PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Perubahan kosokulasi cocaine ing ekspresi gene nyebabake owah-owahan morphology lan prilaku neuronal sing bisa ndadekake kecanduan kokain. Kita ngenali peran penting kanggo dimetilasi 3 lysine 9 (H3K9) lan dimethyltransferase lysine G9a ing plasticity struktural lan tindak tanduk cocaine. Koefisien kokain sing bola-bali ngurangi tingkat dimetilasi H3K9 global ing accumbens inti. TPengurangan ing histone methylation diarani liwat penindasan G9a ing wilayah otak iki, sing diatur dening faktor transkripsi kokain sing didhuksi ΔFosB. Nggunakake mutagenesis kondisional lan transfer gene-mediated virus, kita nemokake sing G9a downregulation tambah spine dendritic plexus nukleus accumbens neuron lan pilihan sing luwih apik kanggo kokain, kanthi mangkono nggawe peranan penting kanggo methylation histone ing tumindak jangka panjang kokain.
Pambuka
Eksposisi kokain sing diulang ditondoi kanthi owah-owahan ekspresi gen lan morfologi neuronal sing diganti ing inti accumbens (NAc), komponen utama sirkuit ganjaran otak (1-2). Remodeling kromatin penting banget kanggo owah-owahan transcriptional aberrant ing wilayah otak sing bisa ndandani aspirasi kecanduan kokain (3-9). Regulasi cocaine struktur kromatin ing asil NAc, sabagean, saka modifikasi langsung kokain sing diasilake saka mesin enzimatik kromatin, sing ndadékaké perubahan asetilasi histon lan fosforilasi (4, 7-9); Nanging, peran kanggo enzim sing ngontrol métilasi histon durung diselidiki.
Analisis promotor génom anyar nggunakake imunopasthitasi kromatin sing digabung karo microarrays (Chip-Chip) ngidentifikasi pola histone H3 lysine 9 (H3K9) lan 27 (H3K27) metilasi ing promotor gene spesifik ing NAc sawise perawatan kokain berulang6). Mulane, kita nyathet akeh methyltransferases lysine (KMTs) lan demethylases (KDMs) sing dikenal kanggo ngontrol methylation H3K9 utawa H3K27 (Gambar 1A). Mung kalih enzim, G9a lan GLP, nampilake regulasi transcriptional sing terus-terusan ing jam 24 sawise administrasi kokain sing bola-bali, nalika ekspresi kedadeyane gen sacara signifikan downregulated. Amarga G9a lan GLP catalyze dimethylation saka H3K9 (H3K9me2), downregulation dening kokain punika konsisten karo mudhun tingkat global saka euchromatic H3K9me2 diamati ing wektu iki titik (Gambar 1B). Ing kontras, métilasi heterokromatik H3K27 tingkat global tetep ora diowahi kanthi pajanan cocaine sing bola-bali (Gambar S1 ing ndhukung materi online). Amarga tingkat dhuwur katalitik aktivitas loro in vitro lan ing vivo (10), kita nemtokake luwih lanjut babagan kapentingan fungsi G9a minangka panangkepan cocaine liwat ing NAC. Tingkat protein G9a, kaya tingkat mRNA, ngurangi jam 24 sakwise cocaine administration (Gambar S2). Senajan ekspresi mRNA G9a dikurangi dening 35% ing NAC, analisis imunohistokimia ngungkapake pangurang% 15 ing tingkat protein G9a sing luwih modhèrn, konsisten karo pangurangan 21% ing H3K9me2 sawise administrasi kokain sing bola-bali (Gambar 1B). Ekspresi mRNA G9a uga ditindhes ing wilayah otak iki kanthi 20% ing ngisor iki,Gambar S3).
Kanggo nemtokake manawa owah-owahan ing H3K9me2 ekuostromat kautamane karo perubahan genome ing ekspresi gen ing NAc, kita nganakake analisis microarray kanggo mriksa profil ekspresi gene sing diakibatake dening tantangan cocaine dosis kokain ing kéwan kanthi utawa tanpa riwayat ekspose kokain sadurunge (pirsani tambahan dhaptar gene ing Tabel S1-S3). Kéwan sing wis nampa cocaine sing bola-bali nampilake épisode gèn ekspresi gen sing gedhé nalika jam 1 sawisé tantangan kokain sing dibandhingake karo kéwan sing dianggep akut (Gambar 1C). Ekspresi gene iki isih dumadi kanggo nanggepi tantangan kokain sing diwenehi sawise minggu mundur saka 1 saka kokain sing bola-bali. Konsisten karo laporan sadurungé, persentase cilik saka gen (~ 10%) nuduhaké respon transkriptional sing ora disenengi miturut administrasi kokain sing bola-bali (Gambar 1C; ndeleng Tabel S1) (5). Kanggo langsung neliti peran G9a downregulation ing ekspresi gene sing diamati sawise cocaine berulang, tikus-tikus nampi injeksi intra-NAc virus herpes simplex (HSV) sing nuduhake GFP utawa G9a lan dianggep karo saline utawa kokain sing bola-bali kanggo nemtokake babagan overexpression G9a cukup kanggo mblokir perangsang ekspresi gen sing cocaine-induced. Saka sapérangan 12 sing dipilih kanthi gen sing nampilake tingkat ekspresi sing dhuwur sawise cocaine bola, kita ngati-ati sing G9a sacara nyata nyuda ekspansi sing luwih dhuwur saka 50% gen kasebut (Tabel S4).
Kanggo ngenali acara-acara transkrip hulu sing ngiringi repress kokain sing diulang saka ekspresi G9a, kita nyelidiki peran sing mungkin kanggo ΔFosB, produk sambatan sing stabil banget saka gen awal sing langsung fosB. ΔFosB akumulasine ing NAC sakwise kedadeyane cocaine, sing wis disambungake kanggo ningkatake ganjaran kokain (11). ΔFosB bisa minangka salah sawijining aktivator transkriptor utawa repressor gumantung saka target gene sing ditindakake (3, 5, 6, 12). Nggunakake bitransgenic NSE-tTA × tetop-ΔFosB tikus, endi Ekspresi ΔFosB bisa dienggo sacara selektif ing stekat NAc lan dorsal kéwan diwasa (13), kita nliti efek ekspresi ΔFosB ing regulasi kokain H3K9me2 lan KMTs ing NAc. Overexpression ΔFosB cukup kanggo nyuda tingkat H3K9me2 (Gambar 1D) lan ekspresi G9a (Gambar 1E), kanthi mangkono niru efek cocaine. Contone, ΔFosB ora ngurangi ekspresi GLP ing wilayah otak iki, lan ora duwe efek ing SUV39H1 lan EZH2, enzim utama trimethylating kanggo H3K9 lan H3K27,Gambar S4). Kanggo ngonfirmasi data kasebut nggunakake sistem overexpression ΔFosB, tikus diwasa wildtype nampa injeksi intra-NAc bilateral vektor virus sing terkait Adeno (AAV) sing nuduhake GFP utawa ΔFosB. Overexpression-mediated ΔFosB menurun tingkat ekspresi G9a ing wilayah otak (Gambar 1E).
G9a kaya kasebut tegese lan tegese njalari kita bisa neliti manawa ngowahi ekspresi G9a khusus ing neuron NAC ngatur respon tingkah laku marang kokain. Tikus Wildtype ditampa injeksi intra-NAc saka vektor HSV sing ngandhut GFP utawa G9a lan banjur dianalisis kanthi nggunakake paradigma preferensi tempat kokain kahanan sing ora adil, sing menehi ganjaran tamba ora langsung. Overkontra virus G9a ing neuron NAc dikonfirmasi pamungkas perilaku (Gambar 2A). Overexpression G9a sacara signifikan ngurangi pilihan kanggo kokain sajrone dibandhingake karo kewan sing overexpressing GFP (Gambar 2B), lan nambah tingkat H3K9me2 ing NAc (Gambar 2C). Overexpression saka mutan sacara katalitik mati G9a (G9aH1093K) (14) ora kena pengaruh kokain (Gambar 2B) lan ora duweni pengaruh marang H3K9me2 tingkat ing wilayah otak (Gambar 2C).
Kanggo luwih sinau peran G9a ing efek perilaku kokain, lan luwih khusus kanggo niru ekspresi kokain sing diulangi ulang ekspresi G9a ing NAc, diwasa G9afl / fl tikus (14) ditampa injeksi intra-NAc saka vektor AAV sing nuduhake Cre recombinase utawa GFP minangka kontrol. AAV-Cre knockdown saka G9a ing NAc, sing dikonfirmasi imunohistokimia (Gambar S5), ningkatake efek kokain ing eksperimen kahanan panggonan lan ngurangi tingkat H3K9me2 ing NAc (Gambar 2D, E). A pharmacological inhibitor sing kasedhiya ing komersial saka G9a lan GLP, BIX01294 (15-16) digunakake kanggo nemtokake yen pamblokiran enzyme uga ndadekake respon perilaku marang kokain. Pancen, inhibisi pharmacological saka G9a lan GLP tambah akeh pilihan kanggo kokain lan mudhun H3K9me2 ing NAc (Gambar 2F, G).
Pangopènan kokain sing diulangi nambahake bobot dendritik duri ing neuron menengah (NAc spiny medium)17), sawijining prosès sing digandhengake karo owah-owahan fungsi ing synapses glutamatergic ing neuron kasebut (18-19) lan respon prilaku sensitized menyang tamba (17, 20). Mulane kita hypothesized yen downregulation kegiatan G9a ing NAC dening cocaine bola bisa ngatasi kemampuan kokain kanggo ngatur dendritic spine Kapadhetan neuron NAc. Nggunakake immunoprecipitation chromatin (Chip) kanthi antibodi anti-G9a, kita nemtokake sapérangan target G9a gèn putative ing NAC, sing sadurungé wis dilibataké ing plastik dendritik sing diduwèni kokain (Gambar 3A) (20-26). Kita nemokake manawa cocaine administrasi sing berlebihan sacara signifikan ngurangi naleni G9a, uga tingkat H3K9me2, ing promotor gene iki (Gambar 3B). Contone, administrasi kokain akut kanthi cepet ngrekrut G9a marang sawetara promotor gene padha, konsisten karo ekspresi G9a sing ditemokake ing jam NAN 1 sawise dosis kokain akut (Gambar S6). Senajan G9a ngiket ing promotor gene spesifik sing gegandhèngan karo owah-owahan ekspresi, tetep ora cetha manawa acara kaya kasebut dimediasi dening G9a tingkat global sing diubah ing NAc lan / utawa kanthi beda perekrutan G9a ing ngisor iki vs. cocaine administration.
Adhedhasar angger-angger G9a babagan macem-macem gen sing duwé pori plasticity ing NAC, kita mirsani manawa pangopènan ekspresi G9a ing wilayah otak iki sawise perawatan kokain bola cukup kanggo mblokir pambentukan spine dendritik sing diduwèni kokain. Nggunakake protokol perawatan kokain sadurunge tampil kanggo ningkatake induksi dendritik ing NAc (20), kita nyinaoni kepadatan balung ing kéwan sing disuntik kanthi HSV-GFP utawa HSV-G9a. Ing persetujuan karo panemuan sadurungé, kita nemokaké kenaikan pinunjul ing dendritic bone density ing NAc sawise perawatan kokain, efek sing diblokir sacara sakabehe dening overexpression G9aGambar 3C). G9a overexpression piyambak ora cukup kanggo ngurangi kepadatan tulang dendritik dengrit NAc tanpa kokain. Kanggo nglengkapi data kasebut, G9afl / fl tikus ditampa injeksi intra-NAc saka HSV-Cre lan kepadatan tulang tonggak diitung lan dibandhingake karo kéwan sing nampi HSV-GFP tanpa kokain. Knockdown saka G9a ekspresi sacara signifikan tambah kepadatan tulang belakang ing neuron menengah (NAc spiny medium)Gambar 3C).
Amarga bukti yen G9a downregulation ing NAC sawise kokain bola-bali ditengahi dening ΔFosB, kita maneh nliti manawa faktor transkripsi iki uga melu anggone nyathet anggone dendritic NAc. Senadyan ΔFosB durung tau dikaitake kanthi kaidah kanggo plastik dendrit, sawetara target, kalebu Cdk5 lan NFbitB subunit, wis dadi kondhisi (20-23), lan ekspresi persekengan ΔFosB ing neuron NAc gegayutan karo tambah dendritik kerucut tulang tonggak sawise perawatan kokain bola (27). Kaping pisanan, kita nemokake yen induksi ΔFosB ing tikus bitransgenic tanpa anané kokain, sing ngeculake ekspresi G9a lan H3K9me2 (Gambar 1D, E), ngurangi naleni G9a kanggo macem-macem gen sing gegandhengan karo plastik, akeh uga wis dituduhake minangka target langsung saka ΔFosB dhewe (Gambar 3D) (3, 6). Kita sabanjuré nedahake yen overexpression virus saka ΔFosB ing NAc sacara signifikan ningkatake dendritic bone density ing basal conditions, sing padha karo sing cocog sawise administrasi cocaine bola (Gambar 3E). Kosok baline, overexpression ing NAc of ΔJunD, protein mutant negatif dominan sing antagonizes kegiatan Transcriptional ΔFosB, diblokir kemampuan kokain bola kanggo nambah formasi spine dendritik ing NAc (Gambar 3C).
Pengamatan kita yen ΔFosB ngatur ekspresi G9a ing NAc, lan ΔFosB lan G9a ngatur sawetara gen target sing padha, mimpin kita kanggo mriksa interaksi liya antara ΔFosB lan G9a. Sawise kokain akut, nalika tingkat G9a tambah, ngiket G9a menyang fosB gene tambah, nalika sawise cocaine berulang, nalika ekspresi G9a ditindhes, G9a ngiket menyang fosB gene mudhunGambar 3A). Kandhutan G9a kaya mengkono sawise cocaine bola-bali ora ditindakake c-fos, ngendi G9a naleni tambah kanthi cocaine berulang (Gambar S7). Iki konsisten karo kasunyatan sing, ora kaya fosB, c-fos ditindakake, ora dipengaruhi, kanthi paparan psychostimulant kronis (5). Overexpression ΔFosB ing tikus bitransgenic cukup kanggo nyuda sacara nyata G9a mengikat menyang fosb gene (Gambar 3D). Sabanjure, overexpressive G9a cukup kanggo ngurangi ekspresi ΔFosB sing tambah sawise ngisor cocaine administration (Tabel S4). Data kasebut nyatake daur ulang autoregulatory ing ngendi G9a mbatesi induksi ΔFosB dening administrasi kokain sing akut. Nanging, minangka ΔFosB akumulasinake eksposur karo obat-obatan sing wis bola-bali, piranti kasebut ngeculake G9a lan kanthi mangkono bisa ngetokake induksi luwih lanjut.
Saklajengipun, kita sampun nedahaken methylation histone lysine ing NAC sacara kritis nularaken anggenipun ngatur ekspresi neuron nanggapi cocaine. Penekanan saka G9a lan H3K9me2 sawise administrasi kokain sing bola-bali ngusulake preferensi kokain, sebagéyan, liwat aktivasi transkripsional saka pirang-pirang gén sing dikenal kanggo ngatur bentuk abadi sing bentuké dendritic. Mupangatake pemahaman sing luwih apik babagan gen sing diatur liwat mekanisme kasebut bakal nambah kawruh kita babagan basis biologi kompleks saka kecanduan narkoba lan bisa mbantu ngembangake pengobatan sing luwih efektif tumrap adiktif.
Bahan lan Metode
Kéwan lan pangobatan
Kajaba disatake, tikus ditempelake 4 nganti 5 saben kandhang ing koloni karo siklus cahya / siklus gelap 12 (lampu saka 7: 00 AM nganti 7: 00 PM) ing suhu konstan (23 ° C) karo ad libitum akses menyang banyu lan pangan. Protokol kewan kabeh disetujoni dening IACUC ing Pusat Kesehatan Southwestern UT lan Sekolah Kedokteran Gunung Sinai.
Kanggo eksperimen kokain [immunohistochemitry, western blotting, kuantitatif PCR (qPCR), analisis microarray lan immunoprecipitation kakek banyu chromatin (Chip)], tikus 8- kanggo tikus C10BL / 57 jantan 6. Kéwan ditampa suntik saben dina saka 'saline' (pangobatan 7 saline, ip), 'akut' kokain (6 pangobatan saline + salah perawatan 20 mg / kg kokaine-HCl, ip) cocaine-HCl, ip). Tikus dikorbanaken jam 7 utawa jam 20 sasampunipun perawatan pungkasan. Kanggo studi microarray, kéwan uga dianggep saben dina kanthi 'saline' (pangobatan 1, saline, ip), kokain 'akut' (pangobatan 24 saline + 15 treatment 14 mg / kg cocaine-HCl, ip) Pangobatan 1 saline + pangobatan 20 7 mg / kg kokaine-HCl, ip) utawa 'cocaine-mundur' akut '(pangobatan 8 20 mg / kg pengobatan kokaine-HCl + 7 saline 20 tantangan perlakuan 7 mg / kg kokain- ip) lan dikorbanaken jam 1 sawisé perawatan pungkasan. Ing percobaan prilaku, tikus padha ditempelake sawise-operasi lan dianggep kanthi 20 mg / kg kokaine-HCl, ip kaya sing kasebut ing ngisor iki. Kanggo ngetrapake analisis spine dendritik lan validasi microarray ing ngisor infèksi HSV-GFP lan HSV-G1a-GFP, tikus dianggep 'saline' (pangobatan 10 saline, ip) utawa 'cocaine berulang' (pangobatan 9 5 mg / kg kokaine-HCl, ) nalika dina 5, amarga protokol injeksi iki sadurunge wis ditrapake kanggo nambah kepadatan spine ing neuron nukleus accumbens (NAc) ing jangka wanci ekspresi transgene virus Herpes simplex (HSV)Supplemental ref S1). Tikus sing digunakake kanggo analisis spine dendritik padha kurban jam 4 sasampunipun perawatan pungkasan.
Kanggo ngindhuksi pambusakan lokal transkrip G9a sing diwatesi kanggo neuron NAc, kita nggunakake homozygous tikus mutah kanggo allel G9a, sing wis dijelasake kanthi rinci ing papan liyaS2). Rekombinasi Cre-induced mrodhuksi exon 22 kanggo 25 splicing metu-saka-pigura anjog kanggo karusakan-mediated saka transcript mutated. We dipigunakaké G9a tikus sing wis dicithak ulang menyang tikus C57BL / 6J. Tikus uga disuntikake menyang NAc karo vektor virus sing digandhengake karo Adeno (serotype 2) sing nuduhake GFP utawa Cre-GFP antarane umur 7 lan 10 minggu. Analisis imunohistokimia digunakake kanggo verifikasi efisiensi rekombinasi Cre-mediated (waca Suplemen Gambar S5). We digunakake AAV nyuntikake kéwan 21 dina pasca operasi amarga rekombinasi ing G9a tikus floxed stabil lan maksimal ing wektu-titik, konsisten karo laporan diterbitake (S3-S4). Eksperimen eksekusi G9a lan ΔJUND padha dileksanakake nggunakake vektor virus HSV sing nuduhake GFP, wildtype G9a-GFP, G9aH1093K-GFP utawa ΔJunD-GFP mati sacara katalitik GXNUMXaHXNUMXK-GFP utawa ΔJunD-GFP (waca S2 kanggo rincian babagan pembangunan konstruksi G9a). HSV overexpressing tikus digunakake 3 dina sawise operasi amarga overexpression maksimal ing wektu-titik, minangka diamati liwat immunohistochemistry. Amarga sifat ekspresi HSV, lan jinis AAV sing luwih stabil, vektor HSV dipigunakaké ing eksperimen sing mbutuhake ekspresi transgene singkat, singkat, déné vektor AAV dipigunakaké ing eksperimen sing mbutuhake periode transgene. Loro-lorone vektor kasebut ditampilake, sajrone panularan sadurunge, kanggo nginfeksi mung sel-sel neuronal ing wilayah otak sing disuntikake, tanpa infeksi neuron afferent utawa efferent.
Kanggo eksperimen perilaku nggunakake inhibitor G9a / GLP pharmacological, BIX01294 (25 ng / μl), tikus padha sterotaxically implanted karo loro mini pumps subkutan, uga guide cannulae bilateral, menyang NAc. Mini-pumps diaktifake jam 12 sadurunge implantasi miwiti pangiriman fokus (0.25 μl / jam) saka salah siji kendaraan (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) utawa obat kanggo dina 14, sajrone wektu evaluasi prilaku ditindakake.
Kanggo eksperimen overexpression ΔFosB [western blotting, qPCR, lan Chip], male bitransgenic NSE-tTA × tetop-ΔFosB tikus dipigunakaké (10 minggu sepisan), ing endi ora ana dxxycycline derivative (8 minggu mati doxycycline), kéwan ditampilake ekspresi konstitutif striatal sing èFosB (S5). Overexpression ΔFosB ing tikus iki dikonfirmasi liwat qPCR. Kanggo konfirmasi temuan nggunakake NSE-tTA × tetop-ΔFosB tikus, wildtype Tikus lanang C8BL / 57 6-minggu wis intra-NAc sing disuntikake sacara sterotaxik karo vektor AAV sing nuduhake GFP utawa ΔFosB-GFP. AAV vektor digunakake, ing kasus iki, kanggo njamin ekspresi ΔFosB maksimal ing 8 minggu pasca operasi, saéngga kanggo perbandingan langsung antarane ΔFosB terinfeksi lan bitransgenic nginfeksi tikus. Overprongasi virus dikonfirmasi nggunakake qPCR ing minggu 8 pasca operasi (pukulan NAN 15-gauge dibedhah ing situs injeksi). Tikus-tikus bereaksi AAV-GFP lan AAV-ΔFosB-GFP sing ora digunakake kanggo qPCR diobati karo saline (pangobatan 14 saline, ip) utawa kokain berulang (pangobatan 14 30 mg / kg kokaine-HCl, ip) surgery. 6 dina sawise perawatan pungkasan, otak wis diatasi kanthi 4% paraformaldehida, dipotong ing vibratome lan digunakake kanggo analisis spine dendrit.
Analisis blot Kulon
14-gauge NAc punches dijupuk saka korona 1 mm sing diduweni nggunakake matriks tikus otak stainless steel lan dideleng ing 1 M HEPES lysis buffer (1% SDS) sing ngandung inhibitor protease lan fosfatase. 10-Sampel 30 μg protein total wis diselehake ing 18% SDS gel. Protein ditransfer menyang membran PVDF lan diinkubasi karo anti-H3K9me2 (monoclonal tikus, 1: 500), anti-β-tubulin (tikus monoklonal, 1: 60,000), histone anti-total H3 (rabbit polyclonal, 1: 5,000) anti-GFP (dipigunakaké kanggo verifikasi ekspresi virus sing padha ing tisu punched) (kelinci poliklonal, 1: 1000), anti-H3K27me3 (kelinci poliklonal, 1: 500) utawa anti-actin antibodies (mouse monoclonal, 1: 60,000) 4 ° C (kabeh membran diblokir ing susu 5 utawa 5% sapi serum sapi). Membran banjur diinkubake karo antibodi sekunder sing duwe label peroksidase (1: 15,000-1: 60,000 gumantung marang antibodi utami ingkang dipunginaaken) lan band dipunambaraken kanthi nggunakake substrate SuperSignal West Dura. Band-band sing dikuantake karo NIH Image J Software lan H3K9me2 band normal kanggo aktin utawa β-tubulin lan total histone H3 kanggo ngontrol pemasukan sing padha. Kokain sing diulang ora duwe efek ing tingkat aktin (Gambar S8) utawa total histone 3 (Gambar S1) ing NAc. Salajengipun, infèksi HSV-G9a-GFP lan HSV-G9aH1093K-GFP boten wonten pangaruh ing tingkat total β-tubulin ing NAc (Gambar S8).
Immunohistochemistry
Tikus diarani dosis nyebabake hydrate chloral lan perfused karo 4% paraformaldehyde sadurunge dianalisis karo imunohistokimia tunggal utawa kaping pindho kaya sing diterangake sadurunge (S6). Suwene, otak post-tetap diinkubake ing suhu kamar sewengi ing 30% sukrosa sadurunge dipotong ing 35 μm (otak sing digunakake kanggo analisa dendritik sing ditemokake ing bagian vibratome ing 100 μm bagian tanpa 30% sukrosa). Bagian-bagian NAC sing ngambang bebas, dicampur karo 1X PBS, diblokir (3% serum keledai normal, 0.1% tritonX, 1X PBS) lan banjur diinkubasi karo anti-GFP (pitik poliklonal, 1: 8000) lan / utawa anti-G9a (rabbit polyclonal , 1: 500) antibodi ing solusi pamblokiran. Bagian-bagian sing dianalisis kanggo dendritik denyut jantung diinkubasi karo antibodi anti-GFP polyconal anti-GFP ing 1: 200. Sawise inkubasi ing jero sasi, bagian NAC wis dicuci kaping 3 kanggo menit 10 karo 1X PBS, diiringi inkubasi karo CyZNUMX lan / utawa Cy2 antibodi sekang antena sing digabungake ing larutan 3X PBS kanggo jam 1. Bagian sing digunakake kanggo studi morfologi diinkubake ing antibodi sekunder ing suhu kamar. Panyeratan nuklir bisa didadekake dening incubating ing 2X PBS kang ngemot DAPI (1: 1) kanggo menit 50,000. Bagian kasebut uga dicampur maneh, disusul dehidrasi etanol lan dipasangake karo DPX. Kabeh bagean dicithak nggunakake microscopy confocal.
Isolasi RNA lan qPCR
Punch NAc 14-gauge bilateral homogenisasi ing Trizol lan diproses miturut instruksi pabrike. RNA diresiki nganggo kolom RNAesy Micro lan spektroskopi dikonfirmasi manawa jatah RNA 260/280 lan 260/230 yaiku> 1.8. RNA banjur transkripsi balik nggunakake Kit iScript Bio-Rad. cDNA diitung kanthi qPCR nggunakake SYBR Green. Saben reaksi ditindakake kanthi duplikat utawa triplicate lan dianalisis sawise metode ΔΔCt kaya sadurunge sing diandharake nggunakake glyceraldehyde-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) minangka kontrol normalisasi (S7). Deleng tambahan Tabel S5 kanggo urutan primer mRNA.
Analisis microarray DNA
Empu grup (3 mereproduksi biologis bebas saben kelompok) digunakna kanggo sinau microarray, total microarray 12. Wektu jam 1 sasampun injeksi kokain pungkasan, kewan kanthi cepet dipenggak lan otak dibuang lan diselehake ing es. Pamisahan NAc dijupuk nggunakake jarum jarum 15 lan cepet beku ing es nganti garing. Pukulan bilateral diklompokake saka papat hewan saben ewangi, total tikus 12 per kelompok. Pemisahan RNA, Processing microarray, lan analisis data padha dilaksanakake kaya sing wis diterangake (S8). Sedhela, RNA diisolasi lan diresiki kaya sing wis diandharake ing ndhuwur lan dipriksa kualitas nggunakake Agilent's Bioanalyzer. Transkripsi, amplifikasi, labeling lan hibridisasi mundur menyang susunan Illumina MouseWG-6 v2.0 ditindakake kanthi prosedur standar dening inti mikroarray UT Southwestern. Data mentah dikethok ing latar mburi lan normalisasi kuantile nggunakake piranti lunak Beadstudio. Data normal dianalisis nggunakake piranti lunak GeneSpring lan genelist digawe nggunakake kritéria signifikansi cutoff pangowahan 1.3 ditambah karo cut-p-nilai non-ketat p <0.05.
Kita njaga tingkat kapercayan sing dhuwur ing data iki kanggo sawetara alasan. Kapisan, kabeh kewan ditangani, diobati lan dipateni ing wektu sing padha, miturut kahanan sing padha. Uga, kabeh proses RNA lan array diisi bebarengan. Kapindho, kita nganakake tataran triplicate lan nglompokake pirang-pirang kewan saben sampel array, kanthi mangkono ngurangi beda amarga variasi individu lan nambah kekuwatan statistik (S9). Kapindho, kritisi analisis data sing digunakake kanggo sinau kita dianjurake dening project Quality Control MicroArray, amarga kriteria kasebut wis divalidasi kanggo nyedhiyakake reproducibility intersite lan reproducibility antar interS10-S11).
Konstruksi vèktor virus
Amarga anané watesan ukuran vèktor insertion virus, urutan kodhe kanggo wildtype G9a (G9a) utawa G9a mati katalitik (G9aH1093K) subcloned dadi plasmid p1005 + HSV kang ngandharake GFP sajrone kontrol promotor cytomegalovirus (CMV) awal manungsa (G9a Ukuran insertion yaiku ~ 3.96 kb, sing ngluwihi ukuran insert maksimum kanggo vektor AAV-2). Promotor IE4 / 5 minggat ekspresi G9a. Pecahan kasebut diarani plasmid p1005 + HSV bicistronic liwat ligate end blunt karo Klenow diobati PmeI lan EcoRI dicerna G9a (saka pcDNA3.1) lan CIP diobati p1005 + sawise pencernaan EcoRI. Kanggo produksi HSV-ΔJunD-GFP, urutan kodhe ΔJunD sing diapit dening situs-situs watesan EcoRI didadekake dening PCR nggunakake oligonukleotida primer sing ngemot situs EcoRI. Produk PCR banjur dilironi ing situs EcoRI saka vektor p1005. Ekspresi lokal saka rekombinase Cre ing neuron NAc dirayakake dening pangiriman gen sing ditengahi kanthi nggunakake vektor AAV kaya sing diterangake (S12). GFP utawa fase N-terminal saka GFP kanggo Cre didadekake subkelas menyang vèrsi AAV-2 rékombinan sing ngemot promotor CMV kanthi urutan akseptor donor splinder lan sinyal polyadenylation. Kabeh sisipan vektor dikonfirmasi dening dideoxy-sequencing. Virus vektor diprodhuksi kanthi cara transfeksi triple, cara mbantu helper, kaya sing diterangake sadurunge (S13). Virus sing diresiki disimpen ing -80 ° C. Kualitas virus ditaksir dening titer infèksius sing dievaluasi ing sel HEK293. Virus AAV-ΔFosB-GFP uga disiapake. Kanggo HSV-Cre, ekspresi Cre didhudhuk dening promotor IRES, adhedhasar promotor IE4 / 5, supaya bisa ngurangi keracunan Cre lan nyegah keracunan neuron (pirsani S14 kanggo konstruksi virus). Ing kabeh kasus, overexpression virus divalidasi, loro-lorone in vitro lan ing vivo, liwat qPCR, lan virus-virus kasebut ditemtokake kanthi immunohisthemik kanggo nampilake ekspresi NAc-diwatesi operasi kasebut.
Stereotaxic surgery
Ing ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anestesi, tikus ditempelake ing alat stereotaxic cilik-kewan, lan permukaan cranial ana ing kahanan. Telung puluh telung jarum jarum suntingan digunakake kanggo bilateral nginfeksi virus 0.5 μl menyang NAc kanthi sudut 10 (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) kanthi laju 0.1 μl / min. Kéwan sing nampa injeksi HSV diijini bisa sembrono kanggo operasi 2 dina, nalika tikus sing digunakake kanggo tes perilaku sing nampi AAV vektor diijini bisa dipundhut kanggo dina 20 sadurunge ditundhuk marang kahanan. Wektu iki konsisten karo periode maksimum transgene-mediated expression transgene kanggo loro vektor. Kanggo infus BIX01294, saben loro mini-pump diposisikan subkutane ing punggung tikus. Penempatan cannulae wis digayuh kanthi ngebaki loro bolongan cranial cilik ing sadhuwure NAc, lan pangiriman cannula saka bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Tikus-tikus uga diuripake saka surgery kanggo 4 kanggo 5 dina sadurunge wiwit prosedur conditioning prosedur kanggo cocaine minangka diterangake ing ngisor iki.
Preferensi panggonan sing kondhang
Prosedur kahanan ing papan kasebut dijlentrehake, kanthi modifikasi ing ngisor iki (S7). Sedhela, 3 dina sawise infus intra-NAc HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP utawa HSV-GFP, tikus dilebokake ing kamar kahanan, sing kalebu telung lingkungan sing beda. Tikus sing nuduhake pilihan sing signifikan kanggo salah sawijine kamar pendingin ruangan ora dikatutake ing panliten (<10% kabeh kewan). Klompok kahanan banjur imbang kanggo nyetel bias kamar sing isih ana. Ing dina sabanjure, kewan disuntik karo uyah lan diwatesi ing sawijining ruangan ing wayah awan suwene 30 menit banjur disuntik karo kokain (10 mg / kg, ip) lan diwatesi sajrone 30 menit ing ruangan liyane ing wayah sore suwene 2 dina (loro saline lan pasangan pasangan kokain). Ing dina tes, tikus dilebokake maneh ing aparat tanpa perawatan sajrone 20 menit lan dites kanggo ngevaluasi sisih endi sing disenengi. Tanggepan lokomotor kanggo kokain ditaksir liwat balok balok ing kamar sing dipasangake kokain kanggo njamin efektifitas perawatan obat. Kanggo eksperimen AAV lan BIX01294 CPP, digunakake protokol sing rada dimodifikasi. Kewan maneh disuntik karo uyah utawa kokain (10 mg / kg, ip) lan diwatesi ing ruangan tartamtu sajrone 30 menit, nanging mung dikondiseni sedina sajrone 4 dina, banjur tes dina 5 (kewan kahanan ing wayah sore lan perawatan kondisionasi diganti). Kanggo kabeh klompok, lokomosi awal minangka tanggepan karo uyah ditaksir kanggo mesthekake yen lokomosi ora kena pengaruh virus utawa perencat.
Kokain intravena ngurus awak
Umur bocah cilik lanang Long-Evans, bobot 230-250 ing awal eksperimen, ditampa. Padha ditempatake ing lingkungan sing asor lan temperatur sing dikontrol ing siklus cahya / siklus gelap 12 (lampu ing 9: 00 am) karo ad libitum akses menyang pangan lan banyu. Tikus uga diakoni ing lingkungan sing anyar lan ditangani saben dina kanggo minggu 1 sadurunge wiwitan eksperimen kasebut. Kabeh tata cara ditindakake miturut National Institute of Health's Guide kanggo Care and Use of Laboratory Animals lan disetujoni dening Animal Care and Use Committee of Mount Sinai. Peralatan administrasi iki dilengkapi karo balok infra merah kanggo ngukur prilaku lokomotif. Self-administrasi iki ditindakake minangka sadurunge diterangake (S15-S16) kanthi kateter sing ditanem ing vena jugular sing tengen ing ngisor anestesi isoflurane (2.4-2.7%). Kateter disiram nganggo 0.1 ml larutan uyah sing isine 10 U heparin lan ampisilin (50 mg / kg). Sawise seminggu pulih saka operasi, pelatihan administrasi mandiri diwiwiti sajrone fase peteng siklus cahya / peteng. Kewan diidini akses 3 jam saben dina menyang kokain (0.75 mg / kg / infus) miturut jadwal tulangan rasio-1 (FR1), ing endi 1 pers pengungkit aktif nyebabake infus siji obat. Tikus stabilake asupan kokain sawise 6 dina (<15% variasi tingkat respons sajrone 3 dina berturut-turut, paling ora 75% nanggepi tuas sing dikuatake). 24 jam sawise sesi pamrentahan pungkasan, tikus cepet dipotong, otak dicopot kanthi cepet lan diproses kanggo isolasi RNA lan qPCR.
Kaseimbangan réaktif kromatin (Chip)
Punch NAC seger yaiku formaldehida sing disambung lan disiapake kanggo ChIP kaya sing diterangake sadurunge (S17-S18) karo modifikasi suntingan. Sabanjure, pukulan NAN 4-gauge saben kewan (kewan 14 diklumpukake saben sampel) diklumpukake, disambungake karo formaldehida 5% lan dileburake karo 1 M glisin sadurunge beku ing -2 ° C. 80 dina sadurunge sampel sonication, anti-rabbit / mouse wedhus (gumantung saka antibodi udan) IgG manik-manik magnetik disiapake dening incubating Magnetik manik sing cocok karo salah siji anti-G1a (wortel polyclonal Chip kelas) utawa anti-H9K3me9 (tikus monoclonal Chip kelas) antibodi sewengi ing 2 ° C ing rotasi pancet ing larutan blok. Tisu sonication lan chromatin shearing digawa metu kaya sadurunge diterangake (S17). Sawise sonication, konsentrasi saka chromatin padha ditransfer menyang tabung anyar lan ~ 5% saka produk akhir disimpen minangka fungsi 'input'. Sawise nglewati lan resuspensi campuran manik / antibodi sing ditambahake, campuran volume antibodi / manik sing padha (antena / sampel 7.5) ditambahake ing saben sampel kromatin lan diinkubasi kanggo jam 16 ing rotasi konstan ing 4 ° C. Sampel uga dicithak lan dibalèkaké salib ing 65 ° C sewengi sadurung modifikasi DNA nggunakake kit pemurnian PCR. Sawisé ngringkesaké DNA, sampel ditaksir menyang qPCR lan diowahi kanggo kontrol input sing cocog kaya sing wis diterangake (S17). Métode normal imunoprecipitations IgG nggunakake antibodi anti-IgG polikonal mouse uga dileksanakake kanggo ngontrol amplifikasi sinyal sing cocog. Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) digunakake minangka kontrol negatif kanggo kokain lan eksperimen overexpression ΔFosB. Deleng Tambahan Tabel S5 kanggo promotor urutan sepisanan.
Analisis spine dendritik
Kanggo sinau peran G9a ing angger-angger morfologi neuronal ing vivo, kita nggunakake metode sing sadurunge diterangake karo modifikasi ing ngisor iki (S1). Telung dina sawisé injeksi HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (kabeh virus dianggo ing wildtype C57Bl / 6J), utawa HSV-Cre-GFP (digunakake ing G9afl / fl tikus), nalika ekspresi viral bisa maksimal, tikus wis diresmekake, otak dicekeli lan dicopot ing 100 μm ing getaran. Bagian kasebut banjur ditindakake kanthi nggunakake antibodi marang GFP kaya sing kasebut ing ndhuwur (pirsani Immunohistochemistry). Kanggo netepake efek saka overexpression G9a lan angka kalah ing nomer spine, lan efek saka ekstremasi ΔJunD, kita ngukur jumlah spines babagan kira-kira neuritus 1-2 per neuron sing paling sakbanjure yaiku 299 μm dendrite sekunder saka medium NAc GFP neuron spiny (MSNs). Given that MSNs are morphologically distinct from the other neuronal populations in the NAc, as well as reports earlier indicate that HSV mainly infects DARPP-32 expressing neurons in this area brain (S19), kita yakin yen MSN wis ditetepake sacara eksklusif ing studi kasebut. Kanggo saben kewan, kita mriksa neuron ~ 6-8 ing kéwan 3-4 saben klompok (kelompok 7), lan saben nilai kasebut ditampa kanggo saben kewan kanggo analisis statistik. Eksperimen sing dirancang kanggo nliti efek saka ekspektasi ΔFosB ing densitas spine NAc uga digawa kanthi mirip karo sing kasebut ing ndhuwur, kajaba vektor AAV digunakake kanggo ngekspresikan GFP utawa ΔFosB-GFP kanggo periode lengkap (8 weeks). Kabeh gambar HSV direbut kanthi nggunakake mikroskop confocal kanthi obyektif lenga-minyak 100X (gambar AAV ditangkap kanthi obyektif lenga-63X). Gambar dipikolehi karo pinhole set ing 1 unit sewenang-wenang lan ukuran frame 1024 × 1024. Panjang dendritik diukur nganggo piranti lunak NIH Image J, lan angka-angka spine dianggep buta déning eksperimental utami, minangka slide sing dikode sadurunge pemindaian eksperimen. Nomer rata-rata spines per 10 μm saka dendrite dihitung.
Analisis statistik
ANOVA lan loro-lengen ANOVA dileksanakake kanggo nemtokake pentinge kapentingan panggonan kahanan lan analisis spine dendritik kanthi luwih saka rong kelompok. T test mahasiswa digunakake kanggo tujuwan liyane kayata qPCR, western blotting, analisis spine dendritic mbandhingake HSV-GFP kanggo HSV-Cre ing G9afl / fl tikus, analisis mikroarray (pirsani ing ndhuwur) lan eksperimen imunoprecipitasi kromatin. Tes t siswa sing direncanakake digunakake sawise analisis ANOVA rong arah kepadatan tulang belakang dendritik sawise ekspresi ΔFosB kanthi konfirmasi efek utama sing penting kanggo pangobatan narkoba lan virus. Kabeh nilai sing kalebu ing legenda gambar nuduhake tegese ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Analisis statistik rinci kanggo Panganan. 1-3 ing teks utamane diwenehi ing: Tokoh Detil Detil Termasuk Statistik.
Cathetan sikil
Aku nandhakake yen ora ana materi sing kasedhiya ing naskah kasebut Peran Penting Histone Methyltransferase G9a ing Cocaine-Induced Plasticity wis diterbitake utawa ditrapake ing papan liya, kalebu ing Internet.
Kabeh karya sing nyakup kewan iki dilakoni miturut pedoman kelembagaan lan IACUC ing Pusat Kesehatan Southwestern Universitas Texas lan Sekolah Kedokteran Gunung Sinai.
Referensi lan Cathetan
;