ПЛоС Оне. КСНУМКС Нов КСНУМКС; КСНУМКС (КСНУМКС): еКСНУМКС. дои: КСНУМКС / јоурнал.поне.КСНУМКС.
Нисхијима Т, Каваками М, Кита И.
извор
Лабораторија за физиологију понашања, Факултет за хуманистичке науке, Токио Метрополитан Университи, Токио, Јапан.
Апстрактан
Физичка вежба побољшава вишеструке аспекте функције хипокампуса. У складу са идејом да је неуронска активност кључна за промовисање неуронских функција, претходна литература доследно је показала да акутни напади вјежбања изазивају активацију неурона у хипокампусу. Понављани активирајући стимулус доводи до акумулације транскрипционог фактора ΔФосБ, који посредује дугорочну неуралну пластичност.
У овој студији смо тестирали хипотезу да дугорочно волонтирање покреће ΔФосБ експресију у хипокампусу и испитује потенцијалне ефекте специфичне за регион унутар хипокампалног субпоља дуж дорсо-вентралне оси. Мужјаци ЦКСНУМКСБЛ / КСНУМКС мишева су смештени са или без точкова за покретање КСНУМКС недеља. Дуготрајно кретање точкова значајно повећало ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у свим хипокампалним регијама \ т (тј. у потпоља ДГ, ЦАКСНУМКС и ЦАКСНУМКС и дорзалног и вентралног хипокампуса). Резултати су потврдили да покретање точкова изазива експресију специфичну за регион ФосБ / ΔФосБ имунореактивности у кортексу, што указује на то да униформно повећање ФосБ / ΔФосБ унутар хипокампуса није неспецифична последица трчања. Вестерн блот подаци указују да је повећана хипокампална ФосБ / ΔФосБ имунореактивност примарно због повећаног ΔФосБ. Ови резултати указују на то да је дуготрајна физичка вежба снажан окидач за индукцију ΔФосБ током читавог хипокампуса, што би објаснило зашто вежбање може побољшати и дорзалне и вентралне функције овисне о хипокампусу. Занимљиво је да смо открили да је експресија ФосБ / ΔФосБ у ДГ била позитивно повезана са бројем двоструко-имунореактивних (тј. Незрелих) неурона.
Иако су механизми помоћу којих ΔФосБ посредује неурогенезу изазвану вежбањем још увек неизвесни, ови подаци указују да је неурогенеза изазвана вежбом најмање зависна од активности. Узети заједно, наши тренутни резултати указују на то да је ΔФосБ нови молекуларни циљ који је укључен у регулисање вештачке индуковане пластичности хипокампа.
увод
Вјежба даје различите предности молекуларним, структурним и функционалним аспектима хипокампуса код глодара [1,2], од којих су неке подржане људским студијама [3,4]. Међутим, механизми на којима се заснивају промене у пластичности хипокампа изазване вежбањем нису довољно разумљиви. Претходна литература доследно је показала да вежба изазива активацију хипокампалног неурона код глодара. Имунохистокемијске студије које су користиле ц-Фос, маркер пролазне активације неурона, показале су да и принудно и добровољно повећање повећане експресије ц-Фос у подземама денталне гирус (ДГ), ЦАКСНУМКС и ЦАКСНУМКС хипокампуса глодара [5-7]. Поред тога, претходна студија која је користила ласерско-Допплер фловметри (ЛДФ) показала је да благи покретни покрет који повећава регионални церебрални крвни проток (рЦБФ), алтернативни маркер неуронске активације, у потпољу ЦАКСНУМКС у пацовима [8]. Имунохистокемијске студије омогућавају детаљне анализе специфичне за регион након прекида вежбања, док ЛДФ омогућава праћење у реалном времену рЦБФ-а у локализованом подручју током вежбања. Упркос предностима и ограничењима сваке студије, ове студије су слично показале ефекат акутних нападаја на активност хипокампалног неурона. Ови резултати указују на механизам у којем дугорочно редовно вежбање промовише пластичност хипокампуса тако што се опетовано активира неуронска активација.9].
Фактор транскрипције ΔФосБ, исецка скраћеног споја ФосБ пуне дужине, индукује се различитим типовима поновљених стимулуса у одређеним регионима мозга, где се постепено акумулира због своје јединствене стабилности (полу-живот недеља).10-12]. Све већи број доказа показује да повишени ниво ΔФосБ посредује дуготрајну неуралну и бихевиоралну пластичност повезану са посебним стимулансима [11,13]. На пример, хронично давање лекова злоупотребе, као што су кокаин и морфин, обично повећава експресију ΔФосБ у нуцлеус аццумбенс, што представља један од молекуларних механизама који леже у основи повећане осетљивости на ове лекове [11,14,15]. Симиларли на друге награде стимулуса, укључујући и високе масноће дијета и сексуалног искуства [16,17], лдугорочно добровољно кретање точкова такође је повећало ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у нуклеусу штакора штакора, што указује на то да је добровољни рад природна награда за глодаре [18,19]. Међутим, према нашим сазнањима, ниједна литература није испитала да ли понављано излагање физичкој активности изазива ΔФосБ експресију у хипокампусу. Пошто вежбање активира неуронску активацију у хипокампусу, претпоставили смо да би дугорочно добровољно покретање точкова такође индуковало експресију ΔФосБ у хипокампусу. Док тачни механизми којима ΔФосБ регулише пластичност хипокампуса остају неизвесни, студије су показале да мишеви којима недостаје фосБ ген показује поремећену хипокампалну неурогенезу и појачано понашање слично депресији20,21]. ИПознато је да вежбе појачавају неурогенезу и имају антидепресивна својства [22-25]. ИАко је наша хипотеза тачна, ΔФосБ би био нови потенцијални молекуларни циљ који посредује хипокампалну пластичност изазвану вежбом.
Хипокампус има анатомски и функционални градијент дуж своје уздужне (дорсо-вентралне) оси26]. Дорзални хипокампус игра кључну улогу у просторном учењу и памћењу27,28], док је вентрални хипокампус преференцијално укључен у регулисање емоционалног понашања [29,30]. Штавише, студије су показале да физиолошки стимулуси индукују различите обрасце експресије ц-Фос у дорзалним и вентралним деловима хипокампуса [31-33]. Зато што вежбање побољшава и дорзално [34-37и функције зависне од вентралног хипокампуса [24,25,38], важно је испитати да ли дугорочни добровољни рад узрокује специфичну експресију ΔФосБ у хипокампусу.
Примарна хипотеза ове студије била је да би дугорочно добровољно покретање точкова изазвало експресију ΔФосБ у мишјем хипокампусу. Ова хипотеза је испитивана помоћу ФосБ / ΔФосБ имунохистокемије у дорзалним и вентралним хипокампалним подпољама, ДГ, ЦАКСНУМКС и ЦАКСНУМКС, са додатним нагласком на идентификацију индукције специфичне за регион. Резултати су потврђени Вестерн блоттингом, који је коришћен за идентификацију изоформа фосБ генски производи индуковани у хипокампусу. Такође смо испитали кортекс за ФосБ / ΔФосБ индукцију специфичну за регион како би се искључила могућност да дуготрајно вежбање не-специфично повећава ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у мозгу. Коначно, испитивана је корелативна веза између експресије ФосБ / ΔФосБ и неурогенезе као првог корака у тражењу функционалних импликација индукције ΔФосБ изазване вежбањем у регулацији пластичности хипокампа.
Материјал и метод
КСНУМКС: Изјава о животињама и етици
Двадесет мушких ЦКСНУМКСБЛ / КСНУМКС мишева (КСНУМКС недеља старости) је набављено од комерцијалног одгајивача (СЛЦ, Схизуока, Јапан). Десет мишева је коришћено за експеримент КСНУМКС, а осталих десет за експеримент КСНУМКС. Мишеви су били смештени у контролисаним условима температуре (КСНУМКС-КСНУМКС ° Ц) и светли (КСНУМКС / КСНУМКС-х циклус светло / мрак, осветљен на КСНУМКС), и обезбеђени су храна и вода по вољи. Све експерименталне процедуре су одобрене од стране Етичког комитета за експерименте са животињама Универзитета Токио Метрополитан Университи.
У сваком експерименту, по доласку, мишеви су насумично распоређени или у контролну групу (Цонтрол, н = КСНУМКС) или у групу која ради (Руннер, н = КСНУМКС). Током прве недеље, сви мишеви су смештени у стандардне пластичне кавезе у групама (КСНУМКС мишеви / кавез) за почетну аклиматизацију. Затим су Руннер мишеви пребачени у кавез опремљен покретним точком (ЕНВ-КСНУМКС, Мед Ассоциате Инц., Георгиа, ВТ, УСА). Зато што је познато да социјална изолација потискује неурогенезу изазвану вежбом у хипокампусу [39Руннер мишеви су смештени као група (КСНУМКС мишеви / кавез) за додатне КСНУМКС недеље. Број ротација точкова је забележен сваког јутра и телесна тежина (г) је мерена недељно.
КСНУМКС: Експеримент КСНУМКС. Имунохистокемијско испитивање експресије ФосБ / ΔФосБ и хипокампалне неурогенезе
КСНУМКС: Перфузија и обрада ткива
Јутро (КСНУМКС-КСНУМКС) након задњег дана периода трчања, мишеви су дубоко анестезирани натријумом пентобарбиталом и транскардијално перфундирани хладним физиолошким раствором. Мозак је брзо уклоњен и накнадно фиксиран у КСНУМКС% параформалдехиду у КСНУМКС М фосфатном пуферу (ПБС, пХ КСНУМКС) преко ноћи. Мозак је затим био цриопротецтед у КСНУМКС% сахарози у ПБС и замрзнут до даље обраде. Короналне секције мозга (КСНУМКС μм) хемисфере су добијене коришћењем микротома за замрзавање и сакупљене у ПБС са КСНУМКС% натријум азидом.
КСНУМКС: Иммунохистоцхемистри
Серија секција један-у-шест је насумично одабрана за имунобојење ФосБ / ΔФосБ. Суседни низ је коришћен за обележавање двоструког кортина (ДЦКС), маркера незрелих неурона валидираних за процену неурогенезе.40,41]. Након гашења активности ендогене пероксидазе са КСНУМКС% Х2O2 у ПБС, слободно плутајуће секције су претходно инкубиране са раствором за блокирање који садржи КСНУМКС% нормалан коњски серум у ПБС за КСНУМКС х. После испирања у ПБС, секције су инкубиране са зечјим поликлонским пан-ФосБ антителом (КСНУМКС: КСНУМКС, сц-КСНУМКС, Санта Цруз Биотецхнологи, Даллас, ТКС, УСА) разблаженим у ПБС са КСНУМКС% Тритон Кс-КСНУМКС и КСНУМКС% БСА (ПБСТ) -БСА) за КСНУМКС х на КСНУМКС ° Ц. Друге серије секција су инкубиране са козјим поликлонским анти-ДЦКС антителом (КСНУМКС: КСНУМКС, сц-КСНУМКС, Санта Цруз) у ПБСТ-БСА за КСНУМКС х на КСНУМКС ° Ц. Секције су даље инкубиране са одговарајућим биотинилованим секундарним антителом (анти-зечји ИгГ, КСНУМКС: КСНУМКС, АПКСНУМКСБ; анти-козји ИгГ, КСНУМКС: КСНУМКС, АПКСНУМКСБ, оба антитела од ЕМД Миллипоре, Биллерица, МА, УСА) у ПБСТ-БСА за КСНУМКС х на собној температури. Секције су затим третиране са авидин-биотин-пероксидаза комплексом (Вецтастаин АБЦ пероксидаза кит, Вецтор Лабораториес Инц, Бурлингаме, ЦА, УСА) за КСНУМКС мин према упутствима произвођача. Антигени су коначно визуализовани са КСНУМКС% КСНУМКС-диаминобензидин (ДАБ) у КСНУМКС М Трис-ХЦл (пХ КСНУМКС) који садржи КСНУМКС% Х2O2. За ФосБ / ΔФосБ имунолошко бојење, реакција је појачана са никл амонијум сулфатом. За ДЦКС бојење, ћелијска језгра су обојена Ниссл бојањем. Секције су постављене на плочице пресвучене желатином и постављени су покровни поклопци.
КСНУМКС: Квантификација ФосБ / ΔФосБ имунореактивности коришћењем прага слике
Пан-ФосБ антитело коришћено у овој студији је подигнуто против унутрашњег региона који дели ФосБ и ΔФосБ Н-терминални регион, тако да не може да прави разлику између две изоформе. Према томе, имуностиране структуре су описане као ФосБ / ΔФосБ имунореактивна (ФосБ / ΔФосБ-ир) језгра. За непристрасну слепу квантификацију, препарати су кодирани пре анализе. Атлас мишјег мозга42] је коришћен за идентификацију следећих региона од интереса (РОИ): слој ћелија гранула (ГЦЛ) ДГ (секције КСНУМКС), слој пирамидалних ћелија ЦАКСНУМКС (секције КСНУМКС) и ЦАКСНУМКС (секције КСНУМКС – КСНУМКС) у дорзалном хипокампусу (затворено до -КСНУМКС мм од брегме); ДГ (КСНУМКС секције), ЦАКСНУМКС (секције КСНУМКС) и ЦАКСНУМКС (секције КСНУМКС) у вентралном хипокампусу (затворено до -КСНУМКС мм од брегме) (Слика КСНУМКС, лево). Каудалне секције садрже и дорзални и вентрални део хипокампуса, али је трбушни део био циљан. У ДГ, супрапирамидним (ДГсп) и инфрапрамидним (ДГип) сечивима анализиране су одвојено. Моторни кортекс (секције КСНУМКС – КСНУМКС, затворене до -КСНУМКС мм од брегме), соматосензорни кортекс (КСНУМКС – КСНУМКС секције, затворене до -КСНУМКС мм од брегме), визуелни кортекс (КСНУМКС секције, затворене до -КСНУМКС мм од анализирана је и слушна кортекс (секције КСНУМКС, затворене до -КСНУМКС мм од брегме) и мирисна сијалица (КСНУМКС секције, затворене до + КСНУМКС мм од брегме) (Слика КСНУМКС, лево).
Дигиталне слике (КСНУМКС × КСНУМКС пиксела) сваког РОИ-а су снимљене оптичким микроскопом (БКС-КСНУМКС, Олимпус, Токио, Јапан) опремљеним ЦЦД камером (ДП-КСНУМКС, Олимпус) и сликовним софтвером (целлСенс, Олимпус). Повећање објектива је било КСНУМКС × за хипокампални РОИ и КСНУМКС × за кортикалне РОИ. Да би се идентификовала умјерена до јака ФосБ / ΔФосБ имунореактивност (Слика КСНУМКСД – Г), користећи неколико секција унапред, оба подешавања снимања слике (интензитет светлости, величина заустављања поља, време експозиције и баланс белине) и нивои прага за сваку од РГБ компоненти су оптимизовани за хипокампални и кортикални РОИ. Следећа анализа је затим изведена под оптимизованим условима (КСНУМКС). РОИ су изабрани полигоном неправилног облика (Слика КСНУМКСА, Б) (КСНУМКС). Слика је праћена, што је ФосБ / ΔФосБ-ир језгре претворило у црвену боју (Слика КСНУМКСЦ-Г) (КСНУМКС). % РОИ је тада аутоматски израчунат на следећи начин:% РОИ = (конвертована површина (у црвеној) / укупна РОИ област) × КСНУМКС.
Да би потврдили ову анализу прага слике, КСНУМКС региони су насумично одабрани из различитих области мозга са различитим величинама региона. Поред квантификације прага слике, број ФосБ / ΔФосБ-ир језгара у одабраним областима је ручно пребројан и густина ФосБ / ΔФосБ-ир језгара је добијена дељењем броја ФосБ / ΔФосБ-ир језгара мерењем површина (мм2).
КСНУМКС: Квантификација ДЦКС-ир незрелих неурона у дентатном гирусу
ДЦКС-ир незрели неурони у ДГ Руннер мишева су били обилни и преклапају, што је отежало прецизно бројање дискретног броја ДЦКС-ир сома помоћу оптичког микроскопа. Међутим, у претходној студији, Схолл анализа за морфолошку процену показала је да сваки ДЦКС-ир неурон има, у просеку, један дендрит када се мери унутар КСНУМКС μм сома [43]. Због тога је развијена следећа оригинална анализа да се омогући квантификација ДЦКС-ир неурона специфичних за регион.
- (КСНУМКС) Слика ГЦЛ-а је пројектована на компјутерском екрану помоћу софтвера за снимање и КСНУМКС × објективом (КСНУМКС). На живој слици, дуж линије ГЦЛ је нацртан сегмент линије (КСНУМКС ± КСНУМКС μм) (Слика КСНУМКС) (КСНУМКС). Променом фокалне дубине, број пута који је прелазио линију пречника ДЦКС-ир дендрита (КСНУМКС). РОИ (дорзални ДГсп, дДГсп; дорзални ДГип, дДГип; вентрални ДГсп, вДГсп; вентрал ДГип, вДГип) одговара регијама у којима је анализирана ФосБ / ΔФосБ имунореактивност (КСНУМКС). У сваком РОИ, сегменти линије КСНУМКС – КСНУМКС су нацртани по секцијама, а број укрштања је просјечан преко КСНУМКС – КСНУМКС секција по мишу. Пошто је дебљина ГЦЛ приближно КСНУМКС – КСНУМКС μм, број укрштања треба да одражава број ДЦКС-ир неурона у анализираном ограниченом региону.
КСНУМКС. Експеримент КСНУМКС. Идентификација изоформе ФосБ / ΔФосБ индуковане покретањем точкова
КСНУМКС: Перфузија и обрада ткива
Додатна кохорта мишева је третирана као горе у експерименту КСНУМКС. После КСНУМКС недеља интервенције у току, мишеви су транскардијално перфундирани са хладном салином под дубоком анестезијом. Хипокампус се брзо исече и замрзне са течним азотом и чува се на -КСНУМКС ° Ц. Хипокампи сваког миша је хомогенизован у РИПА пуферу (КСНУМКС мМ НаЦл, КСНУМКС мМ Трис-ХЦл пХ КСНУМКС, КСНУМКС% НП-КСНУМКС, КСНУМКС% натријум деоксихолат, КСНУМКС% СДС, #КСНУМКС, Тхермо Сциентифиц, ИЛ, УСА) који садржи протеазу инхибитори (цмплете Мини, Роцхе, Манхеим, Немачка). Лизати су центрифугирани за КСНУМКС мин на КСНУМКС рпм на КСНУМКС ° Ц и сакупљени су супернатанти. Концентрације протеина су мерене са комплетом БЦА протеинске анализе (#КСНУМКС, Тхермо Сциентифиц, ИЛ, УСА).
КСНУМКС: Вестерн блоттинг
Једнаке количине протеина (КСНУМКС μг / лане) су електрофорезоване на КСНУМКС% полиакриламидном гелу, затим пребачене у ПВДФ мембрану (Иммун-Блот, КСНУМКС μм, Био-Рад, МД, УСА). Неспецифично везивање је блокирано преинкубацијом мембране за КСНУМКС х у ТБСТ (КСНУМКС М НаЦл, КСНУМКС мМ Трис-ХЦл пХ КСНУМКС, КСНУМКС% Твеен-КСНУМКС) који садржи КСНУМКС% БСА. Мембрана је инкубирана са пан-ФосБ антителом (КСНУМКС: КСНУМКС) који је горе коришћен за имунохистокемију, растворен у ТБСТ који садржи КСНУМКС% БСА. После испирања са ТБСТ, мембрана је инкубирана са ХРП-коњугованим анти-зечјим ИгГ антителом (КСНУМКС: КСНУМКС у ТБСТ, НАКСНУМКС, ГЕ Хеалтхцаре, Буцкингхамсхире, УК) за КСНУМКС х на собној температури. После испирања са ТБСТ, протеинске траке су визуелизоване инкубацијом са Енханцед Цхемилуминесценце (Вестерн Лигхтнинг Плус-ЕЦЛ, ПеркинЕлмер, МА, УСА) и ухваћене употребом Имаге Куант ЛАС КСНУМКС мини (ГЕ Хеалтхцаре, Буцкингхамсхире, УК). Мембрана је затим репробирана са анти-глицералдехид-КСНУМКС-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ) антитело (# КСНУМКС, КСНУМКС: КСНУМКС у ТБС-Т, Тревиген, МД, УСА) као контрола пуњења. Оптичка густина протеинских трака је квантификована помоћу Имаге-Ј и нормализована на ниво ГАПДХ.
КСНУМКС: Статистичка анализа
Промене телесне тежине миша су анализиране двосмерном АНОВА-ом са поновљеним мерама (група × време). Непарни т-тест је коришћен за одређивање статистичких разлика између група (Цонтрол вс. Руннер). Пеарсонова корелациона анализа је коришћена за валидацију ФосБ / ΔФосБ анализе имунореактивности (ручно пребројавање у односу на прагове слике), и за испитивање повезаности између нивоа изражености ФосБ / ΔФосБ и броја ДЦКС укрштања у ДГ. Подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ. Праг за статистичку значајност је постављен на P <0.05.
Резултати
КСНУМКС: Маса тела и растојање у експериментима КСНУМКС и КСНУМКС
Промене телесне тежине контролних и тркачких мишева у експериментима КСНУМКС и КСНУМКС су удружене и приказане у Слика КСНУМКС. Двосмјерна АНОВА поновљених мјера указује на значајну интеракцију (група × вријеме, F(КСНУМКС, КСНУМКС) = КСНУМКС, P <0.001) и главни ефекат групе F(КСНУМКС, КСНУМКС) = КСНУМКС, P <0.05), што указује на значајно нижу телесну тежину код мишева тркача. Растојање трчања по кавезу приказано је у Табела КСНУМКС. Иако је прецизна раздаљина сваког миша била неизвесна, јер су мишеви били смештени заједно, редовно посматрање је потврдило да су сви мишеви често изводили точак. Руннер мишеви у експерименту КСНУМКС су трајали дуже од оних у експерименту КСНУМКС, али средња дужина трчања (м / дан / кавез) је била конзистентна током сваког експеримента.
КСНУМКС: Валидација ФосБ / ΔФосБ квантификације имунореактивности коришћењем прага слике
Дошло је до значајне корелације између ФосБ / ΔФосБ-ир области добијене праговима слике и густине ФосБ / ΔФосБ-ир језгара добијених ручним бројањем (р = КСНУМКС, P <00001, Слика КСНУМКС).
КСНУМКС: ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у хипокампусу
Приказане су репрезентативне слике ФосБ / ΔФосБ имунолошке боје у дорзалном и вентралном хипокампалном субпољу. Слика КСНУМКС. У свим анализираним РОИ, ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у Руннер мишевима (Слика КСНУМКС, десно) био је квалитативно већи него код контролних мишева (Слика КСНУМКС, центар). Код Руннер мишева, квантитативна анализа је показала значајно повећање у ФосБ / ΔФосБ-ир области у оба дорзална (ДГсп: P <0.01; ДГип: P <0.01; ЦА1: P <0.05; ЦА3: P <0.05) и вентрална хипокампална потпоља (ДГсп: P <0.01; ДГип: P <0.05; ЦА1: P <0.05; ЦА3: P <0.05; Слика КСНУМКС).
КСНУМКС: ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у кортексу
Приказане су репрезентативне слике ФосБ / ΔФосБ имунолошког бојења у кортикалним РОИ Слика КСНУМКС. Квантитативна анализа је показала промене у ФосБ / ΔФосБ имунореактивности у зависности од региона са дуготрајним радом (Слика КСНУМКС). Код Руннер мишева, ФосБ / ΔФосБ-ир подручје је било значајно више у моторном кортексу (P <0.05) и соматосензорни кортекс буре (P <0.05), али не и у визуелном кортексу (P = КСНУМКС) или мирисну сијалицу (P = КСНУМКС). У слушном кортексу, ФосБ / ΔФосБ-ир подручје је склоно повећању Руннер мишева (P = КСНУМКС).
КСНУМКС: Неурогенеза
Приказане су репрезентативне слике ДЦКС имунолошког бојења Слика КСНУМКС. У дорзалном хипокампусу, ДЦКС имунореактивност код Руннер мишева (Слика КСНУМКС, десно) је био квалитативно већи у поређењу са контролним мишевима (Слика КСНУМКС, лево). У поређењу са дорзалним хипокампусом, ДЦКС имунореактивност у вентралном хипокампусу била је слабија и код Цонтрол и Руннер мишева. Код Руннер мишева, број укрштања био је значајно већи у дДГсп (P <0.01) и дДГип (P <0.01; Слика КСНУМКС). У вентралном хипокампусу, број укрштања код Руннер мишева је имао тенденцију повећања, али није било значајних разлика између група (вДГсп, P = КСНУМКС; вДГип, P = КСНУМКС; Слика КСНУМКС).
КСНУМКС: Корелација између експресије ФосБ / ΔФосБ и неурогенезе
Извршена је корелациона анализа између ФосБ / ΔФосБ-ир области и броја ДЦКС укрштања (Слика КСНУМКС). Пошто се сваки скуп података (нпр. Дорзални ДГсп у контролним мишевима) састоји само од КСНУМКС парова, анализа је прво изведена са свим паровима КСНУМКС. Интригантно, постојала је значајна корелација између ФосБ / ΔФосБ-ир подручја и броја ДЦКС пријелаза (р = КСНУМКС, P <0.0001). Поред тога, такође су идентификоване значајне корелације када је леђни ДГ (р = 0.762, P <0.05) и трбушни ДГ (р = 0.816, P <0.01) анализирани су одвојено.
КСНУМКС: Идентификација ФосБ / ΔФосБ изоформе индуковане дуготрајним радом
Коначно, идентификовати изоформу фосБ генски производи индуковани у хипокампусу као одговор на дуготрајно трчање, хипокампи из додатне кохорте мишева је подвргнут западном блотингу коришћењем истог пан-ФосБ антитела. Вишеструки опсези КСНУМКС – КСНУМКС кДа, који представљају модификоване изоформе ΔФосБ [44], су значајно повећане код миша Руннер насупрот контролним (Слика КСНУМКС, P <0.01). С друге стране, изоформ ФосБ од 48 кДа није био откривен ни у једној групи. Још једна трака слабо видљива изнад 25 кДа вероватно представља изоформу Δ2ΔФосБ (27 кДа). Постојала су још два опсега, изнад 50 кДа и 37 кДа, који су највероватније били због неспецифичног везивања. Када се квантификују, нису пронађене разлике у овим опсезима који нису ΔФосБ између група (подаци нису приказани).
Дискусија
У сажетку, ова студија је прво извршила имунохистокемијску анализу за испитивање КСНУМКС-а да ли дугорочно волонтирање покреће ФосБ / ΔФосБ експресију у хипокампусу; и КСНУМКС) да ли постоји одговор специфичан за регион дуж њене дорсо-вентралне осе.
Четири недеље добровољног кретања точкова изазвале су значајно повећање имунореактивности ФосБ / ΔФосБ у свим анализираним регионима хипокампа (тј., ДГ, ЦАКСНУМКС и ЦАКСНУМКС подпоља дорзалних и вентралних делова хипокампуса). Потврдили смо да је КСНУМКС-КСНУМКСкДа ΔФосБ изоформа главни фосБ производ гена који се акумулира као одговор на дуготрајно трчање. Ови резултати јасно подупиру хипотезу да је дуготрајна редовна вежба снажан окидач за индукцију ΔФосБ кроз хипокампус, и да би његова индукција могла бити нови молекуларни механизам којим вежбање утиче на различите типове дорзалних и / или вентралних функција хипокампуса.
КСНУМКС: Валидација и ограничења квантификовања ФосБ / ΔФосБ имунореактивности коришћењем прага слике
Техника праћења слике, широко коришћена у имунохистокемијским студијама за бројање циљних ћелија и за процену морфологије ћелија, усвојена је у овој студији за квантификацију ФосБ / ΔФосБ имунореактивности у региону.15,45,46]. Показана је значајна корелација између нивоа имунореактивности ФосБ / ΔФосБ квантитативно одређеног прагом слике и ручним бројањем (Слика КСНУМКС). Међутим, пошто густина и преклапање спречавају бројање броја језгара ФосБ / ΔФосБ-ир у високо густим областима, приказана корелација подразумева само тачност методе граничења слике када подручја ФосБ / ΔФосБ-ир представљају <~ 40% укупног РОИ подручје. Стога је пажљиво тумачење потребно за подручја ФосБ / ΔФосБ-ир> 40% укупне површине РОИ.
Конкретно, у ДГ оф Руннер мишева (Слика КСНУМКС), ФосБ / ΔФосБ експресија је у великој мери индукована покретањем точкова и већина ФосБ / ΔФосБ-ир језгара се преклапала. У овим областима, повећана индукција ФосБ / ΔФосБ изражавања доводи до већег потцењивања нивоа експресије, без обзира на метод квантификације (прага слике или ручно бројање). Међутим, упркос ризику од подцјењивања, важно је напоменути да је ова студија успјешно показала значајна повећања у ФосБ / ΔФосБ-ир подручју у ДГ Руннер мишева. То сугерише да методолошка ограничења не угрожавају наше налазе. Умјесто тога, потенцијално подцјењивање повећава поузданост открића да дугорочно повећано ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у хипокампусу.
КСНУМКС: Јединствена индукција ΔФосБ унутар хипокампуса дуготрајним трчањем
Хипокампус има анатомске и функционалне градијенте дуж своје уздужне оси [26], тако да је за садашњу студију одвојено анализирана ФосБ / ΔФосБ имунореактивност у дорзалним и вентралним деловима хипокампуса. Подаци су показали да се дугорочно изједначено повећава ФосБ / ΔФосБ експресија у свим хипокампалним РОИ. Ова уједначена индукција ФосБ / ΔФосБ имунореактивности може бити неспецифично узрокована системским метаболичким промјенама које су повезане са дуготрајним трчањем. Међутим, важно је напоменути да је дошло до специфичних повећања имунореактивности ФосБ / ΔФосБ у кортексу. Овај резултат је поткрепљен недавним налазима који показују да је акутна појава треадмилла повећала регионални церебрални проток крви у хипокампусу, али не у мирисној сијалици.8]. Осим тога, Рходес ет ал. (КСНУМКС) је показао да су КСНУМКС дани добровољног покретања кола изазвали експресију ц-Фос у ДГ и ЦАКСНУМКС / КСНУМКС хипокампуса (ЦАКСНУМКС није мерен) иу сензорном кортексу, али не у визуелном кортексу [47]. Узете заједно, ове студије указују да униформна индукција експресије ФосБ / ΔФосБ у хипокампусу није неспецифична последица дуготрајног трчања. Занимљиво, Хавлеи и др. недавно је известио да је хронични непредвидиви стрес повећао експресију ФосБ / ΔФосБ у дорзалном, али не иу вентралном, ДГ у хипокампусу пацова [48]. Даљим истраживањем, различити обрасци индукције ФосБ / ΔФосБ, као што су они изазвани вјежбањем или стресом, омогућит ће стални увид у утјецаје на хипокампус овисне о стимулусу.
Познато је да примарно пан-ФосБ антитело које се користи у овој студији препознаје све изоформе ФосБ протеина. На основу Вестерн блоттинг анализе, открили смо да су једине изоформе које су се повећале у хипокампусу након дуготрајног трчања биле модификоване изоформе ΔФосБ (КСНУМКС-КСНУМКС кДа), једине стабилне изоформе међу Фосовим протеинима породице [11]. Овај налаз је у складу са претходним радом који је користио пан-Фос антитела како би се показало да је КСНУМКС – КСНУМКС кДа ΔФосБ предоминантни протеин Фос породице индукован у фронталном кортексу хроничним стресом [44]. Дакле, повећање хипокампалне ФосБ / ΔФосБ имунореактивности индуковане овде дуготрајним трчањем највјероватније одражава ниво ΔФосБ.
Мање је познато о ефектима вјежбања специфичних за регион на молекуларне и структурне аспекте хипокампуса. Међутим, бројне бихевиоралне студије указују на велики потенцијал за побољшања која су изазвана вежбама у дорзалним и вентралним хипокампалним функцијама. Показано је да вежба побољшава просторно учење и памћење.34-38] и просторна и контекстуална обрада углавном зависи од дорзалног хипокампуса [27,28]. Насупрот томе, вежбање је такође познато да показује анксиолитичка и антидепресивна својства.24,25,38и ови емоционални одговори су углавном регулисани вентралним хипокампусом [29,30]. Уједначена индукција ΔФосБ дуготрајним трчањем у овој студији указује да је дошло до неких облика неуропластичних промена у читавом хипокампусу. Ово би објаснило зашто вежбање може да утиче и на дорзалне и на вентралне функције хипокампуса.
КСНУМКС: Анализа специфична за регресију неурогенезе изазване вежбама
Функционална дисоцијација неурогенезе између дорзалног и вентралног хипокампуса такође добија све већу пажњу.49]. У овој студији, искориштавање морфолошких карактеристика ДЦКС-ир незрелих неурона [43], избројали смо број пресека између ДЦКС-ир дендрита и сегмента линије повученог дуж средине ГЦЛ. Ово мерење није обезбедило укупан број ДЦКС-ир неурона у ДГ, али је омогућило квантификацију специфичну за регион неопходну за спровођење корелационе анализе са подацима о експресији ФосБ / ΔФосБ (види доле). Након дуготрајног трчања, број ДЦКС-ир неурона се значајно повећао у дорзалном, али не и вентралном, ДГ. Ово указује на то да вежбање може стимулисати неурогенезу упадљивије у леђима у поређењу са вентралним делом ДГ. Међутим, претходне студије су показале супротне резултате у томе који точак повећава неурогенезу у дорзалној и вентралној ДГ.50,51]. У овој студији, број ДЦКС-ир укрштања у вентралној ДГ имао је тенденцију да се повећава са трчањем, иако је мала величина узорка (КСНУМКС мишеви по групи) могла ограничити способност да се детектује статистички значајна разлика између група. Због тога је вероватно прерано одбацити могућност да добровољно покретање точкова стимулише вентралну хипокампалну неурогенезу. Даљње детаљне студије су неопходне да би се разумела специфичност региона изазване вежбањем изазване неурогенезе у погледу његовог вишестепеног процеса (ћелијска пролиферација, диференцијација, миграција и преживљавање).
КСНУМКС: Функционалне импликације индукције ΔФосБ изазване вежбом за регулацију пластичности хипокампа
Коначно, као први корак у препознавању функционалних импликација ΔФосБ индукције индуковане вежбом у хипокампусу, испитали смо однос имунореактивности ФосБ / ΔФосБ према ДЦКС-ир укрштањима у дорзалној и вентралној ДГ и пронашли значајну, позитивну корелацију између две варијабле. Иако тачни механизми помоћу којих ΔФосБ регулише неурогенезу изазвану вежбањем, и даље су неизвесни, показало је то недавно истраживање фосБнула мишева, којима недостаје ФосБ, ΔФосБ и ΔКСНУМКСΔФосБ (све фосБ производа), показали су недостатке базалне хипокампалне неурогенезе, укључујући смањену пролиферацију неуронских прогениторских ћелија, повећану ектопичну миграцију новорођених неурона и абнормалне структуре ДГ [20]. Међутим, ове измене нису уочене фосБ(д / д) мишева, којима недостаје ФосБ, али не и ΔФосБ / ΔКСНУМКСΔФосБ. Занимљиво, у фосБнула мишева, укључујући експресију неких генома повезаних са неурогенезом, укључујући Вгф (Индуцирајући фактор раста ВГФ нерва) и гал (Галанин препропептид) су регулисани на доле20]. Пошто су ВГФ и ГАЛ секреторни молекули, један предлог који обећава сматра да неурони који експримирају ΔФосБ могу регулисати неурогенезу путем аутокрине / паракрине активности.20].
Поред тога, треба напоменути да регион где је ΔФосБ индукован просторним преклапањем са подручјем где је неурогена активност висока. Овај налаз сугерише да је неурогенеза изазвана вежбом на минимуму зависна од активности. Активација неурона је кључна за одржавање и побољшање функције централног нервног система.9], путем механизама који укључују експресију и ослобађање неуротрофног фактора из мозга (БДНФ) [52,53], узимање серумског инсулину сличног фактора раста КСНУМКС (ИГФ-КСНУМКС) кроз крвно-мождану баријеру54,55], супресија апоптозе [56], и регулација митохондријске покретљивости [57]. Стога, ова студија сугерира да дуготрајно вјежбање покреће поновљену активацију неурона, што је очигледно у повећаној експресији ΔФосБ, што доприноси повећању пластичности хипокампа, потенцијално кроз горе наведене вишеструке механизме.
Ова студија је само проценила неурогенезу изазвану вежбом и њену повезаност са ФосБ / ΔФосБ експресијом у ДГ. Међутим, ФосБ / ΔФосБ имунореактивност је такође индукована у ЦАКСНУМКС и ЦАКСНУМКС подпољама. Иако су потребне додатне студије како би се стекло више разумијевања за функционалне улоге ΔФосБ експресије изазване вјежбањем унутар ових потподручја, претходна литература нуди обећавајућу могућност. Гуан ет ал. (КСНУМКС) је показао да је специфична аблација циклин-зависне киназе КСНУМКС (ЦдкКСНУМКС) у ЦАКСНУМКС или ЦАКСНУМКС пирамидалним неуронима ослабила консолидацију меморије или проналажење, респективно [58]. Занимљиво, ЦдкКСНУМКС је низводни циљ ΔФосБ [59] и укључен је у регулисање синаптичке пластичности [60]. Због тога, експресија ΔФосБ индукована вежбом може бити укључена у регулисање синаптичке пластичности кроз ЦдкКСНУМКС активацију у ЦАКСНУМКС и ЦАКСНУМКС подполама.
Zakljucak
Док је познато да акутни напади вјежбања изазивају експресију непосредних раних протеина гена у хипокампусу, ова студија даје први доказ да дуготрајна редовна вјежба значајно индукује експресију ΔФосБ у читавом хипокампусу. Тхје уједначена индукција ΔФосБ подржава тренутно схватање да је вежбање ефикасна нефармаколошка интервенција која може побољшати вишеструке функције хипокампуса. Заједно са значајном корелацијом између експресије ФосБ / ΔФосБ и неурогенезе, ови подаци су провокативни и указују на потребу за даљим истраживањима која одређују улогу ΔФосБ у посредовању ефеката вежбања на функцију хипокампуса, укључујући неурогенезу.
Изјава о финансирању
Референце