ఎలుకలో అధిక కొవ్వు-ఆహారం ప్రేరిత ఊబకాయం మెదడు స్ట్రెటమ్ లో డోపామైన్ D2 రిసెప్టర్స్ బాహ్యజన్యు మాడ్యులేషన్ పై గోధుమ బియ్యం-నిర్దిష్ట γ-oryzanol ప్రభావం (2017)

చిసాయో కొజుకా,¹ తదాషి కనమే,² చిగుసా షిమిజు-ఒకాబే,³ చితోషి తకాయామా,³ మసాటో సుట్సుయ్,⁴ మసయుకి మాట్సుషిత,⁵ కైకో అబే,^6,7 మరియు హిరోకి మసుజాకి¹

జంతువులు

చార్లెస్ రివర్ లాబొరేటరీస్ జపాన్ (కనగావా, జపాన్) నుండి పొందిన ఏడు వారాల మగ C57BL / 6J ఎలుకలను 3 h / 4 h కాంతి / కింద 24 ° C వద్ద నిర్దిష్ట-వ్యాధికారక రహిత పరిస్థితులలో (పంజరానికి 12–12) ఉంచారు. చీకటి చక్రం. ఒక వారం అలవాటుపడిన తరువాత, 8 వారాల వయసున్న ఎలుకలను బరువుతో సరిపోల్చారు మరియు ప్రతి ప్రయోగానికి రెండు లేదా మూడు గ్రూపులుగా విభజించారు. ఎలుకలు ఆహారం మరియు నీటికి ఉచిత ప్రవేశానికి అనుమతించబడ్డాయి. అన్ని జంతు ప్రయోగాలను ర్యూక్యూస్ విశ్వవిద్యాలయం యొక్క జంతు ప్రయోగాత్మక నీతి కమిటీ ఆమోదించింది (సంఖ్య 5352, 5718 మరియు 5943).

Γ-oryzanol మరియు 5-aza-2′-deoxycytidine యొక్క పరిపాలన

HFD కొరకు ప్రాధాన్యతను అంచనా వేయడానికి, choice- ఒరిజనాల్ (వాకో ప్యూర్ కెమికల్ ఇండస్ట్రీస్, ఒసాకా, జపాన్) గతంలో వివరించిన విధంగా ఆహార ఎంపిక పరీక్ష సమయంలో గ్వేజ్ ద్వారా 8- వారాల వయస్సు గల ఎలుకలకు ఇవ్వబడింది [14, 17]. ఇతర ప్రయోగాల కోసం, 12079% or-oryzanol కలిగిన HFD (D0.4B; రీసెర్చ్ డైట్స్, న్యూ బ్రున్స్విక్, NJ, USA) గుళికలుగా తయారు చేయబడింది. ఆహారం యొక్క భాగాలు ఎలక్ట్రానిక్ సప్లిమెంటరీ మెటీరియల్ (ESM) పట్టికలో చూపించబడ్డాయి 1. 12 వారాల దాణా తరువాత, స్ట్రియాటం మరియు హైపోథాలమస్ నుండి కణజాలం సేకరించబడింది. ఎలుకల సగటు ఆహారం తీసుకోవడం నుండి అంచనా వేయబడిన γ-oryzanol యొక్క రోజువారీ తీసుకోవడం సుమారు 320 μg / g శరీర బరువు. Desined-oryzanol యొక్క మోతాదు గతంలో వివరించిన విధంగా నిర్ణయించబడింది [14]. 5-అజా -2′-డియోక్సిసైటిడిన్ (5-అజా-డిసి; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, ఎంఓ, యుఎస్ఎ) ఇంట్రాపెరిటోనియల్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడింది (0.25 μg / g శరీర బరువు) వారానికి మూడు సార్లు 12 వారాలు [18].

ఆహార కొవ్వుకు ప్రాధాన్యత అంచనా

ఆహార కొవ్వుకు ప్రాధాన్యతలను అంచనా వేయడానికి, ఆహార పరీక్షలు గతంలో వివరించిన విధంగా చౌ మరియు హెచ్‌ఎఫ్‌డి (D12450B మరియు D12451; రీసెర్చ్ డైట్స్) మధ్య ఎంపికను అందించాయి [14]. ఆహారం యొక్క భాగాలు ESM పట్టికలో చూపించబడ్డాయి 1. క్లుప్తంగా, ఎలుకలకు చౌ మరియు హెచ్‌ఎఫ్‌డికి ఉచిత ప్రవేశం లభించింది. చౌ మరియు హెచ్‌ఎఫ్‌డి తీసుకోవడం వారానికొకసారి కొలుస్తారు మరియు ఆహార కొవ్వుకు ప్రాధాన్యతలో మార్పుల కోసం విశ్లేషించబడుతుంది. HFD ప్రాధాన్యత సూత్రం ప్రకారం లెక్కించబడుతుంది: HFD ప్రాధాన్యత = [(HFD తీసుకోవడం / మొత్తం ఆహారం తీసుకోవడం) × 100].

DNA మిథైలేషన్ కోసం బిసుల్ఫైట్ సీక్వెన్సింగ్

DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, టోక్యో, జపాన్) ఉపయోగించి DNA శుద్ధి చేయబడింది. DNA ద్రావణాన్ని తాజాగా తయారుచేసిన 3 mol / l NaOH తో కలిపి, 37 నిమిషాలు 15 ° C వద్ద పొదిగించి 5.3 mol / l యూరియా, 1.7 mol / l సోడియం బిసుల్ఫైట్ మరియు 4.9 mmol / l హైడ్రోక్వినోన్‌లకు చేర్చారు. ఈ పరిష్కారం 15 సెకన్లకు 95 ° C వద్ద 30 చక్రాల డీనాటరేషన్ మరియు 50 నిమిషాలకు 15 ° C వద్ద పొదిగేది [19]. మిసూలూట్ పిసిఆర్ ప్యూరిఫికేషన్ కిట్ (QIAGEN) ను ఉపయోగించి బిసుల్ఫైట్-చికిత్స చేయబడిన డిఎన్‌ఎ శుద్ధి చేయబడింది మరియు పిసిఆర్ చేత KAPA హైఫై హాట్‌స్టార్ట్ యురేసిల్ + రెడీమిక్స్ పిసిఆర్ కిట్ (KAPA బయోసిస్టమ్స్, వోబర్న్, MA, USA) మరియు D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతం యొక్క సిపిజి సైట్ చుట్టూ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి . ప్రైమర్ సీక్వెన్సులు ఈ క్రింది విధంగా ఉన్నాయి: ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3; రివర్స్ ప్రైమర్, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3. తరువాత, అగెన్‌కోర్ట్ AMPure XP (బెక్మాన్ కౌల్టర్, బ్రీ, CA, USA) ఉపయోగించి అడాప్టర్ సన్నివేశాలు జోడించబడ్డాయి మరియు శుభ్రం చేయబడ్డాయి. తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం క్రమం చేయడానికి నమూనాలను ఒక GS జూనియర్ (రోచె డయాగ్నోస్టిక్స్, టోక్యో, జపాన్) లో పూల్ చేసి లోడ్ చేశారు. అన్ని సైటోసిన్ అవశేషాలలో మిథైలేటెడ్ సైటోసిన్ల శాతంగా మిథైలేషన్ స్థాయి వ్యక్తీకరించబడింది.

DNMT కార్యాచరణ పరీక్ష

తయారీదారుల ప్రోటోకాల్స్ ప్రకారం ఎపిక్విక్ డిఎన్ఎ మిథైల్ట్రాన్స్ఫేరేస్ యాక్టివిటీ / ఇన్హిబిషన్ అస్సే కిట్ (ఎపిజెంటెక్ గ్రూప్, బ్రూక్లిన్, ఎన్వై, యుఎస్ఎ) మరియు ఇపిజినియస్ మెథైల్ట్రాన్స్ఫేరేస్ అస్సే కిట్ (సిస్బియో జపాన్, చిబా, జపాన్) ఉపయోగించి డిఎన్ఎమ్టి ఎంజైమాటిక్ యాక్టివిటీ అస్సే జరిగింది.

DNA మిథైలేషన్ పై ప్రతి సమ్మేళనం యొక్క నిరోధక చర్యను అంచనా వేయడానికి, ఏర్పడటం S-అడెనోసిల్-ఎల్-హోమోసిస్టీన్ (SAH) ను ప్రతి సమ్మేళనం సమక్షంలో కొలుస్తారు (స్క్రీనింగ్ పరీక్షల కోసం 20 μmol / l), S-అడెనోసిల్ మెథియోనిన్ (SAM; 10 μmol / l) మరియు DNMT ఉపరితలం (4 ng / μl) 37 ° C వద్ద 90 నిమిషాలు. మైఖేలిస్-మెంటెన్ గతిశాస్త్రాలను అంచనా వేయడానికి, DNMT1 (20 μmol / l) γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) తో పొదిగేది మరియు 37 నిమిషాలు 90 ° C వద్ద పాలీ dI-dC యొక్క సాంద్రత సూచించబడింది. DNMT3a (100 μmol / l) మరియు DNMT3b (100 μmol / l) γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) తో పొదిగేవి మరియు 37 నిమిషాలకు 120 ° C వద్ద పాలీ DG · dC యొక్క సూచించిన సాంద్రత. ఈ పరీక్షలు చతురస్రాకారంలో జరిగాయి. సంగ్రహించిన ప్రోటీన్ (0.75 mg / ml) SAM (5 μmol / l), పాలీ dI-dC (5 μg / ml), మరియు పాలీ dG · dC (5 μg / ml) 40 ° C వద్ద 120 నిమిషాలకు పొదిగేది, మరియు SAH నిర్మాణం కొలుస్తారు.

ఈస్ట్రోజెన్-సంబంధిత గ్రాహక- γ కార్యాచరణ పరీక్ష

తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం ఈస్ట్రోజెన్-సంబంధిత రిసెప్టర్- γ (ERRγ) పై γ- ఒరిజనాల్ యొక్క సంభావ్య వ్యతిరేక చర్యను హ్యూమన్ ఈస్ట్రోజెన్-రిలేటెడ్ రిసెప్టర్ గామా రిపోర్టర్ అస్సే సిస్టమ్ (INDIGO బయోసైన్స్, స్టేట్ కాలేజ్, PA, USA) ఉపయోగించి అంచనా వేశారు. క్లుప్తంగా, క్రియాశీల ERRγ ను రాజ్యాంగబద్ధంగా వ్యక్తీకరించే నాన్-హ్యూమన్ క్షీరద రిపోర్టర్ కణాలు ప్రతి సమ్మేళనం యొక్క సూచించిన సాంద్రతలకు 24 గంటలకు త్రిపాదిలో బహిర్గతమవుతాయి.

వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్

గతంలో వివరించిన విధంగా ఇది జరిగింది [20] D2R (1: 500, కుందేలు), డోపామైన్ ట్రాన్స్పోర్టర్ (DAT; 1: 500, కుందేలు), టైరోసిన్ హైడ్రాక్సిలేస్ (TH; 1: 1000, కుందేలు) (AB5084P, AB1591P మరియు AB152, మెర్క్ మిల్లిపోర్, బిల్లెరికా, MA, USA), సిగ్నల్ ట్రాన్స్డ్యూసెర్ మరియు ట్రాన్స్క్రిప్షన్ 3α (STAT3α; 1: 1000, కుందేలు), DNMT1 (1: 1000, కుందేలు), DNMT3a (1: 1000, కుందేలు) (సంఖ్య 8768, 5032 మరియు 3598; సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ, టోక్యో, జపాన్), DNMT3b (1 μg / ml, కుందేలు), ERRγ (1: 1000, కుందేలు) మరియు β- ఆక్టిన్ (1: 10,000, ఎలుక) (ab16049, ab128930 మరియు ab6276; అబ్కామ్, కేంబ్రిడ్జ్, MA, USA).

పరిమాణాత్మక రియల్ టైమ్ పిసిఆర్

గతంలో వివరించిన విధంగా జన్యు వ్యక్తీకరణ పరిశీలించబడింది [14]. mRNA స్థాయిలు సాధారణీకరించబడ్డాయి Rn18s (18S rRNA). పరిమాణాత్మక నిజ-సమయ PCR విశ్లేషణల కోసం ఉపయోగించే ప్రైమర్ సెట్లు ESM పట్టికలో సంగ్రహించబడ్డాయి 2.

గణాంక విశ్లేషణ

డేటా సగటు ± SEM గా వ్యక్తీకరించబడింది. వన్-వే ANOVA మరియు పునరావృత-కొలతలు ANOVA తరువాత బహుళ పోలిక పరీక్షలు (బోన్‌ఫెరోని-డన్ పద్ధతి) వర్తించే చోట ఉపయోగించబడ్డాయి. విద్యార్థుల t రెండు సమూహాల మధ్య తేడాలను విశ్లేషించడానికి పరీక్ష ఉపయోగించబడింది. వద్ద తేడాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి p <0.05.

5-aza-dC చే DNMT ల యొక్క c షధ నిరోధకత ఎలుకలలో ఆహార కొవ్వుకు ప్రాధాన్యతనిచ్చింది

ఎలుకలలో HFD కి ఆహారం ఇవ్వబడినప్పుడు, స్ట్రియాటమ్‌లోని D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతంలో DNA మిథైలేషన్ ఎలుకలతో ఒక చౌ డైట్ (Fig. (Fig.1a) .1ఒక). మరోవైపు, D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతంలో హైపోథాలమిక్ DNA మిథైలేషన్ చౌ డైట్ కింద స్ట్రియాటమ్ కంటే ఎక్కువగా ఉంది (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) మరియు HFD (Fig.) చేత మార్చబడలేదు. (Fig.1f) .1f). ఎలుకలలో HFD కి, స్ట్రియాటమ్‌లోని D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతంలో వృద్ధి చెందిన DNA మిథైలేషన్ 5-aza-dC, శక్తివంతమైన DNMT నిరోధకం (Fig.) తో చికిత్స ద్వారా సాధారణీకరించబడింది. (Fig.1a) .1ఒక). దీనికి విరుద్ధంగా, హైపోథాలమస్‌లోని D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతంలో DNA మిథైలేషన్ 5-aza-dC (Fig.) తో చికిత్స ద్వారా గణనీయంగా మార్చబడలేదు. (Fig.1f) .1f). 20 వారాల వయసున్న మగ ఎలుకల స్ట్రియాటమ్‌లో 12 వారాల పాటు హెచ్‌ఎఫ్‌డిని తినిపించింది, mRNA మరియు D2R యొక్క ప్రోటీన్ స్థాయిలు గణనీయంగా తగ్గాయి (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). దీనికి విరుద్ధంగా, డోపామైన్ D1 గ్రాహకాల స్థాయిలు (D1R లు, ఎన్కోడ్ చేయబడ్డాయి Drd1), అడెనైల్ సైక్లేస్ మరియు CAMP- మధ్యవర్తిత్వ కణాంతర సిగ్నలింగ్‌పై D2R లకు విరుద్ధంగా పనిచేస్తుంది, మారవు (Fig. (Fig.1c) .1సి). ఇంకా, MX మరియు / లేదా ప్రోటీన్ స్థాయిలో TH మరియు DAT వంటి D2R సిగ్నలింగ్‌కు సంబంధించిన ఇతర అణువుల స్థాయిలలో ఎటువంటి మార్పు లేదు (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). మరోవైపు, హైపోథాలమస్‌లో D2R (Fig.) తో సహా స్పష్టమైన మార్పులు కనిపించలేదు. (Fig.1g-m) .1గ్రా-m). ముఖ్యంగా, హైపోథాలమస్‌లోని D2R మరియు TH యొక్క ప్రోటీన్ స్థాయిలు స్ట్రియాటం (Fig.) కన్నా చాలా తక్కువగా ఉన్నాయి. (Fig.1l, 1l, మ), హైపోథాలమస్‌తో పోలిస్తే మెదడు రివార్డ్ సిస్టమ్‌లో డోపామైన్ రిసెప్టర్ సిగ్నలింగ్ యొక్క సాపేక్ష ప్రాముఖ్యతను ప్రతిబింబిస్తుంది.

 

అంజీర్

5-aza-dC చే DNMT ల యొక్క నిరోధం HFD- తినిపించిన ఎలుకల స్ట్రియాటంలో D2R లను పెంచడం ద్వారా HFD కి ప్రాధాన్యతనిస్తుంది. స్ట్రియాటమ్‌లోని D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతంలో DNA మిథైలేషన్ స్థాయిలు (n = 3) (a) మరియు హైపోథాలమస్ (n = 3) ...

D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతంలో DNA మిథైలేషన్ ఆహార కొవ్వుకు ప్రాధాన్యతనిస్తుందో లేదో పరిశీలించడానికి, 5-aza-dC- చికిత్స చేసిన ఎలుకల దాణా ప్రవర్తన విశ్లేషించబడింది. Expected హించినట్లుగా, 5-aza-dC HFD- తినిపించిన ఎలుకల స్ట్రియాటంలో D2R కొరకు mRNA మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలను గణనీయంగా పెంచింది (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). మరోవైపు, స్థాయిలపై ఎటువంటి ప్రభావం లేదు Drd1, Th మరియు Slc6a3 (ఎన్‌కోడింగ్ DAT) స్ట్రియాటమ్‌లో లేదా స్థాయిలలో Drd2, Drd1, వ మరియు Slc6a3 హైపోథాలమస్ (Fig. (Fig.1c-ఇలో 1c - e, g-m). వాహన-చికిత్స ఎలుకలు HFD కి ప్రాధాన్యత ఇవ్వగా, 5-aza-dC- చికిత్స చేసిన ఎలుకలలో (వాహన-చికిత్స ఎలుకల విలువలలో 88%) HFD కి ప్రాధాన్యత గణనీయంగా తగ్గింది (Fig. (Fig.1n) .1n). పర్యవసానంగా, 5-aza-dC తో చికిత్స శరీర బరువు పెరుగుదలను తగ్గించింది (Fig. (Fig.11o).

F- ఓరిజనాల్ HFD- తినిపించిన ఎలుకల స్ట్రియాటంలో DNMT ల స్థాయిలను తగ్గిస్తుంది

మేము గతంలో నివేదించినట్లు [14], గావేజ్ ద్వారా మగ ఎలుకలకు γ-oryzanol యొక్క నోటి పరిపాలన HFD (వాహన-చికిత్స ఎలుకల విలువలలో 93%) కు ప్రాధాన్యతనిస్తుంది (Fig. (Fig.2a), 2a), దీని ఫలితంగా శరీర బరువు పెరుగుట స్పష్టంగా కనబడుతుంది (Fig. (Fig.2b) .2బి). అందువల్ల మేము స్ట్రియాటంలో D2R ల యొక్క బాహ్యజన్యు మాడ్యులేషన్ పై γ- ఒరిజనాల్ యొక్క సంభావ్య ప్రభావాన్ని అన్వేషించాము.

 

అంజీర్

HFD- తినిపించిన ఎలుకలలో DNMT లపై γ-oryzanol యొక్క నిరోధక ప్రభావం. HFD ప్రాధాన్యత (a) మరియు శరీర బరువు (b) చౌ vs హెచ్‌ఎఫ్‌డి యొక్క ఆహార ఎంపిక పరీక్షల సమయంలో or- ఓరిజనాల్-చికిత్స చేసిన ఎలుకలలో (n = 4 బోనులో; బోనులో మూడు ఎలుకలు). కోసం mRNA స్థాయిలు ...

క్షీరదాలలో, మూడు ప్రధాన DNMT లు ఉన్నాయి-DNMT1, 3a మరియు 3b. DNMT1 DNA మిథైలేషన్‌ను నిర్వహించడానికి పనిచేస్తుంది, అయితే DNMT3a మరియు 3b డి నోవో DNA మిథైలేషన్‌ను సులభతరం చేయడంలో పాత్ర పోషిస్తాయి [21]. వివోలోని DNMT లపై γ-oryzanol యొక్క సంభావ్య ప్రభావాన్ని అన్వేషించడానికి, మేము HFD- తినిపించిన ఎలుకల మెదడుల్లో DNMT ల స్థాయిలను అంచనా వేసాము. స్ట్రియాటం లేదా హైపోథాలమస్‌లో MRNA మరియు DNMT ల ప్రోటీన్ స్థాయిలపై HFD ప్రభావం చూపనప్పటికీ, γ- ఒరిజనోల్‌తో భర్తీ చేయడం వల్ల స్ట్రియాటంలో DNMT స్థాయిలు గణనీయంగా తగ్గాయి కాని హైపోథాలమస్‌లో కాదు (Fig. (Fig.2c-ఇలో 2c - e, g-i, k-n). Data-oryzanol DNMT ల స్థాయిలను స్ట్రియాటం-నిర్దిష్ట పద్ధతిలో నియంత్రించే అవకాశాన్ని ఈ డేటా పెంచుతుంది. ఇదే తరహాలో, 5-aza-dC గణనీయంగా స్ట్రియాటం (ESM Fig.) లో DNMT3a మరియు 3b యొక్క mRNA స్థాయిలను గణనీయంగా తగ్గించింది. 1ఒక-D).

మునుపటి అధ్యయనం ఆధారంగా, DNMT1 యొక్క mRNA స్థాయి సానుకూలంగా నియంత్రించబడిందని చూపిస్తుంది, కనీసం పాక్షికంగా, న్యూక్లియర్ రిసెప్టర్ ERR by [22], ERRγ కార్యాచరణపై γ-oryzanol యొక్క సంభావ్య ప్రభావాన్ని మేము పరిశీలించాము. క్రియాశీల ERRγ ను రాజ్యాంగబద్ధంగా వ్యక్తీకరించే మానవులేతర క్షీరద కణాలలో, ERRγ యొక్క శక్తివంతమైన విలోమ అగోనిస్ట్ అయిన 4- హైడ్రాక్సీ టామోక్సిఫెన్, ERRγ కార్యాచరణను గణనీయంగా తగ్గించింది. గమనించదగినది, γ-oryzanol పాక్షికంగా ERRγ కార్యాచరణను తగ్గించింది (సహజ విలువ యొక్క సుమారు 40% తగ్గింపు) (Fig. (Fig.3a) .3ఒక). ముఖ్యముగా, ERRγ స్ట్రియాటంలో ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడింది కాని హైపోథాలమస్ (Fig.) లో కాదు. (Fig.3b-డి) .3బి-D). స్ట్రియాటం యొక్క పరిస్థితికి విరుద్ధంగా, γ-oryzanol హైపోథాలమస్ (Fig.) లో మాత్రమే DNMT1 యొక్క ప్రోటీన్ స్థాయిలను గణనీయంగా పెంచింది. (Fig.2k, 2k, l). DNMT3 స్థాయి యొక్క సానుకూల నియంత్రకం అయిన STAT1α అని మేము కనుగొనడం ద్వారా ఈ ఫలితాలను వివరించవచ్చు [23], హైపోథాలమస్‌లో సమృద్ధిగా వ్యక్తీకరించబడింది కాని స్ట్రియాటం (Fig. (Fig.33ఇ-గ్రా).

 

అంజీర్

ERRγ కార్యాచరణ మరియు STAT3α పై γ-oryzanol ప్రభావం. (a) విట్రోలో ERRγ పై γ-oryzanol యొక్క నిరోధక ప్రభావం. R-oryzanol (బ్లాక్ సర్కిల్స్), ఫెర్యులిక్ ఆమ్లంతో ERRγ కార్యకలాపాల మోతాదు-ప్రతిస్పందన వక్రతలు ...

వివోలో DNMT ల యొక్క కార్యాచరణపై γ-oryzanol యొక్క ప్రభావాన్ని మరింత అంచనా వేయడానికి, DNA మిథైలేషన్ యొక్క ఉప ఉత్పత్తి మరియు DNMT ల యొక్క శక్తివంతమైన నిరోధకం అయిన SAH ఏర్పడటం F-oryzanol- చికిత్స చేసిన ఎలుకలలో HFD కి ఆహారం ఇవ్వబడింది. స్ట్రియాటం లేదా హెచ్‌ఎఫ్‌డి-ఫెడ్ మరియు చౌ-ఫెడ్ ఎలుకల మధ్య హైపోథాలమస్‌లో SAH ఏర్పడటంలో గణనీయమైన మార్పులు లేవు (Fig. (Fig.2f, 2f, j). గమనించదగ్గ విషయం ఏమిటంటే, stri-oryzanol స్ట్రియాటం (Fig.) లో SAH ఏర్పడటాన్ని గణనీయంగా తగ్గించింది. (Fig.2f) 2f) కానీ హైపోథాలమస్‌లో కాదు (Fig. (Fig.2j), 2j), H-oryzanol DFMT ల యొక్క కార్యాచరణను HFD- తినిపించిన ఎలుకలలో స్ట్రియాటం-నిర్దిష్ట పద్ధతిలో అణచివేయవచ్చని సూచిస్తుంది.

విట్రోలోని DNMT ల కొరకు γ-oryzanol యొక్క నిరోధక లక్షణాలపై ఎంజైమాటిక్ విశ్లేషణలు

మేము తరువాత విట్రోలోని DNMT ల కార్యాచరణపై γ-oryzanol యొక్క ప్రభావాన్ని అంచనా వేసాము. N-oryzanol, Ferulic acid, 5-aza-dC, హలోపెరిడోల్ (ఒక ప్రతినిధి D2R విరోధి), క్విన్పిరోల్ (ఒక ప్రతినిధి D2R అగోనిస్ట్) మరియు DNMT లకు వ్యతిరేకంగా SAH యొక్క నిరోధక శక్తిని విశ్లేషించారు. సానుకూల నియంత్రణగా, SAH DNMT ల యొక్క కార్యకలాపాలను మోతాదు-ఆధారిత పద్ధతిలో గట్టిగా ఆకర్షించింది (Fig. (Fig.4a -f) .4ఒక-ఎఫ్). Expected హించినట్లుగా, హలోపెరిడోల్ మరియు క్విన్పిరోల్ DNMT ల కార్యకలాపాలపై ఎటువంటి ప్రభావాన్ని చూపించలేదు (ESM Fig. 2). గమనించదగినది, N-oryzanol DNMT1 (IC) యొక్క కార్యకలాపాలను గణనీయంగా నిరోధించింది₅₀ = 3.2 μmol / l), 3a (IC₅₀ = 22.3 olmol / l) మరియు 3b (గరిష్ట నిరోధం 57%) (Fig. (Fig.4d -f) .4డి-ఎఫ్). దీనికి విరుద్ధంగా, fer- ఓరిజనాల్ యొక్క మెటాబోలైట్ అయిన ఫెర్యులిక్ ఆమ్లం యొక్క నిరోధక చర్య γ-oryzanol (Fig.) కంటే చాలా తక్కువగా ఉంది. (Fig.44డి-ఎఫ్).

 

అంజీర్

విట్రోలోని DNMT లపై γ-oryzanol యొక్క నిరోధక ప్రభావం. DNMT1 యొక్క సంభావ్య నిరోధకాల కోసం హై-త్రూపుట్ స్క్రీనింగ్ పరీక్షలు (a), DNMT3a (b) మరియు DNMT3b (c). N-oryzanol, Ferulic acid (γ-oryzanol యొక్క జీవక్రియ) కొరకు DNMT లకు వ్యతిరేకంగా నిరోధక సామర్థ్యాలు, ...

మేము DNMT లలో γ-oryzanol యొక్క నిరోధక లక్షణాలను మరింత పరిశోధించాము. విట్రోలోని DNMT లపై γ-oryzanol యొక్క నిరోధక చర్యను అంచనా వేయడానికి SAH ఏర్పడటాన్ని కొలుస్తారు. DNMT- మధ్యవర్తిత్వ DNA మిథైలేషన్ సమయంలో SAH ఏర్పడటానికి సంబంధించిన డేటా mic-oryzanol (Fig.) ఉనికి మరియు లేకపోవడం రెండింటికీ మైఖేలిస్-మెంటెన్ గతిశాస్త్రం యొక్క సంతృప్త నమూనాను సూచిస్తుంది. (Fig.4g-i) .4జి-i). DNMT1- మధ్యవర్తిత్వ DNA మిథైలేషన్‌లో, ఈడీ-హాఫ్స్టీ విశ్లేషణ γ-oryzanol పై ఎటువంటి ప్రభావాలను చూపించలేదని నిరూపించింది V _{గరిష్టంగా} SAH నిర్మాణం (వాహనం, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), అయితే γ-oryzanol స్పష్టంగా పెరిగింది K _m . (Fig.4j) .4j). Results-oryzanol DNMT1 ని కనీసం కొంతవరకు పోటీ పద్ధతిలో నిరోధిస్తుందని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి. మరోవైపు, DNMT3a- మరియు 3b- మధ్యవర్తిత్వ DNA మిథైలేషన్ కొరకు, γ-oryzanol తగ్గింది V _{గరిష్టంగా} SAH (DNMT3a: వాహనం, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: వాహనం, 42.3 pmol / min;. -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) మరియు, అదేవిధంగా, K _m ఈ ప్రతిచర్య కోసం (DNMT3a: వాహనం, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: వాహనం, 0.0122 μg / ml; γ-. oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Results-oryzanol DNMT3a మరియు 3b ని కనీసం పాక్షికంగా పోటీ లేని పద్ధతిలో నిరోధిస్తుందని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.

F- ఓరిజనాల్ HFD- తినిపించిన ఎలుకల స్ట్రియాటంలో D2R స్థాయిలను పెంచుతుంది

Next-oryzanol DNMT ల నిరోధం ద్వారా స్ట్రియాటల్ D2R కంటెంట్‌ను పెంచే అవకాశాన్ని మేము తరువాత పరీక్షించాము. HFD- తినిపించిన ఎలుకలలో, X-oryzanol యొక్క నోటి పరిపాలన D2R ల యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతంలో స్ట్రియాటల్ DNA మిథైలేషన్ గణనీయంగా తగ్గింది (Fig. (Fig.5a), 5a), అయితే ఇది హైపోథాలమస్ (Fig.) లో చేయలేదు. (Fig.5f) .5f). ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, mRNA మరియు D2R యొక్క ప్రోటీన్ స్థాయిలు పరస్పరం పెంచబడ్డాయి (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). 5-aza-dC (Fig.) తో చికిత్సకు సంబంధించిన డేటా మాదిరిగానే. (Fig.1), 1), యొక్క RNA మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలపై స్పష్టమైన ప్రభావాలు లేవు Drd1, Th మరియు Slc6a3 (DAT) స్ట్రియాటంలో, మరియు స్థాయిలపై ఎటువంటి ప్రభావాలు లేవు Drd1, Th మరియు Slc6a3 హైపోథాలమస్ (Fig. (Fig.5c-ఇలో 5c - e, h-k, m).

 

అంజీర్

N-oryzanol చేత DNMT ల యొక్క నిరోధం HFD- తినిపించిన ఎలుకల స్ట్రియాటంలో D2R లను పెంచడం ద్వారా HFD కి ప్రాధాన్యతనిస్తుంది. స్ట్రియాటమ్‌లోని D2R యొక్క ప్రమోటర్ ప్రాంతం యొక్క DNA మిథైలేషన్ స్థాయిలు (n = 3) (a) మరియు హైపోథాలమస్ ...

మునుపటి అధ్యయనాలు D2R మరియు DNMT1 స్థాయిలు ER ఒత్తిడి మరియు మంట ద్వారా నియంత్రించబడుతున్నాయి, కనీసం కొంతవరకు NF-viaB ద్వారా [17, 24, 25]. అందువల్ల మేము ER ఒత్తిడి-సంబంధిత మరియు మంట-సంబంధిత జన్యువుల స్థాయిలను పరిశీలించాము. గతంలో ప్రదర్శించినట్లు [26], TNF-α (ఎన్కోడింగ్ జన్యువుల యొక్క వ్యక్తీకరణ HFD పెరిగిందిTnfa), మోనోసైట్ కెమోఆట్రాక్ట్ ప్రోటీన్ - 1 (MCP-1) (Ccl2), సి / ఇబిపి హోమోలాగస్ ప్రోటీన్ (చాప్), ER- స్థానికీకరించిన DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) మరియు X- బాక్స్ బైండింగ్ ప్రోటీన్ 1 యొక్క విభజించబడిన రూపం (Xbp1s) హైపోథాలమస్‌లో కానీ స్ట్రియాటమ్‌లో కాదు (Fig. (Fig.6) .6). ముఖ్యంగా, F-oryzanol తో HFD యొక్క భర్తీ గణనీయంగా పెరిగిన వ్యక్తీకరణను తగ్గించింది Ccl2, చాప్, Dnajb9 మరియు Xbp1s ప్రత్యేకంగా హైపోథాలమస్‌లో కానీ స్ట్రియాటమ్‌లో కాదు (Fig. (Fig.66).

 

అంజీర్

స్ట్రియాటం మరియు హైపోథాలమస్‌లో ప్రోఇన్‌ఫ్లమేటరీ మరియు ER ఒత్తిడి సంబంధిత జన్యువుల వ్యక్తీకరణ. కోసం mRNA స్థాయిలు Tnfa (a, f), Ccl2 (b, g), చాప్ (c, h), Dnajb9 (d, i), మరియు యొక్క క్రియాశీల స్ప్లిస్డ్ రూపం Xbp1 (Xbp1s) (e, j) స్ట్రియాటంలో (n = 8) ...

మాన్యుస్క్రిప్ట్‌ను సమీక్షించినందుకు ఎస్. ఓకామోటో (యూనివర్శిటీ ఆఫ్ ది ర్యూక్యూస్, జపాన్) కు మేము కృతజ్ఞతలు. సెక్రటేరియల్ సహాయం చేసినందుకు ఎం. హిరాటా, హెచ్. కనెషిరో, ఐ. అసటో మరియు సి. నోగుచి (జపాన్ ఆఫ్ ర్యూక్యూస్, జపాన్) కు కృతజ్ఞతలు.

డేటా లభ్యత

ప్రస్తుత అధ్యయనం సమయంలో ఉత్పత్తి చేయబడిన మరియు / లేదా విశ్లేషించబడిన డేటాసెట్‌లు సంబంధిత రచయిత నుండి సహేతుకమైన అభ్యర్థనలపై అందుబాటులో ఉన్నాయి.

ఫండింగ్

జపాన్ సొసైటీ ఫర్ ది ప్రమోషన్ ఆఫ్ సైన్స్ (JSPS; కాకెన్హి గ్రాంట్ నంబర్స్ 15K19520 మరియు 24591338), కౌన్సిల్ ఫర్ సైన్స్, టెక్నాలజీ అండ్ ఇన్నోవేషన్ (CSTI), క్రాస్ మినిస్టీరియల్ స్ట్రాటజిక్ ఇన్నోవేషన్ ప్రమోషన్ ప్రోగ్రామ్ నుండి గ్రాంట్స్-ఇన్-ఎయిడ్ ఈ పనికి కొంత మద్దతు ఇచ్చింది (SIP) 'తరువాతి తరం వ్యవసాయం, అటవీ మరియు మత్స్య సంపదను సృష్టించే సాంకేతికతలు', లోట్టే ఫౌండేషన్, జపాన్ ఫౌండేషన్ ఫర్ అప్లైడ్ ఎంజైమాలజీ, న్యూ ఎనర్జీ అండ్ ఇండస్ట్రియల్ టెక్నాలజీ డెవలప్‌మెంట్ ఆర్గనైజేషన్ (NEDO), లైఫ్ సైన్స్ నెట్‌వర్క్ (ఫార్మాస్యూటికల్ ఫీల్డ్ ) (ఒకినావా ప్రిఫెక్చర్, జపాన్) మరియు జపాన్లోని ఓకినావా ప్రిఫెక్చర్ యొక్క మెడికల్ క్లస్టరింగ్ యొక్క ప్రమోషన్ ప్రాజెక్ట్, అధునాతన medicine షధం (ఓకినావా ప్రిఫెక్చర్, జపాన్) ప్రమోషన్ కోసం ఒకినావా ప్రిఫెక్చర్ నుండి మంజూరు చేయబడినది.

ఆసక్తి యొక్క ద్వంద్వత్వం

ఈ మాన్యుస్క్రిప్ట్‌తో సంబంధం ఉన్న ఆసక్తి యొక్క ద్వంద్వత్వం లేదని రచయితలు ప్రకటించారు.

సహాయ ప్రకటన

సికె మరియు హెచ్‌ఎం పరిశోధనలను రూపొందించారు. సికె మరియు టికె ప్రయోగాలు చేసి డేటాను విశ్లేషించారు. TK, CS-O, CT, MT, MM మరియు KA డేటా యొక్క వివరణకు దోహదపడ్డాయి. సికె, హెచ్‌ఎం మాన్యుస్క్రిప్ట్ రాశారు. రచయితలందరూ డేటా వ్యాఖ్యానానికి సహకరించారు. మాన్యుస్క్రిప్ట్‌ను సవరించడంలో రచయితలందరూ చేరారు మరియు దాని తుది సంస్కరణను ఆమోదించారు. HM ఈ పనికి హామీ ఇస్తుంది, అన్ని డేటాకు పూర్తి ప్రాప్తిని కలిగి ఉంది మరియు డేటా యొక్క సమగ్రత మరియు డేటా విశ్లేషణ యొక్క ఖచ్చితత్వానికి పూర్తి బాధ్యత తీసుకుంటుంది.

ఎలక్ట్రానిక్ అనుబంధ పదార్థం

ఈ వ్యాసం యొక్క ఆన్‌లైన్ వెర్షన్ (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) తోటి-సమీక్షించిన కాని సవరించని అనుబంధ పదార్థాలను కలిగి ఉంది, ఇది అధికారం కలిగిన వినియోగదారులకు అందుబాటులో ఉంటుంది.