Proc Natl Acad Sci US A. 2005 February 1; 102(5): 1737-1742.
Abstract
Cocaine, tamba penyalahgunaan, mundhakake tingkat dopamin synopic ing striatum kanthi mblokir reuptake dopamin ing terminal akson. Kinase 5 (Cdk5) lan aktivator p35 sing gumantung marang siklik, protèin sing nglibataké fosforilasi substrat ing neuron pasca-medeni, wis ditemtokaké dadi regulasi sawise cocaine nemen. Kanggo luwih nyinaoni efek saka indikasi Cdk5 lan p35 ing sinyal dopamin striatal, kita ngasilake loro garis mouse transgenik independen kang Cdk5 utawa p35 ditekanake banget ing neuron. We laporan kene sing nambah kegiatan Cdk5, minangka asil saka p35 nanging ora saka ekspresi Cdk5, ndadékaké kanggo ngilangi cocaine-mediated dopamin signaling. Fosforilasi dopamin dan phosphoprotein-dikelola phosphorylation, massa molekul 5 kDa (DARPP-32) ing Thr-32, didampingi oleh fase DosPP-75 ing Thr-32. Fosforilasi-diganti Cdk34 kinase kinase 5-ing sinyal Thr-1 diiringi paningalan aktivasi sinyal-diatur kinase 286 / 1 ekstrasel. Efek kasebut nyumbang kanggo ngurangi fosforilasi kokain sing diakibatake kokain protein protèktif-respon cAMP lan uga induksi c-fos sing kurang ing striatum. Hasil kasebut ndhukung idea yen kegiatan Cdk2 melu eksprimen gene sawise ekspirasi kokain kanggo kokain lan nimbulaké owah-owahan ing fungsi neuronal sing nyebabake kecanduan kokain.
Cocaine nambahake tingkat dopamin synaptic ing striatum lan ngrubah ekspresi gene ing dopaminoceptive neurons kanthi ngaktifake jalur intraseluler sing nyebar sinyal awal saka reseptor D1 dopamin menyang inti (1). Kocokan kronis kanggo kokain munggah-ngatur sawetara faktor transkripsi, nyebabake owah-owahan long-term ekspresi gen sing dianggep minangka adaptasi neuronal ing kecanduan kokain (2). ΔFosB, diidentifikasi minangka faktor transkripsi (3), wis ditampilake kanggo ningkatake tanggap marang tindak tanduk kewan kanggo kokain (4, 5). Mulane, identifikasi gen sing target sing diatur dening ΔFosB induksi wis samesthine kanggo nyumbangake pemahaman sing luwih gedhe babagan mekanisme molekuler sing ndadekake kecanduan cocaine. Biyasane, perawatan kéwan sing kronis kanthi kokain wis ditampilake kanggo ngatur maneh ekspresi Kinase 5 (Cdk5) lan aktivator p35 gumantung ing siklus kanthi induksi ΔFosB (6, 7).
Cdk5 minangka anggota saka kulawarga Cdk serine / kinase kinase. Ora kaya Cdks liyane sing dadi regulator utama perkembangan siklus sel, Cdk5 utamane melu ing fosforilasi substrat ing neuron pasca-mikroseksa (8). Spesifik neuronal aktivitas Cdk5 dihasilake liwat asosiasi dengan aktivatornya, baik p35 atau p39, sing utamané ditulis ing neuron postmitotik (8). Saliyane peran penting Cdk5 ing perkembangan otak (9, 10), it uga wis disambungake ing transmisi dopaminergik ing otak pasnatal (11, 12). Inhibisi aktivitas Cdk5 nyebabake release dopamin ing striatum, nuduhake fungsi presynaptic saka Cdk5 minangka regulator negatif dopamin release (11). Tambahan, Cdk5 modulates efektivitas dopamin-signaling dosis saka fosforilasi dopamin- lan phosphoprotein cAMP-diatur, massa molekul 32 kDa (DARPP-32) ing Thr-75, sing ngowahi DARPP-32 dadi inhibitor cAMP-dependent kinase (PKA) (12).
Observasi kasebut nyatakake yen Cdk5 lan p35 minangka regulator mudhun saka aktivasi dopamin signaling prolonged sawise parutan kronis kanggo kokain lan kanthi mangkono ing kecanduan kokain. Kanggo luwih alamat peran Cdk5 ing sinyal dopamin striatal, kita ngasilake loro baris mouse transgenik sing salah siji saka Cdk5 utawa p35 sing ditekanake khusus ing neuron miturut kontrol promotor p35. Temuan kasebut nuduhake yen aktivitas Cdk5 munggah-diatur karo peningkatan protein p35 nanging ora protein Cdk5, ngakoni yen protein p35 tingkat-matesi kanggo aktivitas Cdk5. Kita nyedhiyani kene ing vivo bukti sing ningkatake kegiatan Cdk5, minangka akibat saka ekspresi p35, ngasilake reduksi signaling dopamin sing cocaine menyang inti liwat inhibisi PKA lan cascades sinyal-diatur kinase (ERK) ekstraselular.
Bahan lan Metode
Antibodi. Antibodi poliklonal kanggo Cdk5 (C-8) lan p35 (C-19) dituku saka Bioteknologi Santa Cruz. Antibodi sing gumantung saka fosforilasi lan gumantung marang ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, lan protein-mengikat unsur protein CAMP-respon (CREB) ditampa saka Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antibodi kanggo phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), total DARPP-32 (12), lan c-fos (14) digunakake minangka diterangake. Antibodi kanggo actin dibeli saka Sigma.
Eksperimental Hewan. Kita sadurungé kloning gen p35 mouse Cdk5r1, sing encode protein P35, lan ditondoi struktur genomik (15). Kanggo nggawe mouse transgenik kanthi overexpression neuronal p35 (Tgp35), 6-kb EchoRI-EchoPotongan RI sing ngemot wilayah promotor 1.2-kb subcloned dadi plasmid pGEM9Z (-), lan tag 45-bp sing diturunake saka SV40 disisipaké ing KpnAku situs mudhun saka poli (A+) sinyal (Anjir. 1A). Tag ana sing LiyaneAku ngemot genotyping kéwan. Potongan 6-kb diisolasi saka plasmid lan diresiki, disusul dening injeksi pronuklir saka transgene kanggo ngasilake tikus transgenik. Kanggo nliti profil ekspresion transgen ing sangisore kontrol peraturan saka promotor 1.2-kb p35 ing vivo, mouse transgenik pindho (Tgp35; p35 - / -) luwih disedhiyakake kanthi nggunakake strategi breeding 2 langkah kanthi mouse Tgp35 diwenehi regenerasi kanthi latar belakang p35 endogen. Model mouse liyane sing digunakake ing panliten iki kalebu p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/-, lan mouse transgenik kanthi overexpression neuronal saka Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotypes tikus iki ditemtokake kanthi nglakokna analisis blot Kidul utawa PCR ing DNA genom sing diisolasi saka biopsi buntut. Tikus dipapanake ing siklus gelap 12-h / 12-h. Kabeh perawatan diwenehake miturut National Institute of Health pedoman babagan perawatan lan nggunakake laboratorium lan eksperimen kéwan.
Analisis Kumbang Kuning. DNA genomik sing diekstrak saka biopsi buntut dicerna kanthi EchoRI lan LiyaneAku, electrophoresed ing gel agarose% 0.9, lan ditransfer menyang membran nilon. Mèmbran wis diinfèksi kanthi acak-acak 32Probe P-labeled ing 42 ° C ing wayah wengi. Wujude 485-bp kanggo genotipe saka tikus p35 (p35 - / -) lan tikus Tgp35 didadekake dening PCR kanthi nggunakake primer: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'lan 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Membran hibrida iki dicampur kaping loro ing 2 × SSC / 0.1% SDS ing 42 ° C kanggo 10 min, lan kaping loro ing 0.1 × SSC / 0.1% SDS ing 65 ° C kanggo 20 min, lan kapapar film x-ray.
Perawatan Narkoba. Cocaine (Sigma) bubar sajroning saline resin. Kéwan kasebut disuntikaké karo kokain (15 mg / kg) utawa jumlah salin sing padha ing umur 3 sasi lan dibunuh dening decapitation ing titik wektu sing beda (15, 30, 60, lan 120 min) sawise injeksi. Pemikiran wis cepet dibuang lan diiseni ing PBS es sing adhem. Striata kasebut banjur dibédakaké lan dianalisis analisis Northern utawa Western. Kanggo analisis imunohistokimia, bagian striat ditampa saka tikus 2 h sawise injeksi.
Analisis Kalor Utara. Total RNA diekstraksi saka striata karo reagen TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) lan tundhuk analisis Northern blot minangka diterangake (18). Kanggo deteksi mRNA c-fos, fragmen 189-bp saka cDNA mouse cDNA digunakake minangka probe sing diterangake (19). Tingkat mRNA c-fos dikuantifikasi kanthi ngukur kepadatan optik band khusus kanthi nggunakake sistem analisis gambar karo perangkat lunak gambar nih, Versi 1.62.
Western Blot Analysis. Jaringan-jaringan striatal padha sonicated ing 1% SDS lan nggodhok kanggo 10 min. Konsentrasi protein ing saben sampel ditemtokake dening protein protein BCA (Pierce). Jumlah protein sing padha dipisahake dening SDS / PAGE sadurunge ditransfer menyang membran nitroselulosa. Membran diblokir ing 1 × PBS ngemot 5% skim susu lan 0.05% Tween 20 lan diinkubasi karo antibodi utama sewengi ing 4 ° C. Inkubasi dengan anti-mouse atau kelinci peroxidase-konjugasi IgG (Sigma) ditindakake ing suhu kamar kanggo 60 min. Sinode kasebut dideteksi dening chemiluminescence (Pierce), lan densitas optik saka pita kasebut diitung kaya sing kasebut ing ndhuwur.
Cdk5 Kinase Assay. Striatal lysates wis disiapake kanthi buffer lisis sing kasusun saka 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml inhibitor ml leupeptin / phosphatase (phosphatase inhibitor I lan II, Sigma). Ing lysates padha immunoprecipitated karo salah siji anti-Cdk5 (C-8) utawa anti-p35 (C-19) antibodi. Immunoprecipitates Cdk5 disiapake kanthi inkubasi 300 μl saka lysate (sing cocog karo 300 μg protein) karo antibodi anti-Cdk5 (3 μg) sewengi ing 4 ° C diikuti inkubasi luwih saka 25 μl manik Protein A-agarose (50 % slurry ing buffer lysis; Santa Cruz Biotechnology) kanggo 3 h ing 4 ° C. Kanggo nyiapake immunoprecipitates p35, 500 μl saka lysate (cocog karo 1 mg protein) diinkubasi karo antibodi anti-p35 (3 μg) kaya sing kasebut ing ndhuwur. Immunoprecipitates dicampur kaping pindho kanthi penyangga lisis lan kaping pindho kanthi penyangga kinase sing kasusun saka 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspended ing 60 μl saka buffer kinase. Aktivitas kinase diukur kanthi nggunakake histone H1 minangka substrate (18).
Immunohistochemistry. Tikus uga disebabake dening injeksi ip of avertin (250 mg / kg, Fluka) lan transfolana kanthi transparan karo buffer 0.1 M sodium fosfat, pH 7.4, diikuti dening Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), fiksasi non-silang. Olah raga sing diencerake terus luwih cepet ing saben jam ing 37 ° C. Banjur, otak diselehake ing paraffin, dipotong menyang bagian koronal 5-μm-tebal lan ditindakake kanthi imunohistokimia kanthi nggunakake teknik komplek avidin-biotin-peroksidase (Vektor Laboratorium) sing diaminobenzidine minangka substrat. Bagian kasebut diinkubasi karo antibodi poliklonal sing diresapi afinitas marang c-fos sewengi ing 4 ° C. Spesimen pewarnaan dievaluasi kanthi ora ana antibodi utama.
results
Generasi Tetes Transgenik kanthi Overexpression Neuronal saka p35. Transgene sing dipigunakaké kanggo entuk ekspresi neuronal p35 tambah fragmen 6-kb saka gen p35 mouse clone sing ngandung promotor 1.2-kb lan urutan coding sakabèhané p35 (Anjir. 1 A). Genotip tikus kasebut ditemtokake dening analisis blot Kidul kanthi nggunakake probe sing dirancang kanggo mbedakake p35 - / - lan Tgp35 tikus saka tikus liar tipe (Anjir. 1 A lan B). Kanggo nliti ekspresi transgene miturut kontrol promotor 1.2-kb p35, kita ngasilake tikus transgenik ganda (Tgp35; p35 - / -) kang ekspresi p35 mung didol saka transgene. Ekspresi p35 ing Tgp35; p35 - / - tikus diamati mung ing otak (Anjir. 1C), ing ngendi pola ekspresi spasial iki padha karo tikus liar tipe (Anjir. 1D). Kurangé p35 wis ditampilake nyebabake struktur layering abnormal ing korteks serebral lan hippocampus tikus (10). Nanging, Tgp35; p35 - / - tikus nampilake ngluwari phenotype otak p35 - (-)Anjir. 1E). Data kasebut nuduhake yen promotor 1.2-kb p35 ngontrol ekspresi transgene kanthi profil ekspresi sing padha karo p35 saka gen p35 endogen.
Tingkat Protein p35 Tingkatkan-watesan kanggo Up-Regulasi Kegiatan Cdk5. We sinau efek gene-dosis saka encoding gen p35 lan Cdk5 ing ekspresi protein ing ekstrak striatal saka p35 - / -, p35 +/-, tipe liar, Tgp35, Cdk5 +/-, lan TgCdk5 ing umur 3 wulan. Ing tingkat protein p35 lan Cdk5 hubungane karo dos gen,Anjir. 2 A lan B). Tikus Tgp35 nuduhaké tingkat ≈1.6-fold ing tingkat protein p35 dibandhingake karo tikus liar tipe, dene tingkat protein Cdk5 ora kena pengaruh tingkat protein p35 sing beda. Tikus TgCdk5 nuduhake peningkatan ≈1.9-kali lipat ing tingkat protein Cdk5 sing dibandhingake karo tikus jinis-jinis liar, dene tingkat protein p35 ora kena pengaruh tingkat protein Cdk5 sing beda. Kanggo mriksa efek saka protein p35 sing beda ing kegiatan Cdk5, Cdk5 disebabake immunoprecipitated saka ekstrak striat karo antibodi anti-Cdk5 lan aktivitas kinase diukur. Uga, kanggo nliti efek saka jumlah protein Cdk5 ing aktivitas kinase, p35 didhisikake saka ekstrak striat karo antibodi anti-p35, lan aktivitas kinase diukur. Aktivitas Cdk5 hubungane apik karo tingkat protein p35 nanging ora kanthi tingkat protein Cdk5 (Anjir. 2 C lan D). Hasil kasebut nunjukake yen jumlah protein p35 minangka faktor-faktor pemblokiran kanggo aktivitas Cdk5. Mulane kita nggunakake Tgp35 tikus kanggo neliti efek saka tambah Cdk5 kegiatan ing striatal dopamin signaling.
Phosphorylation of Cocaine-DARPP-32 at Thr-34 Is Attenuated in Tgp35 Mice. Fungsi DARPP-32 gumantung marang kondisi phosphorylation ing pirang-pirang situs (20). PKA phosphorylates DARPP-32 at Thr-34, dene phosphorylates Cdk5 DARPP-32 ing Thr-75. Mangkono, kita mriksa kondisi phosphorylation saka DARPP-32 ing ekstrak striatal saka Tipe wild-type lan Tgp35. Tingkat phospho-Thr-75 DARPP-32 luwih dhuwur ing Tgp35 tikusAnjir. 3A; 1.6 ± 0.2-lipat ing ndhuwur nilai tikus jinis liar). Sabanjure kita nandhesake efek saka aktivitas Cdk5 sing tambah ing sinyal dopamin striatal. Kita mirsani aktivasi PKA sing diakibatake kokain ing tikus Tgp35 kanthi nganalisa kondisi fosforilasi DARPP-32 ing Thr-34. Tingkat phospho-Thr-34 DARPP-32 ditingkatake ing tikus tipe 15 min sawise injeksi kokain (Anjir. 3B; 1.8 ± 0.2-tingkat ndhuwur tingkat basal). Nanging, efek kokain ing fosforilasi Thr-34 saka DARPP-32 diancemake ing tikus Tgp35 (1.2 ± 0.3-lipat ndhuwur tingkat basal). Hasil kasebut nudhuhake yen peningkatan aktivitas Cdk5 ngilangi aktifitas PKA sing diakibatake cocaine mbokmenawa liwat fosforilasi DARPP-32 ing Thr-75 (6, 12). Sampeyan uga bisa uga yen peningkatan aktivitas presdaptic Cdk5 bisa nyebabake nyepetake dopamin, lan iki nyumbang kanggo efek ngurangi kokain. Khusus, cocaine injeksi siji ora nyebabake tingkat protein p35 lan Cdk5 uga aktivitas kinase (Anjir. 3 C lan D). Iki minangka kontras kanggo studi sing sadurunge ing cahya kronis saka kokain dituduhake kanggo ngaturake dhéfinisi p35 lan Cdk5 (6).
Up-Regulasi Kegiatan Cdk5 Attenuates Activation Cocaine saka ERK1 / 2. Bukti pungkasan nuduhake yen aktifitas reseptor dopamin ing striatum uga ngaktifake cascate tandha liya, kalebu jalur ERK (21, 22), sing nduweni peran penting ing respon perilaku marang kokain (23). Mulane kita bakal sinau manawa kegiatan Cdk5 bisa ndadekake aktifitas cocaine-induksi jalur ERK. Aktivasi jalur ERK ditemokake sawise injeksi kokain ing ekstrak striatal saka tikus liar, kaya sing ditemokake dening tambah fosforilasi MEK1 / 2 ing Ser-217 lan Ser-221 (1.5 ± 0.2-lipat ndhuwur tingkat basal) lan ERK1 / 2 ing Thr-202 lan Tyr-204 (phosphorylation ERK2: 1.5 ± 0.2-fold above level basal) (Anjir. 4 A lan B). Nanging, aktivasi kokaine MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-lipat ndhuwur tingkat basal) lan ERK1 / 2 (fosforilasi ERK2: 1.2 ± 0.2-lipat ndhuwur level basal) ditandhai ing Tgp35 tikusAnjir. 4 A lan B). Ing ngisor iki, tingkat dasar phospho-ERK1 / 2 luwih murah tinimbang Tgp35 tikus (0.8 ± 0.2-fold ngisor ngisor tikus liar), dene gaya iki ora signifikan sacara statistik. Hasil kasebut terakhir bisa dianggep minangka fungsi fosforilasi Cdk5 MEK1 ing Thr-286, sing nyebabake nyuda aktivitas katalitik24). Kanggo netepake kamungkinan iki, kita mriksa kondisi phosphorylation saka MEK1 ing Thr-286 lan nemokake yen kadar phospho-Thr-286 MEK1 luwih dhuwur ing ekstrak striatal saka Tgp35 tikusAnjir. 4C; 1.3 ± 0.1-lipat ing ndhuwur nilai tikus jinis liar). Saliyané, negara fosforilasi MEK1 ing Thr-286 ora diowahi kanthi injeksi kokain siji, konsisten karo nemokake yen aktivitas Cdk5 ora kena pengaruh ing perawatan (Anjir. 3D).
Penyebaran Dopamine Sinyal menyang Inti wis diatasi dening Tambah Aktivitas Cdk5. Aktivasi cocaine-induced saka cascode multivariate sing nglibataké PKA lan ERK ndadékaké kanggo aktivasi sakteruse saka faktor transkripsi CREB ing inti liwat fosforilasi ing Ser-133 (22, 25). Kanggo menguji manawa efek-efek hambat Cdk5-mediated ing PKA lan ERK cascade pangaktifan bisa nglumpukake ing fosforilasi CREB ing nukleus, kita mriksa kondisi fosforilasi CREB ing Ser-133 ing ekstrak striatal saka tikus jinis lan Tgp35. Tingkat dasar phospho-CREB rendah ing tikus Tgp35 (0.7 ± 0.1-kali ganda dari nilai tikus liar) (Anjir. 5). Kanggo nanggepi injeksi kokain, tingkat phospho-CREB ditingkatake ing striatum tikus jinis liar (1.5 ± 0.1-lipat ndhuwur tingkat basal), nanging respon iki kanggo kokain dilemoni ing tikus Tgp35 (1.2 ± 0.1- melu ing ndhuwur level basal) (Anjir. 5).
Phosphorylation of CREB at Ser-133 nambahake aktivitas transkripinal liwat unsur respon cAMP ing wilayah promotor gen tartamtu, kalebu gen c-fos26). Mulane kita sinau induksi c-fos ing striatum liar-jinis lan Tgp35 tikus sawise injeksi kokain. Ing tikus jinis liar, tingkat mRNA c-fos meningkat dadi nilai puncak (1.8 ± 0.2-lipida ing tingkat basal) 30 min sawise injeksi kokain, lan salajengipun bali menyang tingkat dasar dening 120 min sawise injeksi (Anjir. 6 A lan B). Nanging, tingkat c-fos mRNA padha ≈30% luwih murah tinimbang tikus Tgp35 ketimbang tikus jinis liar nganti 30 min sawise injeksi (Anjir. 6 A lan B). Induksi c-fos sing luwih cilik ing tikus Tgp35 luwih dikukuhake dening imunohistokimia (Anjir. 6 C-F). Administrasi kokain nambahake immunoreactivity c-fos, banget ing bagian dorsomedial-dorsocentral striatum lan lemah ing bagian lateral, ing tikaman liyo lan Tgp35. Nanging, kena nambah cocaine ing jumlah sel c-fos-imunopositive iki disemai ing striatum tikus Tgp35 (Anjir. 6G). Bebarengan, asil kasebut nélakaké yen kena pengaruh cocaine-mediated stigat dopamine steriatal menyang nukleus dicegah ing tikaman Tgp35, asil sing cenderung nambah aktivitas Cdk5.
Diskusi
Cdk5 lan aktivator p35 wis diidentifikasi minangka target gen sing munggah-diatur dening cahya nemen cocaine (6). We laporan kene bukti sing tambah Cdk5 kegiatan, minangka asil p35 munggah-peraturan tinimbang Cdk5 munggah-regulasi, ndadékaké attenuation cocaine-mediated dopamin signaling ing neuron striatal. Kanggo nliti konsekwensi ekspresi munggah saka salah siji Cdk5 utawa p35 ing sinyal dopamin striatal, loro baris mouse transgenik, TgCdk5 lan tikus Tgp35, dianalisis. Kita nemokake yen aktivitas Cdk5 munggah-diatur kanthi proporsional karo tingkat protein p35 sing tambah nanging ora kena kena protein Cdk5. Laporan sadurungé uga nunjukaké manawa aktivitas Cdk5 ing otak tikus TgCdk5 luwih murah tinimbang ing otak tikus jinis liar nalika kegiatan diukur kanthi nggunakake immunoprecipitates Cdk5 (17), nedahake yen overexpression Cdk5 ningkatake tingkat monomer Cdk5 yen tingkat p35 ora meningkat. Hasil kasebut nunjukake yen tingkat protein p35 minangka faktor-faktor pemblokiran kanggo aktivitas Cdk5.
Tikus Tgp35 nuduhaké indhuksi fosforilasi CREB lan c-fos ing striatum sawise injeksi akut kokain, nerangake manawa respon striat kanggo kokain wis dicegah dening aktivitas Cdk5 sing tambah. Ing ngilangi dosis sinyal dopamine sing ditandhai cocaine ing tikus Tgp35 bisa ditindakake liwat inhibisi Cdk5-inovatif saka rongga tandha sinyal sing nglibatake DARPP-32, PKA, lan ERK. Administrasi kokain nambahake fosforilasi PKA saka DARPP-32 ing Thr-34 ing tikus spesies liar, dene respon iki dilemokake ing tikaman Tgp35. Phosphorylation saka PKA saka DARPP-32 ing Thr-34 wis dituduhake nyandhet kegiatan protein phosphatase 1 (PP1), enzim sing tanggung jawab kanggo dephosphorylation Ser-133 saka CREB27). Mangkono, kegiatan PP1 ora bakal antagonisasi liwat jalur DARPP-32 / PP1 ing tikaman Tgp35.
Aktivasi Cocaine-induced ERK1 / 2 uga dilemoni ing tikaman Tgp35. Ana sawetara mekanisme béda sing bisa dicegah dening Cdk5 aktivasi ERK1 / 2. Pisanan, fosforilasi Cdk5 saka DARPP-32 ing Thr-75 bisa nyandhet PKA, sing ngetokake pamblokiran sabanjure pengaktifan MEK1 / 2 sing dibandhingake PKA sing dibutuhake kanggo aktivasi ERK1 / 2. Sawijining studi sing anyar uga nemuake yen phosphorylation saka DARPP-32 ing Thr-34 dibutuhake kanggo ngaktifake cocaine-mediated saka ERK1 / 2 dening macem-macem jalur nglibatake angger-angger ora langsung ing activation MEK uga nglibatake angger-angger fosfatase enriched, sebuah tirosin fosfatase sing tumindak langsung ing ERK1 / 2 (28). Dhukungan kanggo kamungkinan iki disaranake kanthi nemokake yen phosphorylation MEK1 / 2 ing Serum X-217 lan Ser-221 dicopot ing tikaman Tgp35. Jalur liyane sing mlaku liwat Fosforilasi Cdk5 saka MEK1 ing Thr-286, sing bakal nyebabake nyuda aktivitas katalitik lan nyebabake inhibisi aktivitas ERK1 / 2 (24).
Werna aktivitas Cdk5 ing striatum wis ditampilake kanggo ngetokne efek prilaku ngenani perawatan kokain kronis ing kewan (6). Konsisten karo hipotesis yen up-regulasi aktivitas Cdk5 bisa nyumbangake adaptasi neuronal kanggo counteracting efek saka cocaine administrasi berulang (6), kita nemokake fosforilasi Cdk5 saka DARPP-32 lan MEK1 nyumbang kanggo ngurangi pengaktifan kokain sing diakibatake saka ERK1 / 2, lan asil induksi CREB fosforilasi lan c-fos ing striatum. Temuan kita ndhukung gagasan sing nambah kegiatan Cdk5, minangka asil p35 up-regulation, bisa ngowahi ekspresi gen ing striatum sawise cahya kronis kanggo kokain. Iki bisa kedadeyan liwat owah-owahan ing aktivitas saka faktor transkripsi kayata CREB lan c-fos. Mangkono, aktivator Cdk5 p35, kanthi efek-efek sing mbatesi babagan aktivitas Cdk5, bisa nyumbang marang owah-owahan ing fungsi neuronal sing nyebabake kecanduan kokain.
Acknowledgments
We thank Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant, lan Sashi Kesavapany kanggo maca kritis manuskrip. Karya iki didhukung dening National Institutes of Health Grant Z01DE00664-05 (kanggo ABK), US Public Health Service Grant DA10044, lan hibah saka Yayasan Simons, Yayasan Peter J. Sharp, lan Picower Foundation (kanggo PG).
Cathetan
Singkatan: Cdk5, Kinase 5-dependen siklin; ERK, ekstrasel sinyal-diatur kinase; DARPP-32, fosfoprotein dopamin lan cAMP, massa molekul 32 kDa; PKA, kinase gumantung cAMP; MEK, ERK kinase; CREB, protein-binding protein cAMP-respon.
Cathetan Suku
;