'mikroskopija konfokali (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 ta 'DRD2 Tattenwa l-Attività tar-Riċetturi

Ġie rrappurtat li l-fosforilazzjoni timmodula proprjetajiet kritiċi tal-GPCRs bħall-akkoppjar tal-proteini G, l-internalizzazzjoni tar-riċetturi, il-lokalizzazzjoni intraċellulari, u l-assoċjazzjoni ma 'proteini modulaturi [9], [11], [24]. AL-internalizzazzjoni tar-riċettur indotta minn gonisti hija proċess regolatorju kritiku tat-trasduzzjoni tas-sinjali. Aħna investigajna l-modulazzjoni medjata minn Cdk5 tal-internalizzazzjoni DRD2. Ċelloli HEK 293 li jesprimu DRD2-GFP u DRD2 S321A-GFP bi jew mingħajr Cdk5/p35 ġew inkubati b'1 µM quinpirole biex jinduċu internalizzazzjoni DRD2 stimulata mill-agonist (Fig. 4A). [3Sinjali H]-spiperone ta 'ċelluli li jesprimu DRD2-GFP tnaqqsu b'mod sinifikanti fi trattament ta' quinpirole ta '30 min u rkuprati f'90 min. Interessanti, [3Is-sinjali H]-spiperone taċ-ċelloli li jesprimu DRD2-GFP u Cdk5/p35 tnaqqsu wkoll fi trattament ta' quinpirole ta' 30 min iżda ma rkuprawx f'90 min (Fig. 4A, it-tieni taqsima). Minn naha l-ohra, [3Sinjali H]-spiperone ta 'ċelloli li jesprimu DRD2 S321A-GFP tnaqqsu fi 30 min u rkuprati f'90 min, irrispettivament mill-ko-espressjoni ma' Cdk5/p35. Studji preċedenti wrew li d-DRD2 internalizzat jirriċikla lura lejn il-membrana tal-plażma wara stimulazzjoni agonista fit-tul. [11]. Thus jidher li l-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 ta 'DRD2 hija involuta fil-proċessi ta' resensitization wara l-internalizzazzjoni DRD2 indotta minn agonist.

thumbnail

Figura 4. Il-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 tattenwa l-espressjoni tal-wiċċ DRD2 u s-sinjalar downstream.

(A) Espressjoni tal-wiċċ DRD2 imkejla minn [3Assaġġ tal-irbit tal-H]-spiperone. Ċelloli HEK293 trasfettati ġew stimulati b'1 µM quinpirole għaż-żmien indikat u maħsuda, segwiti minn 3 nM [3Trattament ta 'H]-spiperone għal 3 sigħat. Ir-radjuattività ġiet imkejla u s-sinjali tal-wiċċ ġew ikkalkulati. Il-vireg tal-iżball jirrappreżentaw il-medja ± SE (n = 8; *p<0.05, **p<0.01; One-way ANOVA bit-test Dunnett post hoc: qabbel il-kolonni kollha vs kolonna ta 'kontroll). (B) [35S]-GTPγS assaġġ tal-irbit. Il-membrani taċ-ċelluli ġew ippreparati miċ-ċelloli trasfettati kif indikat. Il-preparazzjonijiet tal-membrana ġew inkubati b'1 µM quinpirole segwit minn 3 nM [35S]-GTPγS għal 90 min. Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± SE (n = 8; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; One-way ANOVA bit-test Bonferroni post hoc: qabbel il-pari kollha ta 'kolonni). (C) Kompetizzjoni ta' Quinpirole [3Assaġġ tal-irbit tal-H]-spiperone. Preparazzjonijiet tal-membrana minn ċelluli trasfettati ġew inkubati b'0.01 nM [3H]-spiperone u konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta' quinpirole għal 30 min. Rigressjoni mhux lineari nkisbet minn GraphPad. Il-vireg tal-iżball jindikaw il-medja ± SE (n = 3). (D) immunoassaġġi tal-enżimi cAMP f'ċelloli HEK 293 trasfettati. Ċelloli trasfettati ġew ittrattati minn qabel b'10 µM rolipram għal siegħa, u sussegwentement kotrattati b'1 µM forskolin u żieda fil-konċentrazzjonijiet ta 'quinpirole għal 0.1 min. Rigressjoni mhux lineari nkisbet minn GraphPad. Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± SE (n = 30; **p<4; b'żewġ denbu) t-testijiet). (E) Newroni strijatali kkultivati ​​minn embrijuni knockout tat-tip selvaġġ u p35 (DIV 7) ġew ittrattati b'10 µM rolipram għal siegħa segwit minn 1 µM dopamine għal siegħa. Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± SE (n = 1; **p<0.01; żewġ denbu t-testijiet).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Aħna evalwajna ulterjorment bidla potenzjali ta 'akkoppjar tal-proteina G stimulata mill-agonist għal DRD2 assoċjat ma' fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 bl-użu [35S]-GTPγS assaġġ tal-irbit [25], [26]. DRD2-GFP u DRD2 S321A-GFP bi jew mingħajr Cdk5/p35 ġew espressi f'ċelloli HEK 293. Il-membrani ġew ippreparati u stimulati b'1 µM quinpirole u aktar permessi [35S]-GTPγS inkorporazzjoni. DRD2-GFP u membrana taċ-ċelluli li jesprimu Cdk5/p35 wrew indeboliment sinifikanti [35S]-GTPγS rbit meta mqabbel mal-membrani taċ-ċelluli l-oħra kollha (Fig. 4B). Dawn ir-riżultati jindikaw li l-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 tirregola 'l isfel l-irbit tal-proteina G stimulata mill-agonist f'DRD2.

Barra minn hekk, li jikkompeti għall-quinpirole [3Twettqu analiżi tal-irbit ta' H]-spiperone biex tiġi investigata kwalunkwe bidla potenzjali fl-affinità tal-agonist f'DRD2 permezz ta' fosforilazzjoni medjata minn Cdk5. Irbit kompetittiv ta' [3Tkejjel H]-spiperone fuq trattament ta 'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta' quinpirole għall-preparazzjoni tal-membrana minn trasfettat. Irbit li jikkompetu ta' quinpirole u [3H]-spiperone f'DRD2-GFP u DRD2 S321A-GFP għamlu logK similii valuri (-9.789 għal DRD2-GFP; -9.691 għal DRD2 S321A-GFP), li jindika li l-affinità tal-ligand għal DRD2 mhix affettwata b'mod sinifikanti minn fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 f'DRD2 (Fig. 4C).

Il-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 tirregola 'l isfel il-Pathway ta' Sinjali DRD2-cAMP

Sussegwentement, investigajna jekk il-modifika ta 'DRD2 minn Cdk5 taffettwax mogħdijiet ta' sinjalazzjoni downstream. Aħna mmonitorjajna l-inibizzjoni medjata minn DRD2 tal-produzzjoni ta 'cAMP stimulata minn forskolin minn adenylyl cyclase fiċ-ċelloli li jesprimu DRD2-GFP u DRD2 S321A-GFP bl-użu ta' immunoassay ta 'enżima cAMP. Iċ-ċelloli li jesprimu DRD2 wrew livelli mnaqqsa ta' cAMP b'rispons għal quinpirole b'mod dipendenti mid-doża. B'mod notevoli, il-ko-espressjoni ta 'Cdk5/p35 naqqset b'mod sinifikanti l-inibizzjoni massima tal-formazzjoni ta' cAMP (Fig. 4D, panel tax-xellug). Min-naħa l-oħra, fiċ-ċelloli li jesprimu DRD2 S321A-GFP, il-formazzjonijiet cAMP ġew inibiti b'mod effettiv b'reazzjoni għat-trattament ta 'quinpirole irrispettivament mill-espressjoni ta' Cdk5/p35 (Fig. 4D, panel tal-lemin). Dawn ir-riżultati jindikaw li l-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 ta 'DRD2 tattenwa l-attività inibitorja ta' DRD2 fuq il-mogħdija ta 'sinjalazzjoni downstream cAMP. Biex nikkonfermaw aktar il-fenomeni f'ambjent aktar fiżjoloġikament rilevanti, għamilna użu ta 'newroni kkultivati ​​primarji minn embrijuni knockout defiċjenti f'p35, attivatur essenzjali ta' Cdk5. In-newroni strijatali kkultivati ​​primarji ġew ittrattati b'1 µM dopamine u analizzati b'immunoassay tal-enżima cAMP. Newroni minn ġrieden knockout p35 urew livelli mnaqqsa ta’ cAMP meta mqabbla ma’ newroni ta’ tip selvaġġ meta stimulati bid-dopamina (Fig. 4E). Tflimkien, aħna kkonkludejna li l-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 ta 'DRD2 tirriżulta fi tnaqqis fit-ton inibitorju fuq il-mogħdija tal-cAMP eżerċitata minn DRD2.

Diskussjoni

Aħna identifikajna DRD2 bħala sottostrat ġdid ta 'Cdk5. Il-fosforilazzjoni tidher li tirregola 'l isfel l-espressjoni tal-wiċċ DRD2 billi taffettwa d-destin ta' DRD2 wara l-internalizzazzjoni tar-riċettur u b'hekk tnaqqas DRD2 Gi-coupling u downstream cAMP mogħdija. Peress li r-residwu tal-fosforilazzjoni S321 jeżisti kemm f'isoformi twal u qosra DRD2, il-mekkaniżmu propost f'dan l-istudju jista' jkun mod ġenerali ta' regolazzjoni fis-sinjalar medjat minn DRD2.

DRD2 fin-newroni tax-xewka medji mhux biss tqies bħala sottotip ewlieni tar-riċettur tad-dopamina iżda ġie wkoll rikonoxxut għas-suxxettibilità tiegħu għal bidliet fid-disponibbiltà b'reazzjoni għal stimuli ambjentali. Id-desensibilizzazzjoni u r-risensitizzazzjoni ta' DRD2 indotta minn agonisti ġew studjati b'mod estensiv [11], [24]. B'mod partikolari, numru ta 'studji wrew li l-effetti ta' espożizzjoni kronika ta 'psikostimulanti, bħall-kokaina u l-amfetamina, li jgħollu l-livell extraċellulari ta' dopamina fis-sinapsi strijatali, huma akkumpanjati minn bidliet dinamiċi ta 'DRD2 postsinaptikament. [36]. Tabilħaqq, l-utenti kroniċi tal-kokaina huma magħrufa li naqqsu l-livelli ta’ DRD2 fiż-żona strijatali, u d-disponibbiltà ta’ DRD2 fin-nukleu accumbens (NAcc) turi korrelazzjoni negattiva mal-imgieba ta’ tiftix u rinfurzar tad-droga fil-ġrieden u l-primati. [37]-[39]. Dawn is-sejbiet jindikaw li l-funzjonalità tad-DRD2 hija suxxettibbli ħafna għal regolazzjoni adattiva jew kumpensatorja b'reazzjoni għal diversi stimuli inkluż esponiment kroniku għall-mediċina. Ir-riżultati tagħna juru li r-residwu S321 fit-tielet loop intraċellulari ta 'DRD2 jista' jiġi fosforilat minn Cdk5, li jirriżulta fi tnaqqis fl-influwenza inibitorja ta 'DRD2 fuq il-mogħdija tal-cAMP. Din l-interazzjoni tipproponi mekkaniżmu regolatorju ġdid assoċjat ma 'Cdk5 fin-newroni dopaminoċettivi li jista' jkun marbut man-natura dinamika tad-disponibbiltà tal-wiċċ DRD2.

Għandu jiġi nnutat li Cdk5 huwa magħruf li huwa komponent ewlieni fil-medjazzjoni tal-bidliet adattivi tal-ambjent newronali. Per eżempju, alterazzjonijiet strutturali u funzjonali ta 'spina dendritika fin-newroni taċ-ċirkwit limbic huma waħda mill-konsegwenzi ta' espożizzjoni ripetuta ta 'psikostimulanti. [40]. Dawn il-bidliet huma akkumpanjati minn diversi bidliet molekulari inkluż l-induzzjoni ta’ proteina li torbot l-element tar-rispons cAMP (CREB) u ΔFosB, fatturi ta’ traskrizzjoni li juru regolamentazzjoni dejjiema b’reazzjoni għall-amministrazzjoni kronika tal-kokaina. [41], [42]. Importanti, Cdk5 huwa mira ta 'ΔFosB [19], u ħafna komponenti kritiċi involuti fid-dinamika tas-sinsla dendritika, bħal PSD-95, kinase attivat minn p21 (PAK), β-catenin, u spinophilin, ġew irrappurtati bħala sottostrati Cdk5 [43]-[46]. B'mod konsistenti, il-manipulazzjonijiet ġenetiċi jew farmakoloġiċi tal-attività Cdk5 iġibu tibdil fil-morfoloġija tas-sinsla dendritika u r-risponsi tal-imġieba għall-kokaina, li jimplikaw rwoli kritiċi għal Cdk5 fil-bidliet molekulari u morfoloġiċi taċ-ċirkwiti mesolimbiċi tad-dopamina. [47], [48]. Ir-riżultati tagħna li juru li DRD2 hija mira ġdida ta’ Cdk5 tipprovdi għarfien addizzjonali dwar il-bidliet adattivi tas-sistema tad-dopamina b’reazzjoni għal espożizzjonijiet kroniċi tad-droga minħabba r-regolazzjoni sussegwenti ta’ Cdk5 medjata minn ΔFosB tista’ twassal għal żieda tonika fil-fosforilazzjoni ta’ DRD2. . Barra minn hekk, DRD2 huwa magħruf li jaffettwa bosta proċessi ċellulari, inkluża r-regolamentazzjoni tal-mogħdijiet ta’ cAMP u MAP kinase u avvenimenti ta’ traskrizzjoni downstream. [42], [49]. Għalhekk, is-sejbiet f'dan l-istudju jistgħu mhux biss juru regolamentazzjoni diretta ta 'DRD2 minn Cdk5 iżda wkoll jipprovdu ħarsa ġdida dwar ir-risponsi adattivi tas-sistema tad-dopamina għall-espożizzjoni kronika tad-droga.

Kontribuzzjonijiet tal-Awtur

Ikkonċeput u ddisinjat l-esperimenti: JJ YUP DH SKP. Għamel l-esperimenti: JJ YUP DKK YK. Analizzat id-dejta: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reaġenti/materjali/għodod ta' analiżi kkontribwew: YHS. Kiteb il-karta: JJ SKP.

Referenzi

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Riċetturi tad-dopamina: mill-istruttura għall-funzjoni. Physiol Rev 78: 189–225.
  2. 2. Wise RA (2002) Ċirkwiti ta 'premju tal-moħħ: għarfien minn inċentivi mhux sensati. Neuron 36: 229–240. doi: 10.1016/s0896-6273(02)00965-0
  3. Ara l-Artikolu
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Ara l-Artikolu
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Ara l-Artikolu
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Ara l-Artikolu
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Ara l-Artikolu
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Ara l-Artikolu
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Ara l-Artikolu
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Ara l-Artikolu
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Ara l-Artikolu
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Ara l-Artikolu
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Ara l-Artikolu
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Ara l-Artikolu
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Ara l-Artikolu
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Ara l-Artikolu
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Ara l-Artikolu
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Ara l-Artikolu
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Ara l-Artikolu
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Ara l-Artikolu
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Ara l-Artikolu
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Ara l-Artikolu
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Ara l-Artikolu
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Ara l-Artikolu
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Ara l-Artikolu
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Ara l-Artikolu
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Ara l-Artikolu
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Ara l-Artikolu
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Ara l-Artikolu
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Ara l-Artikolu
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Ara l-Artikolu
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Ara l-Artikolu
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Ara l-Artikolu
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Ara l-Artikolu
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Ara l-Artikolu
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Ara l-Artikolu
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Ara l-Artikolu
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Ara l-Artikolu
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Ara l-Artikolu
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Ara l-Artikolu
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Ara l-Artikolu
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Ara l-Artikolu
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Ara l-Artikolu
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Ara l-Artikolu
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Ara l-Artikolu
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Ara l-Artikolu
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Ara l-Artikolu
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Ara l-Artikolu
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Ara l-Artikolu
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Sinjali tar-riċettur tad-dopamina. J Irċevi Transduct Sinjal Res 24: 165–205. doi: 10.1081/lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Involviment possibbli ta 'komponenti ta' sinjalazzjoni tar-riċettur D2 post-dopamine fil-patofiżjoloġija tal-iskiżofrenja. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197–205. doi: 10.1017/s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Rwol ta 'riċetturi li jixbħu d-dopamina D2 fl-awto-amministrazzjoni tal-kokaina: studji bi ġrieden mutanti tar-riċettur D2 u antagonisti ġodda tar-riċetturi D2. J Neurosci 22: 2977–2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (2012) Valproate jibdel is-sinjalar tad-dopamine flimkien mal-induzzjoni tal-espressjoni tal-proteina Par-4. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371/journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Glikosilazzjoni differenzjali u traffikar intraċellulari għall-isoformi twal u qosra tar-riċettur tad-dopamina D2. J Biol Chem 270: 29819–29824. doi: 10.1074/jbc.270.50.29819
  149. 8. Qarrej TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Ir-rabta speċifika ta '[3H] raclopride mar-riċetturi tad-dopamine D2 neostriatal: rwol ta' gruppi disulfide u sulfhydryl. Neurochem Res 17: 749–759. doi: 10.1007/bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) Fosforilazzjoni u palmitoylation tar-riċettur tad-dopamina D2L tal-bniedem fiċ-ċelloli Sf9. J Neurochem 63: 1589–1595. doi: 10.1046/j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Modulazzjoni ta 'sinjalazzjoni tar-riċettur tad-dopamine D(2) permezz ta' proteina li torbot l-actina (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446–452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) L-endoċitożi indotta mill-agonisti u l-fosforilazzjoni tar-riċetturi jimmedjaw ir-sensittività mill-ġdid tar-riċetturi tad-dopamine D(2). Mol Endocrinol 24: 574–586. doi: 10.1210/me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 hija subunità regolatorja speċifika għan-newrali ta 'kinase dipendenti fuq iċ-ċiklin 5. Natura 371: 419-423. doi: 10.1038/371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Għaxar snin ta' CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749–759. doi: 10.1038/35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Kinase 5 dipendenti fuq iċ-ċiklinina jgħaqqad indikazzjonijiet extraċellulari maċ-ċitoskeletru ta 'l-actin waqt l-iżvilupp tas-sinsla dendritika. Cell Adh Migr 1: 110–112. doi: 10.4161/cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) L-attivazzjoni ta 'Cdk5 tinduċi mewt taċ-ċelluli ta' l-ippocampal CA1 billi fosforilazzjoni direttament ir-riċetturi NMDA. Nat Neurosci 6: 1039–1047. doi: 10.1038/nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 jirregola l-fosforilazzjoni ta 'tyrosine 1472 NR2B u l-espressjoni tal-wiċċ tar-riċetturi NMDA. J Neurosci 28: 415–424. doi: 10.1523/jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Kinase 5 phosphorylates cyclin-dependent serine 31 ta 'tyrosine hydroxylase u jirregola l-istabbiltà tiegħu. J Biol Chem 279: 54487–54493. doi: 10.1074/jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Il-fosforilazzjoni ta 'DARPP-32 minn Cdk5 timmodula s-sinjalar tad-dopamine fin-newroni. Natura 402: 669–671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001) L-effetti ta 'espożizzjoni kronika għall-kokaina huma regolati mill-proteina newronali Cdk5. Natura 410: 376–380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Kontribuzzjonijiet sinerġistiċi ta 'kinase 5/p35 dipendenti fuq iċ-ċiklin u Reelin/Dab1 għall-ippożizzjonar ta' newroni kortikali fil-moħħ tal-ġurdien li qed jiżviluppa. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2764–2769. doi: 10.1073/pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Kinase 5 dipendenti fuq iċ-ċiklin fosforila d-dominju N-terminal tal-proteina ta 'densità postsinaptika PSD-95 fin-newroni. J Neurosci 24: 865–876. doi: 10.1523/jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 jgħaqqad is-sinjalar tad-dopamine u d-dipressjoni. Ċellula 122: 275–287. doi: 10.1016/j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL huwa substrat Cdk5 ġdid li jassoċja ma 'LIS1 u dynein ċitoplasmika. Neuron 28: 697–711. doi: 10.1016/s0896-6273(00)00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (2001) Regolamentazzjoni differenzjali tar-riċetturi tad-dopamine D2 u D3 minn riċetturi kinases akkoppjati mal-proteini G u beta-arrestins. J Biol Chem 276: 37409–37414. doi: 10.1074/jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Separazzjoni differenzjali ta 'riċetturi ta' dopamine A1 adenosine u D2 minn suramin u suramin didemethylated (NF037). Mol Pharmacol 53: 808–818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (2000) It-twaħħil ta 'calmodulin mar-riċettur D2-dopamine inaqqas is-sinjalar tar-riċettur billi jwaqqaf is-swiċċ tal-attivazzjoni tal-proteina G. J Biol Chem 275: 32672–32680. doi: 10.1074/jbc.m002780200
  168. 27. Lista SJ, Seeman P (1981) Riżoluzzjoni ta 'komponenti ta' riċettur ta 'dopamine u serotonin ta' [3H] spiperone li jorbot mar-reġjuni tal-moħħ tal-firien. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620–2624. doi: 10.1073/pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Azzjoni agonista f'riċetturi tad-dopamina D2 (twil): analiżi ta 'ligand u funzjonali. Br J Pharmacol 124: 978–984. doi: 10.1038/sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Id-dopamina tispjaċih [3H] domperidone minn siti b'affinità għolja tar-riċettur tad-dopamina D2, iżda mhux [3H] raclopride jew [3H] spiperone f'mezz iżotoniku: Implikazzjonijiet għall-emissjoni tal-pożitroni umani tomografija. Sinapsi 49: 209–215. doi: 10.1002/syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Tbassir madwar Proteome ta 'interazzjonijiet ta' sinjalazzjoni taċ-ċelluli bl-użu ta 'motifi ta' sekwenza qasira. Aċidi Nukleiċi Res 31: 3635–3641. doi: 10.1093/nar/gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Mudell għal kampjunar każwali u stima ta 'abbundanza relattiva ta' proteina fil-proteomika ta 'shotgun. Anal Chem 76: 4193–4201. doi: 10.1021/ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Is-sekwestru ta 'riċetturi tad-dopamine D2 jiddependi fuq il-koespressjoni ta' riċetturi kinases akkoppjati mal-proteini G 2 jew 5. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Protein kinase C timmedja l-fosforilazzjoni, id-desensibilizzazzjoni u t-traffikar tar-riċettur tad-dopamina D2. J Biol Chem 279: 49533–49541. doi: 10.1074/jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Il-fosforilazzjoni medjata minn Cdk5 ta 'endophilin B1 hija meħtieġa għal awtofaġija indotta f'mudelli tal-marda ta' Parkinson. Nat Cell Biol 13: 568–579. doi: 10.1038/ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35/cdk5 jorbot u fosforila beta-catenin u jirregola l-interazzjoni beta-catenin/presenilin-1. Eur J Neurosci 13: 241–247. doi: 10.1046/j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) L-ipoteżi tad-dopamina tal-proprjetajiet li jsaħħu l-kokaina. Xejriet Neurosci 14: 299–302. doi: 10.1016/0166-2236(91)90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Effetti ta 'abbuż kroniku tal-kokaina fuq riċetturi ta' dopamine postsinaptiċi. Am J Psikjatrija 147: 719–724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (2007) Ir-riċetturi Nucleus accumbens D2/3 ibassru l-impulsività tal-karatteristika u t-tisħiħ tal-kokaina. Xjenza 315: 1267–1270. doi: 10.1126/xjenza.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) Immaġini tal-PET tar-riċetturi tad-dopamina D2 waqt l-amministrazzjoni kronika tal-kokaina waħedha fix-xadini. Nat Neurosci 9: 1050–1056. doi: 10.1038/nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Modifiki strutturali persistenti fin-nukleu accumbens u newroni tal-kortiċi prefrontali prodotti minn esperjenza preċedenti b'amfetamina. J Neurosci 17: 8491–8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Alterazzjonijiet fil-morfoloġija tad-dendriti u l-ispina dendritiċi fin-nukleu accumbens u l-kortiċi prefrontali wara trattament ripetut b'amfetamina jew kokaina. Eur J Neurosci 11: 1598–1604. doi: 10.1046/j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regolament tal-espressjoni tal-ġeni u l-premju tal-kokaina minn CREB u DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208–1215. doi: 10.1038/nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) Spinophilin jirregola l-formazzjoni u l-funzjoni ta 'spina dendritika. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287–9292. doi: 10.1073/pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Trasport modulari ta 'clusters ta' densità postsinaptika-95 u assoċjazzjoni ma 'prekursuri tas-sinsla stabbli matul l-iżvilupp bikri ta' newroni kortikali. J Neurosci 21: 9325–9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Id-depolarizzazzjoni tmexxi beta-Catenin fis-sinsla newronali li tippromwovi bidliet fl-istruttura u l-funzjoni sinaptika. Neuron 35: 91–105. doi: 10.1016/s0896-6273(02)00764-x
  187. 46. ​​Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (2004) Morfoloġija sinaptika kortikali mibdula u konsolidazzjoni tal-memorja indebolita fi ġrieden transġeniċi PAK dominanti negattivi speċifiċi għall-forbrain. Neuron 42: 773–787. doi: 10.1016/j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 jimmodula l-premju, il-motivazzjoni u l-eċitabbiltà tan-newroni strijatali tal-kokaina. J Neurosci 27: 12967–12976. doi: 10.1523/jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) Id-disregolazzjoni striatali ta 'Cdk5 tbiddel ir-risponsi lokomotriċi għall-kokaina, it-tagħlim bil-mutur u l-morfoloġija dendritika. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561–18566. doi: 10.1073/pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Nagħmlu konnessjonijiet ġodda: ir-rwol tas-sinjalar tal-kinase ERK/MAP fil-plastiċità newronali. Neuron 23: 11–14. doi: 10.1016/s0896-6273(00)80747-3