Настанак дендритске кичме изазване кокаином у средњим кичастим неуронима који садрже ДКСНУМКС и ДКСНУМКС рецепторе допамина у нуцлеус аццумбенс (КСНУМКС)

Проц Натл Ацад Сци УС А. 28. фебруар 2006; 103(9): 3399–3404.
Објављено онлајн 21. фебруара 2006. дои:  КСНУМКС / пнас.КСНУМКС
ПМЦИД: ПМЦКСНУМКС
Неуронауке
Овај чланак је био навели друге чланке у ПМЦ-у.

Апстрактан

Психостимулансом изазвана промена дендритских бодљи на допаминоцептивним неуронима у нуцлеус аццумбенс (НАцц) је претпостављена као адаптивни неуронски одговор који је повезан са дуготрајним понашањем зависности. НАцц се углавном састоји од две различите субпопулације шиљастих неурона средње величине који изражавају високе нивое допаминских Д1 или Д2 рецептора. У овој студији, анализирали смо дендритичну густину кичме након хроничног третмана кокаином у различитим спиналним неуронима средње величине који садрже Д1 или Д2 рецепторе у НАцц. Ове студије су користиле трансгене мишеве који су експримирали ЕГФП под контролом промотора Д1 или Д2 рецептора (Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП). После 28 дана третмана кокаином и 2 дана одвикавања, густина кичме се повећала и код Дрд1-ЕГФП- и Дрд2-ЕГФП-позитивних неурона. Међутим, повећање густине кичме је одржано само код неурона позитивних на Дрд1-ЕГФП 30 дана након повлачења лека. Значајно је да је повећана експресија ΔФосБ такође примећена код неурона позитивних на Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП након 2 дана повлачења лека, али само код неурона позитивних на Дрд1-ЕГФП након 30 дана повлачења лека. Ови резултати сугеришу да је повећана густина кичме уочена након хроничног третмана кокаином стабилна само у неуронима који садрже Д1 рецептор и да је експресија ΔФосБ повезана са формирањем и/или одржавањем дендритских бодљи у Д1 као и неуронима који садрже Д2 рецептор у НАцц.

Мезолимбички допаминергички пут се састоји од неурона у вентралном тегменталном подручју који инервирају нуцлеус аццумбенс (НАцц), олфакторни туберкул, префронтални кортекс и амигдалу (1), док нигростриатални допаминергички неурони у супстанцији нигра (парс цомпацта) пружају узлазну пројекцију до дорзалног стријатум (2). Психостимуланси подижу синаптичке концентрације допамина у НАцц: кокаин, блокирањем узимања допамина из синаптичког пукотина, и амфетамин, промовишући ослобађање допамина из нервних завршетака (3-5). Понављано, повремено давање психостимуланса доводи до појачаних бихејвиоралних одговора (сензибилизација) на акутне стимулативне ефекте ових лекова (6-8). Већина доказа сугерише да су адаптивне промене у вентралном тегменталном подручју–НАцц допаминергичком систему централне за промене у пластичности зависне од искуства која лежи у основи понашања изазваног лековима.

Поред допамина, глутамат је неопходан за развој бихејвиоралне сензибилизације као одговор на психостимулансе (9, 10). Спинати неурони средње величине (МСН) у вентралном стријатуму примају ексцитаторне глутаматергичне пројекције из префронталног кортекса које синапсе на главе дендритских бодљи. МСН су такође главна мета за допаминергичке аксоне који се синапсе на вратове кичме (1, 11, 12). Стога, дендритичне бодље у МСН-овима представљају ћелијски одељак где су допаминергички и глутаматергични пренос иницијално интегрисани.

Допамин делује на две главне подфамилије рецептора, подфамилију Д1 (подтипови Д1 и Д5) и потфамилију Д2 (подтипови Д2, Д3 и Д4) (13). У дорзалном стријатуму, анатомске студије су показале да стриатонигрални МСН садрже високе нивое Д1 рецептора (заједно са супстанцом П и динорфином), док стриатопалидални МСН претежно експримирају Д2 рецепторе (заједно са енкефалином) (14-17). Пројекције из НАцц су сложеније него у дорзалном стриатуму, са љуском и деловима језгра НАцц који се пројектују на различите подрегије вентралног палидума и на вентрално тегментално подручје и супстанцију црну (18). Док су Д2 рецептори и енкефалин високо изражени у пројекцијама на вентрални паллидум, Д1 рецептори и супстанца П налазе се подједнако распоређени у пројекцијама на вентрални паллидум и вентралну тегменталну област (19). Студије агониста и антагониста селективних за Д1 или Д2 рецепторе су показале да су и Д1 и Д2 рецептори потребни за промене понашања зависне од психостимуланса (20-25). Међутим, чини се да су улоге ових рецептора различите. На пример, стимулација Д1 рецептора умањује тражење кокаина изазвано ињекцијама кокаина и утицајима околине у вези са кокаином, док стимулација Д2 рецептора олакшава поновно успостављање изазвано кокаином (26-28).

Абнормалности у понашању повезане са зависношћу од психостимуланса су изузетно дуговечне. Стога је постојао значајан интерес за идентификацију дуготрајних промена изазваних лековима на молекуларном и структурном нивоу у неуронским круговима регулисаним допамином и глутаматом (29-32). Посебно је утврђено да дуготрајна изложеност кокаину или амфетамину повећава број дендритских грана и бодљи МСН-а у НАцц (33-35). Показало се да ове структурне промене трају и до ≈1–3.5 месеци након последњег излагања леку (30, 35) и сугерише се да леже у основи дуготрајних промена у синаптичкој пластичности повезане са излагањем психостимулансима.

Циљ ове студије је био да се испитају структурне промене дендритских бодљи изазване кокаином у субпопулацијама акумбалних МСН које експримирају или Д1 или Д2 рецепторе. У овим студијама користили смо трансгене мишеве са бактеријским вештачким хромозомом (БАЦ) који експримирају ЕГФП под контролом или Д1 (Дрд1-ЕГФП) или Д2 (Дрд2-ЕГФП) промотора допаминског рецептора (36). Резултати показују да, иако се повећана густина кичме у почетку јавља у МСН-овима који садрже Д1 рецептор и МСН-овима који садрже Д2 рецептор, измењена густина кичме је стабилна само у неуронима који садрже Д1 рецептор. Штавише, налазимо сличне промене у експресији фактора транскрипције ΔФосБ, што сугерише да ΔФосБ може бити укључен у формирање и/или одржавање дендритских бодљи у Д1, као и неурона који садрже Д2 рецептор у НАцц.

Резултати

Анализа МСН код Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП БАЦ трансгених мишева.

Пројекциони образац МСН-а из дорзалног и вентралног стриатума код Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП БАЦ трансгених мишева окарактерисан је анализом експресије ГФП (36). Диференцијална експресија ГФП-а у МСН-овима дорзалног стриатума генерално одговара експресији ендогених Д1 или Д2 рецептора, респективно (36). Даље смо анализирали диференцијалну експресију ГФП-а у НАцц код Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП мишева (Сл. КСНУМКСa b). Иако је ≈58% неурона у НАцц испољило ГФП код Дрд1-ЕГФП мишева (Сл. КСНУМКСa), ≈48% неурона у НАцц експримира ГФП код Дрд-2-ЕГФП мишева (Сл. КСНУМКСb). МСН представљају 90–95% свих неурона у НАцц (12, 37). Д1 рецептори су експримирани само у МСН, а Д2 рецептори су експримирани у МСН и холинергичким интернеуронима, који представљају 1-3% стријаталних неурона (37). Узимајући ове факторе у обзир, резултати сугеришу да, минимално, ≈10–15% МСН у НАцц вероватно изражава и Д1 и Д2 рецепторе.

Сл. КСНУМКС. 

Анализа МСН код Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП мишева. (a b) Поправљени делови мозга из НАцц од Дрд1-ЕГФП (a) или Дрд2-ЕГФП (b) БАЦ трансгени мишеви су имуно обојени на ГФП и НеуН (као општи неуронски маркер). Спојене слике показују жуту колокализацију ...

Анализа дендритских бодљи код Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП мишева.

Експресија ГФП-а код Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП мишева била је корисна за бојење тела неуронских ћелија. Међутим, ГФП сигнал у дендритима и дендритским бодљама био је преслаб да би омогућио њихову анализу након имунобојења анти-ГФП антителима. Балистичка испорука флуоресцентних боја посредована честицама је недавно коришћена за обележавање неуронских популација на брз и ефикасан начин (38). Помоћу ове технике могу се означити читави неурони, а чини се да је метода упоредива са Голги-Цок бојењем. Да би се анализирала дендритска морфологија неурона у НАцц, фиксирани акумбални резови су обележени липофилном флуоресцентном бојом 1,1′-диотадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцијанин перхлорат (ДиИ) коришћењем генског пиштоља. Пример ДиИ обојеног МСН-а је приказан у Сл. КСНУМКСc. У коришћеним условима, генерално смо посматрали обележене неуроне без икаквих преклапајућих дендрита са других обележених неурона. При већем увећању, може се уочити детаљна дендритска морфологија, укључујући дендритске бодље (Сл. КСНУМКСd).

Затим смо користили комбинацију обележавања ДиИ и имунохистохемије за ГФП код Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП трансгених мишева, што је омогућено коришћењем ниске концентрације детерџента за пермеабилизацију ткива (видети Методе). Пажљивим поређењем ДиИ мрље и ГФП експресије у ћелијским телима МСНс, могли бисмо да идентификујемо ДиИ- и ГФП-позитивне или ДиИ-позитивне и ГФП-негативне неуроне у Дрд1-ЕГФП (Сл. КСНУМКСa) или Дрд2-ЕГФП (Сл. КСНУМКСb) мишеви. За следеће студије, анализирали смо дендритску морфологију само код ДиИ- и ГФП-позитивних неурона код Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП мишева.

Сл. КСНУМКС. 

Анализа дендритских бодљи код Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП мишева. Неурони у НАцц било којег Дрд1-ЕГФП миша (a) или Дрд2-ЕГФП мишеви (b) прво су обележени са ДиИ (црвено), а затим подвргнути имунохистохемији коришћењем анти-ГФП антитела (ЕГФП, зелено). Само ...

Хронични третман кокаином резултира повећаном густином кичме у акумбалним МСН-овима који изражавају или Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП.

Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП мишевима је више пута убризгаван кокаин (30 мг/кг) или физиолошки раствор током четири узастопне недеље (види Методе). Два дана (2ВД) или 30 дана (30ВД) након последњег третмана лековима, мозгови су обрађени за ДИИ обележавање и имунохистохемију као што је горе описано. Претходна студија је известила да хронично лечење амфетамином повећава густину кичме на дисталним, али не и проксималним дендритима МСН у НАцц (35). Стога смо нашу анализу ограничили на дисталне дендрите (тј. оне са гранама другог или трећег реда), укључујући терминалне регионе. Када се анализира на 2ВД, утврђено је да се густина кичме повећава у Дрд1-ЕГФП-позитивним МСН-овима (128% групе са сланим раствором) (Сл. КСНУМКСa c) иу мањој мери код неурона позитивних на Дрд2-ЕГФП (115% физиолошке групе) (Сл. КСНУМКС b d). Након 30ВД, повећана густина кичме је одржана у Дрд1-ЕГФП-позитивним неуронима (118% контроле физиолошког раствора) (Сл. КСНУМКС a c), али не у Дрд2-ЕГФП-позитивним неуронима (Сл. КСНУМКС b d).

Сл. КСНУМКС. 

Хронична повећања густине кичме изазвана кокаином у Дрд1-ЕГФП- или Дрд2-ЕГФП-позитивним МСН-овима у НАцц. (a b) Дрд1-ЕГФП (a) или Дрд2-ЕГФП (b) мишеви су третирани физиолошким раствором (Сал) или кокаином (Цоц, 30 мг/кг) током 4 недеље. Обрађени су мозгови миша 2ВД или 30ВД ...

Морфологија дендритичних бодљи је променљива у погледу њихове дужине и ширине главе кичме. Због тога смо класификовали дендритичне избочине у четири класе кичме (дебљи, печурке, танке и филоподије) на 2ВД од кокаина (подаци нису приказани). Густина печурке (119.7 ± 4.0%, P < 0.01) и танке бодље (120.0 ± 3.4%, P < 0.01) повећана је третманом кокаином у Дрд1-ЕГФП-позитивним МСН-овима, док је густина трбушних (182.4 ± 21.6%, P < 0.05) и печурке (122.5 ± 5.0%, P < 0.01) је повећан у Дрд2-ЕГФП-позитивним МСН-овима. Није било значајног пораста укочених бодљи код Дрд1-ЕГФП-позитивних неурона или танких бодљи код Дрд2-ЕГФП-позитивних неурона.

Хронични кокаин изазива експресију ΔФосБ у Дрд1-ЕГФП- или Дрд2-ЕГФП-позитивним МСН-овима у НАцц.

ΔФосБ је члан Фос породице транскрипционих фактора. Док акутна примена кокаина изазива брзу и пролазну индукцију неколико Фос изоформа у НАцц, поновљено излагање кокаину повећава ниво ΔФосБ. Штавише, повећање експресије ΔФосБ опстаје у НАцц недељама до месецима након престанка излагања лековима и сугерисано је да је укључено у дуготрајну регулацију експресије гена, чак и након престанка узимања лека (29, 39, 40).

Да бисмо испитали индукцију ΔФосБ у НАцц од Дрд1-ЕГФП или Дрд2-ЕГФП мишева након третмана кокаином, анализирали смо експресију ФосБ и ГФП двоструким означавањем (Сл. КСНУМКС Табела КСНУМКС) Анти-ФосБ антитело препознаје све облике ФосБ, али претпостављамо да повећана имуностаница представља ΔФосБ (видети Методе за даљу дискусију). Код мишева третираних физиолошким раствором, 16% Дрд1-ЕГФП-позитивних неурона и 15% Дрд2-ЕГФП-позитивних неурона испољило је ФосБ имунореактивност са релативно слабим интензитетом (Сл. КСНУМКС a b Табела КСНУМКС). Поновљени третман кокаином праћен 2ВД је резултирао значајним повећањем броја неурона позитивних на Дрд1-ЕГФП који су коекспримирали ΔФосБ (55% ГФП-позитивних неурона) (Сл. КСНУМКСc Табела КСНУМКС). Мање, али и даље значајно повећање експресије ΔФосБ пронађено је код Дрд2-ЕГФП-позитивних неурона (25% ГФП-позитивних неурона) (Сл. КСНУМКСd Табела КСНУМКС). Као и код промена у густини кичме, повећана експресија ΔФосБ је одржана у Дрд1-ЕГФП-позитивним неуронима (46% ГФП-позитивних неурона), али не и у Дрд2-ЕГФП-позитивним неуронима (15% ГФП-позитивних неурона) након 30ВД (Сл. КСНУМКС e f Табела КСНУМКС). Имајте на уму да је повећана експресија ΔФосБ примећена у Сл. КСНУМКСf је присутан у Дрд2-ЕГФП-негативним неуронима.

Сл. КСНУМКС. 

Хронични кокаин индукује експресију ΔФосБ у Дрд1-ЕГФП- или Дрд2-ЕГФП-позитивним МСН-овима у НАцц. Дрд1-ЕГФП (a, c, и e) или Дрд2-ЕГФП (b, d, и f) мишеви су третирани физиолошким раствором или хроничним кокаином као што је описано у Сл. КСНУМКС. 2ВД (c d) или 30ВД (e ...
Табела КСНУМКС. 

Квантификација ЕГФП-позитивних неурона који експримирају ΔФосБ

Дискусија

Верује се да дуготрајне адаптације допаминергичке неуротрансмисије леже у основи зависничког понашања повезаног са психостимулативним лековима. Конкретно, претпоставља се да је повећање густине дендритичне кичме МСН у НАцц изазвано психостимулансима повезано са реорганизацијом синаптичке повезаности (30). НАцц се у великој мери састоји од две различите субпопулације МСН-а које изражавају високе нивое Д1 или Д2 допаминских рецептора. У овој студији, анализирали смо густину кичме у различитим МСН-овима који садрже Д1 или Д2 рецептор у НАцц након хроничног третмана кокаином. Добијени резултати показују да, иако се повећана густина кичме у почетку јавља у МСН-овима који садрже Д1 рецептор и МСН-овима који садрже Д2 рецептор, измењена густина кичме је стабилна само у неуронима који садрже Д1-рецептор. Штавише, налазимо сличан образац промена у експресији фактора транскрипције ΔФосБ у МСН-овима који садрже Д1 и Д2 рецептор.

Ове студије су користиле БАЦ трансгене мишеве који експримирају ГФП у специфичним субпопулацијама МСН-а под контролом промотора или Д1 или Д2 рецептора. Штавише, развили смо метод двоструког обележавања који је комбиновао имунохистохемију за ГФП са балистичким обележавањем неурона користећи ДиИ. Претходне студије су користиле Голги-Цок метод да анализирају ефекат психостимуланса на густину кичме (34), а ДиИ метода коришћена овде дала је резултате који су били квантитативно упоредиви. Развили смо метод двоструког обележавања јер бојење по Голгију није компатибилно са имунохистохемијом. Имунолошко бојење обично захтева пермеабилизацију ткива са детерџентима, процес који обично доводи до солубилизације липофилних боја из мембране (38). Међутим, у нашим тренутним студијама, ГФП имунобојење није захтевало високу концентрацију детерџента за пермеабилизацију ткива и стога би се могло користити у комбинацији са обележавањем липофилне боје. Наш метод двоструког обележавања би требало да буде генерално користан за проучавање структурних промена у дендритским бодљама, на пример када се користи за анализу БАЦ трансгених линија мишева где је ГФП изражен у специфичним популацијама неурона у кортексу (36).

Иако је још увек донекле контроверзно, верује се да су Д1 и Д2 рецептори у великој мери анатомски раздвојени на директне (стриатонигралне) и индиректне (стриатопалидалне) неуроне стријатне пројекције, респективно (17, 41). Почетна карактеризација локализације ГФП-а код Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП мишева била је у складу са овим закључком (36). Штавише, наша анализа броја ГФП-позитивних неурона у НАцц од Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП мишева је у складу са закључком да ≈50% МСН експресује само Д1 рецепторе, да ≈35–40% експримира само Д2 рецепторе, и да ≈10–15% коекспресује и Д1 и Д2 рецепторе. Ова вредност коекспресије је слична оној коју имплицирају студије дорзалног стриатума које су комбиновале анализу појединачних стријаталних неурона са РТ-ПЦР техникама за изоловање и појачавање мРНК (≈17% коекспресија енкефалина и супстанце П) (42). Треба напоменути да се наше тренутне студије не баве питањем експресије Д3, Д4 и Д5 рецептора, нити се баве питањем ниског нивоа експресије Д1 рецептора у МСН-овима који експримирају високе нивое Д2 рецептора или обрнуто.

Неколико претходних студија је испитивало неуронску локализацију експресије Фос изазване психостимулансима и улогу Д1 и Д2 рецептора (43-45). Те студије су подржале закључак да је индукција Фос и ΔФосБ посредована активацијом Д1 рецептора. Међутим, ћелијска локализација експресије Фос-а је под утицајем окружења у којем се дају психостимулативни лекови (46, 47). На пример, амфетамин или кокаин који се дају у кућном кавезу индукују непосредне ране гене (укључујући Фос) првенствено у П-позитивним ћелијама које коекспримирају Д1 рецепторе. Насупрот томе, ови лекови могу да изазову експресију Фос-а у МСН-овима који садрже Д1 и Д2 рецептор када се примењују у новом окружењу. Протокол коришћен у нашим тренутним студијама није укључивао упаривање ињекције лека са излагањем новом окружењу. Међутим, не можемо искључити неку врсту стреса зависног од контекста који је одговоран за експресију ΔФосБ у МСН-овима који садрже Д2 рецептор.

Значајна карактеристика садашњих резултата био је паралелни образац повећане густине кичме и експресије ΔФосБ. Повећана густина кичме и експресија ΔФосБ у почетку су се појавили у МСН-овима који експримирају Дрд1-ЕГФП и Дрд2-ЕГФП. Међутим, ове промене су биле стабилне само у неуронима који садрже Д1 рецептор. Једно могуће објашњење за запажање да је повећана густина кичме и експресија ΔФосБ пролазно пронађена у неуронима који садрже Д2 рецептор је да се то догодило у малом делу МСН-а који коекспримирају и Д1 и Д2 допаминске рецепторе. Дакле, пролазна природа ових повећања може бити повезана са антагонистичким ефектима активације Д2 рецептора на сигналне путеве зависне од Д1 (48). Интересантно је да су промене у густини кичме и експресији ΔФосБ биле реверзибилне, што може одражавати способност сигналних путева зависних од Д2 рецептора да утичу на стабилност ΔФосБ.

Опажање да постоје паралелне промене у експресији ΔФосБ и густине кичме је у складу са идејом да је ΔФосБ укључен у почетно формирање и накнадно одржавање дендритских бодљи у неуронима који садрже Д1 рецептор у НАцц. Експресија ΔФосБ се контролише сигналним путем зависним од Д1/ДАРПП-32/ПП1 у МСН-овима (49). Неколико студија је показало да ΔФосБ игра важну улогу у деловању психостимуланата који награђују и активирају локомотор (39), вероватно утичући на експресију више гена који укључују рецепторе неуротрансмитера, сигналне протеине и протеине укључене у регулацију неуронске морфологије (50). Међутим, специфични молекуларни механизми укључени у хронично формирање кичме изазвано кокаином тренутно нису познати. Наше претходне студије су показале да интраакумбална инфузија Цдк5 инхибитора росковитина ослаби повећање густине кичме изазвано кокаином (51). Штавише, Цдк5 је низводни циљни ген за ΔФосБ и умешан је у компензаторне адаптивне промене повезане са хроничним третманом кокаином (52). Према томе, промена фосфорилације зависне од Цдк5 је вероватан механизам који лежи у основи формирања кичме изазване кокаином и/или стабилности кичме. ПАК (53), β-катенин (54), ПСД-95 (55), и спинофилин (56) су супстрати за Цдк5 и сви су укључени у регулацију морфогенезе кичме (57-60). Даља карактеризација ових и других Цдк5 супстрата у бодљама ће, надамо се, бацити светло на механизме укључене у регулацију формирања кичме помоћу психостимуланса.

Методе

Животиње.

Мишеви који носе ЕГФП трансген под контролом Д1 или Д2 допаминских рецептора су генерисани у Генсат БАЦ трансгеном пројекту (36). Трансгени мишеви који су коришћени у овој студији били су стари 4-5 недеља и били су у Свисс-Вебстер позадини. Мишеви су одржавани у циклусу светлости/мрака од 12:12 сати и смештени у групе од 2–5 са храном и водом доступним ад либитум. Сви протоколи за животиње били су у складу са Водичем Националног института за здравље за негу и употребу лабораторијских животиња и одобрени су од стране Институционалне комисије за негу и употребу животиња Рокфелер универзитета.

Друг Треатмент.

Пријављено је да хронични третман кокаином (30 мг/кг, дневно) доводи до снажног повећања густине кичме МСН и у језгру и у љусци НАцц код пацова, али нижа доза (15 мг/кг) повећава густину кичме само у љуска (61). Стога смо користили већу дозу кокаина да изазовемо структурну модификацију у оба дела НАцц. Мишеви су примали једну ињекцију (ип) од 30 мг/кг кокаин-ХЦл (или физиолошког раствора) сваког дана током 5 узастопних дана, након чега су уследила 2 дана без ињекција, и овај поступак је поновљен 4 узастопне недеље. Ињекције су вршене у кућном кавезу. 2ВД или 30ВД, мишји мозгови су обрађени за ДИИ обележавање и/или имунохистохемију.

Балистичко обележавање са флуоресцентном бојом ДиИ.

Мишеви су анестезирани са 80 мг/кг натријум пентобарбитала и перфузирани транскардијално са 5 мл ПБС, након чега је уследила брза перфузија са 40 мл 4% параформалдехида у ПБС (20 мл/мин). Мозгови су брзо уклоњени из лобање и накнадно фиксирани у 4% параформалдехиду током 10 минута. Резови мозга (100 μм) су обележени балистичким испоруком флуоресцентне боје ДиИ (молекуларне сонде) као што је описано у реф. 38. Развијена је комбинована метода обележавања ДиИ-имунохистохемија са ниском концентрацијом детерџента. ДиИ-обележени пресеци су пермеабилизовани са 0.01% Тритон Кс-100 у ПБС током 15 минута, а затим инкубирани у 0.01% Тритон Кс-100 и 10% нормалног козјег серума у ​​ПБС током 1 х да би се минимизирало неспецифично обележавање. Секције ткива су затим инкубиране са 1% нормалног козјег серума/0.01% Тритон Кс-100 и анти-ГФП антитела (Абцам, Цамбридге, МА) током 2 х на собној температури, испране и инкубиране у 1:1,000 разблажењу ФИТЦ-а. коњуговано секундарно антитело (Молецулар Пробес). Секције су постављене на микроскопска стакалца и покривене медијумом за монтажу. Метода балистичког обележавања омогућила је детаљну анализу дендритске структуре кичме, а добијени резултати су били квалитативно и квантитативно упоредиви са претходним студијама применом Голги-Цок методе импрегнације у резовима мозга пацова (34). Међутим, за разлику од претходних студија, ретко смо приметили двоглаве кичме у неуронима обојеним ДиИ. Ова разлика може бити узрокована осетљивошћу метода бојења или варијабилности миша (ова студија) у односу на ткиво пацова (34).

Иммунохистоцхемистри.

Животиње су анестезиране и перфузиране као што је горе описано. Мозгови су уклоњени и чувани преко ноћи у 4% параформалдехиду на 4°Ц. Мозгови су пребачени у 30% сахарозу у ПБС раствору за криопротекцију. Коронални пресеци (12 μм) су исечени на микротому за замрзавање (Леица) и затим обрађени за имунохистохемију. Секције мозга су затим пермеабилизоване у 0.3% Тритон Кс-100 у ПБС током 15 минута и испране два пута у ПБС. Секције су претходно инкубиране у 10% нормалном козјем серуму у ПБС-у 1 х на 37°Ц, изложене примарним антителима (разблаженим у 1% нормалном козјем серуму у ПБС-у) преко ноћи на 4°Ц, а затим испране у ПБС-у и инкубиране са секундарним антитела 1 х на 37°Ц. Коришћена су следећа антитела: зечја анти-пан-ФосБ (СЦ-48, 1:500; Санта Цруз Биотецхнологи), мишја анти-НеуН (Цхемицон), зечја анти-ГФП, ФИТЦ-коњуговани анти-зечји ИгГ и родамин- коњуговани анти-мишји ИгГ (молекуларне сонде). За троструко обележавање (ΔФосБ, НеуН и ГФП), делови мозга су прво имуно обојени анти-пан ФосБ антителом и анти-НеуН антителом, а затим инкубирани са секундарним антителима (против зечјег ИгГ коњугованог са родамином и анти-мишји ИгГ коњугован са цијаном ). Двоструко обојени пресеци мозга су даље обрађени за ГФП имунобојење коришћењем Зенон технологије обележавања (Зенон Алека Флуор 488, Молекуларне сонде). Анти-пан-ФосБ антитело је подигнуто до Н краја ФосБ и препознаје ΔФосБ и ФосБ пуне дужине (62). На основу претходних студија које су показале да се ΔФосБ, али не и ФосБ или други антигени сродни Фос, стабилно експримирају након хроничног третмана кокаином, претпостављамо да дуготрајна повећања имунореактивности представљају стабилну експресију ΔФосБ. Међутим, идентитет имунореактивног ФосБ сигнала уоченог код мишева третираних сланим раствором није познат. Статистичка анализа у Табела КСНУМКС користио је Студентов t тест.

Дендритска анализа кичме.

Појединачни МСН-ови у НАцц-у су изабрани за анализу кичме на основу неколико критеријума. (i) Постојало је минимално или никакво преклапање са другим означеним ћелијама како би се осигурало да процеси из различитих ћелија не би били помешани. (ii) Најмање три примарна дендрита морају бити видљива да би се ћелије користиле за анализу. (ИИИ) Испитани су дистални дендрити (терминални дендрити или близу терминалног дендрита). Анализирани су дендрити из оба МСН у језгру и љусци НАцц. Иако смо посматрали МСН са ретким бодљама (шиљасти тип ИИ), анализирали смо само МСН са густим бодљама (шиљасти тип И). Да би се израчунала густина кичме, дужина дендрита (дужине >20 μм) је праћена коришћењем конфокалног микроскопа (Зеисс ЛСМ 510) са сочивом за урањање у уље (×40). Све слике дендрита су снимљене на различитим местима z нивои (0.5–1 μм дубински интервали) да се испита морфологија дендритских бодљи. Сва мерења су направљена помоћу софтвера за анализу метаморфних слика (Универсал Имагинг, Довнингтовн, ПА). Статистичка анализа је користила Колмогоров–Смирнов тест.

Избочине из дендрита су класификоване у четири типа на основу њихове дужине како је описано у реф. 63 64. Избочине класе 1, које се називају и здепасте избочине, биле су <0.5 μм у дужину, недостајале су им велика глава кичме и није изгледало да имају врат; класа 2, или печурке у облику печурака, биле су дугачке између 0.5 и 1.25 μм и карактерисале су их кратки врат и велика глава кичме; класа 3, или танке бодље, кретале су се између 1.25 и 3.0 μм и имале су издужене кичмене вратове са малим главама; класа 4, или филоподијални наставци, биле су дугачке филаментне избочине којима је недостајала уочљива глава кичме.

priznanja

Овај рад је подржан од стране Службе јавног здравља Сједињених Држава Грант ДА10044 (за ПГ и АЦН) и од стране Симонс фондације, Петер Ј. Схарп фондације, Пицовер фондације и ФМ Кирби фондације.

Скраћенице

  • НАцц
  • језгра аццумбенс
  • МСН
  • бодљасти неурон средње величине
  • БАЦ
  • бактеријски вештачки хромозом
  • ДрдКСНУМКС
  • вођен промотором Д1 рецептора допамина
  • ДрдКСНУМКС
  • вођен промотором Д2 рецептора допамина
  • ДиИ
  • 1,1′-диотадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцијанин перхлорат
  • КСНУМКСВД
  • 2 дана након последњег лечења леком
  • КСНУМКСВД
  • 30 дана након последњег лечења леком.

Фусноте

 

Изјава о сукобу интереса: Нема пријављених сукоба.

Референце

1. Тоттерделл С., Смитх АДЈ Цхем. Неуроанат. 1989;2:285–298. [ЦроссРеф]
2. Смитх И., Беван МД, Схинк Е., Болам ЈП Неуросциенце. 1998;86:353–387. [ЦроссРеф]
3. Хеиккила РЕ, Орлански Х., Цохен Г. Биоцхем. Пхармацол. 1975;24:847–852. [ЦроссРеф]
4. Ритз МЦ, Ламб РЈ, Голдберг СР, Кухар МЈ Сциенце. 1987;237:1219–1223. [ЦроссРеф]
5. Нестлер ЕЈ Трендс Пхармацол. Сци. 2004;25:210–218. [ЦроссРеф]
6. Каливас ПВ, Стеварт Ј. Браин Рес. Рев. 1991;16:223–244. [ЦроссРеф]
7. Пиерце РЦ, Каливас ПВ Браин Рес. Рев. 1997;25:192–216. [ЦроссРеф]
8. Робинсон ТЕ, Берридге КЦ Анну. Рев. Псицхол. 2003;54:25–53. [ЦроссРеф]
9. Волф МЕ, Кханса МР Браин Рес. 1991;562:164–168. [ЦроссРеф]
10. Вандерсцхурен Љ, Каливас ПВ Псицхопхармацологи. 2000;151:99–120. [ЦроссРеф]
11. Сесацк СР, Пицкел ВМЈ Цомп. Неурол. 1992;320:145–160. [ЦроссРеф]
12. Смитх АД, Болам ЈП Трендс Неуросци. 1990;13:259–265. [ЦроссРеф]
13. Сиблеи ДР, Монсма ФЈ, Јр. Трендс Пхармацол. Сци. 1992;13:61–69. [ЦроссРеф]
14. Бецкстеад РМ, Цруз ЦЈ Неуросциенце. 1986;19:147–158. [ЦроссРеф]
16. Герфен ЦР, Иоунг ВС, ИИИ Браин Рес. 1988;460:161–167. [ЦроссРеф]
16. Герфен ЦР Трендс Неуросци. 2000;23:С64–С70. [ЦроссРеф]
17. Герфен ЦР, Енгбер ТМ, Махан ЛЦ, Сусел З., Цхасе ТН, Монсма ФЈ, Јр., Сиблеи ДР Сциенце. 1990;250:1429–1432. [ЦроссРеф]
18. Захм ДС Неуросци. Биобехав. Рев. 2000; 24:85–105. [ЦроссРеф]
19. Лу Кс.-И., Гхасемзадех МБ, Каливас ПВ Неуросциенце. 1998;82:767–780. [ЦроссРеф]
20. Кооб ГФ, Ле ХТ, Цреесе И. Неуросци. Летт. 1987;79:315–320. [ЦроссРеф]
21. Воолвертон ВЛ, Вирус РМ Пхармацол. Биоцхем. Бехав. 1989;32:691–697. [ЦроссРеф]
22. Бергман Ј., Камиен ЈБ, Спеалман РД Бехав. Пхармацол. 1990;1:355–363. [ЦроссРеф]
23. Еппинг-Јордан МП, Маркоу А., Кооб ГФ Браин Рес. 1998;784:105–115. [ЦроссРеф]
24. Цаине СБ, Негус СС, Мелло НК, Бергман ЈЈ Пхармацол. Екп. Тхер. 1999;291:353–360. [ЦроссРеф]
25. Де Вриес ТЈ, Цоолс АР, Схиппенберг ТС НеуроРепорт. 1998;9:1763–1768. [ЦроссРеф]
26. Селф ДВ, Барнхарт ВЈ, Лехман ДА, Нестлер ЕЈ Сциенце. 1996;271:1586–1589. [ЦроссРеф]
27. Кхроиан ТВ, Барретт-Лариморе РЛ, Ровлетт ЈК, Спеалман РДЈ Пхармацол. Екп. Тхер. 2000;294:680–687. [ЦроссРеф]
28. Аллевеирелдт АТ, Вебер СМ, Кирсцхнер КФ, Буллоцк БЛ, Неисевандер ЈЛ Псицхопхармацологи. 2002;159:284–293. [ЦроссРеф]
29. Нестлер ЕЈ Нат. Рев. Неуросци. 2001;2:119–128. [ЦроссРеф]
30. Робинсон ТЕ, Колб Б. Неуропхармацологи. 2004;47:33–46. [ЦроссРеф]
31. Каливас ПВ Цурр. Опин. Пхармацол. 2004;4:23–29. [ЦроссРеф]
32. Химан СЕ, Маленка РЦ Нат. Рев. Неуросци. 2001;2:695–703. [ЦроссРеф]
33. Робинсон ТЕ, Колб БЈ Неуросци. 1997;17:8491–8497. [ЦроссРеф]
34. Робинсон ТЕ, Колб Б. Еур. Ј. Неуросци. 1999;11:1598–1604. [ЦроссРеф]
35. Ли И., Колб Б., Робинсон ТЕ Неуропсицхопхармацологи. 2003;28:1082–1085. [ЦроссРеф]
36. Гонг С., Зхенг Ц., Доугхти МЛ, Лосос К., Дидковски Н., Сцхамбра УБ, Новак Њ, Јоинер А., Лебланц Г., Хаттен МЕ, ет ал. Природа. 2003;425:917–925. [ЦроссРеф]
37. Зхоу ФМ, Вилсон ЦЈ, Дани ЈАЈ Неуробиол. 2002;53:590–605. [ЦроссРеф]
38. Грутзендлер Ј., Тсаи Ј., Ган ВБ Метходс. 2003;30:79–85. [ЦроссРеф]
39. Келз МБ, Цхен Ј., Царлезон ВА, Јр., Вхислер К., Гилден Л., Бецкманн АМ, Стеффен Ц., Зханг ИЈ, Маротти Л., Селф ДВ, ет ал. Природа. 1999;401:272–276. [ЦроссРеф]
40. Нестлер ЕЈ Неуропхармацологи. 2004;47:24–32. [ЦроссРеф]
41. Ле Моине Ц., Блоцх БЈ Цомп. Неурол. 1995;355:418–426. [ЦроссРеф]
42. Сурмеиер ДЈ, Сонг ВЈ, Иан ЗЈ Неуросци. 1996;16:6579–6591. [ЦроссРеф]
43. Ние ХЕ, Хопе БТ, Келз МБ, Иадарола М., Нестлер ЕЈЈ Пхармацол. Екп. Тхер. 1995;275:1671–1680. [ЦроссРеф]
44. Герфен ЦР, Кеефе КА, Гауда ЕБЈ Неуросци. 1995;15:8167–8176. [ЦроссРеф]
45. Мораталла Р., Елибол Б., Валлејо М., Граибиел АМ Неурон. 1996;17:147–156. [ЦроссРеф]
46. ​​Бадиани А., Оатес ММ, Даи ХЕ, Ватсон СЈ, Акил Х., Робинсон ТЕ Бехав. Мозак. Рес. 1999;103:203–209. [ЦроссРеф]
47. Усланер Ј., Бадиани А., Нортон ЦС, Даи ХЕ, Ватсон СЈ, Акил Х., Робинсон ТЕ Еур. Ј. Неуросци. 2001;13:1977–1983. [ЦроссРеф]
48. Хуфф РМ, Цхио ЦЛ, Лајинесс МЕ, Гоодман ЛВ Адв. Пхармацол. 1998;42:454–457. [ЦроссРеф]
49. Зацхариоу В., Сгамбато-Фауре В., Сасаки Т., Свеннингссон П., Бертон О., Фиенберг АА, Наирн АЦ, Греенгард П., Нестлер ЕЈ Неуропсицхопхармацологи. 2005. 3. августа; 10.1038/сј.нпп.1300832.
50. МцЦлунг ЦА, Нестлер ЕЈ Нат. Неуросци. 2003;6:1208–1215. [ЦроссРеф]
51. Норрхолм СД, Бибб ЈА, Нестлер ЕЈ, Оуимет ЦЦ, Таилор ЈР, Греенгард П. Неуросциенце. 2003;116:19–22. [ЦроссРеф]
52. Бибб ЈА, Цхен Ј., Таилор ЈР, Свеннингссон П., Нисхи А., Снидер ГЛ, Иан З., Сагава ЗК, Оуимет ЦЦ, Наирн АЦ, ет ал. Природа. 2001;410:376–380. [ЦроссРеф]
53. Николић М., Цхоу ММ, Лу В., Маиер БЈ, Тсаи ЛХ Натуре. 1998;395:194–198. [ЦроссРеф]
54. Кесавапани С., Лау КФ, МцЛоугхлин ДМ, Бровнлеес Ј., Ацкерлеи С., Леигх ПН, Схав ЦЕ, Миллер ЦЦ Еур. Ј. Неуросци. 2001;13:241–247. [ЦроссРеф]
55. Морабито МА, Схенг М., Тсаи ЛХЈ Неуросци. 2004;24:865–876. [ЦроссРеф]
56. Футтер М., Уематсу К., Буллоцк СА, Ким И., Хеммингс ХЦ, Јр., Нисхи А., Греенгард П., Наирн АЦ Проц. Натл. Акад. Сци. САД. 2005;102:3489–3494. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
57. Хаиасхи МЛ, Цхои СИ, Рао БС, Јунг ХИ, Лее ХК, Зханг Д., Цхаттарји С., Кирквоод А., Тонегава С. Неурон. 2004;42:773–787. [ЦроссРеф]
58. Мурасе С., Моссер Е., Сцхуман ЕМ Неурон. 2002;35:91–105. [ЦроссРеф]
59. Пранге О., Мурпхи ТХЈ Неуросци. 2001;21:9325–9333. [ЦроссРеф]
60. Фенг Ј., Иан З., Ферреира А., Томизава К., Лиаув ЈА, Зхуо М., Аллен ПБ, Оуимет ЦЦ, Греенгард П. Проц. Натл. Акад. Сци. САД. 2000;97:9287–9292. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
61. Ли И., Ацербо МЈ, Робинсон ТЕ Еур. Ј. Неуросци. 2004;20:1647–1654. [ЦроссРеф]
62. Перротти ЛИ, Боланос ЦА, Цхои КХ, Руссо СЈ, Едвардс С., Улери ПГ, Валлаце ДЛ, Селф ДВ, Нестлер ЕЈ, Баррот М. Еур. Ј. Неуросци. 2005;21:2817–2824. [ЦроссРеф]
63. Харрис КМ, Јенсен ФЕ, Тсао БЈ Неуросци. 1992;12:2685–2705. [ЦроссРеф]
64. Вандерклисх ПВ, Еделман ГМ Проц. Натл. Акад. Сци. САД. 2002;99:1639–1644. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]