Pembentukan tulang tonggong dendritik ing Cocaine ing D1 lan D2 reseptor dopamin sing ngemot neuron spin medium ing inti sèl (2006)

Proc Natl Acad Sci US A. Feb 28, 2006; 103 (9): 3399-3404.
Published online Feb 21, 2006. aja:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neuroscience
Artikel iki wis dikutip dening Artikel liya ing PMC.

Abstract

Psikostimulant-induced alteration dendritic spines on dopaminoceptive neurons in nucleus accumbens (NAcc) wis dihipotesisake minangka respon neuronal adaptif sing dihubungkan karo perilaku adiktif sing tahan lama. NAcc dumadi saka rong subpopulations sing béda karo neuron sing ukurane medium sing ngandhut tingkat dhuwur saka dopamin D1 utawa D2 reseptor. Ing panliten iki, kita nganalisis kerapatan tulang dendritik sawise perawatan kokain kronis ing dxNUMX utawa reseptor D1 sing ngandung neuron sing ukurane berukuran sedang ing NAcc. Pasinaon iki migunakake tikus transgenik sing nyatakake EGFP ing sangisore kontrol promotor reseptor D2 utawa D1 (Drd2-EGFP utawa Drd1-EGFP). Sawise 2 dina perawatan kokain lan 28 dina mundur, kepadatan tulang tonggong tambah ing loro neuron Drd2-EGFP- lan Drd1-EGFP. Nanging, tambah ing kepadatan tulang tonggong kajaba mung ing neuron Drd2-EGFP positif 1 dina sawise penarikan obat. Khusus, ekspresi ΔFosB uga diamati ing neuron Drd30-EGFP- lan neuron Drd1-EGFP sawise penundaan obat 2, nanging mung ing neuron Drd2-EGFP sawise dina penarikan obat 1. Hasil kasebut nuduhaké manawa kepadatan tulang tongkèn tambah sing ditindakake sawisé perawatan kokain kronis mung stabil ing neuron-reseptor sing duweni D30 lan ekspresi ΔFosB digandhengake karo pembentukan lan / utawa pangopènan dendritik duri ing D1 uga neuron sing ngandung reseptor D1 ing NAcc.

Jalur dopaminergik mesolimbi dumadi saka neuron ing tlatah tegegalal ventral sing ngasilake akrab nukleus (NAcc), tuberkle olfactory, korteks prefrontal, lan amygdala1), déné neuron dopaminergik nigrostrialis ing substantia nigra (pars compacta) nyedhiyakake proyeksi munggah kanggo striatum dorsal (2). Psikostimulant nyedhaki konsentrasi sinoptik dopamin ing NAcc: kokain, kanthi pamblokiran panyambutan dopamin saka cetha sinaptik, lan amphetamine, kanthi nyebarake dopamin saka terminal syaraf (3-5). Pasien psychostimulant sing diulangi, nyebabake respon perilaku sing ditambahake (sensitisasi) marang efek stimulasi akut obat kasebut (6-8). Paling garis bukti ngandharake menawa owah-owahan adaptif ing sistem dopaminergik-NACC ventral tegmental minangka pusat kanggo owah-owahan ing plastisitas gumantung pengalaman sing nandhang prilaku narkoba.

Saliyane dopamin, glutamat dibutuhake kanggo pangembangan sensitisasi prilaku sajrone nanggepi psychostimulants (9, 10). Neuron spin menengah ukuran (MSNs) ing striatum ventral nampa proyeksi glutamatergis excitatory saka korteks prefrontal sing sinapsis menyang kepala dendritic spines. MSN uga minangka sasaran utama kanggo akseptor dopaminergik sing nyatakake ing leher tulang belakang (1, 11, 12). Mulane, dendritik spines ing MSNs makili kompartemen sel sing ngendi transmisi dopaminergik lan glutamatergia wiwitan digabungake.

Dopamin tumindak ing loro subfamili reseptor utama, subfamili D1 (subtipe D1 lan D5) lan subfamili D2 (subtipe D2, D3, lan D4) (13). Ing dorsal striatum, studi anatomi nuduhaké yèn MSN striatonigral ngandhut reseptor D1 sing dhuwur (bebarengan karo substansi P lan dynorphin), déné MSN striatopallidal utamané nyatakaké reseptor D2 (bebarengan karo enkephalin) (14-17). Préstasi saka NAcc luwih kompleks tinimbang striatum dorsal, kanthi cangkang lan bagéan inti NACC ngusulaké menyang sub-laladan khusus saka pallidum ventral lan menyang wilayah tegmental ventral lan substantia nigra18). Dene reseptor D2 lan enkephalin sing dikeprigekake kanthi dhuwur ing proyeksi menyang pallidum ventral, reseptor D1 lan substansi P ditemokake sacara bebarengan ing proyeksi menyang pallidum ventral lan area tegal ventral19). Studi saka agonis lan antagonis sing selektif kanggo reseptor D1 utawa D2 nuduhaké yen reseptor D1 lan D2 dibutuhake kanggo owah-owahan prilaku psychostimulant gumantung (20-25). Nanging, peran reseptor iki katon beda. Contone, stimulasi reseptor D1 ngasilake cocaine nggoleki indikator-implikasi kokain lan kokain sing terkait karo kokain, dene stimulasi reseptor D2 ndadekake reinstatement kokain26-28).

Kelainan prilaku sing digandhengake karo kecanduan psychostimulantum sing dawa banget. Mulane, wis ana kapentingan gedhe kanggo ngenali owah-owahan akibat narkoba sing tahan ing tingkat molekul lan struktural ing sirkuit neuronal sing diatur dening dopamin lan glutamat (29-32). Khususé, paparan cocaine utawa amfetamin wis ditemokake kanggo nambah jumlah titik dendritik lan spin saka MSN ing NAcc33-35). Owah-owahan struktural iki wis ditampilake kanggo nganti nganti ≈1-3.5 sasi sawise paparan tamba pungkasan (30, 35) lan wis disaranake kanggo nyelehake owah-owahan sing langgeng ing plasticity synaptic sing ana hubungane karo psikostimulan.

Tujuan saka panliten iki yaiku kanggo nliti owah-owahan struktural dendritik kokain sing diakibatake kokain ing subpopulasi MSN akuntan sing ngandharake reseptor D1 utawa D2. Ing studi kasebut, kita wis nggunakake tikus transgenik kromosom bakterial bakteri (BAC) sing ngandhakake EGFP ing sangisoré kontroler reseptor dopamin D1 (Drd1-EGFP) utawa D2 (Drd2-EGFP)36). Hasil kasebut nunjukake menawa, sanajan tambah kepadatan tulang tonggong pisanan ana ing DNNUMX reseptor MSNs lan MSNs sing mengandung reseptor D1, kerapatan tulang tonggong sing kuwat mung stabil ing neuron sing duweni reseptor D2. Menapa malih, kita nemoni perubahan ingkang sami ing ekspresi faktor transkripsi ΔFosB, nedahaken bilih ΔFosB saged dipunlibataken ing pembentukan lan / utawa pangopènan dendritik duri ing D1 ugi neuron ingkang mengandung reseptor D1 ing NAcc.

results

Analisis MSN ing Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP BAC Transgenik Tikus.

Pola proyeksi MSNs saka stroke dorsal lan striatum ing tikus transgenik Drd1-EGFP utawa Drd2-EGFP BAC wis ditondoi liwat analisis ekspresi GFP (36). Ekspresi diferensial GFP di MSNs striatum dorsal sepadan dengan reseptor D1 atau D2 endogen, masing-masing (36). Kita luwih analisa ekspresi diferensial GFP ing NAcc ing tikus Drd1-EGFP utawa Drd2-EGFP (Anjir. 1a lan b). Senajan ≈58% neuron ing NAcc mratélakaké GFP ing tikus Drd1-EGFP (Anjir. 1a), ≈48% neuron ing NAcc mratélakaké GFP ing tikus Drd-2-EGFP (Anjir. 1b). MSNs nggambarake 90-95% kabeh neuron ing NAcc (12, 37). Reseptor D1 mung ditulis ing MSN, lan reseptor D2 dicakake ing MSN lan ing internèton cholinergic, sing makili 1-3 saka neuron striatal (37). Mupangatake faktor kasebut, asil nuduhake yen, minimal, ≈10-15% MSN ing NAcc bakal nyatakake reseptor D1 lan D2.

Gambar 1. 

Analisis MSN ing tikus Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP. (a lan b) Tetep irisan otak saka NAcc saka Drd1-EGFP (a) utawa Drd2-EGFP (b) Tikus transgenik BAC ditindhes kanggo GFP lan NeuN (minangka penanda neuronal umum). Gambar sing ditambahake, ing werna kuning, colokalisasi ...

Analisis Spine Dendrit ing Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP Tikus.

Ekspresi GFP ing tikus Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP migunani kanggo noda awak sel neuronal. Nanging, sinyal GFP ing dendrite lan dendritik duri didol banget kanggo ngidini analisis kasebut sawise immunostaining karo antibodi anti-GFP. Pangiriman balistik sing digediasi partikel saka pewarna fluorescent wis bubar digunakake kanggo nyelehake populasi neuronal kanthi cepet lan efisien38). Saben neuron bisa dicap kanthi nggunakake teknik iki, lan cara iki bisa ditandingake karo Golgi-Cox pewarnaan. Kanggo nganalisis morfologi neuron dendritik ing NAcc, irisan accumbal sing tetep dicelupake kanthi pewarna fluoresensi lipofilik 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) kanthi nggunakake pistol gene. Conto saka MSN diarani ing Anjir. 1c. Ing salebetipun kondisi ingkang dipunginaaken, kita sacara umum nedahaken neuron kanthi label tanpa nyebar dendrit saking neuron berlabel sanesipun. Ing perbesaran sing luwih dhuwur, morfologi dendritik sing rinci, kayata dendritik duri, bisa diamati (Anjir. 1d).

Kita banjur nggunakake kombinasi DiI labeling lan immunohistochemistry kanggo GFP ing salah siji tikus transgenik Drd1-EGFP utawa Drd2-EGFP, sing bisa digawe kanthi konsentrasi rendah deterjen kanggo permeabilisasi jaringan (pirsani cara). Liwat perbandingan sing cetha ana ing stain Diet lan ekspresi GFP ing badan sel MSN, kita bisa nemtokake neuron DiI- lan GFP-positif utawa DiI-positif lan GFP-negatif ing Drd1-EGFP (Anjir. 2a) utawa Drd2-EGFP (Anjir. 2b) tikus. Kanggo pasinaon ing ngisor iki, kita nganalisa morfologi dendrit ing mung neuron DiI- lan GFP positif saka tikus Drd1-EGFP utawa Drd2-EGFP.

Gambar 2. 

Analisis spines dendritik ing tikus Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP. Neuron ing NAcc salah sawijining tikus Drd1-EGFP (a) utawa tikus Drd2-EGFP (b) sing pisanan dilabeli kanthi DiI (abang) lan banjur dilakoni ing imunohistokimia kanthi nggunakake antibodi anti-GFP (EGFP, ijo). Mung ...

Hasil Pengobatan Cocaine Kronis ing Kapasitas Tulang Jangkung Meningkat ing MSNs Accumbal Ngandharake Drd1-EGFP utawa Drd2-EGFP.

Tikus Drd1-EGFP utawa Drd2-EGFP disuntikake kaping pirang-pirang karo kokain (30 mg / kg) utawa uyah kanggo papat minggu berturut-turut (waca cara). Rong dina (2WD) utawa 30 dina (30WD) sawise perawatan obat pungkasan, otak wis diproses kanggo DiLabel lan immunohistokimia kaya sing kasebut ing ndhuwur. Saliyane sinau dilapurake yen perawatan kronis kanthi amphetamine tambah kepadatan bobot ing distal nanging ora proksimal dendrit MSN ing NAcc (35). Mulane kita nganetepi analisis kita marang dendrites distal (ie, sing nganggo cabang liya utawa katelu), kalebu wilayah terminal. Nalika dianalisis ing 2WD, kerapatan tulang tongkat ditemokake kanggo nambah ing MSNs Drd1-EGFP positif (128% saka kelompok asin) (Anjir. 3a lan c) lan tingkat sing luwih duwur ing neuron neuron Drd2-EGFP (115% saka kelompok asin) (Anjir. 3 b lan d). Sawise 30WD, tambah kepadatan tulang tonggong dipertahankan ing neuron Drd1-EGFP-positif (118% kontrol saline) (Anjir. 3 a lan c) nanging ora ing neuron Drd2-EGFP (Anjir. 3 b lan d).

Gambar 3. 

Cocaine kronis-induced mundhak ing dawa spine ing Drd1-EGFP- utawa Drd2-EGFP-positif MSNs ing NAcc. (a lan b) Drd1-EGFP (a) utawa Drd2-EGFP (b) tikus diobati karo saline (Sal) utawa kokain (Coc, 30 mg / kg) kanggo minggu 4. Telung tikus 2WD utawa 30WD diproses ...

Morfologi spines dendritik bervariasi sajroning segi panjang lan jembaré kepala balung. Mulane, klompok protèin dendritik dadi papat kelas balung (stubby, jamur, tipis, lan filopodia) ing 2WD saka kokain (data ora ditampilake). Kapasitas jinis jamur (119.7 ± 4.0%, P <0.01) lan duri lancip (120.0 ± 3.4%, P <0.01) ditambah dening pangobatan kokain ing MSNs positif Drd1-EGFP, dene kapadhetan rintisan (182.4 ± 21.6%, P <0.05) lan spines jamur (122.5 ± 5.0%, P <0.01) tambah ing MSN positif Drd2-EGFP. Ora ana kenaikan signifikan duri duri ing neuron positif Drd1-EGFP utawa duri tipis ing neuron positif Drd2-EGFP.

Cocaine kronis nyebabake ΔFosB Expression ing Drd1-EGFP- utawa MSNs Drd2-EGFP-positif ing NAcc.

ΔFosB iku anggota kulawarga transkripsi saka faktor transkripsi. Déné pangangkut kokain sing nyebabake induksi kanthi cepet saka sawetara isoform Fos ing NAcc, eksposur saka kokain mundhak tingkat ΔFosB. Kajaba iku, paningkatan ekspresi ΔFosB tetep ana ing NAcc kanggo minggu nganti pirang-pirang wulan sawisé mateni paparan obat-obatan lan wis disaranake supaya bisa melu regulasi ekspresi gen sing tahan, sanajan sawise njupuk obat-obatan (ceases)29, 39, 40).

Kanggo mriksa induksi ΔFosB ing NAcc saka Drd1-EGFP utawa Drd2-EGFP minangka perawatan kokain, kita nganalisis ekspresi FosB lan GFP kanthi label gandaAnjir. 4 lan Tabel 1) Antibodi anti-FosB ngenali kabeh bentuk FosB, nanging kita nganggep yen immunostain sing luwih dhuwur nggambarake ΔFosB (waca cara kanggo diskusi luwih lanjut). Ing tikus saline-treated, 16% neuron Drd1-EGFP lan 15% neuron Drd2-EGFP ngandhakake immunoreaktifitas FosB kanthi intensitas sing relatif lemah (Anjir. 4 a lan b lan Tabel 1). Pangobatan kokain sing diulang sawise 2WD ngasilake ningkatake jumlah neuron Drd1-EGFP positif sing didadekake ΔFosB (55% neuron GFP positif)Anjir. 4c lan Tabel 1). Ekspresi ΔFosB sing luwih cilik, nanging tetep signifikan ing neuron Drd2-EGFP (25% neuron positif GFP)Anjir. 4d lan Tabel 1). Karo perubahan owah-owahan spine, ekspresi tambah ΔFosB dipertahankan ing neuron Drd1-EGFP positif (46% neuron GFP positif) nanging ora ing neuron Drd2-EGFP positif (15% neuron positif GFP) 30WD (Anjir. 4 e lan f lan Tabel 1). Elinga yen tambah ΔFosB expression diamati ing Anjir. 4f saiki ana ing neuron Drd2-EGFP.

Gambar 4. 

Cocaine kronis ngakibatake ekspresi ΔFosB ing MSDs-Drd1-EGFP- utawa MSNs-DRD2-EGFP ing NAcc. Drd1-EGFP (a, c, Lan e) utawa Drd2-EGFP (b, d, Lan f) tikus diobati karo cuka utawa kokain kronis kaya sing dijelasake ing Anjir. 3. 2WD (c lan d) utawa 30WD (e lan ...
Tabel 1. 

Kuantisasi neuron EGFP positif sing artine ΔFosB

Diskusi

Adaptasi long-term ing neurotransmission dopaminergic dipercaya nduwe perilaku adiktif sing gegayutan karo obat psikostimulant. Khususé, kenaikan psikostimulant-induced ing dendritik kerepotan bobot MSN ing NAcc wis hypothesized bakal disambung karo reorganisasi panyambungan synaptic (30). NAcc dumadi saka rong subpopulations sing béda saka MSN sing ngandhut tingkat dhuwur saka reseptor dopamin D1 utawa D2. Ing panliten iki, kita wis nganalisis bobot keruwetan ing D1 utawa MSNs reseptor D2 sing béda ing NAcc sawise perawatan kokain kronis. Hasil sing ditemtokake nuduhake, sanajan tambah kepadatan tulang tongkangan pisanan ana ing DNNUMX reseptor MSNs lan reseptor MSNs sing mengandung D1, keruwetan tulang belakang sing kubah mung stabil ing neuron sing duweni reseptor D2. Kajaba iku, kita nemokake pola sing padha karo owahan ing ekspresi saka faktor transkripsi ΔFosB ing D1 lan DNNUMX reseptor-containing MSNs.

Pasinaon iki nggunakake tikus trans Bacteria BAC sing ngandhakake GFP ing subpopulasi spesifik MSN ing kontrol saka promotor reseptor D1 utawa D2. Kajaba iku, kita ngembangake metode double-labeling sing digabungake imunohistokimia kanggo GFP kanthi label balistik neuron nggunakake DiI. Panaliten sadurungé wis nggunakake metode Golgi-Cox kanggo nganalisis efek psychostimulants ing kepadatan tulang tonggak (34), lan metode Dii sing dipigunakaké ing kene mènèhi asil sing padha bisa ditandingi. Kita ngembangake metode labeling ganda amarga pewarnaan Golgi ora cocog karo imunohistokimia. Immunostaining biasane mbutuhake permeabilisasi jaringan karo deterjen, proses sing biasane ndadékaké kanggo solubilisasi pewarna lipophilic saka membran (38). Nanging, ing pawiyatan kita saiki, immunostaining GFP ora mbutuhake konsentrasi deterjen dhuwure kanggo permeabilisasi jaringan lan kanthi mangkono bisa digunakake sajrone ngasilake pewarna lipophilic. Metode labeling kaping pindho kudu umum migunani kanggo nyinaoni owah-owahan struktural ing spines dendritik, umpamane nalika digunakake kanggo analisis garis tikus transgenik BAC ngendi GFP ditulisake ing populasi spesifik neuron ing korteks (36).

Senajan isih kontroversial, dipercaya manawa reseptor D1 lan D2 sebaran anatomis dibedakake langsung karo striatonigral lan neuron proyeksi striatopalidal langsung,17, 41). Karakterisasi awal lokalisasi GFP ing tikus Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP konsisten karo kesimpulan kasebut (36). Luwih saka kuwi, analisis kita marang jumlah neuron positif GFP ing NAcc saka tikus Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP konsisten karo kesimpulan yen ≈50% saka MSN ngandharake reseptor D1, sing ≈35-40% mung nuduhake reseptor D2, lan ≈10-15% coexpress loro D1 lan D2 reseptor. Nilai coexpression iki padha karo sing diwenehake dening studi babagan striatum dorsal sing nggabungake analisis patch-clamp neuron striat tunggal karo teknik RT-PCR kanggo ngisolasi lan nguatake mRNAs (≈17% coexpression of enkephalin lan substansi P) (42). Perlu dicathet yen pasinaon kita saiki ora ngatasi masalah ekspresi reseptor D3, D4, lan D5, utawa ora ngatasi masalah reseptor reseptor D1 ing MSN kanthi tingkat reseptor D2 sing luwih dhuwur utawa kosok balene.

Sawetara studi sadurunge wis nliti pangembangan neuronal psychostimulant-induced Fos expression lan peran reseptor D1 lan D2 (43-45). Pasinaon kasebut nyengkuyung kesimpulan yen Fos lan induksi ΔFosB dimediasi dening aktivasi reseptor D1. Nanging, lokalisasi pangecualian Fos dipengaruhi dening konteks lingkungan ing ngendi obat psikostimulan diterbitake (46, 47). Contone, amphetamine utawa kokain sing diwenehake ing kandhang ngarep ngindhuksi gene awal sing cepet (kalebu Fos) sing luwih disengaja ing inti sel P-positif sing nyatakake reseptor D1. Sacoro bedane, obatan kasebut bisa ngindhakake ekspresi Fos ing D1 lan D2 reseptor-containing MSN nalika diterbitake ing lingkungan novel. Protokol sing digunakake ing pasinaon kita saiki ora kalebu injeksi narkoba kanthi paparan lingkungan novel. Nanging, kita ora bisa ngendheg sawetara stres gumantung kontekstual sing tanggung jawab ekspresi ΔFosB ing MSNs reseptor D2.

Ciri khas saka asil saiki yaiku pola paralel saka kepadatan tulang punggung lan ekspresi ΔFosB. Kapasitas spine tambah lan ekspresi ΔFosB wiwitane ana ing MSNs ngandhut Drd1-EGFP lan Drd2-EGFP. Nanging, owah-owahan kasebut mung stabil ing neuron sing mengandung reseptor D1. Salah sawijining panjelasan sing bisa ditemtokake manawa paningkatan spine density lan ekspresi ΔFosB ditemokake ing neuron sing duweni reseptor D2, iki ana ing fraksi cilik saka MSN sing nyatakake reseptor dopamin D1 lan D2. Mangkono, sifat transient saka mundhut iki bisa digandhengake karo efek antagonist saka aktivasi reseptor D2 ing jalur pandharisan gumantung D1 (48). Kapentingan kanggo owah-owahan ing kepadatan tulang punggung lan ekspresi ΔFosB bisa dibalik, sing bisa nggambarake kemampuan jalur sinyal sing gumantung reseptor D2 kanggo nguatake stabilitas ΔFosB.

Observasi sing ana owah-owahan paralel ing ekspresi ΔFosB lan kepadatan tulang pérak iku konsisten karo gagasan sing ΔFosB melu ing pambentukan wiwitan lan pangopènan dendritik spines ing neuron-reseptor D1 sing ana ing NAcc. Ekspresi ΔFosB dikontrol dening pathways sing gumantung D1 / DARPP-32 / PP1 ing MSN (49). Sawetara panaliten nampilake yen ΔFosB nduweni peranan penting sajroning psychostimulants (rewarding and locomotor-activating actions)39), kanthi ngedhunake ekspresi saka macem-macem gen sing kalebu reseptor neurotransmitter, protein sing menehi tandha, lan proti sing melu aturan morfologi neuron (50). Nanging, mekanisme molekul tartamtu sing nyebabake pambentukan spine cocaine kronis ora saiki dikenal. Studi sadurungé kita wis nampilake yen infra intravaskular saka inhibitor Cdk5 roscovitine ngilangi cocaine-induced increase in density spine (51). Menapa malih, Cdk5 minangka gene target hilir kangge ΔFosB lan sampun dipunkubuh wonten owah-owahan adaptif ingkang saged dipuntampi kaliyan pengobatan kokain kronis (52). Mulane, perubahan ing fosforilasi gumantung Cdk5 minangka mekanisme sing bisa ditemokake sing ndadekake formasi spine cocaine lan / utawa stabilitas tulang belakang. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), lan spinophilin (56) minangka substrat kanggo Cdk5 lan kabeh kalibat ing regulasi morfogenesis tulang punggung (57-60). Karakteristik luwih akeh kasebut lan substrat Cdk5 ing spine bakal mugia nduduhake mekanisme sing ana ing regulasi pembentukan tulang punggung dening psychostimulants.

cara

Kéwan.

Tikus-tikus mawa transgene EGFP ing kontrol salah sawijining reseptor D1 utawa D2 didadekake dening transgenik Gensat BAC project (36). Tikus transgenik sing digunakake ing panliten iki yaiku minggu-minggu 4-5 lan ana ing latar mburi Swiss-Webster. Tikus dipertahankan ing siklus 12: 12-h / sikil gelap lan dumunung ing golongan 2-5 kanthi pangan lan banyu sing ana ing libitum. Kabeh protokol kewan padha karo National Institutes of Health Guide kanggo Care and Use of Laboratory Animals lan disetujoni dening Universitas Rockefeller Institution Animal Care and Use Committee.

Perawatan Narkoba.

Pangobatan kokain kronis (30 mg / kg, saben dina) kacarita ngasilake nambah bobot ing kepadatan tulang tonggak MSN ing inti lan cangkang NAcc saka tikus, nanging dosis sing luwih murah (15 mg / kg) mung ningkatake kepadatan tulang tonggong cangkang (61). Mulane kita nggunakake dosis kokain sing luwih dhuwur kanggo nginduksi modifikasi struktural ing loro bagean NAcc. Tikus nampi siji injeksi (ip) saka 30 mg / kg kokain-HCl (utawa uyah) saben dina kanggo 5 dina berturut-turut, diiringi dina ora injeksi 2, lan prosedur iki diulang kanggo 4 minggu-minggu berturut-turut. Injeksi kasebut ditindakake ing kandhang ngarep. 2WD utawa 30WD, tikus tikus diproses kanggo Dieling lan / utawa immunohistokimia.

Labeling Ballistic karo Dye Fluorescent DiI.

Tikus uga ana ing anesthetized karo 80 mg / kg sodium pentobarbital lan perfused transcardially karo 5 ml saka PBS, diiringi perfusi cepet kanthi ml 40 saka paraformaldehida 4 ing PBS (20 ml / min). Pemikiran wis cepet dibuang saka tengkorak lan postfixed ing 4% paraformaldehyde kanggo 10 min. Irisan otak (100 μm) dilapisi kanthi pamuter ballistic saka pewarna fluorescent DiI (Probes Molekul) kaya sing diterangake ing ref. 38. Metode labelling-immunohistochemistry digabungake kanthi konsentrasi rendah deterjen. Dii-labeled bagean permeabilized karo 0.01% Triton X-100 ing PBS kanggo 15 min banjur diinkubake ing 0.01% Triton X-100 lan 10% normal serum wedhus ing PBS kanggo 1 h kanggo nyilikake nonspecific labeling. Bagian tisu banjur diinkubasi karo 1% serum wedhus normal / 0.01% Triton X-100 lan anti-GFP antibodi (Abcam, Cambridge, MA) kanggo 2 h ing suhu kamar, dicuci lan diinkubasi ing 1: 1,000 dilusi FITC- antibodi sekunder conjugated (Probes Molekul). Bagian kasebut diselehake ing slamet mikroskop lan ditudhuhake kanthi medium sing dipasang. Cara labeling labeling ngidinake analisis rinci struktur spine dendritik, lan asil sing diduweni sacara kualitatif lan kuantitatif bisa ditandingake karo studi sadurunge nggunakake metode impregnasi Golgi-Cox ing irisan otak tikus34). Nanging, beda karo panaliten sadurunge, kita jarang nonton spin loro sing ana ing neuron DiI-noda. Benten iki bisa disebabake dening sensitivitas cara pewarnaan utawa variasi mouse (penelitian iki) tinimbang jaringan tikus (34).

Immunohistochemistry.

Kewan-kewan padha anesthetized lan perfused minangka diterangake ing ndhuwur. Pemikiran wis dibuang lan disimpen sewengi ing 4% paraformaldehida ing 4 ° C. Pemikiran ditransfer menyang 30% sukrosa ing larutan PBS kanggo cryoprotection. Coronal sections (12 μm) dipotong ing microtome pembekuan (Leica) lan banjur diolah kanggo imunohistokimia. Bagian otak banjur di-permeabilisasi ing 0.3% Triton X-100 ing PBS kanggo 15 min lan dibilas kaping pindho ing PBS. Bagian kasebut diumumake ing 10% serum kambing normal ing PBS kanggo 1 h ing 37 ° C, sing ana ing antibodi utama (dicampur ing 1% serum kambing normal ing PBS) sewengi ing 4 ° C, banjur dibilas ing PBS lan diinkubasi karo sekunder antibodi kanggo 1 h ing 37 ° C. Antibodi kasebut digunakake: anti-pan-FosB kelinci (SC-48, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-NeuN (Chemicon) mouse, anti kelinci kelinci, IgG anti-rabbit conjugated FITC, conjugated anti-mouse IgG (Molecular Probes). Kanggo triple labeling (ΔFosB, NeuN, lan GFP), bagian otak ditemoni kanthi antioksidan antibodi antibodi antibodi lan antibodi anti-NeuN anti-pan banjur diinkubasi karo antibodi sekunder (IgG anti-kelinci rhodamine-conjugated IgG lan IgG anti-tikus cyan-conjugated) ). Bagian otak kaping pindho luwih diproses kanggo immunostaining GFP nggunakake teknologi labeling Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Probes Molekul). Antibodi anti-pan-FosB diunggahake ing terminal N saka FosB lan ngenali ΔFosB lan FosB lengkap (62). Adhedhasar panaliten sadurungé sing nuduhake yen ΔFosB nanging ora antigen FosB utawa Fos liya sing gegandhengan karo steroid kasebut kanthi tegas sawise perawatan kokain kronis, kita nganggep yen mundhake immunoreaktivitas sing tahan suwe nuduhake ekspansi stabil ΔFosB. Nanging, identitas sinyal FosB immunoreaktif kang diamati ing tikus saline-dianggep ora dingerteni. Analisis statistik ing Tabel 1 digunakake mahasiswa t test.

Analysis Spine Dendritik.

MSN individu ing NAcc dipilih kanggo analisa spine adhedhasar sawetara kritéria. (i) Ana minimal utawa ora tumpang tindih karo sel label liyane kanggo mesthekake yen proses saka sel beda ora bakal bingung. (ii) Paling ora telung dendrit primèr sing perlu ditemokake kanggo sel sing digunakake kanggo analisis. (c) Dendrit distal (dendrit terminal utawa cedhak terminal dendrite) ditliti. Dendrit saka kalorone MSN ing inti lan cangkang NAcc dianalisis. Sanajan kita amati MSN spiny (spiny type II), mung nganalisa MSN spiny (jinis spiny I). Kanggo ngetung kerapatan tulang belakang, dendrite dawane (> dawane 20 μm) dilacak kanthi nggunakake mikroskop confocal (Zeiss LSM 510) kanthi lensa perendaman minyak (× 40). Kabeh gambar dendrit dijupuk kanthi beda z tingkat (0.5-1 μm depth interval) kanggo mriksani morphology dendritic spines. Kabeh pangukuran digawe karo piranti lunak analisis gambar metamorph (Universal Imaging, Downingtown, PA). Analisis statistik migunakaké tes Kolmogorov-Smirnov.

Protrusion saka dendrit diklasifikasèkaké dadi 4 jinis adhedhasar dawa sing kasebut ing ngisor iki. 63 lan 64. Tonjolan kelas 1, uga diarani protuberansi rintisan, dawane <0.5 μm, kurang endhas tulang punggung, lan katon ora duwe gulu; kelas 2, utawa duri sing bentuk jamur, antarané antara 0.5 lan 1.25 μm lan ditandhani karo gulu cendhak lan endhas tulang punggung gedhe; kelas 3, utawa duri sing lancip, kisaran antara 1.25 lan 3.0 μm lan gulu balung mburi sing dawa karo endhas cilik; kelas 4, utawa ekstensi filopodial, yaiku tonjolan filamen dawa sing ora duwe sirah balung mburi sing bisa dingerteni.

Acknowledgments

Karya iki didhukung dening Layanan Kesehatan Masyarakat Amerika Serikat Grant DA10044 (kanggo PG lan ACN) lan déning The Simons Foundation, Yayasan Peter J. Sharp, Picower Foundation, lan FM Kirby Foundation.

Cekakan

  • NAcc
  • nukleus accumbens
  • MSN
  • neuron spin medium-ukuran
  • LAC
  • kromosom buatan
  • DrD1
  • dopamin reseptor D1 promoter-driven
  • DrD2
  • dopamin reseptor D2 promoter-driven
  • DiI
  • 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
  • 2WD
  • 2 dina sawise perawatan obat pungkasan
  • 30WD
  • 30 dina sawise perawatan obat pungkasan.

Cathetan sikil

 

Konflik kepentingan statement: Ora ana konflik sing diumumake.

Cathetan Suku

1. Totterdell S., Smith ADJ Chem. Neuroanat. 1989; 2: 285-298. [Sunting]PubMed]
2. Smith Y., Bevan MD, Shink E., Bolam JP Neuroscience. 1998; 86: 353-387. [Sunting]PubMed]
3. Heikkila RE, Orlansky H., Cohen G. Biochem. Pharmacol. 1975; 24: 847-852. [Sunting]PubMed]
4. Ritz MC, Lamb RJ, Goldberg SR, Kuhar MJ Science. 1987; 237: 1219-1223. [Sunting]PubMed]
5. Nestler EJ Trends Pharmacol. Sci. 2004; 25: 210-218. [Sunting]PubMed]
6. Kalivas PW, Stewart J. Brain Res. Rev. 1991; 16: 223-244. [Sunting]PubMed]
7. Pierce RC, Kalivas PW Brain Res. Rev. 1997; 25: 192-216. [Sunting]PubMed]
8. Robinson TE, Berridge KC Annu. Rev. Psychol. 2003; 54: 25-53. [Sunting]PubMed]
9. Wolf ME, Khansa MR Brain Res. 1991; 562: 164-168. [Sunting]PubMed]
10. Vanderschuren LJ, Kalivas PW Psychopharmacology. 2000; 151: 99-120. [Sunting]PubMed]
11. Sesack SR, Pickel VMJ Comp. Neurol. 1992; 320: 145-160. [Sunting]PubMed]
12. Smith AD, Bolam JP Trends Neurosci. 1990; 13: 259-265. [Sunting]PubMed]
13. Sibley DR, Monsma FJ, Jr. Trends Pharmacol. Sci. 1992; 13: 61-69. [Sunting]PubMed]
14. Beckstead RM, Cruz CJ Neuroscience. 1986; 19: 147-158. [Sunting]PubMed]
16. Gerfen CR, Young WS, III Brain Res. 1988; 460: 161-167. [Sunting]PubMed]
16. Gerfen CR Trends Neurosci. 2000; 23: S64-S70. [Sunting]PubMed]
17. Gerfen CR, Engber TM, Mahan LC, Susel Z., Chase TN, Monsma FJ, Jr., Sibley DR Science. 1990; 250: 1429-1432. [Sunting]PubMed]
18. Zahm DS Neurosci. Biobehav. Rev. 2000; 24: 85-105. [Sunting]PubMed]
19. Lu X.-Y., Ghasemzadeh MB, Kalivas PW Neuroscience. 1998; 82: 767-780. [Sunting]PubMed]
20. Koob GF, Le HT, Creese I. Neurosci. Lett. 1987; 79: 315-320. [Sunting]PubMed]
21. Woolverton WL, Virus RM Pharmacol. Biokim. Behav. 1989; 32: 691-697. [Sunting]PubMed]
22. Bergman J., Kamien JB, Spealman RD Behav. Pharmacol. 1990; 1: 355-363. [Sunting]PubMed]
23. MP Epping-Jordan, Markou A., Koob GF Brain Res. 1998; 784: 105-115. [Sunting]PubMed]
24. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Bergman JJ Pharmacol. Exp. Dadi 1999; 291: 353-360. [Sunting]PubMed]
25. De Vries TJ, Cools AR, Shippenberg TS NeuroReport. 1998; 9: 1763-1768. [Sunting]PubMed]
26. Self DW, Barnhart WJ, Lehman DA, Nestler EJ Science. 1996; 271: 1586-1589. [Sunting]PubMed]
27. Khroyan TV, Barrett-Larimore RL, Rowlett JK, Spealman RDJ Pharmacol. Exp. Dadi 2000; 294: 680-687. [Sunting]PubMed]
28. Alleweireldt AT, Weber SM, Kirschner KF, Bullock BL, Neisewander JL Psychopharmacology. 2002; 159: 284-293. [Sunting]PubMed]
29. Nestler EJ Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 119-128. [Sunting]PubMed]
30. Robinson TE, Kolb B. Neuropharmacology. 2004; 47: 33-46. [Sunting]PubMed]
31. Kalivas PW Curr. Mesthine. Pharmacol. 2004; 4: 23-29. [Sunting]PubMed]
32. Hyman SE, Malenka RC Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 695-703. [Sunting]PubMed]
33. Robinson TE, Kolb BJ Neurosci. 1997; 17: 8491-8497. [Sunting]PubMed]
34. Robinson TE, Kolb B. Eur. J. Neurosci. 1999; 11: 1598-1604. [Sunting]PubMed]
35. Li Y., Kolb B., Robinson TE Neuropsychopharmacology. 2003; 28: 1082-1085. [Sunting]PubMed]
36. Gong S., Zheng C., Doughty ML, Losos K., Didkovsky N., Schambra UB, Nowak NJ, Joyner A., ​​Leblanc G., Hatten ME, et al. Alam. 2003; 425: 917-925. [Sunting]PubMed]
37. Zhou FM, Wilson CJ, Dani JAJ Neurobiol. 2002; 53: 590-605. [Sunting]PubMed]
38. Grutzendler J., Tsai J., Gan WB Methods. 2003; 30: 79-85. [Sunting]PubMed]
39. Kelz MB, Chen J., Carlezon WA, Jr., Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen C., Zhang YJ, Marotti L., Self DW, et al. Alam. 1999; 401: 272-276. [Sunting]PubMed]
40. Nestler EJ Neuropharmacology. 2004; 47: 24-32. [Sunting]PubMed]
41. Le Moine C., Bloch BJ Comp. Neurol. 1995; 355: 418-426. [Sunting]PubMed]
42. Surmeier DJ, Song WJ, Yan ZJ Neurosci. 1996; 16: 6579-6591. [Sunting]PubMed]
43. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M., Nestler EJJ Pharmacol. Exp. Dadi 1995; 275: 1671-1680. [Sunting]PubMed]
44. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EBJ Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [Sunting]PubMed]
45. Moratalla R., Elibol B., Vallejo M., Graybiel AM Neuron. 1996; 17: 147-156. [Sunting]PubMed]
46. Badiani A., Oates MM, Hari HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Behav. Brain. Res. 1999; 103: 203-209. [Sunting]PubMed]
47. Uslaner J., Badiani A., Norton CS, Day HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 1977-1983. [Sunting]PubMed]
48. Huff RM, Chio CL, Lajiness ME, Goodman LV Adv. Pharmacol. 1998; 42: 454-457. [Sunting]PubMed]
49. Zachariou V., Sgambato-Faure V., Sasaki T., Svenningsson P., Berton O., Fienberg AA, Nairn AC, Greengard P., Nestler EJ Neuropsychopharmacology. 2005 Aug 3; 10.1038 / sj.npp.1300832.
50. McClung CA, Nestler EJ Nat. Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [Sunting]PubMed]
51. Norrholm SD, Bibb JA, Nestler EJ, Ouimet CC, Taylor JR, Greengard P. Neuroscience. 2003; 116: 19-22. [Sunting]PubMed]
52. Bibb JA, Chen J., Taylor JR, Svenningsson P., Nishi A., Snyder GL, Yan Z., Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, et al. Alam. 2001; 410: 376-380. [Sunting]PubMed]
53. Nikolic M., Chou MM, Lu W., Mayer BJ, Tsai LH Alam. 1998; 395: 194-198. [Sunting]PubMed]
54. Kesavapany S., Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J., Ackerley S., Leigh PN, Shaw CE, Miller CC Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 241-247. [Sunting]PubMed]
55. Morabito MA, Sheng M., Tsai LHJ Neurosci. 2004; 24: 865-876. [Sunting]PubMed]
56. Futter M., Uematsu K., Bullock SA, Kim Y., Hemmings HC, Jr., Nishi A., Greengard P., Nairn AC Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 3489-3494. [Sunting]Artikel gratis PMC] [PubMed]
57. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, Zhang D., Chattarji S., Kirkwood A., Tonegawa S. Neuron. 2004; 42: 773-787. [Sunting]PubMed]
58. Murase S., Mosser E., Schuman EM Neuron. 2002; 35: 91-105. [Sunting]PubMed]
59. Prange O., Murphy THJ Neurosci. 2001; 21: 9325-9333. [Sunting]PubMed]
60. Feng J., Yan Z., Ferreira A., Tomizawa K., Liauw JA, Zhuo M., Allen PB, Ouimet CC, Greengard P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 9287-9292. [Sunting]Artikel gratis PMC] [PubMed]
61. Li Y., Acerbo MJ, Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2004; 20: 1647-1654. [Sunting]PubMed]
62. Perrotti LI, Bolanos CA, Choi KH, Russo SJ, Edwards S., Ulery PG, Wallace DL, DW DW, Nestler EJ, Barrot M. Eur. J. Neurosci. 2005; 21: 2817-2824. [Sunting]PubMed]
63. Harris KM, Jensen FE, Tsao BJ Neurosci. 1992; 12: 2685-2705. [Sunting]PubMed]
64. PW Vanderklish, Edelman GM Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 1639-1644. [Sunting]Artikel gratis PMC] [PubMed]