Дисфункција базалних ганглија доприноси физичкој неактивности код гојазности (2016)

Доступно на мрежи 29. децембра 2016

схов море

http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2016.12.001

pramenovi

• Гојазност је повезана са физичком неактивношћу

• Гојазни мишеви имају мање везивања за Д2Р стријату, што може објаснити њихову неактивност

• Обнављање Г_i сигнализација у иМСНс спасава нивое физичке активности гојазних мишева

• Физичка неактивност је више последица него узрок дебљања

резиме

Гојазност је повезана са физичком неактивношћу, што погоршава здравствене последице повећања телесне тежине. Међутим, механизми који посредују у овој асоцијацији су непознати. Претпоставили смо да дефицити у сигнализацији допамина доприносе физичкој неактивности код гојазности. Да бисмо ово истражили, квантификовали смо више аспеката сигнализације допамина код мршавих и гојазних мишева. Открили смо да је везивање рецептора типа Д2 (Д2Р) у стриатуму, али не и везивање рецептора типа Д1 или нивои допамина, смањено код гојазних мишева. Генетско уклањање Д2Р из стријаталних средњих бодљикавих неурона било је довољно да смањи моторичку активност код мршавих мишева, док је враћање Г_i сигнализација у овим неуронима је повећала активност код гојазних мишева. Изненађујуће, иако су мишеви са ниским Д2Р били мање активни, нису били рањивији на повећање телесне тежине изазвано исхраном од контролних мишева. Закључујемо да дефицити у стријаталној Д2Р сигнализацији доприносе физичкој неактивности код гојазности, али је неактивност више последица него узрок гојазности.

Графички сажетак

Фигуре опције

Кључне речи

гојазност;
допамин;
физичка активност;
вјежба;
ДКСНУМКС;
стриатум;
гојазни;
губитак тежине

увод

Гојазност је повезана са физичком неактивношћу (Бровнсон ет ал., 2005 Екекакис ет ал., 2016), што уједињује негативне ефекте на здравље дијабетеса типа ИИ и кардиоваскуларних болести (де Резенде ет ал., 2014 Схарма и сар., 2015). Механизми који леже у основи ове асоцијације нису познати, што се огледа у недостатку ефикасних интервенција за промену нивоа физичке активности у популацијама са гојазношћу (Екекакис ет ал., 2016). Занимљиво је да је гојазност повезана са променама у сигнализацији стријаталног допамина (ДА), што је довело до хипотеза о дисфункцији награђивања код гојазности (Блум ет ал., 2011, Кенни, КСНУМКС Волков анд Висе, КСНУМКС). Иако је стријатални ДА снажно повезан са моторним излазом, неколико студија је истраживало како допаминергичке промене изазване исхраном могу допринети физичкој неактивности. Претпостављамо да је стријатална ДА сигнализација поремећена код гојазности и да то доприноси физичкој неактивности. Разумевање биолошких узрока физичке неактивности може довести до ефикасних интервенција за повећање активности, а самим тим и побољшање здравља, код особа са гојазношћу.

Стриатал ДА је критично укључен у контролу мотора. Ово је очигледно код моторичких поремећаја као што је Паркинсонова болест, коју карактерише смрт допаминергичких неурона у средњем мозгу и резултира губитком стријаталног ДА (Хорникиевицз, КСНУМКС). Две популације неурона стриаталне пројекције које модулира ДА познате су као шиљасти неурони средњег и индиректног пута (дМСН и иМСН) (Алекандер и Црутцхер, КСНУМКС, Делонг, 1990 Герфен ет ал., 1990). дМСН-ови изражавају Г_s-упарени Д1 рецептор (Д1Р) и пројектују се на супстанцију црну и унутрашњи сегмент глобуса паллидуса, док иМСН експримирају Г_i-упарен Д2Р и пројектован на спољашњи сегмент глобуса паллидуса (ГПе) (Герфен ет ал., 1990, Ле Моине и Блоцх, КСНУМКС Левеи ет ал., 1993). Генетска елиминација Д2Р из иМСН-а, или оптогенетска стимулација иМСН-а, довољна је да смањи кретање (Кравиц ет ал., 2010 Лемос ет ал., 2016). На основу веза између дисфункције Д2Р и гојазности, претпоставили смо да су гојазне животиње промениле излаз иМСН, што је резултирало физичком неактивношћу.

Овде смо испитали више аспеката ДА сигнализације код мршавих и гојазних мишева изазваних исхраном. Везивање Д2Р је смањено код гојазних мишева, док су Д1Р везивање и нивои екстрацелуларног ДА остали непромењени. Гојазни мишеви су такође показали поремећаје у стријаталном пуцању и имали су смањено кретање. Генетско елиминисање Д2Р из иМСНс смањује активност код мршавих мишева, док враћање Г_i сигнализација у иМСН повећала активност код гојазних мишева. Ови резултати показују да Д2Р сигнализација у иМСН-овима може двосмерно модулирати физичку активност. Затим смо питали да ли су мишеви са ниском Д2Р сигнализацијом били подложнији дебљању на исхрани са високим садржајем масти, због њихове ниске активности. Да бисмо то урадили, испитали смо повећање телесне тежине у односу на природне варијације у везивању Д2Р међу мишевима, као и код мишева са генетском елиминацијом стриаталних Д2Р. Иако су мишеви са ниским нивоом Д2Р имали низак ниво физичке активности, добијали су на тежини истом брзином као и мишеви са нетакнутим Д2Р. Ово оспорава јаку узрочну везу између физичке активности и повећања телесне тежине. Закључујемо да оштећења у Д2Р сигнализацији доприносе физичкој неактивности код гојазности, али да неактивност не доводи нужно до повећања телесне тежине.

Резултати

Гојазност изазвана исхраном била је повезана са физичком неактивношћу

Ц57БЛ6/Ј мушки мишеви (3-4 месеца) храњени су или стандардном храном (мршава, н = 8) или исхраном са високим садржајем масти (гојазни, н = 8) током 18 недеља (Слика С1А). Почевши од 2. недеље и настављајући до 18. недеље, гојазни мишеви су имали значајно већу телесну тежину и масну масу од мршавих мишева (п < 0.0001; Фигуре КСНУМКСА анд S1Б). Немасна маса није значајно промењена (Слика С1Ц). Мерили смо нивое активности на отвореном пољу сваке 2 недеље током 18 недеља (Етховисион; Нолдус Информатион Тецхнологиес). Гојазни мишеви су имали нижу активност од мршавих мишева почевши од 4. недеље и опстајали до 18. недеље (п < 0.0001; Фигуре КСНУМКСБ и 1Ц). У 18. недељи, гојазни мишеви су проводили мање времена у покрету (п = 0.005), имали су мање покрета (п = 0.0003) и имали су спорију брзину током кретања (п = 0.0002; Слика 1Д) у односу на мршаве мишеве. Узгој и неговање нису значајно измењени (Слика 1Д). Гојазни мишеви су такође трчали мање од мршавих мишева када су добили приступ точковима за трчање у кућном кавезу (п = 0.0005; Слика 1Е). Тестирали смо да ли су дефицити покрета повезани са повећањем тежине у гојазној групи. Иако је повећање телесне тежине било у корелацији са уносом калорија у исхрани са високим садржајем масти (Слика 1Ф), није у корелацији са нивоима кретања на отвореном пољу или са енергијом која се троши током периода дијете са високим садржајем масти (Фигуре КСНУМКСГ и 1Х). Занимљиво је да су ове исте корелације постојале када смо испитивали унос хране у првој недељи експеримента (Фигуре КСНУМКСИ–1К), што указује да је почетни ниво уноса исхране са високим садржајем масти (али не и кретање или потрошња енергије) предвиђао касније повећање телесне тежине.

Слика 1.

Хронична исхрана са високим садржајем масти довела је до физичке неактивности

(А) Мишеви храњени исхраном са високим садржајем масти тежили су више од мишева који су храњени стандардном храном почевши од 2. недеље и настављајући до 18. недеље (Ф_(18,252) = 62.43, п < 0.0001).

(Б и Ц) (Б) Примери праћења активности на отвореном који показују да (Ц) гојазни мишеви имају смањену физичку активност у поређењу са мршавим мишевима почевши од 4. недеље и настављајући до 18. недеље (Ф_(10,140) = 4.83, п < 0.0001).

(Д) После 18 недеља на исхрани са високим садржајем масти, гојазни мишеви су смањили време проведено у покрету (т₍₁₄₎ = 3.32, п = 0.005), смањена фреквенција кретања (т₍₁₄₎ = 4.74, п = 0.0003), и смањена брзина током кретања (т₍₁₄₎ = 4.69, п = 0.0002) у односу на контроле мршавости. Гојазни мишеви су такође показали тренд смањеног узгоја (п = 0.07).

(Е) Када им је омогућен приступ точку за трчање у кућном кавезу, гојазни мишеви су имали мање окрета точка у односу на мршаве мишеве (т₍₁₄₎ = 4.55, п = 0.0005).

(Ф–Х) Укупно повећање телесне тежине формирало је значајну корелацију са (Ф) уносом енергије током експеримента (р = 0.74, п = 0.04), али не и (Г) потрошњом енергије (р = 0.52, п = 0.19) ни (Х) брзина у отвореном пољу (р = 0.19, п = 0.65).

(И–К) Укупно повећање телесне тежине формирало је значајну корелацију са (И) просечним уносом енергије током прве недеље (р = 0.88, п = 0.004), али не и са (Ј) потрошњом енергије (р = −0.19, п = 0.66) , нити (К) брзина у отвореном пољу (р = 0.36, п = 0.38).

Статистичка анализа. (А и Ц) Двосмерна АНОВА поновљених мерења праћена пост хоц т тестом са стопом лажног откривања Бењамини-Хохберга; (Д и Е) неупарени Студентов т тест; (Ф–Х) линеарна регресија; ^*п < 0.05, ^**п < 0.01, ^***п < 0.0001 наспрам мршавости. (И–К) линеарна регресија; ^***п < 0.001 у односу на мршаве мишеве.

Фигуре опције

Гојазност је била повезана са смањењем везивања за допамин Д2Р

Да бисмо идентификовали механизме који леже у основи физичке неактивности, квантификовали смо више аспеката ДА сигнализације код мршавих и гојазних мишева. У складу са претходним извештајима код глодара, везивање рецептора сличног Д2Р (преко ауторадиографије са ³Х-спиперон, у даљем тексту Д2Р везивање) био је нижи код гојазних мишева у односу на мршаве мишеве (п < 0.0001; Фигуре КСНУМКСА и 2Б), налаз који је био значајан у све три стријаталне пододеле (дорзомедијално: п = 0.004; дорсолатерално: п < 0.0001; вентрално: п < 0.001; Фигуре СКСНУМКСА и С2Б). Међутим, везивање Д2Р није било у корелацији са телесном масноћом у мршавим или гојазним групама (п > 0.55 за обоје; Слика 2Ц), што сугерише да, иако се Д2Р везивање и складиштење масти мењају хроничном исхраном са високим садржајем масти, ове варијабле можда нису узрочно повезане једна са другом.

Слика 2.

Исхрана са високим садржајем масти, оштећено везивање стријаталног допамина Д2Р

(А) Слике стријаталног везивања Д2Р мерено преко ³Х-спиперон ауторадиографија.

(Б) Стриатално везивање Д2Р је смањено код гојазних у односу на мршаве мишеве (т₍₂₅₎ = 5.02, п < 0.0001).

(Ц) Стриатално везивање Д2Р није било у корелацији са процентом телесне масти код мршавих (п = 0.95) или гојазних мишева (п = 0.56).

(Д–Ф) (Д) Стријално Д1Р везивање (т₍₂₄₎ = 1.31, п = 0.20), (Е) укупан садржај допамина (ДА; т₍₁₃₎ = 0.85, п = 0.41) и (Ф) густина тирозин хидроксилазе (ТХ) (т₍₁₄₎ = 0.48, п = 0.64) нису се разликовале између група са исхраном.

Статистичка анализа. Средња вредност код појединачних мишева; н = 8–19 мишева/групи; Студентов т тест (Б и Д–Ф) или линеарна регресија (Ц); ^*п < 0.01.

Фигуре опције

Покушали смо да идентификујемо механизам који лежи у основи смањења везивања Д2Р изазваног гојазношћу. Да бисмо то урадили, тражили смо разлике у ДрдКСНУМКС мРНК (путем ин ситу хибридизације) и пронашао је непромењену у све три стријаталне поделе (дорзомедијално: п = 0.92; дорсолатерално: п = 0.90; вентрално: п = 0.34; Слика С2Ц). Урадили смо вестерн блот да бисмо квантификовали укупне нивое Д2Р протеина и приметили да нема промена ни у опсегу од 50 или 70 кДа, за које се сматра да представљају различита стања гликозилације Д2Р (оба п > 0.95, Фигуре СКСНУМКСД и С2Е) (Јохнсон и Кенни, КСНУМКС). Коначно, проценили смо маркере метаболичке дисфункције код мршавих и гојазних мишева да видимо да ли се они могу односити на смањење Д2Р као што је раније објављено (Дунн ет ал., 2012). Гојазни мишеви имали су виши холестерол наташте (п < 0.0001), лептин (п < 0.0001), глукозу (п = 0.0002), инсулин (п = 0.001) и процену хомеостатског модела засновану на резистенцији (ХОМА-ИР) (п < 0.001) , али не и триглицериде или слободне масне киселине (Фигуре СКСНУМКСД–С1Ј). Међутим, ниједан од ових фактора није био у корелацији са Д2Р везивањем код гојазних мишева (подаци нису приказани).

Везивање налик Д1Р (преко ауторадиографије са ³Х-СЦХ23390, у даљем тексту Д1Р везивање) није се разликовао између гојазних и мршавих мишева (п = 0.20; Слика 2Д). Такође није било разлика у садржају стријаталног ДА, мереног течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ) пуњача стријаталног ткива (п = 0.41; Слика 2Е), или имуно-обележавање тирозин хидроксилазе (п = 0.64; Слика 2Ф). У светлу вишеструких извештаја о разликама у базалном ДА код гојазних мишева (Царлин ет ал., 2013, Давис ет ал., 2008, Вучетић и сар., 2012 Ванг и сар., 2014), даље смо истражили ову тачку користећи микродијализу без нето флукса (нови мишеви, н = 6 по групи). Поново нисмо приметили никакве разлике у екстрацелуларном ДА (п = 0.99) или било ком од његова два метаболита, 3,4-дихидроксифенилсирћетној киселини (ДОПАЦ) (п = 0.85) и хомованилној киселини (ХВА) (п = 0.68, Слика С3), овом методом, што указује да гојазност није била повезана са смањењем екстрацелуларног тонуса ДА у овим експериментима.

Стреатално пуцање повезано са кретањем било је поремећено код гојазних мишева

Извршили смо електрофизиологију ин виво да бисмо испитали како смањено везивање стриаталног Д2Р може да промени излаз стријаталног неурона и на тај начин допринесе смањењу кретања. Снимали смо из дорсомедијалног стриатума мршавих и гојазних мишева (н = 3 миша по групи, хистологија у Слика 3Ф). Иако су се гојазни мишеви укупно мање кретали, брзина извршених покрета није се разликовала између ових група (п = 0.55; Слика 3А), што нам омогућава да упоредимо пуцање везано за кретање између мршавих и гојазних мишева. Базалне стопе пораста више јединица нису се разликовале између мршавих и гојазних мишева (мршави, 2.1 ± 0.4 Хз; гојазни, 2.0 ± 0.7 Хз; п = 0.93). Међутим, преваленција јединица које се активирају покретом (Слика 3Б) била је значајно нижа код гојазних мишева (п < 0.0001; Слика 3Ц). Ово није зависило од наше статистичке дефиниције јединица „активираних покретом“, пошто смо такође приметили смањени скок око покрета у просечном одговору свих забележених јединица код гојазних у односу на мршаве мишеве (интеракција према АНОВА, п < 0.0002; Фигуре КСНУМКСД и 3Е). Закључујемо да се укупна стопа шиљака у стриатуму није разликовала, али је код гојазних мишева поремећена организација шиљака око кретања.

Слика 3.

Пуцање везано за кретање у стријатуму било је поремећено код гојазних мишева

(А) Догађаји кретања имали су сличну брзину код мршавих и гојазних мишева.

(Б) Примери активирања покрета и нереаговања у стриаталним неуронима.

(Ц) Преваленција неурона активираних покретом била је нижа код гојазних мишева (п = 0.002).

(Д) Просечно покретање свих снимљених неурона везано за кретање.

(Е) Пуцање у вези са кретањем било је значајно ниже након излагања исхрани (интеракција исхрана × кретање, Ф_(1,171) = 14.77, п < 0.0002).

(Ф) Шема (преузето из Франклин и Пакинос, КСНУМКС) који илуструје постављање низа електрода код мршавих и гојазних мишева (н = 3 сваки).

Статистичка анализа. (Ц) Фишеров тачан тест. (Д и Е) Двосмерна АНОВА поновљених мерења.

Фигуре опције

Инхибиција иМСН излаза обновљених нивоа активности код гојазних мишева

Да бисмо тестирали да ли смањење излаза иМСН-а може повећати кретање код гојазних мишева, користили смо стратегију зависну од Цре-рекомбиназе (Цре) да бисмо изразили инхибиторни Г_i-упарени модификовани рецептор дизајнера капа опиоидног рецептора који се искључиво активира дизајнерским лековима (КОР-ДРЕАДД) у иМСН-овима гојазних мишева (Слика 4А). Иако је миш Цре (А2А-Цре) са аденозин 2А-рецептором претходно потврђен имунолошким бојењем како би се показало да је експресија Цре специфична за стриаталне иМСН (Цуи ет ал., 2013 Лемос ет ал., 2016), извршили смо додатну валидацију ове линије двоструком флуоресцентном ин ситу хибридизацијом. Скоро сви неурони (98.7% ± 0.6% од 1,301 пребројаног неурона) су експримирали оба Цре ДрдКСНУМКС мРНА, док је врло мали број (1.3% ± 0.6%) експримирао било који Цре or ДрдКСНУМКС мРНА, али не обоје, што потврђује да линија А2А-Цре верно циља иМСН ( Слика С4).

Слика 4.

Инхибиција иМСН-а посредована ДРЕАДОМ обновила је физичку активност код гојазних мишева

(А) Фотографија израза КОР-ДРЕАДД и шема (прилагођено из Франклин и Пакинос, КСНУМКС) илустровање места убризгавања вируса свих КОР-ДРЕАДД код А2А-Цре мишева; непрозирност означава број мишева који експримирају вирус на датој локацији.

(Б) Гојазни мишеви су се више кретали када им је убризган СалБ у поређењу са ДМСО (т₍₇₎ = 3.056, п = 0.02).

(Ц–Г) Након давања СалБ-а, гојазни мишеви су показали незнатне промене у (Ц) учесталости покрета, (Д) просечном трајању покрета и (Е) брзини кретања, у односу на када им је даван ДМСО. (Ф) Примена Сал-Б повећала је учесталост узгоја (т₍₇₎ = 3.116, п = 0.02), али (Г) није значајно променио учесталост дотеривања.

(Х) Мршави мишеви су се више кретали када им је убризган СалБ у поређењу са ДМСО (т₍₉₎ = 3.3, п = 0.01).

(И) СалБ није утицао на кретање код мишева дивљег типа који нису изразили КОР-ДРЕАДД (п = 0.77).

Статистичка анализа. (Б–И) Упарени Студентови т тестови; значи са појединачним мишевима; н = 6–10 мишева/групи.

Фигуре опције

Ињекције КОР-ДРЕАДД агониста салвинорина-Б (СалБ) повећале су раздаљину коју су прешли гојазни мишеви који експримирају КОР-ДРЕАДД (п = 0.02; Слика 4Б). СалБ је такође повећао учесталост узгоја (п = 0.02; Слика 4Ф) и изазвао тренд повећања учесталости (т₍₇₎ = 1.64, п = 0.12), али не и трајање или брзина кретања (Фигуре КСНУМКСЦ–4Е). Ињекције СалБ су такође повећале кретање код мршавих мишева (п = 0.01; Слика 4Х), али не и код мишева дивљег типа који нису експримирали КОР-ДРЕАД (п = 0.73; Слика 4И). Закључујемо да је смањење производње иМСН довољно за повећање нивоа кретања и мршавих и гојазних животиња.

Низак ниво Д2Р не предиспонира животиње за будуће повећање телесне тежине

Коначно, испитали смо да ли постојеће разлике у Д2Р сигнализацији могу предиспонирати појединачне мишеве на гојазност изазвану исхраном. Да бисмо одговорили на ово питање, урадили смо микро-позитронску емисиону томографију (микро-ПЕТ) са ¹⁸Ф-фалиприд за одређивање основне доступности Д2Р пре излагања исхрани са високим садржајем масти (Слика 5А). Приметили смо висок ниво варијансе у потенцијалу везивања Д2Р међу мишевима, као што су други показали (Константинеску и др., 2011). Индивидуалне разлике у доступности Д2Р биле су у позитивној корелацији са кретањем у отвореном пољу (п = 0.045; Слика 5Б), у складу са улогом Д2Р у кретању. Након микро-ПЕТ скенирања, животиње су држане на исхрани са високим садржајем масти током 18 недеља, како би се тестирало да ли ће мишеви са ниским Д2Р бити рањивији на повећање телесне тежине изазвано исхраном. Изненађујуће, пронашли смо тренд ка а позитиван однос између почетне доступности Д2Р и повећања телесне тежине у овом експерименту (п = 0.10; Слика 5Ц). Иако ова корелација није била значајна, она оспорава хипотезу да ниска доступност Д2Р или ниска физичка неактивност чини животиње рањивијим на повећање телесне тежине. Ово је такође било у складу са нашим налазима да ни базална активност на отвореном пољу, нити активност на отвореном пољу током целог експеримента, нису у корелацији са повећањем телесне тежине (Фигуре КСНУМКСФ–1К).

Слика 5.

Базално везивање Д2Р није предвидело будуће повећање телесне тежине

(А) Пример Д2Р микро-ПЕТ криве доступности у стриатуму и малом мозгу коришћењем ¹⁸Ф-фаллиприде.

(Б и Ц) (Б) Потенцијал везивања је у корелацији са базалним кретањем отвореног поља (р = 0.56, п = 0.045), и (Ц) је имао тренд ка позитивној вези са повећањем телесне тежине изазваном исхраном са високим садржајем масти (р = 0.50, п = 0.10, н = 12–14 мишева).

(Д) Репрезентативна Д2Р ауторадиографија код мишева са нетакнутим Д2Рс (горе) и иМСН-ДрдКСНУМКС-КО мишеви (доле).

(Е и Ф) (Е) иМСН-ДрдКСНУМКС-КО мишеви су имали смањену физичку активност на отвореном пољу (т₍₈₎ = 2.99, п = 0.02) и (Ф) на точковима за трчање у кућном кавезу (п = 0.01, н = 5–19 мишева/групи).

(Г) иМСН-ДрдКСНУМКС-КО мишева и ДрдКСНУМКС- флоксиране контролне групе легла добијале су сличне количине на тежини на исхрани са високим садржајем масти (Ф_(5,70) = 1.417, п = 0.23; н = 6–10 мишева/групи).

(Х–Ј) (Х) Није било значајне разлике у нормализованом уносу енергије (п = 0.60), (И) у потрошњи енергије (п = 0.47) или (Ј) РЕР (п = 0.17) између иМСН-Д2Р-КО контроле мишева и легла.

Статистичка анализа. (Б и Ц) Линеарна регресија; (Е, Ф, и Х–Ј) неупарени Студентов т тест; (Г) двосмерна АНОВА поновљених мерења, ^*п < 0.05.

Фигуре опције

Да бисмо даље истражили везу између већ постојећих разлика у нивоима активности и повећања телесне тежине, искористили смо генетски модел миша са циљаним брисањем ДрдКСНУМКС ген из иМСН-а (иМСН-ДрдКСНУМКС-КО), али очувана експресија у другим типовима ћелија ( Доббс ет ал., 2016 Лемос ет ал., 2016). Као што је раније објављено, иМСН-ДрдКСНУМКС-КО мишеви су се кретали мање од контролне групе легла на отвореном пољу (п = 0.02; Слика 5Е) и на точковима за трчање кућног кавеза (п = 0.01; Слика 5Ф). У складу са горњим експериментима, иМСН-ДрдКСНУМКС-КО мишеви нису добили више на тежини од својих контролора легла када су стављени на исхрану са високим садржајем масти (п = 0.23; Слика 5Г). Да бисмо пажљивије испитали њихово коришћење енергије, извели смо експерименте индиректне калориметрије да бисмо упоредили иМСН-ДрдКСНУМКС-КО мишеве за контролу легла. Нисмо открили значајне разлике у уносу енергије (п = 0.60), потрошњи енергије (п = 0.47) или у односу респираторне размене (РЕР) (однос ЦО₂ производњу до О₂ потрошња [ВЦО₂/ВО₂], п = 0.17) између иМСН-Дрд2-КО мишева и њихових контрола легла, што указује да смањење кретања ИМСН-Дрд2-КО мишева није довело до промена у коришћењу енергије (Фигуре КСНУМКСХ–5Ј). Коначно, истражили смо у којој мери мања смањења стријаталног Д2Р (као што су она примећена код наших гојазних мишева) могу регулисати кретање и повећање телесне тежине. Да бисмо то урадили, користили смо линију миша која доводи до 30%–40% смањења стријаталног ДрдКСНУМКС мРНА (иМСН-Дрд2-Хет) ( Лемос ет ал., 2016). Ови мишеви су такође показали смањено кретање, показујући да је делимично обарање Д2Р довољно да произведе моторни дефицит (п = 0.04; Слика С5А). Слично иМСН-Дрд2-КО мишевима, иМСН-Дрд2-хет мишеви нису били подложнији гојењу изазваном исхраном са високим садржајем масти (п = 0.89; Слика С5Б). Закључујемо да су промене у стријаталним Д2Р довољне да промене кретање, али не и калоријски баланс или телесну тежину код мишева.

Дискусија

Гојазност је повезана са физичком неактивношћу, за коју се често верује да доприноси повећању телесне тежине. Поред тога, претпоставља се да повећана адипозност доприноси ниском нивоу активности код људи са гојазношћу (Екекакис и Линд, 2006 Вестертерп, 1999), иако је ову идеју тешко директно тестирати. Занимљиво је да људи који губе на тежини било дијетом (де Боер ет ал., 1986, де Гроот ет ал., 1989, Мартин и др., 2007 Редман ет ал., 2009) или баријатријска хирургија (Берглинд и сар., 2015, Берглинд и сар., 2016, Бонд ет ал., 2010 Рамирез-Марреро ет ал., 2014) не повећавају ниво своје активности, аргументујући против тежине адипозности која узрокује њихову неактивност. Овде смо истражили хипотезу да гојазност изазвана исхраном узрокује физичку неактивност преко дефицита у стриатном преносу ДА. У складу са претходним радом, открили смо да хронична исхрана са високим садржајем масти смањује везивање стријаталног Д2Р (Хајнал и др., 2008, Хуанг ет ал., 2006, Нараианасвами ет ал., 2013, ван де Гисен и др., 2012 ван де Гисен и др., 2013). Такође смо приметили дефицит у моторичком покретању стријаталних неурона код гојазних мишева. Инхибирање иМСН-а са Г_i-упарени ДРЕАДД је спасио активност код гојазних мишева, показујући да се мишеви са вишком адипозности могу нормално кретати када се поврати излаз базалних ганглија. Изненађујуће, међутим, ни базална Д2Р мерења ни физичка активност нису у корелацији са повећањем телесне тежине, што смо приметили у више експеримената. Ово је у супротности са студијом на пацовима, која може одражавати врсте или експерименталне разлике (Мицхаелидес ет ал., 2012). Закључујемо да су смањење Д2Р и накнадна физичка неактивност последице гојазности, али нису нужно узрочно повезане са даљим повећањем телесне тежине код мишева.

Веза између измењене Д2Р сигнализације и гојазности је први пут идентификована код људи и првобитно је реплицирана од стране других (де Веијер ет ал., 2011, Кесслер ет ал., 2014, Волков и сар., 2008 Ванг и сар., 2001). Међутим, новији рад довео је ово откриће у питање (Каравађо и сар., 2015, Цосгрове ет ал., 2015, Дунн ет ал., 2012, Гуо ет ал., 2014, Карлссон ет ал., 2015, Карлссон ет ал., 2016, Стееле ет ал., 2010 Туоминен ет ал., 2015). Иако су потребна додатна истраживања да би се разумеле разлике уочене међу клиничким студијама, оне могу одражавати сложеност својствену клиничким студијама и ПЕТ имиџингу. На пример, раклоприд, радио-лиганд који се користи у многим студијама, може бити замењен ендогеним ДА, и стога на везивање може утицати разлике у базалном тонусу ДА (Хорстманн ет ал., 2015). Поред тога, однос између нивоа Д2Р и гојазности може бити нелинеаран, тако да се промене у Д2Р могу појавити другачије код пацијената са различитим нивоима гојазности (Хорстманн ет ал., 2015). Коначно, фактори као што су трајање сна (Виерс и сар., 2016) и унос кофеина (Волков и сар., 2015) такође могу утицати на везивање Д2Р и нису пријављени нити контролисани у већини клиничких студија. Ови извори варијансе могу се ублажити у студијама на животињама, које дају конзистентну слику смањења Д2Р мРНА (Матхес ет ал., 2010 Зханг ет ал., 2015), беланчевина (Адамс ет ал., 2015 Јохнсон и Кенни, КСНУМКС), и везивање рецептора (Хајнал и др., 2008, Хуанг ет ал., 2006, Нараианасвами ет ал., 2013, ван де Гисен и др., 2012 ван де Гисен и др., 2013) код гојазних глодара. Наш рад проширује ову литературу извештавајући да други аспекти ДА сигнализације остају непромењени код гојазних мишева, чак и код оних са смањењем Д2Р. Поред тога, с обзиром на наше уочено смањење везивања Д2Р ³Х-спиперон, али без промене у укупном Д2Р протеину или ДрдКСНУМКС мРНА, верујемо да промене у Д2Р могу укључивати пост-транслационе промене као што је интернализација рецептора. Иако наши подаци сугеришу да је смањено везивање Д2Р довољно за смањење физичке активности код гојазности, на физичку активност утичу многи фактори, укључујући генетику и окружење ( Бауман и др., 2012). Верујемо да је мало вероватно да су Д2Р једина неуролошка промена повезана са физичком неактивношћу код гојазности. На пример, промене у циркулишућим хормонима као што су грелин, лептин и инсулин делују на допаминергичке неуроне и могу утицати на активност (Мурраи ет ал., 2014). Коначно, иако нисмо приметили промене у Д1Р, не можемо искључити промене у неуронском активирању неурона директног пута које такође могу утицати на физичку активност.

Није јасно да ли варијације у доступности Д2Р предиспонирају појединце да добију на тежини. Људи са ДрдКСНУМКС Алел Так1А је смањио доступност Д2Р и повећао ризик од гојазности ( Блум ет ал., 1996, Царпентер ет ал., 2013, Нобле ет ал., 1991, Стице и др., 2008 Тхомпсон ет ал., 1997). Поред тога, мишеви са глобалном делецијом Д2Р лакше су добијали на тежини на исхрани са високим садржајем масти, што се приписује физичкој неактивности (Беелер и сар., 2015). Насупрот томе, индивидуалне варијације (природне или генетски изазване) у стријаталном Д2Р корелирају са нивоима активности у нашој студији, али ниједна није у корелацији са повећањем тежине. Важна разлика у нашој студији била је да је наш генетски модел уклонио Д2Р искључиво из иМСН-а. Поред тога, пажљива мерења уноса хране и потрошње енергије открила су да манипулација Д2Р на овим неуронима није променила енергетски баланс. Као такве, студије које показују везе између глобалне функције Д2Р и енергетске равнотеже могу посматрати ефекте Д2Р на друге типове ћелија. Наши експерименти подржавају закључак да је физичка неактивност последица гојазности, али сама по себи није довољна да изазове промене у тежини.

Упркос растућим доказима да је физичка активност повезана са побољшањем кардиоваскуларног здравља и смањеним ризиком од неколико других хроничних болести, физичка активност остаје ниска код особа са гојазношћу (Екекакис ет ал., 2016). Недостатак ефикасних интервенција за повећање нивоа физичке активности огледа се у недостатку разумевања ћелијских и молекуларних механизама који леже у основи физичке неактивности код особа са гојазношћу. Овде повезујемо физичку неактивност са променама у функцији базалних ганглија, пружајући биолошко објашњење за недостатак физичке активности код особа са гојазношћу.

Експерименталне процедуре

Предмети и дијете

У свим студијама, мишеви су појединачно смештени у стандардним условима (12-часовни циклус светлости/мрака, 21-22°Ц), са ад либитум приступом храни и води. Мишеви су добијали или стандардну исхрану (5001 дијета за глодаре; 3.00 кцал/г са 29% енергије добијене из протеина, 13% из масти и 56% из угљених хидрата; ЛабДиет) или исхрана са високим садржајем масти (Д12492; 5.24 кцал/г са 20% енергије се добија из протеина, 60% из масти и 20% из угљених хидрата; истраживачке дијете). Све процедуре су спроведене у складу са смерницама Комитета за негу и употребу животиња Националног института за дијабетес и болести варења и бубрега.

Трансгенични условни нокаут иМСН-Дрд2-КО мишеви су генерисани укрштањем мишева који експримирају Цре вођени регулаторним елементима гена рецептора аденозина 2А (Адора2а) (Б6.ФВБ(Цг)-Тг(Адора2а-Цре)КГ139Гсат/Ммуцд; ГЕНСАТ; 036158-УЦД) са мишевима који носе условне ДрдКСНУМКС нулти алели Б6.129С4(ФВБ)-ДрдКСНУМКС^{тм1.1Мруб/Ј},ЈАКС020631 (Белло ет ал., 2011).

Прорачуни састава тела и потрошње енергије

Композиција тела је мерена сваке друге недеље коришћењем ¹Х-НМР спектроскопија (ЕцхоМРИ-100Х; Ецхо Медицал Системс). Потрошња енергије је одређена помоћу прорачуна енергетског биланса (Гуо ет ал., 2009 Равуссин ет ал., 2013):

Потрошња енергије=Унос енергије који се може метаболисати−(Δмаса+Δмаса без масти).

Укључите МатхЈак

Активност на отвореном пољу

Тестови на отвореном пољу су спроведени у ПхеноТипер кавезима (30 × 30 цм; Нолдус ИТ), а софтвер за видео анализу ЕтхоВисион (верзија 11; Нолдус ИТ) је коришћен за праћење мишева током тестирања.

Хоме Цаге Вхеел Руннинг

Трчање точкова је мерено стављањем нископрофилних бежичних точкова за трчање (Мед Ассоциатес) у кућне кавезе мишева на 72 сата сваке 3 недеље (експерименти гојазности изазвани исхраном) или континуирано (иМСН-ДрдКСНУМКС-КО експерименти).

Блоод Меасурес

Крв из очних вена жртвованих животиња коришћена је за анализу серумских метаболита и хормона након 4-часовног гладовања.

Ауторадиографија допаминских рецептора

Десне хемисекције су криосекционисане на нивоу стриата (-0.22, 0.14, 0.62 и 1.18 мм од брегме, покривајући пуну дужину стриатума) на пресеке од 12 мм. Слајдови су одмрзнути и претходно инкубирани у пуферу за испитивање (20 мМ ХЕПЕС, 154 мМ НаЦл и 0.1% говеђег серумског албумина [БСА]; пХ 7.4) током 20 минута на 37°Ц. Везивање Д1Р је процењено инкубацијом плочица у пуферу за испитивање који садржи 1.5 нМ трицијумом обележен СЦХ-23390 (Перкин-Елмер) и 100 нМ кетансерина током 60 минута на 37°Ц. Везивање Д2Р је процењено инкубацијом плочица са 600 пМ трицијумом обележеним спипероном (Перкин-Елмер) и 100 нМ кетансерином током 100 минута на 37°Ц. Након инкубације са одговарајућим радиолигандом, плочице су испране два пута по 10 минута на 4°Ц у пуферу за испирање (10 мМ Трис-ХЦл, 154 мМ НаЦл), а затим потопљене у воду (0°Ц) и остављене да се осуше преко ноћи. Слајдови су затим изложени плочама за сликање фосфора 7 (везивање Д1Р) или 11 дана (везивање Д2Р) и развијене помоћу фосфоимагера (Цицлоне; Перкин-Елмер). За анализу, области од интереса су наведене и анализиране коришћењем софтвера за анализу слике Оптикуант (Перкин-Елмер).

Вестерн блоттинг

Вестерн блотови су инкубирани са мишјим анти-Д2ДР антителом (1:500; Санта Цруз; сц-5303) или мишјим анти-ГАПДХ антителом (1:1,000; Санта Цруз; сц-32233) и након тога са козјим анти-мишјим ИгГ- ХРП (1:1,000; Санта Цруз; сц-2005). Сигнал хемилуминисценције је генерисан коришћењем реагенса за детекцију вестерн блотинга са побољшаном хемилуминисценцијом (Био-Рад) и визуелизован помоћу Цхемидоц Имагинг Систем-а (Био-Рад).

Ин ситу хибридизација

За ин ситу хибридизацију (Адванцед Целл Диагностицс) коришћен је комплет за мултиплексну флуоресцентну анализу РНАсцопе. Укратко, делови фиксирани формалином су дехидрирани у етанолу, након чега је уследило излагање протеази. Секције су затим хибридизоване са РНАсцопе олигонуклеотидним сондама против ДрдКСНУМКС. Након хибридизације сонде, дијапозитиви су инкубирани са појачавачом сигнала према протоколима РНАсцопе. Слајдови су затим испрани пуфером за испирање РНАскоп. Коначно, дијапозитиви су монтирани ДАПИ контрастаином.

Течна хроматографија високих перформанси са електрохемијском детекцијом

Леве хемисекције су обрађене за детекцију ДА коришћењем течне хроматографије високих перформанси реверзне фазе са електрохемијском детекцијом (ХПЛЦ-ЕЦ), као што је претходно описано (Килпатрицк ет ал., 1986).

Имунохистохемија тирозин хидроксилазе

Секције постављене на клизачу су фиксиране у 10% неутралном пуферисаном формалину, испране у 0.1 М ТБС (пХ 7.5) и инкубиране у раствору примарног антитела који садржи 3% нормалног магарећег серума, 0.3% Тритон Кс-100 и зечје антитело против тирозин хидроксилазе (1:1,000; Миллипоре; МАБ152) преко ноћи на 23°Ц. Следећег дана, делови ткива су испрани у ТБС-у и инкубирани у секундарном раствору антитела који садржи 3% нормалног магарећег серума, 0.3% Тритон Кс-100 и козјег анти-зеца коњугованог са Алека Флуор 555 (Миллипоре; АК132Ф). За сваког миша, анализирана су два стријатална пресека, осим за четири миша (два ХФД, два Цхов) где је анализиран само један део због лошег квалитета ткива или слике.

Мицро-ПЕТ

Мишевима је убризгано ¹⁸Ф-фалиприд са специфичном активношћу од 2.5 ± 0.34 мЦи/нмол у запремини од 130 μЛ преко репне вене док је под анестезијом изофлураном. Микро-ПЕТ скенирање је обављено током 2 сата, током којих је добијено 25 оквира за анализу. Криве време-активност за ¹⁸Ф-фалиприд у регионима од интереса (РОИ) екстраховани су коришћењем АФНИ софтвера (https://afni.nimh.nih.gov/afni) и кинетички параметри су прилагођени моделу са четири одељка користећи прилагођену МАТЛАБ скрипту (са малим мозгом коришћеним као референтним ткивом) да би се одредио потенцијал везивања Д2Р (Ламмертсма и Хуме, КСНУМКС).

Ин виво електрофизиологија

Снимци су направљени од низа електрода који садржи 32 волфрамове микро жице обложене тефлоном (пречник 35 мм) имплантиране једнострано у дорзомедијални стриатум (предњи/постериорни [А/П]: +0.8; медијални/латерални [М/Л]: +1.5 дорзално/вентрално [Д/В]: −2.6 мм по брегми), и обрађено комерцијалним софтвером (Оффлине Сортер и Неуроекплорер; Плекон).

Стереотаксична вирусна векторска ињекција

Мишеви су накратко анестезирани излагањем изофлурану. Једном дубоко анестезиран, направљен је један рез дуж средње линије, лобања је откривена и направљена је билатерална краниотомија (А/П: +0.5; М/Л: ±1.5 мм по брегми). Вирусни вектор који садржи инхибиторни КОР-ДРЕАДД (Син-ДИО-хКОРД-ИРЕС-мЦит-ВПРЕ; 0.5 μЛ) је убризган билатерално у дорсомедијални стриатум (Д/В, -2.8 мм од врха лобање) и остављен да се експресира за 9 недеља пре експеримента.

Микродијализа без нето протока и анализа допамина

Мерење базалног екстрацелуларног ДА, ДОПАЦ и ХВА у дорзалном стриатуму мишева изведено је приступом микродијализе без нето флукса. Једностране сонде од 2 мм (прекид мембране од 18 кДа) су стереотаксички имплантиране 1 недељу након имплантације каниле уз континуирану перфузију вештачке цереброспиналне течности (аЦСФ) при 1 μЛ/мин током 4 сата пре узимања узорка (видети Додатне експерименталне процедуре). Експеримент без нето флукса за мерење нивоа екстрацелуларног ДА изведен је насумично перфузијом шест различитих концентрација ДА (0, 2.5, 5, 10, 20 и 40 нМ) у аЦСФ кроз сонду за дијализу. Свака концентрација ДА је перфундирана током 30 минута, а затим су 2 × 10-минутна узорка сакупљена у 2.5 μЛ 100 мМ ХЦл плус 1 мМ ЕДТА да би се спречила деградација катехоламина и замрзнута на -80 ° Ц. За неурохемијске анализе коришћен је изократски ХПЛЦ систем повезан са амперометријском детекцијом (ХПЛЦ-ЕЦ; БАСи ЛЦ-4Ц). У анализу су укључени само мишеви са одговарајућим постављањем сонде (Слика С3Е).

Статистика

Статистичка анализа је извршена коришћењем ГрапхПад Присм (верзија 6.07; ГрапхПад софтвер). Осим ако није наведено, коришћени су двострани Студентови т тестови. Иначе, коришћени су двосмерни упарени т тестови, једносмерни АНОВА са поновљеним мерама или АНОВА са двосмерним поновљеним мерама када је то било прикладно и како је наведено. АНОВА је праћена т тестовима за пост хоц поређења. Резултати су сматрани значајним при алфа од п < 0.05, или са алфа одређеном Бејамини-Хоцхберговом корекцијом стопе лажног открића (ФДР), где је то прикладно.

Аутор прилога

ДМФ, КД, ТЈО, МС, АК, ИПСГРВАА, МР, КДХ и АВК су дизајнирали експерименте. ДМФ, КД, ТЈО, МС и АВК, извели су и анализирали експерименте понашања. ИП је извео Вестерн блоттинг експерименте. ДМФ и АВК су извршили и анализирали ин виво електрофизиолошке податке. ДМФ, Ј.-СЛ, ЈГ и АВК су извели и анализирали микро-ПЕТ експерименте. ДМФ, КД, ТЈО и АВК су написали рукопис. Сви аутори су дискутовали о резултатима и коментарисали рукопис.

priznanja

Овај рад је подржао Програм интрамуралног истраживања НИХ-а, Националног института за дијабетес и болести пробаве и бубрега (НИДДК). Желели бисмо да се захвалимо језгру за метаболизам миша у НИДДК за процену серумских метаболита и хормона, Андресу Буонану уз његову помоћ у дизајнирању експеримената микродијализе допамина и др Јудитх Валтерс, др Кристин Дупре и др Цлаире Делавилле за помоћ у ХПЛЦ-у анализа садржаја ткива допамина. Такође желимо да се захвалимо др Скоту Јангу на коришћењу његове лабораторијске опреме и помоћи у вези са студијама. Хвала и члановима АВК лабораторије, Марку Рајтману и Нику Риби за допринос експерименталном дизајну и пажљивом читању рукописа.

Додатне информације

Документ С1. Допунске експерименталне процедуре и слике С1–С5.

Помоћ са ПДФ датотекама

Опције

Документ С2. Чланак плус додатне информације.

Помоћ са ПДФ датотекама

Опције

Референце

Адамс ет ал., 2015
ВК Адамс, ЈЛ Суссман, С. Каур, АМ Д'соуза, ТЈ Киеффер, ЦА Винстанлеи
Дуготрајно, калоријски ограничено узимање исхране са високим садржајем масти код пацова смањује контролу импулса и сигнализацију вентралног стријаталног Д2 рецептора - два маркера рањивости на зависност
ЕУР. Ј. Неуросци., КСНУМКС (КСНУМКС), стр. КСНУМКС – КСНУМКС
ЦроссРеф

Брзи линкови