Cdk5 Phosphorylates Dopamin D2 Receptor and Attenuates Downstream Signaling (2013)

Komentar: Katon yen Cdk5 nyebabake angger-angger reseptor dopamine D2. Sing nggumunake, faktor terjemahan deltafosb nyebabake produksi Cdk5.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Abstract

Reseptor dopamine D2 (DRD2) minangka reseptor utama sing mediasi fungsi otak sing gegandhengan karo dopamin kayata swasana ati, hadiah, lan emosi. Kinase 5 (Cdk5) gumantung ing siklus, yaiku serine / threonine kinase sing fungsine ditrapake ing sirkuit ganjaran otak. Ing panliten iki, kita ngungkapake manawa sisa santai 321 (S321) ing gelung intraselular katelu saka DRD2 (D2i3) minangka situs pangaturan novel Cdk5. Cdk5 fosforilasi sing gumantung saka S321 ing D2i3 diamati ing in vitro lan sistem budaya sel.

Kita luwih weruh yen phosphorylation saka S321 cacat ekspresi permukaan agonist-stimulus saka DRD2 lan mudhun G protein kopling kanggo DRD2. Kajaba iku, jalur cAMP ing hilir kasebut kena pengaruh ing sistem heterologus lan ing budaya neuronal utami saka embrio kalah p35 sing koyok amarga aktivitas hambat sing nyuda DRD2. Hasil kasebut nunjukake yen phosphorylation-Cdk5-mediated saka S321 nyegah fungsi DRD2, nyedhiyakake mekanisme peraturan anyar kanggo dopamin signaling.

Gambar

Kutipan: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamin D2 Receptor lan Attenuates Hilir Sinyal. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

editor: James Porter, Universitas North Dakota, Amerika Serikat

Ditampa: May 20, 2013; Ketompo: Nopember 14, 2013; Diterbitake: Desember 31, 2013

Hak cipta: © 2013 Jeong et al. Iki minangka artikel mbukak-akses sing disebarake miturut syarat-syarat Jeneng lisensi Creative Commons, sing ngidini panggunaan, distribusi, lan reproduksi sing ora bisa ditrapake ing sembarang medium, klebu pangarang asli lan sumber sing dikreditake.

Pendanaan: Karya iki didhukung dening dana bantuan (NRF-2012R1A2A2A01012923 lan NRF-2012R1A4A1028200) saka pemerintah Korea (MSIP) lan uga didhukung miturut program kerjasama internasional sing dikelola dening NRF Korea (2012K2A1A2033117) lan Institut Riset Otak Korea (KBRI) Program Riset Dasar MSIP (2031-415). SKP minangka panampa saka Alliance Nasional 2004 lan 2006 kanggo Riset ing Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Awards. Penanam modal ora duwe peran ing desain sinau, pengumpulan lan analisis data, kaputusan nerbitake, utawa nyiapake manuskrip.

Kapentingan: Penulis wis ngumumake yen ora ana kapentingan sing kompetisine.

Pambuka

Dopamin signaling kalibat ing macem-macem fungsi otak kalebu koordinasi motor, kontrol swasana ati lan mekanisme ganjaran [1]. Komponen utama sinyal dopamin ing vertebrata ditetepake dening neuron spin medium striatal (MSNs) sing sacara selektif ngandhut subtip reseptor dopamin lan nampa input dopaminergik utamane saka area tegalal ventral (VTA) lan substantia nigra (SN) [2]. Reseptor dopamin inggih punika reseptor reseptor G (GPCR) ingkang gadhah pitung domain transmembran lan kalebet kalih subtipe, Reseptor kaya D1 lan D2, sing ngeterake tindakan timbal balik ing dopamin signaling [1]. Contone, dopamine reseptor kaya D1 (D1, D5) ngaktifake adenylyl cyclase liwat Gαs lan nambah tingkat intrapellular cAMP, nanging dopamin reseptor kaya D2 (D2, D3, D4) nyandhet adenylyl cyclase liwat Gαi lan ngurangi tingkat intraselular saka cAMP [1], [3].

Antarane reseptor dopamin, reseptor D2 (DRD2) disebabake ing patofisiologi saka pirang-pirang gangguan kejiwaan utama kalebu skizofrenia lan kecanduan narkoba [4], kayata obatan antipsikotik paling sethithik target DRD2. Sampeyan uga ngerti yen kegiatan DRD2 hubungane karo konsekwensi narkoba saka penyalahgunaan model kewan [5]. Antidepressants lan khasiat stabilizer khasiat uga wis disambung menyang owah-owahan ing expression permukaan sel DRD2 utawa inovatif intrapellular tandha mediated dening PKA, ERK lan GSK3 [1], [4], [6]. Senadyan peran kritis iki kanggo DRD2 ing otak, mekanisme regulasi rinci sing menehi heterogenitas lan kerumitan kanggo sifat DRD2 ora dipahami.

Garis-garis bukti-bukti konvergen nunjukake yen modifikasi posttranslational sing akeh digunakake ing nggoleki kegiatan DRD2. Glycosylation ekstensif saka DRD2 dicethakaké ing awal labeling afinitas foto studi [7], lan formasi jaminan disulfide ing DRD2 uga diidentifikasi minangka modifikasi penting kanggo naleni [8]. Salajengipun, situs fosforilasi DRD2 wiwitanipun dipunidentifikasi dening in vitro assay karo radioisotopes, nyediakake rute kanggo maneka werna jalur peraturan sing dimediasi dening maneka kinase [9]. Pancen, protéin kinase C (PKC) ngatur mobilisasi DRD2-mediated kalsium intrasélular lan modulates interaksi DRD2 karo protein sitoskeletal [10]. Fosforilasi dening GPCR kinase 2 (GRK2) ngatur pola resensitization sing diakibatake agonist saka DRD2 [11].

Kinase 5 (Cdk5) gumantung siklik yaiku serine / threonine kinase proline-directive sing nduweni aktivitas preferensial amarga ekspresi khusus otak aktivator penting, p35 lan p39 [12]. Cdk5 melu ing macem-macem proses neuronal kalebu migrasi neuronal lan panuntun axon, lan Cdk5 lan p35 sketsa cacat nuduhake cacat korteks [13]. Bubar, dituduhake yen phosphorylation saka WAVE1 lan ephexin dening Cdk5 ngatur morphogenesis dendritic spine [14]. Salajengipun, Cdk5 uga ngatur tingkat ekspresi permukaan reseptor NMDA, NR2B, lan NMDA arus NR2A [15], [16]. Perlu dicathet menawa pirang-pirang lembar bukti nuduhaké hubungan intim antara Cdk5 lan sistem dopamin. Cdk5 phosphorylates tyrosine hydroxylase (TH), ngatur stabilitas, lan kanthi mangkono njaga dostaminergic homeostasis [17]. Ing saraf postsynaptic, nalika residu T75 dopamin lan siklis-AMP diatur phosphoprotein-32kD (DARPP-32) wis phosphorylated dening Cdk5, bisa nyandhet PKA kegiatan lan kanthi mangkono antagonize dopamine DRD1-mediated PKA sinyal [18]. Menawa kokain, agonis ora langsung reseptor dopamin, dikembangake kanthi kronis ing tikus, mRNA lan tingkat protein Cdk5 ningkat ing neuron spin medium [19]. Secara kolektif, Cdk5 katon melu adaptasi synaptic sing didhasiya narkoba. Ing panliten iki, kita nuduhake interaksi fungsional saka DRD2 lan Cdk5 sing luwih nggedhekake peran Cdk5 ing dopamin signaling.

Bahan lan Metode

Antibodi

Serum anti-kelinci diunggahake marang peptida sing ngandhut phospho-serine 321 (pS321) saka dobel intraselular katelu saka DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), digunakake kanggo nggawe kolom peptide-conjugated kanggo pemurnian affinity (20401, PIERCE). Antibodi anti-pS321 dipupu dening sistem pemurnian afinasi sasampunipun instruksi pabrik. Fosfo-antibodi sing diresiki disimpen ing PBS kanthi 0.1% sodium azide lan 0.1% gelatin. Anti-tik anti-Cdk5 antibodi (sc-249) lan antibodi antibodi anti-p35 (sc-820) digunakake kanggo blotting lan immunocytochemistry saka Cdk5 / p35. Antibodi anti-tikus anti-GFP (sc-9996) digunakake kanggo reseptoripilitas lan pambungkus saka DRD2-GFP. Antibodi antibodi antibodi (sc-807), antibodi antibodi antibodi (sc-805), antibodi antibodi anti-tikus (sc-138), lan antibodi anti-tikus anti-GAPDH (sc- 32293) dituku saka Biotechnologies Santa Cruz.

Animals

Tikus tikus p35 kuwi hadiah istimewa saka Dr. Katsuhiko Mikoshiba ing RIKEN Brain Science Institute ing Jepang lan digunakake kanggo budaya neuron utama. Primer kanggo genotype yaiku 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC lan 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT kaya sing wis dijelasake sadurunge [20]. Tikus ICR lan tikus Sprague Dawley digunakake kanggo nyiapake otak lysate. Prosedur kéwan kabèh diakoni déning Komite Pemanfaatan Animal and Use Animal Institution Pohang Universitas Pohang.

Plasmid Constructs

DRD2 panjang isoform ing vektor plasmid EGFP-N1 lan loop DRS 2 (212-373 residu asam amino kalebu residu asam amino tambahan 29 sing unik karo iso panjang DRD2) ing vektor plasmid pFLAG-CMV-2 sing digunakake. Human Cdk5 dipasang ing vektor plasmid pCMV HA lan p35 manungsa dipasang ing vektor plasmid pcDNA 3.1. Human Cdk5 disisipaké ing promotor cytomegalovirus (CMV) bebarengan karo p35 manungsa ing vektor PCDNA 3.1 kanggo nggawe ekspresi ganda (Cdk5 / p35) kanggo immunocytochemistry, assay internalization reseptor, [35S] -GTPγS mengikat assay, radioligand binding assay and cAMP enzyme immunoassay.

in vitro Kinase Assay

IP-linked in vitro Kinase assay iki ditindakake minangka berikut. Siji uteg tikus otak diselehake ing 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) dening 20 stroke saka homogenizer Dounce . Ing lysates padha inkubasi ing es kanggo 30 min, sonicated, lan centrifuged ing 16,000 × g kanggo 10 min. Ing supernatants padha immunoprecipitated karo antibodi antibodi anti-p35 kanggo njaluk Komplek Cdk5 / p35 aktif. Cdk5 / p35 protein campuran GST kompleks lan diresiki dicampur karo adenosine 5'-triposphate, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) lan inkubasi ing penyangga kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) kanggo 1 h ing suhu kamar [18], [21]. Komplek Cdk5 / p25 diresiki (14-516, Millipore) uga digunakake kanggo in vitro kinase assay kaya sing kasebut ing ndhuwur. Buffer loading sampel 2 × ditambah ing campuran reaksi lan direbus ing 100 ° C. Sampel kasebut banjur ditudhuhake ing SDS-PAGE lan gel garing ditemtokake dening autoradiography.

Analisis Kromatografi Liquid (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS Analisis

Protein GST-D2i3 rekombinan dianalisis dening LC-MS / MS ing ngisor iki IP-disambung in vitro kinase assay. Kita nganakake identifikasi peptide saka data LC-MS / MS nggunakake X !! Tandem (versi Dec-01-2008). Saben file data RAW pisanan diowahi dadi mzXML nggunakake pipa trans-proteomik (TPP; versi 4.3). MS / MS mindai ing mzXMLs sing diowahi banjur ditelusuri karo basis data protein protein UniProt mouse (rilis 2010_07) kalebu urutan GST-D2i3 nggunakake X !! Tandem. Toleransi disetel kanggo 3 Da kanggo ion prekursor lan 2 Da kanggo ion-ion fragmen. Spesifikasi enzim untuk trypsin dipigunakaké. Pilihan modifikasi sing beda-beda digunakake kanggo carbamidomethylation of cysteine ​​(57.021 Da), oksidasi methionine (15.995 Da), hidrolisis asparagine (0.987 Da) lan fosforilasi serine (79.966 Da).

Immunoprecipitation

Resepsi imunoprasi dilakokake ing lysates sel ing penyangga lisis ELB. Antibodi anti-GFP ditambahake ing lysates lan diinkubasi kanggo 3 h ing 4 ° C. Immunocomplexes diresiki nggunakake protéin-A agarosa. Ing precipitates diinkubasi karo SDS sampel buffer loading kanggo 30 min ing 37 ° C, lan subjected menyang SDS-PAGE lan Kulon blots.

GST Pull-down Assay

10 μg GST dimurnèkaké lan GST-D2i3 diinkubasi karo tikus otak lysate kanggo 1.5 h ing 4 ° C. 30 μL of glutathione (GSH) - Sepharose 4B manik-manik (17-0756-01, GE Healthcare) keseimbangan karo buffer lisis ditambah lan diinkubasi kanggo tambahan 1 h. Manik-manik dikoleksi dening centrifugation ing 2,000 ×g lan disiram karo lisis buffer 4 kaping [22], [23]. Precipitates dianalisis dening Western blotting nggunakake anti-Cdk5 lan anti-p35 antibodi.

Immunocytochemistry

Transfected HEK 293 cells and neurons striatal cultured on coverslips padha sakabeheng sawise karo fosfat buffered saline (PBS) lan tetep dening immersion ing 4% paraformaldehyde / PBS kanggo 30 min. Antibodi utama diencerke ing larutan pamblokiran (2% serum kuda lan 1% Triton X-100 ing PBS). Antibodi anti-tikus antibodi Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) lan antibodi anti-kelenjar Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) digunakake minangka antibodi sekunder. Hoechst digunakake kanggo pewarna nukleus. Gambar ditampa dening mikroskop konfok (Olympus, FluoView-1000).

Internal Internal Receptor

24 h sawise transfeksi, sel dianggep 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) kanggo 30 min lan 90 min ing 37 ° C. Sel padha dilereni maneh ing 2 mL kadhemen PBS lan 200 μL aliquots digunakake kanggo saben reaksi. Pangobatan tamba digawa ing suhu kamar kanggo 3 h ing konsentrasi ing ngisor iki; 3 nM [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma). Hydrophobic [3H] -spiperone dipigunakaké kanggo label total reseptor sing ditepungi lan hydrophilic sulpiride dipigunakaké kanggo ngganti reseptor mbungkus [3H] -spon. Sinyal reseptor sing ana hubungane karo membran diitung kanthi ngurangi nilai reseptor intraselular saka nilai reseptor sing ditulis. Sel-sel wis disaring ing filter GF / B (Millipore) lan diwenehi wektu 3 kanthi buffer cair (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filter-filter kasebut dikeringaké lan radioaktivitas residual diukur kanthi nggunakake counter scintillation cair [24].

Preparation Membrane Cell

Sel-sel brluen ing budaya-piring 100 mm sawise transfeksi dicampur karo PBS ès dingin lan dipanén ing buffer 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Lizzates homogenized padha centrifuged karo 500 × g kanggo 15 min lan supernatants banjur centrifuged karo 36,000 × g kanggo 30 min. Pelet ditrapake maneh ing HME buffer sing digunakake kanggo pengujian.

[35S] -GTPγS Binding Assay

Fraksi-fraksi membran sel wis diinkubasi kanthi 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) ing buffer assay (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA lan 0.01 mM PDB) kanggo 10 min. [Sunting]35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) ditambahake ing konsentrasi final 3 nM ing 30 μL lan terus diinkubasi kanggo 90 min. 170 μL buffer ice (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, lan 0.1 mM GTP) ditambahake kanggo mungkasi reaksi kasebut. Membran disaring ing filter GF / B (Millipore) lan dicampurake kaping 3 karo buffer ngumbah (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filter-filter padha garing lan radioaktivitas diukur nganggo counter scintillation [25], [26].

Radioligand Binding Assay

Membran sel sing disusun diinkubasi karo 0.01 nM [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) lan nambah konsentrasi quinpirole (Q102, Sigma) kanggo min 30 ing buffer assay (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membran disaring ing filter GF / B (Millipore) lan dicampurake kaping 3 karo buffer ngumbah (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reaksi iki diakhiri kanthi filtrasi kanthi cepet liwat saringan GF / C. Radioactivity resik diukur nggunakake counter scintillation cair [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Sel-sel HEK 293 sing ditransfer wis diisi karo 10 μM rolipram (R6520, Sigma) kanggo 1 h, banjur diobati karo 0.1 forskolin (F6886, Sigma) lan nambah konsentrasi quinpirole (Q102, Sigma) kanggo 30 min. Neuron striatik sing diobong-obangi kanthi dianggep 10 μM rolipram kanggo 1 h, banjur 1 μM dopamin kanggo 1 h [22]. Lysates sel wis disiapake karo 0.1 M HCl lan tingkat cAMP dideteksi dening enzim enabolim kit immunoassay (Sapphire Bioscience) sasuwene instruksi pabrik.

Neuron Striatal Utama

Area striatal diisolasi saka otak embrio mouse (E15). Jaringan disisih dipisah saka media penting minimal (MEM) (11095, Invitrogen) sing ngemot 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) lan 0.1% DNase I kanggo 6 min ing 37 ° C. Sel-sel ditrapake maneh ing media plating (MEM karo 0.01 M HEPES (pH 7.4) lan serat kuda (10-16050, GIBCO). Neuron dipunginaaken kanggo dina 122 in vitro (DIV 7) ing MEM karo tambahan B27 (17504-044, Invitrogen) sadurunge diterapake ing immunoassays enzim enzim.

results

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 in the Third Intracellular Loop of DRD2 in vitro

Kanggo ngenali subyektif Cdk5 novel, kita nglakoni telusuran kanthi sistematik (S / T) PX (K / H / R) minangka urutan konsensus Cdk5 pengenalan [30] lan diidentifikasi DRD2 minangka subtitle calon. Urutan konsensus, kalebet serine 321, dumunung ing loop intrapelular ketiga DRD2 (D2i3) dimana manéka mekanisme regulasi wis dipengaruhi [3], [10], [11]. Urutan kasebut sacara evolusioner lestari ing DRD2 ing vertebrata, nggambarake pentinge fungsi saka residuGambar 1A).

thumbnail

Tokoh 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 ing dobel intrasèl katelu saka DRD2 in vitro.

(A) Alangan urutan asam amino nuduhaké daerah konservasi saka DRD2 saka macem-macem spesies (diayahi). Situs phosphorylation potensial Cdk5 dituduhake dening asterisk. (B) IP-disambung in vitro kinase assay with recombinant GST-D2i3 and GST-D2i3 mutant proteins. Komplek Cdk5 / p35 sing dikembangake saka ekstrak otak tikus dening imunoprecipitation saka anti-p35 digunakake kanggo reaksi kinase. A autoradiograph saka protèin fosforilasi ditampilake bebarengan karo Coomassie pewarnaan biru sing éndah saka gel sing padha. Arrowhead nuduhake sinyal radioaktif sing cocog karo GST-D2i3s lan sirah panah mbukak nuduhake sinyal radioaktif saka p35. (C) Spektrum MS / MS potongan peptida fosforilasi D2i3. Pola fragmentasi teoritis dituduhake ing ngisor spektrum. Antarane kabeh ion fragmen, ion-ion lan b-ion sing dideteksi ditutake ing spektrum. Ing y6 lan y7 ion ngandhut fosforilasi serine 321. (D) In vitro kinase assay with complex Cdk5 / GST-p25 using GST-D2i3 and GST-D2i3 mutant proteins. Protein fosforilasi ditampilake ing autoradiograph, bebarengan karo pewarna biru Coomassie sing biru. Arrowhead nuduhake sinyal radioaktif sing cocog karo GST-D2i3 lan sirah panah mbukak nuduhake sinyal radioaktif saka GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Kanggo netepake kapasitas Cdk5 kanggo phosphorylate D2i3, kita nindakake IP-disambungake in vitro kinase nggunakake komplek Cdk5 / p35 aktif sing dikuatake saka otak tikus lysate kanthi reseptorisasi p35 kanthi rekombinan GST-D2i3 (residu asam amino 212-373) minangka substrat. Kita mirsani sinyal phosphorylation ing GST-D2i3 lan proton GST-D2i3 S297A, nanging sinyal kasebut sacara signifikan ditusuk nganggo GST-D2i3 S321A (Gambar 1B). Kanggo verifikasi fosforilasi serum 321 ing GST-D2i3, kita nganakake analisis LC-MS / MS saka conto saka IP-linked in vitro kinase nggunakake spektrometri massa LTQ XL. Senadyan mangkono, phospho-peptides sing cocog karo peptida phospho-serine massa sing dipangan (Gambar 1C). Amarga akuisisi data sing gumantung marang data LC-MS / MS cenderung ndeteksi protein akeh ing sampel [31], data iki nyaranake menawa sisa 321 serine minangka situs fosforilasi dominan Cdk5 ing wilayah D2i3. Kanggo mbuktekaken fosforilasi langsung serine 321 ing GST-D2i3 dening Cdk5, in vitro kinase assay nggunakake komplek Cdk5 / GST-p25 diresifikasi karo protèin rekombinan GST-D2i3 diresiki. Kita nemtokake sinyal fosforilasi sing signifikan ing GST-D2i3 sing absen ing GST-D2i3 S321A (Gambar 1D). Ditemtokake, asil kasebut nuduhake yen residu D2i3 S321 minangka target preferensial kanggo phosphorylation-mediated Cdk5.

Cdk5 Phosphory template Serine 321 ing Loop Intracellular Katelu saka DRD2 ing Sel

Kanggo ngenali fosforilasi serine 321, kita ngasilake antibodi khusus kanggo phospho-serine 321 (pS321). Sampel saka sambungan IP in vitro Kinase assay dianalisis dening Western blotting nggunakake anti-pS321 antibodi. Blotok nuduhaké sawijining band béda ing reaksi kinase sing gumantung marang GST-D2i3 (Gambar 2A). Kanggo verifikasi fosforilasi potensial serum 321 ing DRD2 dening sel-sel Cdk5, immunoprecipitates anti-GFP saka sel HEK 293 sing nduwe DRD2-GFP lan DRD2 S321A-GFP kanthi utawa tanpa HA-Cdk5 lan p35 dianalisis dening Western blotting nggunakake anti-GFP lan anti-pS321 antibodi. Sinyal band sing ditemtokake dening antibodi anti-GFP sing dikenal amarga glikosilasi berlebihan DRD2 sing diamati mung ana ing ngarsane DRD2-GFP, lan antibodi anti-pS321 ndeteksi sinyal DRD2 sing padha karo ekspresi Cdk5 / p35 (Gambar 2B) [7]. Kanggo verifikasi fosforilasi serine 321 dening Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) lan wangun mutan saka D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) kui. FLAG-D2i3 lan FLAG-D2i3 S321A ditulis nganggo utawa tanpa HA-Cdk5 lan p35 ing sel HEK 293 sing dianalisis dening SDS-gel mobilitas shift assay. A shift mobilitas sing gumantung Cdk5 signifikan diamati kanggo FLAG-D2i3, nanging ora kanggo FLAG-D2i3 S321A (Gambar 2C). Kita uga nandhani tingkat fosforilasi DRD2 ing Ser321 marang stimulasi agonist. Senyawa HEK 293 sing ngandhut komplek DRD2-GFP lan Cdk5 / p35 dirangsang dening quinpirole, lan immunoprecipitates anti-GFP saka lysates sel dianalisis dening Western blotting nggunakake anti-GFP lan anti-pS321 antibodi. Kita nemokake yen fosforilasi Cdk5-DRD2 ing Ser321 ora kena pengaruh stimulasi agonis, sing katon beda saka fosforilasi GRK- lan PKCGambar 2D) [32], [33]. Bebarengan, asil kasebut nuduhake yen Cdk5 bisa phosphorylate residual serum 321 saka DRD2 ing lingkungan selular.

thumbnail

Tokoh 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 ing dobel intraselular katelu saka DRD2 ing sel.

Phosphorylation-mediated Cdk5 saka serine 321 dianalisis nggunakake antibodi anti-pS321. (A) Sampel saka IP-disambung in vitro Kinase assay nggunakake protein GST-D2i3 dianalisis dening Western blotting (WB) karo antibodi sing dituduhake. Arrowheads ngenalake GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP lan DRD2 S321A-GFP diandharake kanthi utawa tanpa HA-Cdk5 lan p35 ing sel HEK 293. Immunoprecipitates Anti-GFP dianalisis dening Western blotting nggunakake antibodi anti-GFP lan anti-pS321. Kurungan nuduhake sinyal DRD2 lan sirah panah mbukak nuduhake sinyal sing ora spesifik saka immunoprecipitates anti-GFP. 'Input%' punika% volume total lysate kanggo reaksi IP. Sinyal Cdk5 endogenous sing ditemokake dituduhake dening asterisk. (C) Gel mobilitas shift assay. Sèl HEK 293 sing ditransfèksi kaya dituduhaké dianalisis déning Western blotting. (D) Ditransfeksi sel-sel HEK 293 sing diobati karo iminoprecipitates quinpirole lan anti-GFP kang dianalisis dening Western blotting karo antibodi anti-GFP lan anti-pS321. Bukak panah panah nuduhake sinyal sing ora spesifik saka immunoprecipitates anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex lan DRD2 sing gegandhengan karo fisik

Kita nyelidiki interaksi fisik potensial antarane kompleks Cdk5 / p35 lan DRD2 amarga akeh substrat Cdk5 sing dikenal sacara fisik digandhengake karo kompleks Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Pisanan, eksperimen tarik-mudhun GST ditindakake. Protein GST-D2i3 diresapi protein diinkubasi karo lysate otak tikus lan precipitates GST tarik-mudhun dianalisis kanggo Western blotting. Minangka ditampilake ing Gambar 3A, endogenous Cdk5 lan p35 diidentifikasi ing precipitates tarik-mudhun, nuduhake interaksi fisik antarane DRD2 lan Komplek Cdk5 / p35 (Gambar 3A). Kajaba iku, HA-Cdk5 lan p35 dideteksi ing immunoprecipitates anti-GFP saka lysate sel HEK 293 sing nuduhake DRD2-GFP lan Cdk5 / p35 (Gambar 3B). Kajaba iku, kita nganakake analisis immunocytochemical lan ngati-ati yen DRD2-GFP, HA-Cdk5 lan p35 nuduhake sinyal koordinasi sing signifikan ing area sel kanker HEK 293 (Gambar 3C, panel ndhuwur). Kita uga nyelidiki co-lokalisasi DRD2 lan Cdk5 / p35 ing konteks neuronal. Kanthi konsisten, DRD2-GFP uga nuduhake co-lokalisasi kanthi Cdk5 lan p35 ing neuron striatal sing budayane (DIV7), luwih ndhukung hubungan fungsi antara DRD2 lan Cdk5 / p35 (Gambar 3C, panel ngisor). Hasil kasebut nuduhake yen DRD2 lan Cdk5 / p35 bisa mbentuk kompleks lan kanthi mangkono, ndhukung pemahaman sing DRD2 minangka substrat fisiologis Cdk5.

thumbnail

Tokoh 3. Cdk5 / p35 bisa mbentuk kompleks karo DRD2.

(A) GST pull-down assay nggunakake protein rekombinan GST-D2i3 dimurnèkaké kanthi ekstrak tikus otak. Prediksi tarik mundhut GST dipuntedahaken kangge analisis kapitalisasi Barat. 'Bead' nuduhake endapan narik tanpa protein GST. (B) Immunoprecipitation saka kompleks DRD2 lan Cdk5 / p35. IP Anti-GFP saka lysates saka sel sing ditransfusi diduweni kanggo analisis blotting Barat. Kurungan nuduhake sinyal DRD2 lan sirah panah mbukak nuduhake sinyal sing ora spesifik saka immunoprecipitates anti-GFP. Blot kanggo input sing overexposed uga dituduhake ing sisih tengen. (C) Analisis immunocytochemical saka DRD2 lan Cdk5 / p35. HEK 293 sel sing ndhaptar DRD2-GFP lan Cdk5 / p35 padha diarani antibodi Anti-Cdk5 lan anti-p35 (panel Atas). DRD2-GFP dicakake piyambak ing neuron striatal sing budayane lan diwarnani karo antibodi anti-Cdk5 lan anti-p35 (Panel Bawah). Hoechst digunakake kanggo pewarna nukleus. Bar ukuran yaiku 5 μm. Kabeh gambar diwenehi mikroskopi confocal (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosforilasi Cdk5 saka DRD2 Attenuates Reseptor Kegiatan

Wis dilapurake yen phosphorylation modulates sifat kritis saka GPCRs kayata kopling protein G, internalisasi reseptor, lokalisasi intraselular, lan asosiasi karo protèin modulator [9], [11], [24]. AInternalisasi reseptor sing dipigunaake dening gonist minangka proses regulasi kritis transduksi sinyal. Kita nyelidiki modulasi Cdk5-internationisasi DRD2. HEK 293 sel njedulake DRD2-GFP lan DRD2 S321A-GFP kanthi utawa tanpa Cdk5 / p35 diinkubasi karo 1 μM quinpirole kanggo ngindhuksi internalisasi DRD2 nuju stimulasi agonist (Gambar 4A). [Sunting]3H] -sponer-sinyal sel DRD2-GFP sing dikarepake dikurangi sacara signifikan ing perawatan 30 min quinpirole lan bisa ditemokake ing 90 min. Apike, [3H] -sponer-sinyal sel-sel DRD2-GFP lan Cdk5 / p35 uga dikurangi ing perawatan 30 min quinpirole nanging ora ditemokaké ing 90 min (Gambar 4A, bagean kapindho). Ing sisih liyane, [3H] -spioner sinyal sel DRD2 S321A-GFP dikurangi ing 30 min lan mbalekake ing min 90, tanpa kaprigelan co-expression karo Cdk5 / p35. Pasinaon sadurunge wis nunjukake yen DRD2 internalisasi dicopot ing membran plasma sakwise stimulasi agonis [11]. TDadi, fosforilasi Cdk5-mediated saka DRD2 melu ing proses resensitization iki internalisasi DRD2-induced induced.

thumbnail

Tokoh 4. Fosforilasi-mediated Cdk5 attenuates ekspresi permukaan DRD2 lan signaling hilir.

(A) Ekspresi permukaan DRD2 diukur kanthi [3H] -spiperone binding assay. Transfected HEK293 sel wis stimulus karo 1 μM quinpirole kanggo dituduhake wektu lan panen, ngiring dening 3 nM [3H] -perawatan spiperone sajrone 3 jam. Radioaktivitas diukur lan sinyal permukaan diitung. Batang kesalahan nuduhake tegese ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA Siji arah kanthi tes Dunnett post hoc: bandhingake kabeh kolom vs. kolom kontrol). (B) [35S] -GTPγS mengikat assay. Membran sel wis disiapake saka sel sing ditransfer minangka dituduhake. Preparasi membran diinkubasi kanthi 1 μM quinpirole diiringi 3 nM [35S] -GTPγS kanggo 90 menit. Batang kesalahan nuduhake tegese ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA siji arah kanthi tes post hoc Bonferroni: bandhingake kabeh pasangan kolom). (C) saingan Quinpirole [3H] -spiperone binding assay. Preparasi membran saka sel transfected padha diinkubasi karo 0.01 nM [3H] -spiperone lan konsentrasi quinpirole nambah 30 menit. Regresi non-linear dipikolehi dening GraphPad. Batang kesalahan nuduhake tegese ± SE (n = 3). (D) immunoassay enzim cAMP ing HEK 293 sel sing transfeksi. Sel sing ditransfer digawe kanthi rolipram 10 µM sajrone 1 jam, lan banjur diolah kanthi 0.1 forM forskolin lan nambah konsentrasi quinpirole nganti 30 menit. Regresi non-linear dipikolehi dening GraphPad. Batang kesalahan nuduhake tegese ± SE (n = 4; ** p <0.01; buntut loro t-tests). (E) Kebiasaan neuron striatal saka jinis liar lan embrio knockout p35 (DIV 7) dianggep karo 10 μM rolipram kanggo 1 h diiringi dening 1 μM dopamin kanggo 1 h. Bar kesalahan makili tegese ± SE (n = 4; **p<0.01; buntut loro t-titik).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Kita luwih diandharake owah-owahan potensial g protein protein-stimulasi G agonis kanggo DRD2 sing ana hubungane karo phosphorylation-mediated Cdk5 nggunakake [35S] -GTPγS mengikat assay [25], [26]. DRD2-GFP lan DRD2 S321A-GFP kanthi utawa tanpa Cdk5 / p35 dicakake ing sel HEK 293. Membran wis disiapake lan diangsulake karo 1 μM quinpirole lan luwih diidinake [35S] -GTPγS incorporation. DRD2-GFP lan Cdk5 / p35 mujudake membran sel sing nuduhaké cacat [35S] -GTPγS mengikat dibandhingake kabeh membran sel liyane (Gambar 4B). Hasil kasebut nunjukake yen phosphorylation-mediated Cdk5 mudhun-ngatur pengikuhan protein agonist G ing DRD2.

Tambahan, quinpirole-competing [3H] -spiperone mengikat assays sing dileksanakake kanggo neliti sembarang owahan potensial ing agonist-afinitas ing DRD2 dening phosphorylation-mediated Cdk5. Pengikat kompetitif [3H] -spiperone nalika ngasilake konsentrasi quinpirole kanggo persiapan membran saka transfected diukur. Kompetisi pengikatan saka quinpirole lan [3H] -spiperone ing DRD2-GFP lan DRD2 S321A-GFP digawe padha logKi nilai-nilai (-9.789 kanggo DRD2-GFP; -9.691 kanggo DRD2 S321A-GFP), nuduhake yen afinitas ligan kanggo DRD2 ora kena pengaruh sacara signifikan ing fosforilasi Cdk5 ing DRD2 (Gambar 4C).

Phosphorylation-mediated Cdk5 Down-regulates the DRD2-cAMP Signaling Pathway

Sabanjure, kita nyelidiki apa modifikasi DRD2 dening Cdk5 mengaruhi jalur signaling hilir. Kita ngawasi inhibisi DRD2 ngetokake produksi CAMP-stimulasi dening adenylyl cyclase ing sel sing ngandhakake DRD2-GFP lan DRD2 S321A-GFP nggunakake enzim immunoassay enzim. Sel sing ngasilake DRD2 nuduhake penurunan tingkat cAMP minangka respon marang quinpirole kanthi cara gumantung dosis. Senadyan, ekspresi Cdk5 / p35 sacara signifikan ngurangi inhibisi maksimal pambentukan cAMP (Gambar 4D, panel kiwa). Saliyane, ing sel-sel ekspresioner DRD2 S321A-GFP, formasi cAMP sing efektif nandhang respon kanggo perawatan quinpirole tanpa ekspresi Cdk5 / p35 (Gambar 4D, panel tengen). Hasil kasebut nunjukake yen fosforilasi Cdk5-mediated saka DRD2 attenuates kegiatan nyegat saka DRD2 ing jalur tandha cAMP hilir. Kanggo luwih nganyari fénoména ing setelan sing luwih fisiologis, kita nggunakaké neuron-neuron utama sing didhasaraké saka embrio kalah mati ing p35, aktivator Cdk5 sing penting. Neuron striat utami sing diobati karo 1 μM dopamin lan dianalisis kanthi immunoassay enzyme cAMP. Neurons saka tikus tikus p35 nuduhaké tingkat cAMP sithik tinimbang neuron jenis liar nalika diangsulake dopamin (Gambar 4E). TSakwisé, kita nyimpulaké yen phosphorylation-mediated Cdk5 saka DRD2 nyebabake nyuda nada pamblokiran ing dalan cAMP kang ditindakake dening DRD2.

Diskusi

We diidentifikasi DRD2 minangka subyektif novel Cdk5. Fosforilasi katon mudhun-ngatur ekspresi permukaan DRD2 kanthi nggayuh nasib DRD2 sawise internalisasi reseptor kanthi mangkono ngurangi DRD2 Gi-memokake lan ngubengi cAMP pathway. Minangka residhèn fosforilasi S321 ana ing DRD2 isoforms panjang lan cendhak, mekanisme sing diusulaké ing panlitèn iki bisa dadi modulasi umum ing regulasi DRD2-mediated.

DRD2 ing neuron bolong sing medium ora mung dianggep minangka subtipe subtipe reseptor utama nanging uga diakoni minangka kerentanan kanggo owah-owahan ing kasedhiyan kanggo nanggepi rangsangan lingkungan. Desensitization-induced desensitization lan resensitization saka DRD2 wis sacara ekstensif diteliti [11], [24]. Khususipun, sapérangan pasinaon nampilake yen efek psikostimulan kronis, kayata kokain lan amphetamine, sing ngunggahaké tingkat ekstraselular dopamin ing synapse striatal, sing diiringi owah-owahan dinamis saka DRD2 pasca-pasif [36]. Pancen, pangguna kokain kronis dikenal ngurangi tingkat DRD2 ing wilayah striatal, lan kasedhiyan DRD2 ing accumbens nukleus (NAcc) nuduhake korelasi negatif karo perilaku alkohol lan perilaku penguat ing tikus lan primata [37]-[39]. Temuan kasebut nuduhake yen fungsi DRD2 banget rentan marang regulasi adaptif utawa compensatory kanggo nanggepi macem-macem rangsangan kalebu pajanan obat kronis. Hasil kita nuduhake yen residu S321 ing loop intraselular DRD2 katelu bisa di fosforilasi dening Cdk5, sing ngasilake pangurangan inhibisi DRD2 ing jalur cAMP. Interaksi kasebut ngusulake sawijining mekanisme regulasi novel sing digandhengake karo Cdk5 ing neuron dopaminositif sing bisa disambung karo sifat dinamis babagan DRD2 permukaan.

Perlu dicathet yen Cdk5 dikenal dadi komponen kunci ing mediating owah-owahan adaptif lingkungan neuronal. Kayata, owah-owahan struktural lan fungsi dendritik duri ing neuron sirkuit limbik minangka salah sawijining konsekuensi saka ekspresi psychostimulant bola [40]. Owah-owahan kasebut diiringi owah-owahan macem-macem molekul, kayata induksi protèktif-ikatan protèktif cAMP respon (CREB) lan ΔFosB, faktor transkripsi sing ngetokaké up-regulasi minangka tindak tutur kanggo administrasi kokain kronis [41], [42]. Penting, Cdk5 minangka target ΔFosB [19], lan akeh komponen penting ing dinamika geger dendrit, kayata PSD-95, kinase p21-aktif (PAK), β-catenin, lan spinofilin, kacathet minangka substrat Cdk5 [43]-[46]. Mesthi, manipulasi genetik utawa pharmacological saka kegiatan Cdk5 ngganti perubahan morphology spine dendritik lan respon perilaku kanggo kokain, nggambarake peran penting kanggo Cdk5 ing owah-owahan molekular lan morfologi sirkuit dopamin mesolimbi [47], [48]. Hasil kita nedahake yen DRD2 minangka target novel Cdk5 nyedhiyakake wawasan tambahan marang owah-owahan adaptif saka sistem dopamin kanggo nanggepi eksposisi narkoba kronis amarga peraturan ΔFosB sing ditengahi kanthi regulasi Cdk5 bisa ndadekake kenaikan tonik ing fosforilasi DRD2 . Menapa malih, DRD2 dipunmangertosi mangaruhi manéka prosès selular, kalebet regulasi jalur CAMP lan MAP kinase lan acara transkriptional hilir [42], [49]. Mangkono, temuan ing panliten iki bisa uga ora mung nggambarake peraturan langsung DRD2 dening Cdk5 nanging uga menehi wawasan novel marang respon adaptif sistem dopamin kanggo pajanan narkoba kronis.

Kontribusi panganggo

Nyadari lan ngrancang eksperimen kasebut: JJ YUP DH SKP. Nindakake eksperimen: JJ YUP DKK YK. Analisa data: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reagen / bahan / alat analisis: YHS. Tulis kertas: JJ SKP.

Cathetan Suku

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Reseptor dopamin: saka struktur kanggo fungsi. Physiol Rev 78: 189-225.
  2. 2. Bijak RA (2002) Sirkuit ganjaran otak: pemahaman saka insentif sing ora disengaja. Neuron 36: 229-240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Ndeleng Artikel
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Kabeh Topik
  6. Ndeleng Artikel
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Kabeh Topik
  9. Ndeleng Artikel
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Kabeh Topik
  12. Ndeleng Artikel
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Kabeh Topik
  15. Ndeleng Artikel
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Kabeh Topik
  18. Ndeleng Artikel
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Kabeh Topik
  21. Ndeleng Artikel
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Kabeh Topik
  24. Ndeleng Artikel
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Kabeh Topik
  27. Ndeleng Artikel
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Kabeh Topik
  30. Ndeleng Artikel
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Kabeh Topik
  33. Ndeleng Artikel
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Kabeh Topik
  36. Ndeleng Artikel
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Kabeh Topik
  39. Ndeleng Artikel
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Kabeh Topik
  42. Ndeleng Artikel
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Kabeh Topik
  45. Ndeleng Artikel
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Kabeh Topik
  48. Ndeleng Artikel
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Kabeh Topik
  51. Ndeleng Artikel
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Kabeh Topik
  54. Ndeleng Artikel
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Kabeh Topik
  57. Ndeleng Artikel
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Kabeh Topik
  60. Ndeleng Artikel
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Kabeh Topik
  63. Ndeleng Artikel
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Kabeh Topik
  66. Ndeleng Artikel
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Kabeh Topik
  69. Ndeleng Artikel
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Kabeh Topik
  72. Ndeleng Artikel
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Kabeh Topik
  75. Ndeleng Artikel
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Kabeh Topik
  78. Ndeleng Artikel
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Kabeh Topik
  81. Ndeleng Artikel
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Kabeh Topik
  84. Ndeleng Artikel
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Kabeh Topik
  87. Ndeleng Artikel
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Kabeh Topik
  90. Ndeleng Artikel
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Kabeh Topik
  93. Ndeleng Artikel
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Kabeh Topik
  96. Ndeleng Artikel
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Kabeh Topik
  99. Ndeleng Artikel
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Kabeh Topik
  102. Ndeleng Artikel
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Kabeh Topik
  105. Ndeleng Artikel
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Kabeh Topik
  108. Ndeleng Artikel
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Kabeh Topik
  111. Ndeleng Artikel
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Kabeh Topik
  114. Ndeleng Artikel
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Kabeh Topik
  117. Ndeleng Artikel
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Kabeh Topik
  120. Ndeleng Artikel
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Kabeh Topik
  123. Ndeleng Artikel
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Kabeh Topik
  126. Ndeleng Artikel
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Kabeh Topik
  129. Ndeleng Artikel
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Kabeh Topik
  132. Ndeleng Artikel
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Kabeh Topik
  135. Ndeleng Artikel
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Kabeh Topik
  138. Ndeleng Artikel
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Kabeh Topik
  141. Ndeleng Artikel
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Kabeh Topik
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Dopamin receptor signaling. J Recept Signal Transduct Res 24: 165-205. aja: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Kemungkinan minangka keterlibatan pasca-dopamin D2 reseptor signaling komponen ing pathophysiology saka skizofrenia. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. aja: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Peran dopamin reseptor kaya D2 ing cocaine self-administration: studi karo D2 reseptor mutant tikus lan novel D2 reseptor antagonists. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (2012) Valproate ngowahi sinyal dopamin kanthi asosiasi induksi par-4 protein. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Glycosylation diferensial lan perdagangan manungsa kanggo isoforms dawa lan cendhak D2 reseptor dopamin. J Biol Chem 270: 29819-29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) raclopride nyamuk raclopride khusus kanggo dopamin nikotin D3 reseptor: peran kelompok disulfida lan sulfhydryl. Neurochem Res 2: 17-749. aja: 759 / bf10.1007
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) Fosforilasi lan palmitoylation saka reseptor D2L manungsa ing sel Sf9. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermac JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Modulasi dopamin D (2) reseptor signaling dening protein aktin-ikatan (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Fosforilasi endocytosis lan receptor sing diakibatake dening agonist nyepetake resensitisasi reseptor dopamin D (2). Mol Endocrinol 24: 574-586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 yaiku subunit pangaturan saraf khusus kinase 5 sing gumantung siklin. Alam 371: 419-423. aja: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Dasawarsa CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749-759. aja: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Kinase 5 gumantung siklis gumantung marang owah-owahan ekstrasel kanggo aktin sitoskeleton sajrone perkembangan spine dendritik. Cell Adh Migr 1: 110-112. aja: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Ngaktifake Cdk5 ngakibatake Hippocampal CA1 sel mati kanthi langsung phosphorylating NMDA reseptor. Nat Neurosci 6: 1039-1047. aja: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 ngatur fosforilasi tyrosin 1472 NR2B lan ekspresi permukaan reseptor NMDA. J Neurosci 28: 415-424. aja: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Phosphorylates serum kinase 5-serat kinase 31 serum saka tirosin hidroksilase lan ngatur stabilitas. J Biol Chem 279: 54487-54493. aja: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Fosforilasi DARPP-32 dening Cdk5 modulates dopamin signaling in neurons. Alam 402: 669-671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001) Efek cahya kronis kanggo kokain diatur dening protein neuronal Cdk5. Alam 410: 376-380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. Kontribusi panganggo sinergis kinase 2001 / p5 lan Reelin / Dab35 gumantung marang posisi neuron korteks ing otak tikus sing berkembang. Proc Natl Acad Sci USA 1: 98-2764. aja: 2769 / pnas.10.1073
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Fosforilasi kinase 5-dependent kinase 95 domain N-terminal saka protein densitas postsynaptic PSD-24 ing neuron. J Neurosci 865: 876-10.1523. aja: 4582 / jneurosci.03.2004-XNUMX
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Lukas MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 ngubungake dopamin signaling lan depresi. Cell 122: 275-287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL minangka subyektif Cdk5 novel sing gegandhèngan karo LIS1 lan cytoplasmic dynein. Neuron 28: 697-711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (2001) Regulasi diferensial dopamin D2 lan D3 reseptor dening G reseptor kinase protein lan beta-arrestins. J Biol Chem 276: 37409-37414. aja: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Doppelin diferensial saka adenosin A1 lan D2 reseptor D037 dening suramin lan didemethylated suramin (NF53). Mol Pharmacol 808: 818-XNUMX.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (2000) Pengikatan calmodulin menyang reseptor D2-dopamin nyuda panrima reseptor kanthi nyekel switch G protein activation. J Biol Chem 275: 32672-32680. aja: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Dhaftar SJ, Seeman P (1981) Resolusi komponèn reseptor dopamin lan serotonin spiralone [3H] ngiket ing wilayah otak tikus. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620-2624. aja: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Agonist aksi ing D2 (dawa) reseptor dopamin: ligan ngiket lan fungsi tes. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopamine displaces [3H] domperidone saka situs iminitas dopamin D2, nanging ora [3H] raclopride utawa [3H] spiperone ing medium isotonic: Pangaruh kanggo tomografi emisi positron manungsa. Synapse 49: 209-215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Prediksi prediksi antar-sel awan interaksi kanthi nggunakake motif urutan singkat. Asam Nukleat Res 31: 3635-3641. aja: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004): Model kanggo sampling acak lan ngira kekuwatan protein relatif ing proton shotgun. Anal Chem 76: 4193-4201. aja: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Iki K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Sequestration saka reseptor D2 dopamin gumantung ing coexpression reseptor Kinase X-GIN protein 2 utawa 5. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Protein kinase C mediates phosphorylation, desensitization, and trafficking saka D2 deptin receptor. J Biol Chem 279: 49533-49541. aja: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Phosphorylation-mediated Cdk5 endophilin B1 dibutuhake kanggo autophagy ing model Parkinson penyakit. Nat Cell Biol 13: 568-579. aja: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 ikatan lan phosphorylates beta-catenin lan ngatur beta-catenin / presenilin-1 interaksi. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Hipotesis dopamin ing situs kokain. Trends Neurosci 14: 299-302. aja: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Efek saka pendanaan kokain kronis ing reseptor dopamin postsynaptic. Am J Psychiatry 147: 719-724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 reseptor ngramal sifat impulsivity lan kokain. Science 315: 1267-1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) PET imaging dopamin D2 reseptor sak cocaine kontrol timer cocaine ing kethek. Nat Neurosci 9: 1050-1056. aja: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Modifikasi struktural terus-terusan ing neuron nukleus akrab lan neuron corteks prefrontal sing diprodhuksi dening pengalaman sadurunge karo amphetamine. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Perubahan morfologi dendrite lan dendritik duri ing inti accumbens lan korteks prefrontal sawise perawatan kasebut kanthi amphetamine utawa kokain. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulasi ekspresi gene lan hadiah kokain dening CREB lan DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208-1215. aja: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) Spinophilin ngatur pambentukan lan fungsi dendritik duri. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287-9292. aja: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Modhèrn transportasi klompok pascakostatik-95 klompok lan asosiasi karo prekursor tulang sing stabil sak awal perkembangan neuron korteks. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarization drive beta-Catenin menyang spine neuronal sing ngembangake struktur lan fungsi sinaptik. Neuron 35: 91-105. aja: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (2004) Morfologi synaptic cortical lan konsolidasi memori mbebayani ing forebrain - tartamtu-negatif PAK transgenik clurut. Neuron 42: 773-787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 modulates cocaine reward, motivation, and excitability neuron striatal. J Neurosci 27: 12967-12976. aja: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) Dysregulation Striatal saka Cdk5 ngarubah respon lokomotif kanggo cocaine, learning motor, lan morfologi dendritik. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561-18566. aja: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Nggawe sambungan anyar: peran ERK / MAP kinase signaling ing neuronal plasticity. Neuron 23: 11-14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3