(ХУМАН) Бихевиорални и структурни одговори на хронични кокаин захтевају повратну петљу која укључује ΔФосБ и протеин-киназу зависну од калцијума и калмодулина ИИ у љусци нуклеарног акумулатора (КСНУМКС)

Фактор транскрипције ΔФосБ и протеина киназа ИИ (ЦаМКИИа) која је обогаћена мозгом изазвана је у нуцлеус аццумбенс (НАц) хроничном изложеношћу кокаину или другим психостимулантима, у којима два протеина посредују у сензибилисаним одговорима лека . Иако ΔФосБ и ЦаМКИИа регулишу експресију и функцију АМПА глутаматног рецептора у НАц, формирање дендритске кичме на НАц средњим неуронима кичме (МСНс), и локомоторну сензибилизацију на кокаин, до данас није истражена директна веза између ових молекула. Овде показујемо да је ΔФосБ фосфорилисан ЦаМКИИα на СерКСНУМКС који стабилизује протеине и да је ЦаМКИИ потребан за кокаином посредовану акумулацију ΔФосБ у НАц пацова.

Насупрот томе, показали смо да је ΔФосБ и неопходан и довољан за кокаинску индукцију експресије ЦаМКИИα гена ин виво, ефекат селективан за Д \ т₁-Тип МСН-ови у подрегиону НАц љуске.

Осим тога, индукција дендритичних бодова на НАц МСН-има и повећана реакција понашања на кокаин након претеране експресије НАц ΔФосБ су зависни од ЦаМКИИ.

Важно је да први пут демонстрирамо индукцију ΔФосБ и ЦаМКИИ у НАц од овисници о људском кокаину, сугеришући могуће циљеве за будућу терапијску интервенцију. Ови подаци утврђују да ΔФосБ и ЦаМКИИ учествују у позитивној феедфорвард петљи специфичној за ћелијски тип и мозак-регион као кључни механизам за регулисање круга награђивања мозга као одговор на хронични кокаин.

увод

Све већи број доказа подржава став да промене у експресији гена доприносе механизмима зависности од дрога (Робисон и Нестлер, КСНУМКС). Један важан медијатор ових промена је ΔФосБ, Фос фактор транскрипције породице (Нестлер, КСНУМКС). Хронично давање практично било ког лека изазива дуготрајну акумулацију ΔФосБ у нуцлеус аццумбенс (НАц), лимбичком региону неопходном за понашање награђивања. Синдукција појављује се специфично за класу НАц медијум кичмени неурон (МСН) који изражава ДКСНУМКС допаминске рецепторе. Индуктивна прекомерна експресија ΔФосБ у овим ННС МСН-има типа ДКСНУМКС повећава локомоторне и награђиване одговоре на кокаин и морфијум (Келз ет ал., КСНУМКС; Зацхариоу ет ал., КСНУМКС), укључујући повећану самоконтролу кокаина (Цолби ет ал., КСНУМКС). Надаље, генетска или вирусна блокада ΔФосБ транскрипционе активности смањује ефекат ових лијекова (Зацхариоу ет ал., КСНУМКС), указујући да је ова континуирана индукција ΔФосБ критични медијатор трајних промена изазваних у НАц хроничном применом лека.

Неуобичајена стабилност ΔФосБ (у односу на све остале протеине породице Фос) је и унутрашње својство молекула, због скраћивања дегрон домена присутних у ФосБ-у пуне дужине (Царле ет ал., КСНУМКС), и регулисан процес. ΔФосБ је фосфорилисан ин витро ин виво на СерКСНУМКС, и ова реакција даље стабилизује ΔФосБ, КСНУМКС-фолд, у култури ћелија и НАц ин виво (Улери-Реинолдс ет ал., КСНУМКС). Иако се показало да је СерКСНУМКС-ΔФосБ супстрат за казеин-киназу-КСНУМКС ин витро (Улери и др., КСНУМКС), његов механизам ин виво фосфорилација остаје непозната.

Протеин киназа ИИ (ЦаМКИИ) зависна од калцијума и калмодулина је високо експримирана серин / треонин киназа чије а и β изоформе формирају додекамерни хомо- и хетеро-холоензими ин вивои неопходни су за вишеструке облике неуропластичности (Лисман ет ал., КСНУМКС; Цолбран и Бровн, КСНУМКС). ЦаМКИИа се селективно индукује у НАц љусци хроничним амфетамином (Ловетх ет ал., КСНУМКС), а фармаколошка блокада ЦаМКИИ активности у НАц љусци смањује сензибилизацију понашања на амфетамин (Ловетх ет ал., КСНУМКС) и кокаин (Пиерце и сарадници, КСНУМКС), док прекомерна експресија вируса ЦаМКИИα у овој НАц субрегији повећава локомоторну сензибилизацију и самопримену амфетамина (Ловетх ет ал., КСНУМКС). ЦаМКИИа може утицати на понашање награђивања путем модулације подјединица рецептора глутамата АМПА (Пиерце и сарадници, КСНУМКС), пошто је активност ЦаМКИИа дуго повезана са функцијом АМПА рецептора и синаптичким циљањем у неколико облика неуропластичности (Малинов и Маленка, КСНУМКС).

Ова литература показује неколико паралела између ΔФосБ и ЦаМКИИ: оба су неопходна и довољна за вишеструке бихејвиоралне ефекте лекова злоупотребе, оба регулишу дендритичне бодље у различитим врстама неуронских ћелија ин виво (Јоурдаин ет ал., КСНУМКС; Мазе ет ал., КСНУМКС), и обоје врше барем неке своје ефекте понашања кроз модулацију АМПА рецептора (Келз ет ал., КСНУМКС; Малинов и Маленка, КСНУМКС; Виалоу ет ал., КСНУМКС). Упркос овим паралелама, није позната никаква функционална веза између ΔФосБ и ЦаМКИИ. Овде утврђујемо реципрочну регулацију између ΔФосБ и ЦаМКИИ, и показујемо да два протеина формирају ДКСНУМКС-тип МСН специфичну феед-форвард петљу у НАц љусци која је индукована кокаином и регулише низ одговора кокаина. ин виво.

Иди на:

Материјал и метод

Експеримент КСНУМКС: иТРАК протеомска анализа НАц љуске и језгра након третмана кокаином (Фиг КСНУМКСА)

Одраслим (КСНУМКС седмицама) мужјацима пацова је давано КСНУМКС мг / кг кокаина или физиолошки раствор ИП једном дневно током седам дана. КСНУМКС х после последње ињекције, НАц љуска и језгра су микродисекционисане (Фиг КСНУМКСА) и замрзнути. иТРАК анализе су извршене као што је претходно описано (Росс ет ал., КСНУМКС; Давалос и др., КСНУМКС).

Слика КСНУМКС

Схема-специфична индукција ЦаМКИИ у НАц помоћу кокаина

Експеримент КСНУМКС: Квантификовање промена протеина у НАЦ језгру штакора и љусци након третмана кокаином (Слика КСНУМКСБ – Д)

Одраслим (КСНУМКС седмицама) мужјацима пацова је давано КСНУМКС мг / кг кокаина или физиолошки раствор ИП једном дневно током седам дана у коморама за локомоторно снимање. Локомоторни одговори на једну ињекцију кокаина (КСНУМКС мг / кг ИП) забележени су код оних животиња које су претходно биле лечене кокаином (названим „хронични“) и део оних који су били лечени физиолошком отопином (званом „акутни“), а локомоторни одговори на слану отопину сам је забележен у преосталим животињама које су лечене хроничним сланим раствором (које се називају "физиолошки раствор"). Анализе локомоторне активности су извршене како је описано (Хирои ет ал., КСНУМКС). Укратко, одрасли мужјаци пацова су смештени у КСНУМКС ”× КСНУМКС” ПАС кутије за снимање на отвореном пољу (Сан Диего Инструментс) за КСНУМКС мин да би се хабитуирали, дата је једна ИП ињекција сланог раствора и праћена је додатна КСНУМКС мин, и дата им је једна ињекција ИП КСНУМКС мг / кг кокаина и праћена за КСНУМКС мин.

КСНУМКС х после ове последње ињекције, пацови су без главе без главе, да би се избегли ефекти анестетика на нивое протеина неурона и фосфо-стања. Мозгови су серијски резани у матрици КСНУМКС мм (Браинтрее Сциентифиц) и циљно ткиво је уклоњено у фосфатном пуферу који садржи протеазе (Роцхе) и фосфатазе (Сигма Алдрицх) инхибиторе употребом КСНУМКС мерача бушења за НАц језгро и КСНУМКС мерач бушења преосталих ткиво за НАц љуску (Види Фиг КСНУМКСА) и одмах замрзнути на сувом леду. Узорци су хомогенизовани лаком соникацијом у модификованом РИПА пуферу: КСНУМКС мМ Трис база, КСНУМКС мМ натријум хлорид, КСНУМКС мМ ЕДТА, КСНУМКС% натријум додецил сулфат, КСНУМКС% Тритон Кс-КСНУМКС, КСНУМКС% натријум деоксихолат, пХ КСНУМКС, инхибитори протеазе и фосфатазе као горе. Након додавања Лаеммли пуфера, протеини су раздвојени на КСНУМКС-КСНУМКС% полиакриламидним градијентима (Цритерион Систем, БиоРад), и Вестерн блоттинг је изведен користећи Одиссеи систем (Ли-Цор) према произвођачким протоколима.

Експеримент КСНУМКС: Квантификовање промена протеина у језгру НАц језгра и љусци након повлачења кокаинаФиг КСНУМКСЕ)

Одраслим (КСНУМКС седмицама) мужјацима пацова је давано КСНУМКС мг / кг кокаина или физиолошки раствор ИП једном дневно током седам дана. КСНУМКС дана након завршне ињекције, животиње које су третиране физиолошком отопином добиле су још једну ињекцију сланог раствора (под називом "салине), а животиње које су примале кокаин добиле су још једну ињекцију физиолошког раствора (звану КСНУМКС дан повлачење или" КСНУМКСд ВД ") или једну ињекцију кокаина ( под називом “КСНУМКСд ВД Цхал” за изазов). Један сат након завршне ињекције, животиње су декапитиране и Вестерн блот извршен као у експеримент КСНУМКС.

Експеримент КСНУМКС: Квантификовање промена протеина у језгру НАц језгра и љусци после само-администрације кокаина (Слика КСНУМКСА – Ц)

Пацови су обучени да самостално администрирају КСНУМКС мг / кг / инфузију кокаина у једночасовним сесијама под распоредом КСНУМКС фиксног односа за девет дана. После девет полазних сесија, пацови су подељени у две групе које су биле уравнотежене уносом кокаина на последње две сесије. Једној групи пацова је дозвољено да самостално примењују кокаин (КСНУМКС мг / кг / инфузија) током једног сата (кратак приступ, СхА) док је друга група пацова самостално узимала кокаин у шест часова (дуг приступ, ЛгА). ) за додатних десет дана (сесије ескалације).

Секције мозга су обрађене за имунохистокемију као што је описано (Перротти ет ал., КСНУМКС). Мозгови су перфундирани КСНУМКС-КСНУМКС хр након посљедњег излагања лијеку, што је резултирало деградацијом било којег преосталог ФосБ протеина у пуној дужини тако да сва преостала имунореактивност одражава ΔФосБ. Ова деградација је потврђена Вестерн блот тестом, који није показао значајно бојење са антителом усмереним против Ц терминуса ФосБ пуне дужине који не препознаје ΔФосБ (подаци нису приказани). Након резања у секције КСНУМКС ум, број ΔФосБ имунопозитивних ћелија је квантификован од стране слепог посматрача у две секције кроз НАц сваког пацова, а средње вредности по КСНУМКС × пољу су затим израчунате по регионима за сваку животињу. Свака животиња је сматрана индивидуалном опсервацијом за статистичку анализу. Региони од интереса су идентификовани користећи Пакинос и Ватсон (Пакинос и Ватсон, КСНУМКС).

Квантификација ЦаМКИИа имунореактивности је изведена коришћењем Лицор система као што је описано (Цовингтон ет ал., КСНУМКС). Интегрирани интензитети ЦаМКИИ и ГАПДХ су одређени помоћу Одиссеи софтвера. Резултати су приказани као интегрисане вредности интензитета по мм² и представљени су као средства ± сем (n = КСНУМКС – КСНУМКС по групи). Вредности за ГАПДХ су коришћене као референца за нормализацију интензитета ЦаМКИИ за дебљину пресека и услове.

Слика КСНУМКС

Индукција ЦаМКИИ у НАц љусци пацова и хуманих кокаин зависника

Експеримент КСНУМКС: Квантификовање нивоа протеина код људи зависних од кокаина (Фиг КСНУМКСД)

Поступак

Постмортем ткива људског мозга су добијена од Куебец Суициде Браин Банк (Универзитетски институт за ментално здравље Доуглас, Монтреал, Куебец, Канада). Очување ткива се одвијало у суштини како је описано (Куирион ет ал., КСНУМКС). Укратко, након што је извађен, мозак се ставља на влажан лед у кутији од стиропора и одлази у објекте за самоубилачки мозак у Квебеку. Хемисфере се одмах раздвајају сагиталним резом у средини мозга, можданог стабла и малог мозга. Крвни судови, пинеална жлезда, хороидни плексус, полу церебелум и полу мождана стабла обично се сецирају из леве хемисфере која се затим реже коронално у кришке дебљине КСНУМКС цм пре замрзавања. Потоња половина церебелума се пресјеца сагитално у кришке дебљине КСНУМКСцм прије замрзавања. Ткива су замрзнута у КСНУМКС-метилбутану на -КСНУМКС ° Ц током ~ КСНУМКС сек. Сва замрзнута ткива чувају се одвојено у пластичним кесама на -КСНУМКС ° Ц за дуготрајно складиштење. Специфични региони мозга се сецирају од смрзнутих короналних резова на плочи од нерђајућег челика са сувим ледом све око себе да би се контролисала температура околине. Вестерн блотирање је изведено као што је описано у експеримент КСНУМКС.

Кохорта

Кохорта је била састављена од КСНУМКС мушких и КСНУМКС женских субјеката, у распону старости између КСНУМКС – КСНУМКС година. Сви субјекти су изненада умрли без продуженог агоналног стања или дуготрајне медицинске болести. У сваком случају, узрок смрти је утврђен од стране Куебецовог Цоронер уреда, а токсиколошки екран је проведен са узорцима ткива како би се добиле информације о лијековима и недопуштеној употреби супстанци у вријеме смрти. Група испитаника се састојала од КСНУМКС појединаца који су испунили критеријуме СЦИД-И за зависност од кокаина. Контролна група се састојала од КСНУМКС испитаника без историје кокаинске зависности и без већих психијатријских дијагноза. Сви субјекти су изненада умрли из узрока који нису имали директан утицај на мождано ткиво. Групе су упарене за средњу старосну доб, одлагање хлађења и пХ. За све испитанике извршене су психолошке аутопсије као што је претходно описано (Думаис ет ал., КСНУМКС), омогућујући нам да имамо приступ детаљним информацијама о случају психијатријске и медицинске историје, као и друге релевантне клиничке и социодемографске податке. Укратко, обучени анкетар је спровео Структурирани клинички интервју за ДСМ-ИВ Психијатријски поремећаји (СЦИД-И) са једним или више доушника покојника. Панел клиничара прегледао је СЦИД-И процене, извештаје случајева, извештаје мртвозорника и медицинску документацију да би добио консензусне психијатријске дијагнозе.

Експеримент КСНУМКС: Хроматин имунопреципитација за НАц пацова (Слика КСНУМКСА – Ц)

Одраслим (КСНУМКС седмицама) мужјацима пацова је давано КСНУМКС мг / кг кокаина или физиолошки раствор ИП једном дневно током седам дана. КСНУМКС х после последње ињекције, НАц љуска и језгра су микродисекционисане. Хроматин имунопреципитација (ЦхИП) је изведена обједињавањем билатералних НАц пунуса љуске или језгра од седам пацова у групи у КСНУМКС укупним групама (КСНУМКС животиње укупно, КСНУМКС кокаински базени, КСНУМКС слане базене). Ткива су умрежена, испрана и чувана на -КСНУМКС ° Ц до стрижења кроматина преко соникације. Скраћени хроматин се инкубира преко ноћи са антителима претходно везаним за магнетне куглице (Динабеадс М-КСНУМКС, Инвитроген). Неимунски ИгГ је коришћен као контрола. После обрнутог унакрсног везивања и пречишћавања ДНК, кПЦР је коришћен за мерење нивоа ЦаМКИИа промоторске ДНК. Прајмери ​​су дизајнирани да амплификују регион који садржи АП-КСНУМКС консензус секвенцу лоцирану ~ КСНУМКС бп пре почетка места транскрипције (Форвард: АЦТГАЦТЦАГГААГАГГГАТА; Реверс: ТГТГЦТЦЦТЦАГААТЦЦАЦАА).

Слика КСНУМКС

ТипеФосБ индукција ЦаМКИИα ин виво

Експеримент КСНУМКС: Мерење транскрипта ЦаМКИИ и експресије протеина са ΔФосБ претераном експресијом ћелијског типаФиг КСНУМКСД)

Мушки битрансгенични мишеви изведени из НСЕ-ТА (линија А) × ТетОп-ΔфосБ (линија КСНУМКС) и НСЕ-ТА (линија Б) × ТетОп-ФЛАГ-ΔфосБ мишеви (линија КСНУМКС) (Цхен ет ал., КСНУМКС; Келз ет ал., КСНУМКС; Верме ет ал., КСНУМКС; Зацхариоу ет ал., КСНУМКС) су конципиране и узгојене на КСНУМКС µг / мл доксициклина да би се сузбила експресија ΔФосБ током развоја. Лицемате су подељене на одбиће: половина је остала на доксициклину, а половина је пребачена у воду, а животиње су коришћене КСНУМКС до КСНУМКС недеља касније када су транскрипциони ефекти ΔФосБ максимални (Келз ет ал., КСНУМКС; МцЦлунг и Нестлер, КСНУМКС). За транскрипционе анализе, мишеви су брзо декапитирани, а мозгови су уклоњени и стављени на лед. Дисекције НАц су узете са КСНУМКС-иглом и брзо смрзнуте на сувом леду док се РНА не екстрахује. Изолација РНК, кПЦР и анализа података су изведени као што је претходно описано (ЛаПлант ет ал., КСНУМКС). Укратко, РНК је изолована са ТриЗол реагенсом (Инвитроген), даље пречишћена са РНАеаси микро китом од Киаген, и проверена за квалитет са Агилентовим Биоанализер-ом. Реверзна транскрипција је извршена користећи иСцрипт (БиоРад). кПЦР је изведен са Апплиед Биосистемс КСНУМКСХТ РТ ПЦР системом са следећим параметрима циклуса: КСНУМКС мин на КСНУМКС ° Ц; КСНУМКС циклуси КСНУМКС ° Ц за КСНУМКС мин, КСНУМКС ° Ц за КСНУМКС сец, КСНУМКС ° Ц за КСНУМКС сец; степеновано загревање на КСНУМКС ° Ц да би се добиле кривуље дисоцијације за потврду појединачних ПЦР продуката. Имунохистокемијске анализе експресије ΔФосБ и ЦаМКИИα протеина извршене су како је описано у експеримент КСНУМКС.

Експеримент КСНУМКС: Утицај антагониста допаминских рецептора Д-НУМКС и ДКСНУМКС Интра-НАц на измене протеина посредованих кокаином (Фиг КСНУМКСХ)

Одраслим (КСНУМКС седмицама) мужјацима пацова је давано КСНУМКС мг / кг кокаина или физиолошки раствор (група "носач") ИП једном дневно током седам дана. КСНУМКС мин пре сваке ињекције кокаина, пацовима је примењен ИП антагонист ДКСНУМКС рецептора СЦХ КСНУМКС (КСНУМКС мг / кг, "ДКСНУМКС Ант" група), или антагонист ДКСНУМКС рецептора етиклоприд (КСНУМКС мг / кг, "ДКСНУМКС Ант" група) или контролна ињекција са сланом водом (група „кокаин“). КСНУМКС х након завршне ињекције, животиње су одсечене главе и протеини су квантификовани помоћу Вестерн блот-а по пер експеримент КСНУМКС.

Експеримент КСНУМКС: Ефекти ААВ-посредоване ΔФосБ претеране експресије на експресију протеина (Слика КСНУМКС А – Ц)

Стереотаксијска хирургија је изведена на одраслим мужјацима пацова (КСНУМКС недеља) за убризгавање ААВ-ГФП (зелени флуоресцентни протеин) или ААВ-ГФП-ΔФосБ (Мазе ет ал., КСНУМКС). КСНУМКС игле за мјерење (Хамилтон) су примијењене за све операције, током којих је КСНУМКС µл прочишћеног вируса високог титра билатерално инфундиран током периода КСНУМКС мин, након чега је услиједио додатни КСНУМКС мин пост-инфузијски период одмора. Све удаљености се мере у односу на Брегму: КСНУМКС ° угао, АП = + КСНУМКС мм, Лат = КСНУМКС мм, ДВ = −КСНУМКС мм. КСНУМКС дана након операције, животињама је дата једна ИП ињекција КСНУМКС мг / кг кокаина у коморама за локомоторно праћење како би се процијенили ефекти понашања прекомјерне експресије ΔФосБ. КСНУМКС х након ове финалне ињекције, пацови су одсечени глава према пер експеримент КСНУМКСи микродисекција ткива је изведена под флуоресцентним микроскопским упутством да би се добило ГФП-позитивно НАц ткиво. Затим је извршено Вестерн блотирање према пер Експеримент КСНУМКС.

Слика КСНУМКС

ΔФосБ је и неопходан и довољан за индуковање ЦаМКИИα зависне од ДКСНУМКС рецептора посредованог кокаином у НАц љусци

Експеримент КСНУМКС: Ефекти ААВ-посредоване ΔЈунД претеране експресије на експресију протеина зависних од кокаина (Слика КСНУМКС Д – Ф)

Стереотаксијска ињекција ААВ-ГФП или ААВ-ГФП-ΔЈунД је извршена према Експеримент КСНУМКС. КСНУМКС дана након операције, животињама је примењено КСНУМКС мг / кг кокаина или физиолошки раствор ИП једном дневно током седам дана у коморама за локомоторно снимање. Забиљежени су локомоторни одговори на једну ињекцију кокаина (КСНУМКС мг / кг ИП) или физиолошке отопине. КСНУМКС хр након ове финалне ињекције, пацови су одсечени главе, ткиво сакупљено, и Вестерн блот изведени су као у Експеримент КСНУМКС.

Експеримент КСНУМКС: Ин Витро Протеин Кинасе Ассаис \ тСлика КСНУМКСА – Д)

Рекомбинантни ЦаМКИИα и ΔФосБ су пречишћени из ћелија инсеката (Брицкеи ет ал., КСНУМКС; Јориссен ет ал., КСНУМКС) и тестови протеин киназеЦолбран, КСНУМКС), као што је претходно описано. Укратко, ЦаМКИИ је преинкубиран на леду са КСНУМКС µМ (или назначеном концентрацијом) ΔФосБ, КСНУМКС мМ Ца²⁺, КСНУМКС мМ Мг²⁺, КСНУМКС µМ калмодулина, и КСНУМКС мМ ХЕПЕС пХ КСНУМКС. Фосфорилација је иницирана додавањем КСНУМКС µМ АТП са или без [и-³²П] АТП и дозвољено да се настави током КСНУМКС мин на собној температури (Слика 5А и Б.) или КСНУМКС мин на леду (Слика 5Ц & Д.). Производи су решени Вестерн блоттингом (Слика 5А и Б.) или помоћу ауторадиограма и сцинтилационог бројања (Фиг Б-Д).

Слика КСНУМКС

ΔФосБ је моћан супстрат за ЦаМКИИα

Експеримент КСНУМКС: Идентификација СерКСНУМКС ΔФосБ фосфорилације (Фиг КСНУМКСЕ)

Ин витро тестови киназе су изведени према пер експеримент КСНУМКСпротеини су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ, и траке које одговарају ΔФосБ су изрезане и подвргнуте тандем масеној спектрометрији. М / з додели одговарајућих јонских фрагмената у свим панелима су обележени на врху врхова јона. Нису сви фрагменти иони означени због ограничења простора. Уопштено, текст за ознаке јона фрагмента је обојен у црно, осим када директно потврђују или додају доказ присутности места фосфорилације од интереса, у ком случају су означене црвеном бојом. Докази за производе фрагментације кичме су приказани у редоследу очитавања фосфопептида са детектованим местом остатка фосфорилације назначеним у црвеној боји са ознаком појединачне аминокиселине. Нумерички описи посматраних фрагмента јона су такође обележени на пептидној секвенци као б и и јони. Фактори зумирања за секције м / з оси да би се показали фрагменти јона нижег интензитета су означени на врху сваког масеног спектра фрагмента. Фрагментни јони приказани на панелу Х потврђују присуство СерКСНУМКС фосфорилисане изоформе, међутим, у смеши других фосфорилисаних изоформи на местима СерКСНУМКС, СерКСНУМКС, СерКСНУМКС и ТхрКСНУМКС. Присуство паКСНУМКС, паКСНУМКС-П, пбКСНУМКС и пбКСНУМКС-П јона јединствено потврђује фосфорилацију СерКСНУМКС остатка.

Експеримент КСНУМКС: Квантификација фосфорилације СерКСНУМКС (Фиг КСНУМКСФ)

Стандардни пептиди су дизајнирани тако да опонашају фосфо и нефосфо форме СерКСНУМКС ΔФосБ. После синтезе и пречишћавања, сваки "тешки" идиотипски пептид је растворен у пуферу КСНУМКС / КСНУМКС ацетонитрил / вода и послан на анализу амино киселина да би се одредила апсолутна концентрација на синтетском основном раствору пептида. Сваки "тешки" пептид је затим директно инфундиран у КСНУМКС КТРАП масени спектрометар (МС) да би се одредила најбоља енергија судара за МС / МС фрагментацију и две до четири МРМ транзиције. Затим, чисти "тешки" пептиди су подвргнути ЛЦМС на КСНУМКС КТРАП да би се обезбедило раздвајање пептида. Инструмент је покренут у троструком квадруполном моду, са ККСНУМКС постављеним на специфичну прекурсорску вредност м / з (ККСНУМКС није скенирање), и ККСНУМКС постављен на специфичну м / з вредност која одговара специфичном фрагменту тог пептида. У МРМ моду, серија појединачних реакција (прекурсорски / фрагментни јонски прелази у којима је енергија судара подешена да оптимизује интензитет фрагментарних јона од интереса) је мерена секвенцијално, а циклус (типично КСНУМКС – КСНУМКС сек) је био петља цијело вријеме ХПЛЦ сепарације. МРМ транзиције су одређене из МС / МС спектара постојећих пептида. Потом су изабране две транзиције по пептиду, које одговарају фрагментима јона високог интензитета, а енергија судара је оптимизована да максимизира јачину сигнала МРМ транзиција коришћењем софтвера за аутоматизацију. Врхови који су резултат стандардних пептида и ΔФосБ узорака који су изложени ЦаМКИИ или контроли су затим упоређени да би се одредило апсолутно обиље сваке пептидне форме у реакцији. Анализа података на ЛЦ-МРМ подацима врши се помоћу софтвера АБ Мултикуант КСНУМКС.

Експеримент КСНУМКС: Индукција ΔФосБ у ЦаМКИИ претерано експримирајућим мишевима (Слика 5Г и Х.)

Трансгени мишеви прекомерно експримирају ТКСНУМКСД ЦаМКИИ (Маифорд ет ал., КСНУМКС; Коуррицх ет ал., КСНУМКС) и дивљег типа литтерматес су узгојени у одсуству доксициклина да би се омогућила експресија трансгена. Одраслим мишевима је примењено КСНУМКС мг / кг кокаина или сланог ИП једанпут дневно током КСНУМКС дана. КСНУМКС х након завршне ињекције, животиње су декапитиране и имунохистокемија и квантификација ΔФосБ експресије је изведена као у експеримент КСНУМКС.

Експеримент КСНУМКС: Ефекти ХСВ-посредоване ΔФосБ прекомерне експресије и инхибиције ЦаМКИИ на НАц дендритичне бодље (Фиг КСНУМКСА – Е)

Одрасли мужјаци мишева (КСНУМКС недеље) су стереотаксијски ињектирани у НАц са ХСВ-ГФП, ХСВ-ГФП-ΔФосБ (Олауссон ет ал., КСНУМКС), ХСВ-ГФПАЦКСНУМКСИ, или ХСВ-ГФПАЦКСНУМКСИ-ΔФосБ. У овим конструктима, АЦКСНУМКСИ, инхибитор ЦаМКИИ на бази пептида, је спојен на Ц-крај ГФП. ГФПАЦКСНУМКСИ је клониран помоћу ПЦР користећи пММКСНУМКС-вектор који садржи ГФПАЦКСНУМКСИ као шаблон са следећим прајмерима: ГФП-АЦКСНУМКСИ-Ф: КСНУМКС 'ЦЦ ГЦТАГЦ ГЦЦГЦЦАЦЦ АТГГТГАГЦААГГГЦГАГГАГЦТГТ КСНУМКС' (стезаљка) ГФП-АЦКСНУМКСИ-Р: КСНУМКС 'ЦЦ ТЦЦГГА ТТАЦАГГЦАГТЦЦАЦГГЦЦТ КСНУМКС' (цлампБспЕИстоп). Добијени ПЦР производ је убачен у пКСНУМКС + и пКСНУМКС + -Δ ФосБ векторе користећи Нхел и БспЕИ места. Конструкт је валидиран секвенцирањем. Стереотаксичне координате су: КСНУМКС ° угао, АП = + КСНУМКС мм, Лат = + КСНУМКС мм, ДВ = -КСНУМКС мм (Баррот ет ал., КСНУМКС). Перфузија и сегментација мозга је изведена по пер експеримент КСНУМКС.

Анализа кичме је изведена како је описано (Цхристоффел ет ал., КСНУМКС). Укратко, дендритички сегменти КСНУМКС-КСНУМКС µм удаљени од сома су насумично изабрани из ХСВ-инфицираних ћелија које изражавају ГФП. Слике су добијене на конфокалном ЛСМ КСНУМКС-у (Царл Зеисс) за морфолошку анализу користећи НеуронСтудио са раибурст алгоритмом. НеуронСтудио класифицира бодље као танке, гљиве или стубби засноване на сљедећим вриједностима: (КСНУМКС) омјер ширине и висине, (КСНУМКС) омјер главе и врата и (КСНУМКС) промјер главе. Кичме са вратом могу се класификовати као танке или гљиве, а оне без значајног врата класификују се као тврдоглави. Кичме са вратом су означене као танке или гљиве на основу пречника главе.

Слика КСНУМКС

Блокада ЦаМКИИ активности спречава морфолошке и бихејвиоралне ефекте ΔФосБ у НАц

Експеримент КСНУМКС: Ефекти ХСВ-посредоване ΔФосБ претеране експресије и ЦаМКИИ инхибиције на кокаинске одговоре (Фиг КСНУМКСФ)

Одрасли мужјаци мишева су ињектирани вирусима по пер експеримент КСНУМКС, а локомоторни одговори на једну КСНУМКС мг / кг ињекцију кокаина су мерени по пер Експеримент КСНУМКС. Локомоторни подаци се изражавају као укупни прекиди снопа преко КСНУМКС мин након ињекције кокаина.

Додатне Информације

Анимал Хоусинг

Мужјаци пацова Спрагуе Давлеи (КСНУМКС-КСНУМКС г; Цхарлес Ривер Лабораториес) су били смештени у пару. Мушки мишеви ЦКСНУМКСБЛ / КСНУМКСЈ са осам недеља (Тхе Јацксон Лаборатори) били су смештени у групи са највише пет животиња по кавезу. Све животиње су навикнуте на животињски објекат током ≥КСНУМКС недеље пре експерименталних манипулација и смештене су у климатизованим собама (КСНУМКС – КСНУМКС ° Ц) на КСНУМКС хр светлосном / мрачном циклусу (светла у КСНУМКС: КСНУМКС АМ) са приступом храни и воде по вољи. Експерименти су спроведени у складу са упутствима Друштва за неуронауку и институционалног одбора за негу и коришћење животиња (ИАЦУЦ) на планини Синај.

Лекови

Лекови су давани ИП и растворени у стерилном физиолошком раствору, укључујући кокаин (КСНУМКС – КСНУМКС мг / кг по КСНУМКС µл за мишеве, по КСНУМКС мл за пацове, НИДА) и СЦХ КСНУМКС или етиклоприд хидрохлорид (КСНУМКС мг / кг по КСНУМКС мл, Тоцрис) . За стереотаксијску хирургију, мишеви су анестезирани са "коктелом" кетамина (КСНУМКС мг / кг) и ксилазином (КСНУМКС мг / кг) (Хенри Сцхеин) у стерилном физиолошком раствору.

Антитела

ЦаМКИИα (укупно): Упстате КСНУМКС – КСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС

ЦаМКИИ пхоспхо-ТхрКСНУМКС: Промега ВКСНУМКСА, КСНУМКС: КСНУМКС

ΔФосБ (тотал): Сигнализација ћелија КСНУМКСГКСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС

ΔФосБ фосфо-СерКСНУМКС: Фосфорна раствор, КСНУМКС: КСНУМКС

ГлуАКСНУМКС (укупно): Абцам, АбКСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС

ГлуАКСНУМКС пхоспхо-СерКСНУМКС: Миллипоре НКСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС

ГлуАКСНУМКС пхоспхо-СерКСНУМКС: Цхемицон АбКСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС

ГлуАКСНУМКС: Миллипоре КСНУМКС – КСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС

НРКСНУМКСА: Сигма ХПАКСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС

НРКСНУМКСБ: Миллипоре АбКСНУМКСП, КСНУМКС: КСНУМКС

Статистичке анализе

Све статистичке анализе извршене су коришћењем софтверског пакета Присм КСНУМКС (ГрапхПад). Студентски т-тестови су коришћени за сва парна поређења (назначена у Резултати где је дата вредност т), и једносмерна АНОВА су коришћена за сва вишеструка поређења (назначено у одељку резултата где је дата вредност Ф).

Иди на:

Резултати

Хронични кокаин изазива ЦаМКИИ у НАц Схелл

Многе студије су показале да МСН у шкољци и језгру НАц имају различите биохемијске и физиолошке реакције на хроничну изложеност злоупотреби дрога (Коуррицх и Тхомас, КСНУМКС; Ловетх ет ал., КСНУМКС) и да ове двије подрегије различито регулишу понашање које тражи дрогу (Ито ет ал., КСНУМКС). Одредити диференцијалне ефекте кокаина на састојке протеина НАц шкољке вс језгра, користили смо Мултиплекед Исобариц Таггинг (иТРАК) и тандем масену спектроскопију (МС / МС). Одраслим мужјацима пацова је ињициран ИП са кокаином (КСНУМКС мг / кг) или физиолошким раствором дневно током КСНУМКС дана; КСНУМКС х после последње ињекције, НАц љуска и језгра су микродисекционисане (Фиг КСНУМКСА) и замрзнути. Протеини у овим узорцима су затим квантификовани коришћењем иТРАК. Све четири изоформе ЦаМКИИ показале су велико повећање експресије након третмана кокаином који су били специфични за НАц љуску у поређењу са језгром. Неколико протеинских фосфатаза, укључујући ППКСНУМКС каталитичке и регулаторне подјединице и ППКСНУМКСА, које су претходно биле повезане са различитим ЦаМКИИ супстратима у другим системима (Цолбран, КСНУМКС), слиједио је сличан образац. Ови налази су пружили нове, непристрасне доказе да је сигнални пут ЦаМКИИ на видљив начин регулисан кокаином у НАц.

Да бисмо потврдили овај налаз више квантитативно, третирали смо пацове као горе са кокаином (у различитим дозама) или физиолошким раствором и мерили смо локомоторне одговоре на кокаин (КСНУМКС мг / кг) или дозирну дозу физиолошког раствора. Поновљена изложеност КСНУМКС мг / кг кокаина довела је до типичног обрасца локомоторне сензибилизације (Фиг КСНУМКСБ). Даљње студије са овим режимом дозирања откриле су, коришћењем Вестерн блотинга, да поновљени кокаин индукује ЦаМКИИа селективно у НАц љусци КСНУМКС х након завршне ињекције кокаина (Слика КСНУМКСЦ и Д; п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС). Поред тога, фосфорилација канонског ЦаМКИИ супстрата СерКСНУМКС подјединице ГлуАКСНУМКС рецептора АМПА значајно је повећана у НАц љусци, а не у језгру (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), док је аутофосфорилација ЦаМКИИа ТхрКСНУМКС имала јаку али не значајан тренд ка индукцији само у љусци (Фиг КСНУМКСД). Неколико других рецептора за глутамат је остало непромењено. Насупрот овим мерама ЦаМКИИ, исти узорци ткива су показали индукцију ΔФосБ у обе љуске (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) и језгро (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) НАц (Слика КСНУМКСЦ и Д), у складу са претходним налазима (Перротти ет ал., КСНУМКС).

Будући да је неколико претходних студија кокаинске регулације АМПА рецептора анализирало животиње након ~ КСНУМКС дана повлачења из кроничног кокаина (види дискусију), поновили смо ове биохемијске анализе у овом тренутку. Открили смо да, КСНУМКС дана након завршне ињекције кокаина, ΔФосБ остаје повишен у НАц (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), док ни ЦаМКИИ ни фосфорилација ГлуАКСНУМКС СерКСНУМКС остаје повећана (Фиг КСНУМКСЕ). Међутим, КСНУМКС хр након једне КСНУМКС мг / кг изазовне дозе кокаина, нивои укупног ЦаМКИИ (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) и ГлуАКСНУМКС СерКСНУМКС (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) фосфорилација су оба повишена до степена сличног оном који је пронађен након почетног хроничног излагања кокаину (Фиг КСНУМКСЕ). Ови подаци указују да су неурони НАц љуске припремљени за индукцију ЦаМКИИ током продужених периода апстиненције, можда путем директног примовања ЦаМКИИ промотера гена (види Дискусију). Штавише, чињеница да је индукција ΔФосБ је перзистентнија од индукције ЦаМКИИ указује на постојање додатних механизама, било да су базирани на кроматину или на други начин, који врше "кочницу" на ЦаМКИИ регулацију, као што је описано у дискусији.

Да бисмо додатно ојачали ова опажања, истражили смо моделе само-администрације кокаина, који укључују вољни унос дроге. Одраслим мужјацима пацова је дат или кратак или дугачак приступ кокаину; као што је очекивано (Ахмед и Кооб, КСНУМКС), само дуги услови приступа довели су до ескалације самоуправе дрогом (Фиг КСНУМКСА). ΔФосБ је индукован у већој мери дуготрајно вс кратак приступ кокаину у обе границе НАц-а (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) и језгра (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС). Насупрот томе, ЦаМКИИа је индукован у НАц љусци само дугим приступом кокаину (Слика КСНУМКСБ и Ц; п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС). Интересантно је упоредити просечни дневни унос кокаина код животиња кратког приступа (КСНУМКС мг / кг ИВ), животиња са дугим приступом (КСНУМКС мг / кг ИВ) и животиња које су примиле експерименте (КСНУМКС мг / кг), и питати зашто потоњи изазива снажну индукцију ΔФосБ и ЦаМКИИ док кратки приступ не. Ова разлика је вјероватно посљедица разлика у вршним разинама кокаина (кокаин који се примјењује на експерименту даје се као један болус ИП, док се самокопирани кокаин испоручује путем вишеструких ИВ доза) или разликама у дужини изложености лијеку (КСНУМКС дана за експериментатора администрације, КСНУМКС дана за самоуправу).

Упркос великој литератури о ΔФосБ и ЦаМКИИ у дјеловању кокаина, нема истраживања ових протеина код корисника кокаина. Овде представљамо први доказ да су нивои и ΔФосБ (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) и ЦаМКИИ (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) повећани у НАц људи који зависе од кокаина (Фиг КСНУМКСД, Табела КСНУМКС). Ови подаци указују да је наше испитивање ΔФосБ и ЦаМКИИ индукције кокаином у НАц глодара клинички релевантно за овисност о кокаину код људи.

Табела КСНУМКС

Карактеризација узорака од зависника од кокаина и контролне групе

ΔФосБ Регулише Транскрипцију ЦаМКИИ селективно у МСН-овима типа ДКСНУМКС од НАц Схелл

Налаз да су и ЦаМКИИ и ΔФосБ регулисани кокаином у НАц глодара довели су нас до тога да одредимо да ли ΔФосБ може регулисати транскрипцију ЦаМКИИ гена. Претходно смо пријавили ЦаМКИИα као могућу мету за ΔФосБ у непристрасној микроцарној анализи НАц (МцЦлунг и Нестлер, КСНУМКС), али овај налаз није даље потврђен у тој студији. Прво смо користили квантитативни ЦхИП (кЦхИП-ЦхИП праћен квантитативном ПЦР) да бисмо утврдили да ли се ΔФосБ веже за промотор гена ЦаМКИИα у НАц одраслих мужјака пацова, и утврдили да је ово везање значајно повећано код хроничне администрације кокаина у љусци ( п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), али не и језгро, подрегија (Фиг КСНУМКСА). Да би се даље разумели механизми повезани са овом субрегион-специфичном разликом у ΔФосБ везивању за ЦаМКИИα промотор, користили смо кЦхИП да карактеришемо стање хистонских модификација на овом геномском региону. Претходне студије су показале индукцију кокаина ацетилацијом ХКСНУМКС на промотору ЦаМКИИα у укупном НАц миша (Ванг ет ал., КСНУМКС). Насупрот томе, открили смо да кокаин смањује ацетилацију ХКСНУМКС на ЦаМКИИα промотору селективно у НАц језгру (Фиг КСНУМКСБ; п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), без икаквих промјена у љусци, у складу са субрегион-специфичним промјенама кроматина изнад ΔФосБ везивања. кЦХИП за репресивни знак, диметилирани ХКСНУМКС лизин КСНУМКС (ХКСНУМКСККСНУМКСмеКСНУМКС), открио је трендове смањења у оба под-региона љуске и језгре (Фиг КСНУМКСЦ).

Да би се одредило да ли ΔФосБ регулише транскрипцију ЦаМКИИα ин виво, користили смо две битрансгеничне линије миша које индуцибно прекомерно експримирају ΔФосБ посебно у ДКСНУМКС вс МНС типа ДКСНУМКС на начин контролисан администрацијом доксициклина у води за пиће (Цхен ет ал., КСНУМКС; Келз ет ал., КСНУМКС; Верме ет ал., КСНУМКС). Одрасли мужјаци мишева који су прекомерно експримирали ΔФосБ искључиво у МСН-у типа ДКСНУМКС имали су значајно повишене нивое ЦаМКИИα мРНА у НАц (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), ефекат који није примећен код мишева који прекомерно експримирају ΔФосБ претежно у МСН-овима типа ДКСНУМКСФиг КСНУМКСД). Пораст мРНА ЦаМКИИа, индукован експресијом ΔФосБ у МСН-овима типа ДКСНУМКС, био је праћен пратећим повећањем ЦаМКИИα протеина у обе љуске НАц (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) и језгра (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС; Фиг. КСНУМКСЕ и Ф). Ови подаци показују да је ΔФосБ способан да изазове експресију ЦаМКИИα гена у МСН ДКСНУМКС типу у обе подрегије, иако Слика КСНУМКСБ сугерише да се промене кроматина посредоване кокаином на ЦаМКИИα промотеру (нпр. смањеној ацетилацији) спречавају да ФОСБ регулише ЦаМКИИ у језгру субрегије после кокаина.

Будући да су наши подаци о трансгеним мишима показали да је ΔФосБ индукција експресије ЦаМКИИ гена специфична за МС1 типа Д1 у НАц, следећи пут смо покушали да утврдимо да ли кокеински зависна регулација ЦаМКИИ захтева активацију Д30 допаминског рецептора. Одраслим мужјацима пацова је даван хронични кокаин или физиолошки раствор као и раније, али 1 минута пре сваке ињекције, пацовима из групе кокаина је дато ИП ињекција физиолошког раствора, Д23390 антагонист СЦХ 0.5 (2 мг / кг) или антагонист Д0.5 рецептора етиклоприд (24 мг / кг). Животиње су анализиране 1 сата након последње ињекције кокаина. Вестерн блоттинг открива да је антагонист Д2, али не и Д0.0001, у потпуности блокирао пораст ΔФосБ посредованог кокаином (п <18.96; Ф = 18; дф = XNUMX), као што је претходно наведено (Ние ет ал., КСНУМКС), као и у ЦаМКИИ (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС; Фиг КСНУМКСГ и Х). Ови подаци подупиру хипотезу да кокаин ангажује ΔФосБ-посредовано повећање експресије ЦаМКИИ гена, посебно у МСН-овима типа ДКСНУМКС из НАц љуске. У будућим студијама било би важно да се директно покаже овај специфичан ефекат кокаина на тип ћелије на експресију ЦаМКИИ унутар овог подручја мозга.

ΔФосБ је неопходан и довољан за индукцију кокаина ЦаМКИИ у НАц љусци

Да би се употпунила употреба битрансгеничних мишева, ми смо затим проучавали улогу ΔФосБ у посредовању индукције ЦаЦКИИа кокаина коришћењем преноса гена посредованог вирусом код пацова. Ми смо билатерално убризгали адено-повезане вирусне (ААВ) честице у НАц љуску одраслих мужјака пацова (где се љуска може селективно циљати) да прекомерно експримирају ΔФосБ плус ГФП или ГФП сам. Животиње су затим примиле једну ИП ињекцију КСНУМКС мг / кг кокаина. Животиње које су прекомерно експримирале ΔФосБ / ГФП показале су повећан локомоторни одговор у поређењу са животињама које су прекомерно експримирале сам ГФП (Фиг КСНУМКСА). КСНУМКС хр након појединачне ињекције кокаина, ГФП-позитивна НАц ткива су изрезана из ових животиња дисекцијом под флуоресцентним извором светлости. Вестерн блотинг овог ткива (Слика КСНУМКСБ и Ц) су показали јаку прекомерну експресију ΔФосБ као и значајно повећање укупног ЦаМКИИα протеина у поређењу са ГФП животињама (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), слично индукцији која се види код хроничне примене кокаина. Поред тога, ЦаМКИИа аутофосфорилација на ТхрКСНУМКС (индикатор активације ензима) је повећана прекомерном експресијом ΔФосБ (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), као и фосфорилација ЦаМКИИ супстрата, СерКСНУМКС од ГлуАКСНУМКС (п = КСНУМКС; т = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), поново опонашајући хронични кокаин (Слика КСНУМКСЦ и Д). ТЗаједно, ови подаци пружају додатне доказе да је експресија ΔФосБ у НАц љусци довољна за сензитивизацију локомотора на кокаин и за индукцију и активацију ЦаМКИИ у овој подрегији.

Користили смо сличан приступ како бисмо утврдили да ли је ΔФосБ неопходан и за индукцију ЦаМКИИα посредованом кокаином у НАц љусци. ААВ је коришћен за прекомерну експресију скраћеног ЈунД протеина, названог ΔЈунД, који је негативни регулатор ΔФосБ транскрипционе активације (Винстанлеи ет ал., КСНУМКС) плус ГФП или ГФП. Две недеље касније, када је експресија трансгена максимална, животиње су добијале кокаин (КСНУМКС мг / кг) или физиолошки раствор дневно током КСНУМКС дана, и тестиране на локомоторни одговор на изазивање кокаина (КСНУМКС мг / кг) КСНУМКС х после последњег хроничног убризгавања (Фиг КСНУМКСД). ΔЈунД прекомјерна експресија спријечила је локомоторну сензибилизацију на кокаин, а такођер је спријечила ЦаМКИИα индукцију и активацију у НАц љусци (Фиг КСНУМКСЕ и Ф; п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; укупно дф = КСНУМКС), што указује да је ΔФосБ транскрипциона активност неопходна за индуковање ЦаМКИИа посредовано кокаином у овој субрегији. Занимљиво је да смо открили да ΔЈунД смањује нивое ΔФосБ под условима који су третирани и физиолошким и кокаином (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), повећавајући нову могућност да ΔФосБ зависи од АП-КСНУМКС активности за сопствене нивое експресије.

ЦаМКИИ Пхоспхорилатес ΔФосБ на СерКСНУМКС

Коришћење ин витро тестова киназе протеина, утврдили смо да је пречишћени ΔФосБ робустан супстрат за ЦаМКИИа. Инкубација Његовог₆-АФосБ са ЦаМКИИα и АТП изазвали узлазни помак у електрофоретској покретљивости ΔФосБ (Фиг КСНУМКСА); неколико резултирајућих трака указало је на више места фосфорилације. Слично ин витро тестови киназе помоћу [γ-³²П] АТП је показао инкорпорацију радио-обележеног фосфата у помакнуте ΔФосБ траке (Фиг КСНУМКСБ), показујући директну фосфорилацију протеина. Генерисали смо фосфо-специфично антитело на претходно окарактерисани СерКСНУМКС ΔФосБ (Улери и др., КСНУМКС). Иако ово антитело не производи сигнал против екстракта мозга који садрже СерКСНУМКС-фосфорилирани ΔФосБ (подаци нису приказани), били смо у могућности да детектујемо фосфорилацију СерКСНУМКС у ин витро тест киназе помоћу ЦаМКИИ (Фиг КСНУМКСБ). Кинетичка анализа ЦаМКИИ фосфорилације ΔФосБ указује да је она потентан супстрат за киназу (Фиг КСНУМКСЦ), са очигледним К_M КСНУМКС ± КСНУМКСµМ и К_ЦАТ од КСНУМКС ± КСНУМКСмин^{-КСНУМКС}. Ови резултати су упоредиви са многим добро описаним ин виво супстрати ЦаМКИИ (Цолбран и Бровн, КСНУМКС). Поред тога, утврдили смо да ЦаМКИИ фосфорилира ΔФосБ са стехиометријом КСНУМКС ± КСНУМКС мол / мол (Фиг КСНУМКСД), што указује да постоје најмање три места фосфорилације ЦаМКИИ унутар Хис₆-АФосБ протеин, у сагласности са Фиг КСНУМКСА.

Да бисмо истражили појединачне локације фосфорилације, користили смо МС анализе узорака из наше ин витро киназе. Фиг КСНУМКСЕ показује ΔФосБ фосфорилацију на претходно окарактерисаном СерКСНУМКС и на неколико додатних локација (подаци нису приказани). Имајући у виду претходну функционалну карактеризацију СерКСНУМКС-а, фокусирали смо се на ово место генерисањем обележених синтетичких пептида који опонашају фосфо- и нефосфо-стања СерКСНУМКС-а, а затим користили познате количине ових пептида као стандарде у МРМ анализама ΔФосБ пре и после ин витро фосфорилација са ЦаМКИИ. Накнадна квантификација (Фиг КСНУМКСФ) потврђује да је СерКСНУМКС моћан супстрат за ЦаМКИИ. Ови резултати указују да је, између више фосфорилисаних остатака унутар ΔФосБ, СерКСНУМКС посебно ефикасан супстрат за ЦаМКИИ.

ЦаМКИИ посредује у акумулацији ΔФосБ кокаина у НАц љусци

Пошто ЦаМКИИ може фосфорилисати ΔФосБ ин витро на локацији која драматично повећава њену стабилност ин витро ин виво (Улери и др., КСНУМКС; Улери-Реинолдс ет ал., КСНУМКС), утврдили смо да ли активност ЦаМКИИ контролише ΔФосБ нивое у НАц ин виво. Да бисмо одговорили на ово питање, прво смо користили линију миша која је прекомерно експримирала мутант ЦаМКИИа (ТКСНУМКСД) независан од калцијума у ​​више региона мозга укључујући НАц (Маифорд ет ал., КСНУМКС; Коуррицх ет ал., КСНУМКС). Мужјацима мутираним и дивљим типовима који су одговарали узрасту, убризгавали смо КСНУМКС мг / кг кокаина или физиолошки раствор једном дневно у току КСНУМКС дана, а затим смо анализирали животиње дан након завршне ињекције. Установили смо да су базални нивои ΔФосБ повећани код мутантних животиња у НАц љусци (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС), али не и језгра (Фиг КСНУМКСГ и Х). Изненађујуће, индукција ΔФосБ зависна од кокаина блокирана је код мутантних животиња у љусци и језгру, што указује да, иако ЦаМКИИ може директно регулисати стабилност ΔФосБ у НАц љусци, она такође може лежати узводно од ΔФосБ у путевима активираним кокаином у оба НАц субрегиона .

ЦаМКИИ активност је потребна за ΔФосБ-посредовану структуралну и бихејвиоралну пластичност

Кокаинска индукција дендритских бодљика на НАц МСНс је једна од најбоље установљених адаптација изазваних лековима у овом подручју мозга, а таква индукција кичме је корелирана са сензибилисаним одговорима на понашање лека (Робинсон и Колб, КСНУМКС; Руссо ет ал., КСНУМКС) и пријављено да је селективно за МСН-ове типа ДКСНУМКС (Лее и сарадници, КСНУМКС). Недавно смо показали да је индукција кокаина дендритичких бодља у НАц зависна од ΔФосБ и његовог низводног транскрипционог програма (Мазе ет ал., КСНУМКС). Иако постоји обимна литература о учешћу ЦаМКИИ у морфологији и индукцији дендритске кичме у другим регионима мозга и експерименталним системима (Јоурдаин ет ал., КСНУМКС; Пензес ет ал., КСНУМКС; Окамото и др., КСНУМКС), његова улога у формирању кичме НАц МСН није истражена. Према томе, ми смо одредили да ли је ЦаМКИИ активност потребна за ΔФосБ-посредовану индукцију МСН дендритичних спина коришћењем ХСВ посредоване прекомерне експресије ЦаМКИИ инхибитора пептида АЦКСНУМКСИ фузионисане на ГФП, конструкт који је раније показао да инхибира активност ЦаМКИИ. ин виво (Зханг ет ал., КСНУМКС; Клуг ет ал., КСНУМКС). Вирусна прекомерна експресија ΔФосБ у НАц љусци одраслих мишева изазвала је значајан пораст МСН дендритичне густине кичме (п <0.0001; Ф = 8.558; дф = 59; Слика КСНУМКСА и Б) као што је претходно пријављено (Мазе ет ал., КСНУМКС), а ово повећање је првенствено вођено танким (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) и стубби (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС) типовима кичме (оба су сматрана незрелим бодљама) (Слика КСНУМКСЦ – Е). Никакав ефекат није примећен на зрелијим гребенастим бодљама. Међутим, када је ГФП-АЦКСНУМКСИ био коекспримиран, индукција ΔФосБ спина је потпуно укинута (Фиг КСНУМКСА – Е), што указује да је активност ЦаМКИИ потребна за индукцију ΔФосБ дендритичних бодљи у НАц љусци.

Затим смо користили исте виралне алате да утврдимо да ли је активност ЦаМКИИ потребна за ефекте ΔФосБ на сензитивност понашања на кокаин. КСНУМКС х након ињекције вируса у НАц љуску, животињама је дана једна ињекција КСНУМКС мг / кг кокаина и регистрована је њихова локомоторна активност. Као што је раније приказано са продуженом ААВ прекомерном експресијом ΔФосБ (Фиг КСНУМКСА), ХСВ посредована прекомерна експресија ΔФосБ повећала је локомоторску осетљивост на кокаин (п = КСНУМКС; Ф = КСНУМКС; дф = КСНУМКС; Фиг КСНУМКСФ). Као и код индукције дендритичних бодова, инхибиција активности ЦаМКИИ коекспресијом ГФП-АЦКСНУМКСИ потпуно блокира повећање осјетљивости кокаина посредством ΔФосБ, што указује да је активност ЦаМКИИ потребна за промјене у понашању кокаина изазване ΔФосБ.

Иди на:

Дискусија

Ова студија оцртава нови механизам у којем се кокаин индукује ΔФосБ у НАц, који селективно преправља транскрипцију ЦаМКИИα гена у НАц љусци.. ЦаМКИИα затим фосфорилише и стабилизује ΔФосБ што доводи до веће акумулације ΔФосБ и даље индукције ЦаМКИИα (Фиг КСНУМКСГ). Ко-ескалирајући нивои два протеина током хроничног излагања кокаину доприносе на битан начин сензибилисаним реакцијама понашања на лек. Ово је посебно привлачна хипотеза јер су и ΔФосБ и ЦаМКИИ претходно показали да су неопходни за повећане одговоре на кокаин (Пиерце и сарадници, КСНУМКС; Пеакман ет ал., КСНУМКС), и реплицирамо овај налаз за ΔФосБ у НАц љусци специфично користећи вирусни приступ (Фигс КСНУМКС АндКСНУМКС).

Иако трансгена ΔФосБ прекомерна експресија у МСН-овима типа ДКСНУМКС може да изазове ЦаМКИИ индукцију иу НАц љусци иу језгру животиња кокаина, у контексту кокаина, акумулација ендогеног ΔФосБ, који се јавља у обе субрегије, покреће индукцију ЦаМКИИ специфично у НАц љусци . Ова разлика се може односити на више нивое ΔФосБ индуковане у нашем битрансгенском моделу, међутим, то може такође одражавати способност кокаина да диференцијално промени ЦаМКИИα промотор у љусци вс језгра МСН-а да би или промовисала ΔФосБ у претходном или је искључила у потоњој подрегији. У ствари, наши ЦхИП подаци, који откривају деацетилацију хистона посредством кокаина на промотору ЦаМКИИα гена само у НАц језгру, подржавају могуће учешће механизма хроматина. У складу са овом хипотезом, превелика експресија ΔФосБ у МСН-овима типа ДКСНУМКС била је у стању да индукује индукцију ЦаМКИИα у језгру НАц у одсуству кокаина (Фиг КСНУМКСФ), што сугерише да постоје активне модификације ЦаМКИИа промотора које спречавају ову индукцију током хроничне изложености кокаину. Регулација пејзажа кроматина на промотору ЦаМКИИ може такође објаснити зашто је ЦаМКИИ изазван изазовном дозом кокаина у НАц љусци хроничних пацова који се повлаче из кокаина (Фиг КСНУМКСЕ) али не и од наивних животиња (Фиг КСНУМКСД). Ово би могло представљати епигенетски ефекат ΔФосБ-а на примарно генирањеРобисон и Нестлер, КСНУМКС), и може бити један молекуларни механизам инкубације жудње за кокаином (Пицкенс ет ал., КСНУМКС). Међутим, да би ова промена кроматина била узрочно повезана са инкубацијом жудње, морала би се временом повећавати. Биће занимљиво утврдити да ли је то случај, и проучити да ли други гени показују ΔФосБ-овисну, субрегион-специфичну регулацију кокаином. Такође је важно напоменути да феед-форвард лооп који описујемо не доводи до бескрајне акумулације ЦаМКИИ или ΔФосБ (Фиг КСНУМКСЕ); откривање молекуларне “кочнице” одговорне за ово је важан циљ будућих студија.

Познате функције ΔФосБ и ЦаМКИИ у неколико експерименталних система и регија мозга конвергирају се на многим нивоима (Фиг КСНУМКСФ). Оба молекула су блиско повезана са дендритичким растом кичме: ЦаМКИИ интерагује са актинским цитоскелетом (Окамото и др., КСНУМКС), регулише величину главе кичме (Матсузаки ет ал., КСНУМКС), и неопходан је и довољан за пластично индуковано повећање филоподије и броја синапси у хипокампалним органотипским културама кришке (Јоурдаин ет ал., КСНУМКС), вхил ΔФосБ је и неопходан и довољан за дендритску формацију кокаина изазвану кокаином у НАц МСНс (Мазе ет ал., КСНУМКС). Поред тога, оба молекула повезана су са регулацијом АМПА рецептора глутамата. ЦаМКИИ не регулише укупне нивое подјединица АМПА рецептора, али покреће инсерцију АМПА рецептора у синапсе и повећава проводљивост АМПА канала фосфорилацијом ГлуАКСНУМКС на СерКСНУМКС у хипокампалним пирамидним неуронима у култури и ин виво (прегледано у (Малинов и Маленка, КСНУМКС; Цолбран и Бровн, КСНУМКС)). Таква повећана трговина ГлуАКСНУМКС-ом у синапсу је укључена иу хроничну активност кокаина (Боудреау и Волф, КСНУМКС). Штавише, реакције понашања на активацију АМПА рецептора у НАц појачане су прекомерном експресијом ЦаМКИИа на начин зависан од ДКСНУМКС допамин рецептора (Сингер ет ал., КСНУМКС). Показало се да дуготрајна ДКСНУМКС-специфична прекомерна експресија ΔФосБ индукује ГлуАКСНУМКС транскрипцију у НАц (Келз ет ал., КСНУМКС), што смањује АМПА одговоре посредоване путем ГлуАКСНУМКС-а, док ми овде показујемо да краткорочна ΔФосБ прекомерна експресија - као и краћа експозиција кокаина - немају ефекта на ову подјединицу (Фиг КСНУМКС). Ипак, недавно смо открили да краткотрајна ΔФосБ претерана експресија ипак смањује АМПА одговоре у ДКСНУМКС-типа МСН у НАц (Груетер ет ал., КСНУМКС). Ови подаци сугеришу временски различите механизме који могу представљати серију неуроадаптација које зависе од времена до кокаина и које су у основи различитих аспеката прогресије зависности који још нису добро схваћени. На нивоу понашања, и ЦаМКИИ и ΔФосБ су потребни за локомоторну сензибилизацију према кокаину (види горе), а оба су потребна за континуирану кокаинску самоуправу код глодара (Цолби ет ал., КСНУМКС; Ванг ет ал., КСНУМКС), сугерирајући да су ова два протеина важна и за краткорочне и за дугорочне бихејвиоралне адаптације изложености леку, иако путем делимично различитих механизама. Претпоставља се да ΔФосБ и ЦаМКИИ регулишу такве сложене адаптације понашања кроз промене у НАс синаптичкој функцији, иако је потребно много даљег рада да би се синаптичке феномене директно повезале са променама у понашању.

ЦаМКИИ холоензим истовремено ступа у интеракцију са различитим протеинима повезаним са синапсом (Робисон ет ал., КСНУМКС) за које се сматра да регулишу његово циљање на постсинаптичну густину (ПСД), феномен за који се претпоставља да је важан за синаптичку пластичност. Нарочито је показано да интеракција ЦаМКИИ са подјединицом ГлуНКСНУМКСБ глутаматног рецептора типа НМДА регулише и синаптичку пластичност и учење (Халт ет ал., КСНУМКС). Док АЦКСНУМКСИ пептид имитира аутоинхибиторни домен ЦаМКИИ, и тако инхибира каталитичку активност ензима, он такође блокира вишеструке протеинске интеракције (Страцк и др., КСНУМКС; Робисон ет ал., КСНУМКС). Према томе, бихевиорални и морфолошки ефекти ХСВ-ГФП-АЦКСНУМКСИ који су овде описани могу се појавити кроз смањену фосфорилацију ЦаМКИИ циљних протеина, промене у ЦаМКИИ циљању, или промену у предложеној структурној улози ЦаМКИИ код синапса (Лисман ет ал., КСНУМКС).

Ограничење предложене ΔФосБ-ЦаМКИИ петље на НАц шкољку је посебно запажено, јер су недавни радови показали неколико физиолошких разлика између НАц љуске и језгре као одговор на администрацију кокаина, што је потврђено нашим непристрасним иТРАК подацима (Табела СКСНУМКС). . МСН-овци у НАц љусци показују депресију капацитета печења након хроничног кокаина који се одржава недељама, док основне МСН поруке истих животиња показују пролазно (КСНУМКС – КСНУМКС дан) повећање капацитета паљења које се враћа на базалне нивое у току КСНУМКС недеља (Коуррицх и Тхомас, КСНУМКС). Поред тога, бројни синаптички протеини су различито регулисани у НАц љусци вс језгро животиња изложених хроничном кокаину, укључујући ГлуАКСНУМКС (Кнацкстедт ет ал., КСНУМКС). Како хронични амфетамин индукује ЦаМКИИα посебно у НАц љусци (Ловетх ет ал., КСНУМКС), није изненађујуће да сличан ефекат налазимо код кокаина. Међутим, пошто је ΔФосБ индукован иу НАц љусци иу језгру хроничним кокаином (Перротти ет ал., КСНУМКС), и пошто смо показали да је индукција ЦаМКИИα у љусци зависна од ΔФосБ, наши налази пружају нове доказе за различите транскрипционе механизме на ЦаМКИИα промотору између ове две подрегије, које су одговорне за селективну индукцију ЦаМКИИа у љусци.

Велики број скорашњих радова фокусиран је на оцртавање разлика између НАКС МСН-ова типа ДКСНУМКС и ДКСНУМКС. Иако су и рецептори ДКСНУМКС и ДКСНУМКС укључени у награђивање кокаина (Селф, КСНУМКС), недавни рад показује да оптогенетска активација МСН ДКСНУМКС типа повећава реакције понашања на кокаин, док МСН активација типа ДКСНУМКС има супротан ефекат (Лобо ет ал., КСНУМКС). У складу са овим налазима, ДКСНУМКС-рецептори нокаутни мишеви имају недостатак у стицању кокаинске самоуправе (Цаине ет ал., КСНУМКС), док ДКСНУМКС нокаути нису (Цаине ет ал., КСНУМКС). Администрација ДКСНУМКС агониста директно у НАц активира понашање које тражи кокаин у парадигмама поновног успостављањаСелф, КСНУМКС). Интересантно је да овај ефекат захтева повећање зависности ЦаМКИИ-активности од ДКСНУМКС-рецептора у шкољци НАц, али не и језгре (Андерсон ет ал., КСНУМКС), резултат који се лепо слаже са ДКСНУМКС- и специфичном -ФосБ-ЦаМКИИ петљом предложеном овде.

Раније смо извештавали да се СерКСНУМКС у ΔФосБ може фосфорилисати казеином киназом-КСНУМКС (Улери и др., КСНУМКС), међутим, овде утврђујемо да ЦаМКИИ фосфорилише ΔФосБ на овом и другим местима са далеко већом кинетиком и стехиометријом и може реплицирати вишу очигледну М_r посматрано за ΔФосБ (Фиг КСНУМКСА) са излагањем кокаину ин виво (Нестлер, КСНУМКС). Већ знамо да СерКСНУМКС фосфорилација повећава стабилност ΔФосБ и активност транскрипције (Улери и др., КСНУМКС; Улери и Нестлер, КСНУМКС; Улери-Реинолдс ет ал., КСНУМКС). Будући рад ће се сада фокусирати на идентификацију и функционалне посљедице нових мјеста ΔФосБ фосфорилације назначених у овој студији.

Описана петља напријед-назад пружа увјерљив нови механизам помоћу којег поновна примјена кокаина покреће прогресивне абнормалности у НАц. Као такав, овај биохемијски пут може представљати важан циљ за будуће терапеутске интервенције код поремећаја овисности. Пошто је ЦаМКИИ свеприсутан и потребан за многе базалне неуронске и бихевиоралне функције, директна употреба ЦаМКИИ инхибитора је избегнута као третман зависности. Наши подаци указују на то да суптилније циљање механизма индукције ЦаМКИИ, који је специфичан за поједини тип ћелије и субрегију мозга за награђивање, може да пружи терапеутски циљ који би избегао компликације системске инхибиције ЦаМКИИ.

Иди на:

Признања

Овај рад је подржан грантовима Националног института за злоупотребу дрога (ЕЈН), НИДА-јевског центра за протеомику ДАКСНУМКС (АЈР и ЕЈН) и Хартвелл фондације (АЈР). Аутори би жељели захвалити Габби Рунденко за великодушан дар прочишћеног ΔФосБ и Рогера Цолбрана за великодушан дар прочишћеног ЦаМКИИα.

Иди на:

Референце

1. Ахмед СХ, Кооб ГФ. Прелазак са умереног на претеран унос лека: промена у хедоничној вредности. Наука. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
2. Андерсон СМ, Фамоус КР, Садри-Вакили Г, Кумаресан В, Сцхмидт ХД, Басс ЦЕ, Тервиллигер ЕФ, Цха ЈХ, Пиерце РЦ. ЦаМКИИ: биохемијски мост који повезује допаминске и глутаматне системе у тражењу кокаина. Нат Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
3. Боудреау АЦ, Волф МЕ. Бихевиорална сензибилизација на кокаин повезана је са повећаном површинском експресијом АМПА рецептора у нуцлеус аццумбенс. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
4. Брицкеи ДА, Цолбран РЈ, Фонг ИЛ, Содерлинг ТР. Експресија и карактеризација алфа-подјединице протеинске киназе ИИ зависне од ЦаКСНУМКС + / калмодулина коришћењем система експресије бакуловируса. Биоцхем Биопхис Рес Цоммун. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
5. Цаине СБ, Негус СС, Мелло НК, Пател С, Бристов Л, Кулаговски Ј, Валлоне Д, Саиарди А, Боррелли Е. Улога рецептора сличних допамин ДКСНУМКС у самоконтроли кокаина: студије са мутантним мишевима рецептора ДКСНУМКС и новим ДКСНУМКС рецептором антагонисти. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
6. Цаине СБ, Тхомсен М, Габриел КИ, Берковитз ЈС, Голд ЛХ, ​​Кооб ГФ, Тонегава С, Зханг Ј, Ксу М. Недостатак самопримене кокаина у допамин ДКСНУМКС рецептору нокаутних мишева. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
7. Царле ТЛ, Охнисхи ИН, Охнисхи ИХ, Алибхаи ИН, Вилкинсон МБ, Кумар А, Нестлер ЕЈ. Протеасом-овисни и неовисни механизми за дестабилизацију ФосБ-а: идентификација ФосБ дегрон домена и импликације за стабилност ДелтаФосБ-а. Еур Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
8. Цхен Ј, Келз МБ, Зенг Г, Сакаи Н, Стеффен Ц, Схоцкетт ПЕ, Пицциотто МР, Думан РС, Нестлер ЕЈ. Трансгеничне животиње са индуцибилном експресијом гена у мозгу. Мол Пхармацол. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
9. Цхристоффел ДЈ, Голден СА, Думитриу Д, Робисон АЈ, Јанссен ВГ, Ахн ХФ, Крисхнан В, Реиес ЦМ, Хан МХ, Аблес ЈЛ, Еисцх АЈ, Диетз ДМ, Фергусон Д, Неве РЛ, Греенгард П, Ким И, Моррисон ЈХ , Руссо СЈ. ИкаппаБ киназа регулише друштвени пораз синаптичке и бихејвиоралне пластичности изазване стресом. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
10. Цолбран РЈ. Инактивација ЦаКСНУМКС + / калмодулин-зависне протеин киназе ИИ базалном аутофосфорилацијом. Ј Биол Цхем. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
11. Цолбран РЈ. Протеинска фосфатазе и зависна синаптичка пластичност протеин киназе ИИ зависна од калцијума / калмодулина. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
12. Цолбран РЈ, Бровн АМ. Протеин киназа ИИ зависна од калцијума / калмодулина и синаптичка пластичност. Цурр Опин Неуробиол. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
13. Цолби ЦР, Вхислер К, Стеффен Ц, Нестлер ЕЈ, Селф ДВ. Стриатална тип-специфична прекомерна експресија ДелтаФосБ-а појачава стимулацију за кокаин. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
14. Цовингтон ХЕ, КСНУМКСрд, Мазе И, ЛаПлант КЦ, Виалоу ВФ, Охнисхи ИН, Бертон О, Фасс ДМ, Рентхал В, Русх АЈ, КСНУМКСрд, Ву ЕИ, Гхосе С, Крисхнан В, Руссо СЈ, Тамминга Ц, Хаггарти СЈ, Нестлер ЕЈ. Антидепресивно дејство инхибитора хистон деацетилазе. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
15. Давалос А, Фернандез-Хернандо Ц, Сова Г, Деракхсхан Б, Лин МИ, Лее ЈИ, Зхао Х, Луо Р, Цолангело Ц, Сесса ВЦ. Квантитативна протеомика протеина регулисаних цавеолин-КСНУМКС-ом: карактеризација полимеразе и фактора ослобађања транскрипта / ЦАВИН-КСНУМКС ИН ендотелних ћелија. Мол Целл Протеомицс. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
16. Думаис А, Лесаге АД, Алда М, Роулеау Г, Думонт М, Цхавки Н, Рои М, Манн ЈЈ, Бенкелфат Ц, Турецки Г. Фактори ризика за завршетак самоубиства у великој депресији: студија случаја контроле импулсивног и агресивног понашања у мушкарци. Ам Ј Псицхиатри. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
17. Груетер БА, Робисон АЈ, Неве РЛ, Нестлер ЕЈ, Маленка РЦ. ΔФосБ диференцијално модулира нуклеус аццумбенс директну и индиректну функцију пута. Проц Натл Ацад Сци УСА. КСНУМКС у штампи. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
18. Халт АР, Даллапиазза РФ, Зхоу И, Стеин ИС, Киан Х, Јунтти С, Војцик С, Бросе Н, Силва АЈ, Хелл ЈВ. ЦаМКИИ везивање за ГлуНКСНУМКСБ је критично за вријеме консолидације меморије. ЕМБО Ј. КСНУМКС; КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
19. Хирои Н, Бровн ЈР, Хаиле ЦН, Ие Х, Греенберг МЕ, Нестлер ЕЈ. Мутирани мишеви ФосБ: губитак хроничне индукције кокаина протеина повезаних са Фосом и повећана осетљивост на психомоторне и корисне ефекте кокаина. Проц Натл Ацад Сци УС А. 1997; 94: 10397–10402. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
20. Ито Р, Роббинс ТВ, Еверитт БЈ. Нуклеарна акумбенсова језгра и љуска диференцијална контрола понашања које тражи кокаин. Нат Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
21. Јориссен ХЈ, Улери ПГ, Хенри Л, Гоурнени С, Нестлер ЕЈ, Руденко Г. Димеризација и својства везивања ДНК транскрипционог фактора ДелтаФосБ. Биоцхемистри. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
22. Јоурдаин П, Фукунага К, Муллер Д. Протеин киназа ИИ зависна од калцијума и калмодулина доприноси расту филоподије и формирању кичме која зависи од активности. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
23. Келз МБ, Цхен Ј, Царлезон ВА, Јр., Вхислер К, Гилден Л, Бецкманн АМ, Стеффен Ц, Зханг ИЈ, Маротти Л, Селф ДВ, Ткатцх Т, Баранаускас Г, Сурмеиер ДЈ, Неве РЛ, Думан РС, Пицциотто МР, Нестлер ЕЈ. Експресија транскрипционог фактора делтаФосБ у мозгу контролише осетљивост на кокаин. Природа. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
24. Клуг ЈР, Матхур БН, Касх ТЛ, Ванг ХД, Маттхевс РТ, Робисон АЈ, Андерсон МЕ, Деутцх АИ, Ловингер ДМ, Цолбран РЈ, Виндер ДГ. Генетичка инхибиција ЦаМКИИ у дорзалном стриаталном медију Спини Неуронс смањује функционалне ексцитаторне синапсе и повећава унутрашњу ексцитабилност. ПЛоС Оне. КСНУМКС; КСНУМКС: еКСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
25. Кнацкстедт ЛА, Моуссави К, Лалумиере Р, Сцхвендт М, Клугманн М, Каливас ПВ. Тренирање екстинкције након само-давања кокаина изазива глутаматергичну пластичност да инхибира тражење кокаина. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
26. Коуррицх С, Тхомас МЈ. Слични неурони, супротне адаптације: психостимулантно искуство диференцијално мијења својства паљења у акумбенс језгру у односу на љуску. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
27. Коуррицх С, Клуг ЈР, Маифорд М, Тхомас МЈ. АМПАР-Независни ефекат Стриатал алпхаЦаМКИИ промовише сензибилизацију награде за кокаин. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
28. ЛаПлант К, Цхакраварти С, Виалоу В, Мукхерјее С, Коо ЈВ, Калахасти Г, Брадбури КР, Таилор СВ, Мазе И, Кумар А, Грахам А, Бирнбаум СГ, Крисхнан В, Труонг ХТ, Неве РЛ, Нестлер ЕЈ, Руссо СЈ . Улога нуклеарног фактора каппаБ у стресној хиперсензитивности стресног хормона код женки мишева. Биол Псицхиатри. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
29. Лее КВ, Ким И, Ким АМ, Хелмин К, Наирн АЦ, Греенгард П. Стварање дендритске кичме изазване кокаином у ДКСНУМКС и ДКСНУМКС допамин рецепторима који садрже средње штитне неуроне у нуцлеус аццумбенс. Проц Натл Ацад Сци УС А. КСНУМКС; КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
30. Лисман Ј, Сцхулман Х, Цлине Х. Молекуларна основа ЦаМКИИ функције у синаптичкој и бихевиоралној меморији. Нат Рев Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
31. Лобо МК, Цовингтон ХЕ, КСНУМКСрд, Цхаудхури Д, Фриедман АК, Сун Х, Дамез-Верно Д, Диетз ДМ, Заман С, Коо ЈВ, Кеннеди ПЈ, Моузон Е, Могри М, Неве РЛ, Деиссеротх К, Хан МХ, Нестлер ЕЈ. Специфични губитак типа БДНФ сигнализације ћелија опонаша оптогенетску контролу награде за кокаин. Наука. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
32. Ловетх ЈА, Бакер ЛК, Гуптаа Т, Гуиллори АМ, Везина П. Инхибиција ЦаМКИИ у љусци нуцлеус аццумбенс смањује појачани унос амфетамина у сензибилисане пацове. Неуросци Летт. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
33. Ловетх ЈА, Сингер БФ, Бакер ЛК, Вилке Г, Инамине Х, Бубула Н, Алекандер ЈК, Царлезон ВА, Јр., Неве РЛ, Везина П. Прелазна прекомјерна експресија алфа-ЦаКСНУМКС + / калмодулина зависне протеин киназе ИИ у схеллус нуцлеус аццумбенс побољшава понашање у понашању према амфетамину. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
34. Малинов Р, Маленка РЦ. Трговина АМПА рецепторима и синаптичка пластичност. Анну Рев Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
35. Матсузаки М, Хонкура Н, Еллис-Давиес ГЦ, Касаи Х. Структурна основа дугорочног потенцирања у појединачним дендритским бодљама. Природа. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
36. Маифорд М, Бацх МЕ, Хуанг ИИ, Ванг Л, Хавкинс РД, Кандел ЕР. Контрола формирања меморије преко регулисане експресије ЦаМКИИ трансгена. Наука. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
37. Мазе И, Цовингтон ХЕ, КСНУМКСрд, Диетз ДМ, ЛаПлант К, Рентхал В, Руссо СЈ, Мецханиц М, Моузон Е, Неве РЛ, Хаггарти СЈ, Рен И, Сампатх СЦ, Хурд ИЛ, Греенгард П, Таракховски А, Сцхаефер А, Нестлер ЕЈ. Основна улога хистонске метилтрансферазе ГКСНУМКСа у пластичности изазваној кокаином. Наука. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
38. МцЦлунг ЦА, Нестлер ЕЈ. Регулација експресије гена и награде за кокаин од стране ЦРЕБ и ДелтаФосБ. Нат Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
39. Нестлер ЕЈ. Ревиев. Транскрипцијски механизми зависности: улога ДелтаФосБ-а. Пхилос Транс Р Соц Лонд Б Биол Сци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
40. Ние ХЕ, Хопе БТ, Келз МБ, Иадарола М, Нестлер ЕЈ. Фармаколошке студије регулације кроничне индукције антигена повезане са ФОС кокаином у стриатуму и нуцлеус аццумбенс. Ј Пхармацол Екп. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
41. Окамото К, Босцх М, Хаиасхи И. Улоге ЦаМКИИ и Ф-актина у структуралној пластичности дендритичних бодова: потенцијални молекуларни идентитет синаптичке ознаке? Физиологија (Бетхесда) КСНУМКС; КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
42. Олауссон П, Јентсцх ЈД, Тронсон Н, Неве РЛ, Нестлер ЕЈ, Таилор ЈР. ДелтаФосБ у нуцлеус аццумбенс регулише инструментално понашање и мотивацију ојачану храном. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
43. Пакинос Г, Ватсон Ц. Мозак пацова у стереотаксичним координатама. КСНУМКСтх Едитион. Амстердам; Бостон: Ацадемиц Пресс / Елсевиер; КСНУМКС.
44. Пеакман МЦ, Цолби Ц, Перротти ЛИ, Текумалла П, Царле Т, Улери П, Цхао Ј, Думан Ц, Стеффен Ц, Монтеггиа Л, Аллен МР, Стоцк ЈЛ, Думан РС, МцНеисх ЈД, Баррот М, Селф ДВ, Нестлер ЕЈ , Сцхаеффер Е. Индуцибилна, специфична експресија доминантног негативног мутанта ц-Јун-а у трансгеним мишевима смањује осјетљивост на кокаин. Браин Рес. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
45. Пензес П, Цахилл МЕ, Јонес КА, Сривастава ДП. Конвергентни ЦаМК и РАЦГЕФ сигнали контролишу дендритичку структуру и функцију. Трендс Целл Биол. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
46. Перротти ЛИ, Хадеисхи И, Улери ПГ, Баррот М, Монтеггиа Л, Думан РС, Нестлер ЕЈ. Индукција делтаФосБ у можданим структурама повезаним са наградом након хроничног стреса. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
47. Перротти ЛИ, Веавер РР, Робисон Б, Рентхал В, Мазе И, Иаздани С, Елморе РГ, Кнапп ДЈ, Селлеи ДЕ, Мартин БР, Сим-Селлеи Л, Бацхтелл РК, Селф ДВ, Нестлер ЕЈ. Разликују се обрасци индукције ДелтаФосБ у мозгу путем дрога злоупотребе. Синапсе. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
48. Пицкенс ЦЛ, Аираваара М, Тхеберге Ф, Фаноус С, Хопе БТ, Схахам И. Неуробиологија инкубације жудње за дрогом. Трендс Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
49. Пиерце РЦ, Куицк ЕА, Реедер ДЦ, Морган ЗР, Каливас ПВ. Други гласници посредовани калцијем модулирају изражавање сензибилизације понашања на кокаин. Ј Пхармацол Екп. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
50. Куирион Р, Робитаилле И, Мартиал Ј, Цхабот ЈГ, Лемоине П, Пилапил Ц, Далпе М. Ауторадиографија рецептора за људски мозак помоћу целих хемисфера: општи метод који минимизира артефакте ткива. Синапсе. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
51. Робинсон ТЕ, Колб Б. Структурна пластичност повезана са изложеношћу злоупотреби дрога. Неуропхармацологи. КСНУМКС (КСНУМКС): КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
52. Робисон АЈ, Нестлер ЕЈ. Транскрипцијски и епигенетски механизми зависности. Нат Рев Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
53. Робисон АЈ, Басс МА, Јиао И, МацМиллан ЛБ, Цармоди ЛЦ, Бартлетт РК, Цолбран РЈ. Мултивалентне интеракције протеин киназе ИИ зависне од калцијума / калмодулина са протеинима постсинаптичке густине НРКСНУМКСБ, денсин-КСНУМКС и алфа-актинин-КСНУМКС. Ј Биол Цхем. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
54. Росс ПЛ, Хуанг ИН, Марцхесе ЈН, Виллиамсон Б, Паркер К, Хаттан С, Кхаиновски Н, Пиллаи С, Деи С, Даниелс С, Пуркаиастха С, Јухасз П, Мартин С, Бартлет-Јонес М, Хе Ф, Јацобсон А, Паппин ДЈ. Мултиплексирана квантификација протеина у Саццхаромицес церевисиае употребом амин-реактивних изобаричних реагенса за означавање. Мол Целл Протеомицс. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
55. Руссо СЈ, Диетз ДМ, Думитриу Д, Моррисон ЈХ, Маленка РЦ, Нестлер ЕЈ. Овисни синапси: механизми синаптичке и структурне пластичности у нуцлеус аццумбенс. Трендс Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
56. Селф ДВ. У: Тхе Допамине Рецепторс. Неве КА, уредник. Нев Иорк: Хумана Пресс; КСНУМКС. КСНУМКС – КСНУМКС.
57. Сингер БФ, Ловетх ЈА, Неве РЛ, Везина П. Прелазна вирусна прекомерна експресија протеин-киназе ИИ зависне од алфа-калцијума / калмодулина у љусци нуцлеус аццумбенс доводи до дуготрајне функционалне регулације алфа-амино-КСНУМКС-хидроксил-КСНУМКС -метил-КСНУМКС-изоксазол-пропионатни рецептори: допамин тип-КСНУМКС рецептор и зависност од протеин киназе А. Еур Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
58. Страцк С, МцНеилл РБ, Цолбран РЈ. Механизам и регулација циљања протеин киназе ИИ зависне од калциј / калмодулин на подјединицу НРКСНУМКСБ рецептора Н-метил-Д-аспартата. Ј Биол Цхем. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
59. Улери-Реинолдс ПГ, Цастилло МА, Виалоу В, Руссо СЈ, Нестлер ЕЈ. Фосфорилација ДелтаФосБ посредује њену стабилност ин виво. Неуросциенце. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
60. Улери ПГ, Нестлер ЕЈ. Регулација транскрипционе активности ДелтаФосБ фосфорилацијом СерКСНУМКС. Еур Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
61. Улери ПГ, Руденко Г, Нестлер ЕЈ. Регулација стабилности ДелтаФосБ фосфорилацијом. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
62. Виалоу В, ет ал. ДелтаФосБ у круговима награђивања мозга посредује отпорност на стрес и антидепресивне реакције. Нат Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
63. Ванг Л, Лв З, Ху З, Схенг Ј, Хуи Б, Сун Ј, Ма Л. Хронична кокаином индукована ХКСНУМКС ацетилација и транскрипциона активација ЦаМКИИалпха у нуцлеус аццумбенс је критична за мотивацију за појачање дроге. Неуропсицхопхармацологи. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ПМЦ бесплатан чланак] [ЦроссРеф]
64. Верме М, Мессер Ц, Олсон Л, Гилден Л, Тхорен П, Нестлер ЕЈ, Брене С. Делта ФосБ регулише рад котача. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
65. Винстанлеи ЦА, ЛаПлант К, Тхеобалд ДЕ, Греен ТА, Бацхтелл РК, Перротти ЛИ, ДиЛеоне РЈ, Руссо СЈ, Гартх ВЈ, Селф ДВ, Нестлер ЕЈ. ДелтаФосБ индукција у орбитофронталном кортексу посредује у толеранцији кокаин-индуковане когнитивне дисфункције. Ј Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
66. Зацхариоу В, Боланос ЦА, Селлеи ДЕ, Тхеобалд Д, Цассиди МП, Келз МБ, Схав-Лутцхман Т, Бертон О, Сим-Селлеи Љ, Дилеоне РЈ, Кумар А, Нестлер ЕЈ. Битна улога за ДелтаФосБ у нуцлеус аццумбенс у морфину. Нат Неуросци. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]
67. Зханг Р, Кхоо МС, Ву И, Ианг И, Груетер ЦЕ, Ни Г, цена ЕЕ, Јр, Тхиел В, Гуатимосим С, Сонг ЛС, Маду ЕЦ, Схах АН, Висхниветскаиа ТА, Аткинсон ЈБ, Гуревицх ВВ, Салама Г, Ледерер ВЈ, Цолбран РЈ, Андерсон МЕ. Инхибиција калмодулин киназе ИИ штити од структурних болести срца. Нат Мед. КСНУМКС: КСНУМКС: КСНУМКС – КСНУМКС. [ЦроссРеф]