ПМЦИД: ПМЦКСНУМКС
НИХМСИД: НИХМСКСНУМКС
Апстрактан
Промене у експресији гена изазване кокаином изазивају промене у морфологији и понашању неурона које могу бити у основи зависности од кокаина. Идентификовали смо суштинску улогу диметилације хистона 3 лизина 9 (Х3К9) и лизин диметилтрансферазе Г9а у структурној пластичности и понашању изазваној кокаином. Поновљена примена кокаина смањила је глобалне нивое диметилације Х3К9 у нуцлеус аццумбенс. Тњегово смањење метилације хистона је посредовано преко репресије Г9а у овом региону мозга, што је регулисано кокаином индукованим транскрипционим фактором ΔФосБ. Коришћењем условне мутагенезе и преноса гена посредованог вирусом, открили смо да је смањење регулације Г9а повећало пластичност дендритичне кичме неурона нуцлеус аццумбенс и повећало преференцију за кокаин, чиме је успостављена кључна улога метилације хистона у дуготрајном деловању кокаина.
увод
Поновљено излагање кокаину карактерише упорне промене у експресији гена и измењена неуронска морфологија унутар нуцлеус аццумбенс (НАц), кључна компонента можданог кола за награђивање (1-2). Ремоделирање хроматина је важно у аберантним транскрипционим променама у овом региону мозга које могу бити у основи аспеката зависности од кокаина (3-9). Регулација кокаинске структуре хроматина у НАц делимично је резултат директних модификација ензимске машинерије хроматина изазване кокаином, што доводи до промена у ацетилацији и фосфорилацији хистона (4, 7-9); међутим, улоге ензима који контролишу метилацију хистона још нису истражене.
Недавна анализа промотора у целом геному коришћењем имунопреципитације хроматина у комбинацији са микронизовима (ЦхИП-Цхип) идентификовала је измењене обрасце репресивне метилације хистона Х3 лизина 9 (Х3К9) и 27 (Х3К27) на специфичним промотерима гена у НАц након поновљеног третмана кокаином (6). Стога смо профилисали бројне лизин метилтрансферазе (КМТ) и деметилазе (КДМ) за које је познато да контролишу метилацију Х3К9 или Х3К27 (Слика КСНУМКСА). Само два ензима, Г9а и ГЛП, показали су упорну регулацију транскрипције 24 сата након поновљене примене кокаина, када је експресија оба гена значајно смањена. Пошто Г9а и ГЛП специфично катализују диметилацију Х3К9 (Х3К9ме2), њихова регулација кокаином је у складу са смањеним глобалним нивоима еухроматског Х3К9ме2 уоченог у овом тренутку (Слика КСНУМКСБ). Насупрот томе, глобални нивои хетерохроматске метилације Х3К27 остали су непромењени поновљеним излагањем кокаину (Слика С1 у пратећем онлајн материјалу). Због високог нивоа каталитичке активности оба ин витро ин виво (10), кренули смо да даље истражујемо функционални значај Г9а репресије након поновљене изложености кокаину у НАц. Нивои Г9а протеина, као и нивои његове мРНА, значајно су смањени 24 сата након поновљене примене кокаина (СКСНУМКС). Иако је експресија Г9а мРНА смањена за 35% у НАц, имунохистохемијска анализа је открила скромније смањење нивоа Г15а протеина од 9%, што је у складу са уоченим смањењем Х21К3ме9 од 2% након поновљеног давања кокаина (Слика КСНУМКСБ). Експресија Г9а мРНА је такође смањена у овом региону мозга за 20% након поновљене самопримјене кокаина (СКСНУМКС).
Да бисмо утврдили да ли промене у еухроматском Х3К9ме2 корелирају са променама у геному у експресији гена у НАц, користили смо анализе микромрежа да бисмо испитали профиле експресије гена изазване изазовном дозом кокаина код животиња са или без историје претходног излагања кокаину (видети додатне листе гена у Табеле С1–С3). Животиње које су више пута примале кокаин показале су драматично повећану експресију гена 1 сат након изазивања кокаина у поређењу са акутно третираним животињама (Слика КСНУМКСЦ). Ова повећана експресија гена се и даље јављала као одговор на изазов са кокаином који је дат након 1 недеље одвикавања од поновљеног кокаина. У складу са претходним извештајима, мали проценат гена (~10%) показао је десензибилизоване транскрипционе одговоре након поновљене примене кокаина (Слика КСНУМКСЦ; види Табле СКСНУМКС) (5). Да би се директно истражила улога смањења регулације Г9а у појачаној експресији гена уоченој након поновљене кокаина, мишеви су примили интра-НАц ињекције вектора Херпес симплек вируса (ХСВ) који експримирају или ГФП или Г9а и третирани су физиолошким раствором или поновљеним кокаином како би се утврдило да ли је прекомерна експресија Г9а био довољан да блокира поновљено повећање експресије гена изазвано кокаином. Из скупа од 12 насумично одабраних гена који показују повећане нивое експресије након поновљеног кокаина, приметили смо да Г9а значајно смањује појачану експресију 50% ових гена (Табле СКСНУМКС).
Да бисмо идентификовали узводне транскрипционе догађаје који посредују у поновљеној репресији експресије Г9а изазваној кокаином, истражили смо могућу улогу ΔФосБ, високо стабилног производа спајања непосредног раног гена фосБ. ΔФосБ се акумулира у НАц након поновљеног излагања кокаину, где је повезан са повећаном наградом кокаином (11). ΔФосБ може деловати или као активатор транскрипције или као репресор у зависности од циљаног гена који је укључен (3, 5, 6, 12). Коришћење битрансгених НСЕ-тТА × тетОП-ΔФосБ мишева, при чему се експресија ΔФосБ може селективно индуковати у НАц и дорзалном стриатуму одраслих животиња (13), испитали смо утицај експресије ΔФосБ на регулацију кокаина Х3К9ме2 и КМТс у НАц. Прекомерна експресија ΔФосБ је била довољна да смањи нивое оба Х3К9ме2 (Слика КСНУМКСД) и израз Г9а (Слика КСНУМКСЕ), чиме се опонаша ефекат поновљених кокаина. Насупрот томе, ΔФосБ није смањио експресију ГЛП у овом региону мозга и није имао утицај на СУВ39Х1 и ЕЗХ2, главне триметилирајуће ензиме за Х3К9 и Х3К27, респективно (СКСНУМКС). Да би се потврдили ови подаци коришћењем независног система прекомерне експресије ΔФосБ, одрасли мишеви дивљег типа примили су билатералне интра-НАц ињекције вектора вируса повезаних са Адено (ААВ) који изражавају или ГФП или ΔФосБ. Прекомерна експресија ΔФосБ посредована вирусом смањила је нивое експресије Г9а у овом региону мозга (Слика КСНУМКСЕ).
Овако изражена и специфична регулација Г9а подстакла нас је да истражимо да ли промена експресије Г9а специфично у НАц неуронима регулише бихејвиоралне одговоре на кокаин. Мишеви дивљег типа примили су интра-НАц ињекције ХСВ вектора који експримирају ГФП или Г9а, а затим су анализирани коришћењем непристрасне парадигме преференције места која је условљена кокаином, која обезбеђује индиректну меру награде за лек. Вирусна прекомерна експресија Г9а у НАц неуронима је потврђена након тестирања понашања (Слика КСНУМКСА). Прекомерна експресија Г9а значајно је смањила преференцију за кокаин у поређењу са животињама које прекомерно експримирају ГФП (Слика КСНУМКСБ), и повећао нивое Х3К9ме2 у НАц (Слика КСНУМКСЦ). Прекомерна експресија каталитички мртвог мутанта Г9а (Г9аХ1093К) (14) није утицало на преференцију кокаина (Слика КСНУМКСБ) и није имао утицаја на нивое Х3К9ме2 у овом региону мозга (Слика КСНУМКСЦ).
Да би се даље проучавала улога Г9а у бихевиоралним ефектима кокаина, и тачније да би се опонашала поновљена кокаином индукована репресија Г9а експресије у НАц, одрасла особа Г9афл/фл мишеви (14) примили су интра-НАц ињекције ААВ вектора који експримирају Цре рекомбиназу или ГФП као контролу. ААВ-Цре нокдаун Г9а у НАц, што је потврђено имунохистохемијски (СКСНУМКС), значајно повећао ефекте кокаина у експериментима кондиционирања на месту и смањио нивое Х3К9ме2 у НАц (Слика 2Д, Е). Комерцијално доступан фармаколошки инхибитор Г9а и ГЛП, БИКС01294 (15-16), коришћен је да се утврди да ли инхибиција ензима на сличан начин утиче на бихевиоралне одговоре на кокаин. Заиста, фармаколошка инхибиција Г9а и ГЛП значајно је повећала преференцију за кокаин и смањила Х3К9ме2 у НАц (Слика 2Ф, Г).
Поновљена примена кокаина повећава густину дендритских бодљи на НАц средњим бодљикавим неуронима (17), процес повезан са функционалним променама у ексцитаторним глутаматергијским синапсама на овим неуронима (18-19) и сензибилизоване бихејвиоралне реакције на лек (17, 20). Стога смо претпоставили да смањење активности Г9а у НАц понављаним кокаином може посредовати у способности кокаина да регулише густину дендритичне кичме НАц неурона. Користећи имунопреципитацију хроматина (ЦхИП) са анти-Г9а антителом, идентификовали смо неколико наводних Г9а генских мета у НАц, од којих је сваки претходно био умешан у дендритску пластичност изазвану кокаином (Слика КСНУМКСА) (20-26). Открили смо да поновљена примена кокаина значајно смањује везивање Г9а, као и нивое Х3К9ме2, на овим генским промотерима (Слика КСНУМКСБ). Насупрот томе, акутна примена кокаина је брзо регрутовала Г9а за неке од ових истих промотера гена, у складу са повећаном експресијом Г9а примећеном у НАц 1 сат након акутне дозе кокаина (СКСНУМКС). Иако је везивање Г9а на специфичним промоторима гена у корелацији са променама у његовој експресији, остаје нејасно да ли су такви догађаји посредовани измењеним глобалним нивоима Г9а у НАц и/или разликама у регрутовању Г9а након акутног вс поновљена примена кокаина.
На основу Г9а-ове регулације бројних гена везаних за пластичност у НАц-у, директно смо испитали да ли је одржавање експресије Г9а у овом региону мозга након поновљеног третмана кокаином било довољно да блокира формирање дендритичне кичме изазване кокаином. Коришћење протокола лечења кокаином за које је раније показано да промовише дендритичну индукцију кичме у НАц (20), испитали смо густину кичме код животиња којима је убризган ХСВ-ГФП или ХСВ-Г9а. У складу са претходним налазима, приметили смо значајно повећање дендритске густине кичме у НАц након третмана кокаином, ефекат који је потпуно блокиран прекомерном експресијом Г9а (Слика КСНУМКСЦ). Сама прекомерна експресија Г9а није била довољна да смањи густину НАц дендритичне кичме у одсуству кокаина. Да допуни ове податке, Г9афл/фл мишеви су примили интра-НАц ињекције ХСВ-Цре, а густина кичме је квантификована и упоређена са животињама које су примале ХСВ-ГФП у одсуству кокаина. Обарање експресије Г9а значајно је повећало густину кичме на НАц средњим бодљастим неуронима (Слика КСНУМКСЦ).
С обзиром на доказе да је смањење регулације Г9а у НАц након поновљеног кокаина посредовано ΔФосБ, затим смо испитали да ли је овај фактор транскрипције такође укључен у регулацију НАц дендритских бодљи.. Иако ΔФосБ раније није био узрочно повезан са таквом дендритском пластичношћу, неколико његових мета, укључујући подјединице Цдк5 и НФκБ, су толико умешане (20-23), и упорна експресија ΔФосБ у НАц неуронима корелира са повећаном густином дендритске кичме након поновљеног третмана кокаином (27). Прво смо открили да индукција ΔФосБ код битрансгених мишева у одсуству кокаина, што је смањило експресију Г9а и Х3К9ме2 (Слика 1Д, Е), смањено везивање Г9а за бројне гене везане за пластичност, од којих се показало да су многи директне мете самог ΔФосБ (Слика КСНУМКСД) (3, 6). Затим смо показали да вирусна прекомерна експресија ΔФосБ у НАц значајно повећава густину дендритичне кичме у базалним условима, слично оном уоченом након поновљене примене кокаина (Слика КСНУМКСЕ). Супротно томе, прекомерна експресија у НАц-у ΔЈунД, доминантног негативног мутантног протеина који антагонизује ΔФосБ транскрипциону активност, блокирала је способност поновљеног кокаина да повећа формирање дендритичне кичме у НАц-у. (Слика КСНУМКСЦ).
Наше запажање да ΔФосБ регулише експресију Г9а у НАц, и да ΔФосБ и Г9а регулишу неке од истих циљних гена, навело нас је да испитамо друге интеракције између ΔФосБ и Г9а. Након акутног кокаина, када су нивои Г9а повећани, везивање Г9а за фосБ ген је повећан, док је после поновљеног кокаина, када је експресија Г9а потиснута, Г9а везивање за фосБ ген је смањен (Слика КСНУМКСА). Тако смањено везивање Г9а након поновљених кокаина није примећено ц-фос, где се везивање Г9а повећава поновним кокаином (СКСНУМКС). Ово је у складу са чињеницом да, за разлику од фосБ, ц-фос је потиснут, а не изазван, хроничним излагањем психостимулансима (5). Прекомерна експресија ΔФосБ код битрансгених мишева била је довољна да значајно смањи везивање Г9а за фосб ген (Слика КСНУМКСД). Штавише, прекомерна експресија Г9а је била довољна да смањи повећану експресију ΔФосБ након поновљене примене кокаина (Табле СКСНУМКС). Ови подаци указују на ауторегулаторну петљу у којој Г9а у почетку ограничава индукцију ΔФосБ акутном применом кокаина. Међутим, како се ΔФосБ акумулира са поновљеним излагањем лековима, он потискује Г9а и на тај начин потенцира сопствену даљу индукцију.
У закључку, показали смо да је метилација хистонског лизина у НАц критично укључена у регулисање експресије неуронских гена као одговор на кокаин. Репресија Г9а и Х3К9ме2 након поновљене администрације кокаина промовише преференцију кокаина, делимично, кроз транскрипциону активацију бројних гена за које је познато да регулишу аберантне облике дендритске пластичности. Стицање бољег разумевања гена који се регулишу кроз такве механизме побољшаће наше знање о сложеној биолошкој основи зависности од дрога и могло би помоћи у развоју ефикаснијих третмана поремећаја зависности.
Материјал и метод
Животиње и третмани
Осим ако није другачије наведено, мишеви су смештени четири до пет по кавезу у колонији са циклусом светло/мрак од 12 сати (светла укључена од 7:00 до 7:00) на константној температури (23°Ц) са по вољи приступ води и храни. Све протоколе за животиње одобрио је ИАЦУЦ у медицинском центру УТ Соутхвестерн и Медицинском факултету Моунт Синаи.
За експерименте са кокаином [имунохистохемија, вестерн блоттинг, квантитативни ПЦР (кПЦР), анализа микромрежа и имунопреципитација хроматина (ЦхИП)], коришћени су мужјаци мишева Ц8БЛ/10Ј од 57 до 6 недеља. Животиње су примале дневне ињекције или 'физиолошког раствора' (7 третмана физиолошким раствором, ип), 'акутног' кокаина (6 третмана физиолошким раствором + један третман 20 мг/кг кокаин-ХЦл, ип) или 'поновљених' кокаина (7 третмана 20 мг/кг кокаин-ХЦл, ип). Мишеви су жртвовани или 1 сат или 24 сата након коначног третмана. За студије микромрежа, животиње су свакодневно третиране било 'физиолошким раствором' (15 третмана физиолошким раствором, ип), 'акутним' кокаином (14 третмана физиолошким раствором + 1 третман 20 мг/кг кокаин-ХЦл, ип), 'поновљеним + акутним' кокаином ( 7 третмана физиолошким раствором + 8 третмана 20 мг/кг кокаин-ХЦл, ип) или 'поновљена апстиненција + акутни' кокаин (7 третмана 20 мг/кг кокаин-ХЦл + 7 третмана физиолошким раствором + 1 изазовни третман 20 мг/кг кокаин-ХЦл, ип) и жртвовани су 1 сат након коначног третмана. У експериментима у понашању, мишеви су појединачно смештени након операције и лечени су са 10 мг/кг кокаин-ХЦл, ип као што је описано у наставку. За дендритску анализу кичме и валидацију микромрежа након инфекције ХСВ-ГФП и ХСВ-Г9а-ГФП, мишеви су третирани 'физиолошким раствором' (5 третмана физиолошким раствором, ип) или 'поновљеним кокаином' (5 третмана 20 мг/кг кокаин-ХЦл, ип ) током 3 дана, пошто је раније показано да овај протокол убризгавања повећава густину кичме на неуронима нуцлеус аццумбенс (НАц) у временском оквиру експресије трансгена вируса Херпес симплек (ХСВ) (Додатна референца С1). Мишеви који су коришћени за дендритску анализу кичме су жртвовани 4 сата након последњег третмана.
Да бисмо изазвали локално брисање Г9а транскрипта ограниченог на НАц неуроне, користили смо мутантне мишеве хомозиготне за флоксирани алел Г9а, који су детаљно описани на другом месту (S2). Цре-индукована рекомбинација производи спајање ексона 22 до 25 ван оквира што доводи до бесмислено посредованог распада мутираног транскрипта. Користили смо Г9а флоксиране мишеве који су у потпуности укрштени са Ц57БЛ/6Ј мишевима. Мишеви су стеротаксично ињектирани у НАц са векторима повезаним са вирусом адено (ААВ) (серотип 2) који експримирају ГФП или Цре-ГФП између старости од 7 до 10 недеља. Имунохистохемијска анализа је коришћена да се потврди ефикасност рекомбинације посредоване Цре (видети Додатна слика С5). Користили смо животињама убризгане ААВ 21 дан након операције јер је рекомбинација код Г9а флоксираних мишева била стабилна и максимална у овом временском тренутку, у складу са објављеним извештајима (S3-S4). Експерименти прекомерне експресије Г9а и ΔЈунД су на сличан начин спроведени коришћењем вектора вируса ХСВ који експримирају или ГФП, дивљи тип Г9а-ГФП, каталитички мртви Г9аХ1093К-ГФП или ΔЈунД-ГФП (видети S2 за детаље који се тичу развоја Г9а конструкција). Мишеви са прекомерном експресијом ХСВ-а коришћени су 3 дана након операције пошто је прекомерна експресија била максимална у овом временском периоду, што је примећено имунохистохемијским испитивањем. Због пролазне природе ХСВ експресије и знатно стабилније природе експресије ААВ, ХСВ вектори су коришћени у експериментима који захтевају брзу, краткотрајну експресију трансгена, док су ААВ вектори коришћени у експериментима који захтевају продужене периоде експресије трансгена. Оба вектора су показала, у опсежним претходним студијама, да инфицирају само тела неурона унутар убризганог подручја мозга, без икакве инфекције аферентних или еферентних неурона.
За експерименте понашања који користе фармаколошки инхибитор Г9а/ГЛП, БИКС01294 (25 нг/μл), мишеви су стеротаксично имплантирани са две поткожне мини-пумпе, као и билатералним водећим канилама, у НАц. Мини-пумпе су активиране 12 сати пре имплантације чиме је започела континуирана испорука (0.25 μл/сат) било вехикулума (5 хидроксипропил β-циклодекстрина) или лека током 14 дана, током којих су вршене процене понашања.
За експерименте прекомерне експресије ΔФосБ [вестерн блоттинг, кПЦР и ЦхИП], мушки битрансгени НСЕ-тТА × тетОП-ΔФосБ коришћени су мишеви (стари 10 недеља), при чему су у одсуству деривата тетрациклина доксициклина (8 недеља без доксициклина), животиње су показале робусну стријаталну ограничену конститутивну експресију ΔФосБ (S5). Прекомерна експресија ΔФосБ код ових мишева је потврђена путем кПЦР. Да бисте потврдили налазе помоћу НСЕ-тТА × тетОП-ΔФосБ мишеви, 8-недељни Ц57БЛ/6Ј мушки мишеви дивљег типа су интра-НАц стеротаксично ињектирани са ААВ векторима који експримирају или ГФП или ΔФосБ-ГФП. ААВ вектори су коришћени, у овом случају, да би се обезбедила максимална експресија ΔФосБ 8 недеља након операције, омогућавајући директно поређење између вирусно инфицираних и битрансгених мишева са прекомерном експресијом ΔФосБ. Прекомерна експресија вируса је потврђена коришћењем кПЦР-а 8 недеља након операције (НАц ударци од 15 мера су сецирани испод места ињекције). Мишеви са прекомерном експресијом ААВ-ГФП и ААВ-ΔФосБ-ГФП који нису коришћени за кПЦР лечени су физиолошким раствором (14 третмана физиолошким раствором, ип) или поновљеним кокаином (14 третмана 30 мг/кг кокаин-ХЦл, ип) почевши од 6 недеља након хирургија. 4 дана након завршног третмана, мозгови су фиксирани са 4% параформалдехида, пресечени на вибратому и коришћени за дендритску анализу кичме.
Вестерн блот анализа
НАц ударци 14 калибра узети су из короналних пресека од 1 мм добијених коришћењем матрице мозга миша од нерђајућег челика и обрађени су соникацијом у 1 М ХЕПЕС пуферу за лизу (1% СДС) који садржи инхибиторе протеазе и фосфатазе. 10-30 μг узорака укупног протеина је подвргнуто електрофорези на 18% СДС геловима. Протеини су пребачени у ПВДФ мембране и инкубирани или са анти-Х3К9ме2 (мишји моноклонски, 1:500), анти-β-тубулином (мишји моноклонски, 1:60,000), анти-тоталним хистоном Х3 (зечји поликлонални, 1:5,000), анти-ГФП (користи се за верификацију једнаке експресије вируса у пробушеном ткиву) (зечја поликлонална, 1:1000), анти-Х3К27ме3 (зечја поликлонална, 1:500) или анти-актин антитела (мишја моноклонска, 1:60,000) преко ноћи у 4°Ц (све мембране су блокиране у 5% млека или 5% албумина говеђег серума). Мембране су затим инкубиране са секундарним антителима обележеним пероксидазом (1:15,000-1:60,000 у зависности од примарног коришћеног антитела) и траке су визуелизоване коришћењем СуперСигнал Вест Дура супстрата. Траке су квантификоване помоћу НИХ Имаге Ј софтвера и Х3К9ме2 траке су нормализоване на актин или β-тубулин и на укупан хистон Х3 да би се контролисало једнако оптерећење. Поновљени кокаин није имао утицаја на ниво актина (СКСНУМКС) или укупан хистон 3 (СКСНУМКС) у НАц. Штавише, инфекција ХСВ-Г9а-ГФП и ХСВ-Г9аХ1093К-ГФП није имала утицај на укупне нивое β-тубулина у НАц (СКСНУМКС).
Иммунохистоцхемистри
Мишеви су седирани смртоносном дозом хлорал хидрата и перфузирани са 4% параформалдехида пре него што су анализирани једноструком или двоструком имунохистохемијом као што је претходно описано (S6). Укратко, пост-фиксирани мозгови су инкубирани на собној температури преко ноћи у 30% сахарозе пре него што су исечени на 35 μм (мозгови који се користе за анализу дендритичне кичме су исечени на вибратому на пресецима од 100 μм у одсуству 30% сахарозе). Слободно плутајући НАц делови су испрани са 1Кс ПБС, блокирани (3% нормалног магарећег серума, 0.1% тритонКс, 1Кс ПБС) и касније инкубирани са анти-ГФП (пилећи поликлонални, 1:8000) и/или анти-Г9а (зечји поликлонални , 1:500) антитела у раствору за блокирање. Секције анализиране на дендритске бодље су инкубиране са зечјим поликлонским анти-ГФП антителом у 1:200. После инкубације преко ноћи, НАц секције су испиране 3 пута по 10 минута са 1Кс ПБС, а затим је уследила инкубација са Ци2 и/или Ци3 флуоресцентно спрегнутим секундарним антителима у 1Кс ПБС раствору за блокирање током 2 сата. Секције коришћене за морфолошке студије су инкубиране у секундарном антителу преко ноћи на собној температури. Нуклеарно заједничко бојење је постигнуто инкубацијом секција у 1Кс ПБС који садржи ДАПИ (1:50,000) током 10 минута. Секције су још једном испране, након чега је уследила дехидратација етанолом и монтажа са ДПКС-ом. Сви пресеци су снимљени помоћу конфокалне микроскопије.
Изолација РНК и кПЦР
Двострани НАц ударци 14 калибра су хомогенизовани у Тризолу и обрађени према упутствима произвођача. РНК је пречишћена РНАеси Мицро колонама и спектроскопија је потврдила да су РНК 260/280 и 260/230 порције >1.8. РНК је затим реверзно транскрибована коришћењем Био-Рад иСцрипт комплета. цДНК је квантификована кПЦР коришћењем СИБР Греен. Свака реакција је изведена у дупликату или три примерка и анализирана пратећи ΔΔЦт метод као што је претходно описано коришћењем глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназе (ГАПДХ) као контроле нормализације (S7). Види допунска табела С5 за секвенце прајмера мРНА.
Анализа ДНК микромрежа
Четири групе (3 независне биолошке реплике по групи) су коришћене за студију микромрежа, укупно 12 микронизова. 1 сат након последње ињекције кокаина, животиње су брзо обезглављене, а мозгови су уклоњени и стављени на лед. Дисекције НАц су узете помоћу бушилице иглом од 15 и брзо су замрзнуте на сувом леду док РНК није екстрахована. Билатерални ударци су прикупљени од четири животиње по понављању, укупно 12 мишева по групи. Изолација РНК, обрада микромрежа и анализа података обављени су као што је претходно описано (S8). Укратко, РНК је изолована и пречишћена као што је горе описано, а квалитет је проверен коришћењем Агилентовог биоанализера. Реверзна транскрипција, амплификација, обележавање и хибридизација на Иллумина МоусеВГ-6 в2.0 низове су изведени коришћењем стандардних процедура од стране језгра микромрежа УТ Соутхвестерн. Необрађени подаци су одузети у позадини и квантилизовани су помоћу софтвера Беадстудио. Нормализовани подаци су анализирани коришћењем софтвера ГенеСпринг, а генелисте су генерисане коришћењем критеријума значајности 1.3 пута граничне промене у комбинацији са нестрогом граничном вредности п < 0.05.
Задржавамо висок степен поверења у ове податке из неколико разлога. Прво, све животиње су руковане, лечене и убијене у исто време, под истим условима. Такође, сва обрада РНК и низа је обављена у исто време. Друго, извели смо три поретка и објединили више животиња по узорку низа, чиме смо минимизирали разлике због индивидуалне варијабилности и повећали статистичку моћ (S9). Треће, критеријуме анализе података који се користе за нашу студију препоручује пројекат контроле квалитета МицроАрраи, пошто су ови критеријуми валидирани да обезбеде висок степен интерсите репродуктивности и репродуктивности између и унутар платформе (СКСНУМКС-СКСНУМКС).
Конструкција вирусних вектора
Због ограничења величине уметања вирусног вектора, кодирајуће секвенце било за дивљи тип Г9а (Г9а) или каталитички мртве Г9а (Г9аХ1093К) су субклониране у бицистронски п1005+ ХСВ плазмид који експримира ГФП под контролом хуманог непосредног раног цитомегаловируса (промотор ГЦМаВ) величина уметања била је ~ 9 кб, што премашује максималну величину уметања за ААВ-3.96 векторе). ИЕ2/4 промотер покреће експресију Г5а. Фрагменти су субклонирани у бицистронски п9+ ХСВ плазмид путем везивања тупих крајева са ПмеИ третираним Кленов-ом и Г1005а (од пцДНА9) дигестираним са ЕцоРИ и п3.1+ третираним ЦИП након ЕцоРИ дигестије. За производњу ХСВ-ΔЈунД-ГФП, кодирајућа секвенца ΔЈунД окружена ЕцоРИ рестрикцијским местима је генерисана помоћу ПЦР-а коришћењем олигонуклеотида прајмера који садрже ЕцоРИ место. ПЦР производ је затим везан за ЕцоРИ место вектора п1005+. Локална експресија Цре рекомбиназе у НАц неуронима је постигнута испоруком гена посредованом вирусом коришћењем ААВ вектора како је описано (СКСНУМКС). ГФП или Н-терминална фузија ГФП-а са Цре је субклонирана у рекомбинантни ААВ-2 вектор који садржи ЦМВ промотер са секвенцом акцептора донора спајања и сигналом полиаденилације. Све инсерције вектора су потврђене дидеокси секвенцирањем. Вирусни вектори су произведени методом троструке трансфекције, без помоћника, као што је претходно описано (СКСНУМКС). Пречишћени вирус је чуван на -80°Ц. Квалитет вируса је процењен инфективним титром процењеним у ћелијама ХЕК293. ААВ-ΔФосБ-ГФП вируси су припремљени на сличан начин. За ХСВ-Цре, експресију Цре је покретао ИРЕС промотер, за разлику од ИЕ4/5 промотера, како би се минимизирала експресија Цре и спречила неуронска токсичност (видети СКСНУМКС за вирусну конструкцију). У свим случајевима потврђена је прекомерна експресија вируса, оба ин витро ин виво, путем кПЦР-а, а имунохистохемијски је потврђено да вируси показују експресију ограничену на НАц након операције.
Стереотаксична хирургија
Под анестезијом кетамин (100 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг), мишеви су постављени у стереотаксични инструмент за мале животиње, а површина лобање је изложена. Тридесет три игле за шприц коришћене су за билатералну инфузију 0.5 μл вируса у НАц под углом од 10° (АП + 1.6; МЛ + 1.5; ДВ − 4.4) брзином од 0.1 μл/мин. Животињама које су примале ХСВ ињекције је дозвољено да се опораве 2 дана након операције, док је мишевима који су коришћени за тестирање понашања који су примали ААВ векторе дозвољено да се опораве 20 дана пре него што су подвргнути кондиционирању на месту. Ова времена су у складу са периодима максималне експресије трансгена посредоване вирусом за два вектора. За БИКС01294 инфузије, свака од две мини-пумпе била је постављена субкутано на леђима миша. Постављање каниле је постигнуто бушењем две мале кранијалне рупе изнад НАц и испоруком каниле из брегме (АП + 1.5; МЛ + 1.0; ДВ − 5.4). Мишевима је дозвољено да се опораве од операције 4 до 5 дана пре почетка поступка кондиционирања места на кокаин као што је описано у наставку.
Уређена преференција мјеста
Поступак кондиционирања места је спроведен као што је претходно описано, са следећим модификацијама (S7). Укратко, 3 дана након интра-НАц инфузије ХСВ-Г9а-ГФП, ХСВ-Г9аХ1093К-ГФП или ХСВ-ГФП, мишеви су смештени у коморе за кондиционирање, које се састоје од три различита окружења. Мишеви који су показали значајну преференцију за било коју од две коморе за кондиционирање искључени су из студије (<10% свих животиња). Групе за кондиционирање су затим избалансиране како би се прилагодиле било којој пристрасности коморе која још увек постоји. Следећих дана, животињама је убризган физиолошки раствор и затворен у једну комору поподне 30 минута, а затим им је убризган кокаин (10 мг/кг, ип) и затворен на 30 минута у другу комору увече на 2 дана (два физиолошки раствор и два упаривања кокаина). На дан теста, мишеви су стављени назад у апарат без третмана на 20 минута и тестирани да би се проценило коју страну преферирају. Локомоторни одговори на кокаин су процењени путем прекида снопа у коморама које су упарене са кокаином како би се осигурала ефикасност лечења дрогом. За ААВ и БИКС01294 ЦПП експерименте, коришћен је мало модификован протокол. Животиње су поново убризгане физиолошким раствором или кокаином (10 мг/кг, ип) и затворене у одређене коморе на 30-минутне сесије, али су уместо тога кондициониране само једном дневно током 4 дана, након чега је уследио тест 5. дана (животиње су кондициониране увече и кондициони третмани су се смењивали). За све групе, процењена је почетна локомоција као одговор на физиолошки раствор како би се осигурало да на локомоцију не утиче вирусни или инхибиторни третман.
Интравенска самопримена кокаина
Добијени су мушки адолесцентни Лонг-Еванс пацови, тежине 230–250 г на почетку експеримента. Били су смештени у окружењу са контролисаном влажношћу и температуром у обрнутом циклусу светлости/мрака од 12 сати (светло се гаси у 9:00 ујутру) са по вољи приступ храни и води. Пацовима је дозвољено да се аклиматизирају у свом новом окружењу и њима се рукуло свакодневно 1 недељу пре почетка експеримента. Све процедуре су спроведене у складу са Водичем Националног института за здравље за негу и употребу лабораторијских животиња и одобрене су од стране Комитета за негу и употребу животиња Моунт Синаи. Опрема за самоуправљање је опремљена инфрацрвеним зрацима за мерење локомоторног понашања. Самоадминистрирање је спроведено као што је претходно описано (СКСНУМКС-СКСНУМКС) са катетерима имплантираним у десну југуларну вену под анестезијом изофлураном (2.4–2.7%). Катетери су испрани са 0.1 мл физиолошког раствора који садржи 10 У хепарина и ампицилина (50 мг/кг). Након једне недеље опоравка од операције, обука за самоадминистрирање је почела током мрачне фазе циклуса светло/тамно. Животињама је дозвољен 3-часовни дневни приступ кокаину (0.75 мг/кг/инфузије) под фиксним односом-1 (ФР1) распоредом појачања, где је 1 активни притисак полугом резултирао једном инфузијом лека. Пацови су стабилизовали унос кокаина након 6 дана (<15% варијације у стопи одговора током 3 узастопна дана, са најмање 75% одговора на појачану полугу). 24 сата након последње сесије само-администрирања, пацовима су брзо обезглављени, мозгови су брзо уклоњени и обрађени за изолацију РНК и кПЦР.
Хроматин имунопреципитација (ЦхИП)
Свежи НАц ударци су били умрежени формалдехидом и припремљени за ЦхИП као што је претходно описано (СКСНУМКС-СКСНУМКС) са мањим изменама. Укратко, сакупљена су 4 НАц пунча од 14 калибра по животињи (5 животиња сакупљених по узорку), умрежени са 1% формалдехида и угашени са 2 М глицина пре замрзавања на -80°Ц. 1 дан пре ултразвучне обраде узорка, овчије анти-зечје/мишје (у зависности од антитела за преципитацију) ИгГ магнетне перле су припремљене инкубацијом одговарајућих магнетних перли са било анти-Г9а (зечји поликлонални ЦхИП степен) или анти-Х3К9ме2 (мишји моноклонални ЦхИП степен) антитела преко ноћи на 4°Ц уз константну ротацију у блок раствору. Соникација ткива и сечење хроматина су изведени као што је претходно описано (СКСНУМКС). Након соникације, једнаке концентрације хроматина су пренете у нове епрувете и ~5% финалних производа је сачувано да служе као 'улазне' контроле. После темељног испирања и ресуспендовања мешавина коњугованих зрна/антитела, једнаке запремине мешавине антитела/зрна (~7.5 μг антитела/узорак) су додате сваком узорку хроматина и инкубиране су ~16 сати уз константну ротацију на 4°Ц. Узорци су даље испрани и обрнуто умрежени на 65°Ц преко ноћи пре пречишћавања ДНК коришћењем комплета за ПЦР пречишћавање. Након пречишћавања ДНК, узорци су подвргнути кПЦР-у и нормализовани су на одговарајуће 'улазне' контроле као што је претходно описано (СКСНУМКС). Нормалне мишје ИгГ имунопреципитације коришћењем мишјег поликлонског анти-ИгГ антитела су такође спроведене ради контроле одговарајућег обогаћивања појачања сигнала. Аденин фосфорибозилтрансфераза (АПРТ) је коришћена као негативна контрола за експерименте прекомерне експресије кокаина и ΔФосБ. Види Супплементал Табле СКСНУМКС за секвенце промоторских прајмера.
Дендритска анализа кичме
Да бисмо проучавали улогу Г9а у регулацији неуронске морфологије ин виво, користили смо методе претходно описане са следећим модификацијама (S1). Три дана након ињекције ХСВ-ГФП, ХСВ-Г9а-ГФП, ХСВ-ΔЈунД-ГФП (сви вируси су коришћени код дивљег типа Ц57Бл/6Ј мишева) или ХСВ-Цре-ГФП (користи се у Г9афл/фл мишеви), када је експресија вируса била максимална, мишеви су перфузирани, мозгови су криопротектирани и касније исечени на 100 μм на вибратому. Секције су затим имуно обојене коришћењем антитела против ГФП-а као што је горе описано (видети Имунохистохемију). Да бисмо проценили ефекте прекомерне експресије Г9а и нокаута на број кичме, као и ефекат прекомерне експресије ΔЈунД, измерили смо број бодљи на приближно 1-2 неурита по неурону што је једнако најмање 299 μм секундарних дендрита из НАц медијума који експримира ГФП. бодљасти неурони (МСНс). Имајући у виду да се МСН-ови морфолошки разликују од других неуронских популација у НАц, као и претходни извештаји који указују да ХСВ првенствено инфицира неуроне који експримирају ДАРПП-32 у овом региону мозга (СКСНУМКС), уверени смо да су МСН-ови искључиво процењени у овим студијама. За сваку животињу смо испитали ~6–8 неурона у 3–4 животиње по групи (7 група), након чега је добијена просечна вредност за сваку животињу за статистичку анализу. Експерименти дизајнирани да испитају ефекте прекомерне експресије ΔФосБ на густину кичме НАц спроведени су слично као и горе описани, са изузетком што су ААВ вектори коришћени за експресију ГФП или ΔФосБ-ГФП током дужег временског периода (8 недеља). Све ХСВ слике су снимљене коришћењем конфокалног микроскопа са 100Кс објективом за урањање у уље (ААВ слике су снимљене са 63Кс објективом за урањање у уље). Слике су добијене са пинхоле постављеним на 1 произвољну јединицу и величином оквира од 1024 × 1024. Дендритска дужина је мерена коришћењем НИХ Имаге Ј софтвера, а примарни експериментатор је слепо бројао бројеве кичме, пошто су слајдови кодирани пре експерименталног скенирања. Израчунат је просечан број бодљи на 10 μм дендрита.
Статистичка анализа
Једносмерни и двосмерни АНОВА-и су изведени да би се одредио значај за условљену преференцију места и анализу дендритске кичме са више од две групе. Студентови т тестови су коришћени за друга поређења укључујући кПЦР, вестерн блоттинг, дендритичну анализу кичме која упоређује ХСВ-ГФП са ХСВ-Цре у Г9афл/фл мишеви, анализе микромрежа (види горе) и експерименти имунопреципитације хроматина. Планирани студентски т-тестови су коришћени након двосмерне АНОВА анализе дендритске густине кичме након прекомерне експресије ΔФосБ уз потврду значајних главних ефеката лечења лековима и вируса. Све вредности укључене у легенде слика представљају средњу вредност ± СЕМ (*п ≤ 0.05; **п < 0.001). Детаљне статистичке анализе за Фигс. КСНУМКС-3 у главном тексту дате су у: Детаљне легенде слика укључујући статистику.
Фусноте
Потврђујем да ниједан од материјала укључених у рукопис под насловом Основна улога хистонске метилтрансферазе Г9а у пластичности изазваној кокаином су раније објављени или се разматрају на другим местима, укључујући и Интернет.
Сав рад који је укључивао употребу животиња обављен је у складу са институционалним и ИАЦУЦ смерницама на Медицинском центру Универзитета Тексас Соутхвестерн и Медицинском факултету Моунт Синаи.
Референце и белешке
;