Рецептори допамина ДКСНУМКС-а у дисфункцији награђивања зависности и компулзивном једењу код гојазних пацова (КСНУМКС)

Коментар: Ова студија показује да када се животињи омогући неограничен приступ, снажни природни појачивач (веома подстицајна храна) може проузроковати пад Д2 рецептора. Овај пад примећен је код скоро свих пацова и догодио се прилично брзо. Када је уклоњена „изузетно укусна“ храна, пацови су одбили да једу уобичајени чау. Пацови су наставили да се опијају (кад су могли) упркос удруживању електричних удара са „изузетно укусном“ конзумацијом хране.

• Фулл Студи

Нат Неуросци. КСНУМКС Маи; 13(5): КСНУМКС-КСНУМКС. Објављено на мрежи КСНУМКС Марцх КСНУМКС. дои:  КСНУМКС / нн.КСНУМКС

Апстрактан

Открили смо да је развој гојазности повезан са појавом прогресивно погоршаног дефицита у одговорима за неуралну награду. Сличне промене у хомеостази награђивања изазване кокаином или хероином сматрају се кључним за покретање прелаза из узимања у опште узимање дроге. Сходно томе, открили смо компулзивно храњење код гојазних, али не и мршавих пацова, мерено као укусна потрошња хране која је била отпорна на поремећај аверзивним условљеним стимулусом. Стриатални рецептори допамин ДКСНУМКС (ДКСНУМКСРс) су смањени код претилих пацова, као што је пријављено код људи зависних од дроге. Штавише, лентивирусом посредовано нокаутирање стриаталних ДКСНУМКСР-ова убрзано је убрзало развој дефицита овисности као што су награђивање и почетак компулзивне исхране у штакора са проширеним приступом укусној храни високе масноће. Ови подаци показују да претјерана конзумација укусне хране изазива неуроадаптивне одговоре зависности у круговима награђивања мозга и покреће развој компулзивне исхране. Заједнички хедонистички механизми могу стога бити основа гојазности и овисности о дрогама.

увод

На храњење утичу задовољство и награда, а добијање награде за храну може снажно мотивисати потрошњу1, 2. Ипак, хедонски механизми који доприносе гојазности и даље су слабо разумљиви. У хиперфагичних људи са урођеним недостатком лептина, активност у леђном и трбушном стриатуму, који су кључне компоненте кругова награђивања мозга, знатно се повећава као одговор на слике хране3, а терапија заменом лептина умањује активност стријата и 'наклоност' храни коју пријављују сами3. . То сугерише да је стриатум важан у хедонистичким аспектима понашања храњења. Недавно је показано да је активирање стриатума као одговор на укусну храну отупљено код гојазних особа у поређењу са витким контролама4. Штавише, хипофункција дорзалног стриатума и дугорочно дебљање најизраженији су код особа са ТакИА алелом локуса гена ДРД2 – АНКК1, што резултира смањеном експресијом стријаталног Д2Р и показало се да предиспонира појединце на поремећаје зависности од супстанци4, 5 Ова и слична запажања довела су до претпоставке да дефицит у обради награда може бити важан фактор ризика за развој гојазности и да гојазни појединци могу принудно да једу укусну храну како би надокнадили хипосензибилност награда6. Посебно је нејасно да ли су дефицити у обради награда конститутивни и претходе гојазности или да ли прекомерна конзумација укусне хране може довести до дисфункције награђивања и тиме допринети гојазности изазваној исхраном.

Карактеристика претежих и гојазних особа је да се и даље преједају, упркос добро познатим негативним здравственим и социјалним посљедицама. Заиста, многи људи са прекомерном тежином изражавају жељу да ограниче своју потрошњу хране, а ипак се боре да контролишу свој унос и опетовано троше преко својих енергетских потреба. Развој понашања храњења које је неосјетљиво на негативни исход аналогно је компулзивном понашању узимања дроге које се види код људи зависника од дроге, што је исто тако непроходно за негативне посљедицеКСНУМКС. Овдје смо истражили ефекте проширеног приступа на укусну дијету с високим удјелом масти на осјетљивост система награђивања мозга код штакора. Такође смо испитали везу између хедонистичке дисрегулације изазване исхраном и појаве компулзивног тражења хране. Коначно, истражили смо улогу стриаталних ДКСНУМКСР у тим реакцијама налик овисности.

Дефицити награђивања зависности код гојазних пацова

Да бисмо тестирали ефекте ограниченог или продуженог приступа укусној исхрани са високим уделом масти, припремили смо мужјаке пацова Вистар (300-350 г) са биполарном стимулативном електродом у бочном хипоталамусу и обучавали их 10–14 дана у дискретном суђењу поступак наградне стимулације мозга са тренутним прагом (БСР) све док се не успоставе стабилни прагови награде4. У поступку БСР, пацови енергично реагују како би добили наградну електричну самостимулацију кроз станујућу стимулишућу електроду, са минималним интензитетом стимулације који одржава понашање самостимулације назван праг награде10. Будући да прагови награђивања остају стабилни и непромењени током дужег времена у основним условима, овај поступак пружа осетљиву меру одзивности система награђивања мозга. Након успостављања стабилних БСР прагова (дефинисаних као <10% варијација у праговима током три узастопне сесије), доделили смо пацове у три групе које нису показале разлике у средњој телесној тежини или праговима награде међу групама. Три групе су добиле диференцијални приступ исхрани у „кафетеријском стилу“ која се састоји од укусне енергетски густе хране лако доступне за људску употребу (види Интернет методе). Пацови су имали 0 х (пацови само са цхов-ом; н = 9), 1 х (пацови са ограниченим приступом; н = 11) или 18–23 х (пацови са продуженим приступом; н = 11) дневно 40 дана узастопно. Познато је да исхрана у кафетеријама доводи до гојазности изазване храном код пацова11. Сви пацови су такође имали ад либитум приступ стандардном лабораторијском чау, са праговима награђивања, повећањем телесне тежине и уносом калорија.

Тежина се значајно повећала код пацова са проширеним приступом исхрани у кафетерији у поређењу са групама које су добиле само храну или са ограниченим приступом (Слика КСНУМКСа). Тежина је такође имала тенденцију повећања код штакора са ограниченим приступом у поређењу са пацовима који су имали само храну, али овај ефекат није достигао статистичку значајност. Развој гојазности код штакора са проширеним приступом био је уско повезан са погоршањем дефицита у функцији награђивања мозга, што се огледало у прогресивно повишеним праговима БСР (Слика КСНУМКСб). Будући да нису уочене разлике у латенцијама одговора за БСР међу три групе (допунска слика КСНУМКС), дефицити у понашању не могу узети у обзир ово запажање. Слични дефицити у функцији награђивања мозга забележени су код пацова са продуженим али не и ограниченим приступом интравенозном кокаину или хероину само-администрацијеКСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС. Према томе, проширени приступ укусној храни са високим удјелом масти може изазвати дефиците овисности попут функције награђивања мозга, што се сматра важним извором мотивације који може покренути преједање и допринијети развоју претилости КСНУМКС, КСНУМКС.

Слика КСНУМКС: Повећање тежине и дисфункција награђивања код пацова са проширеним приступом исхрани кафетерије.

(а) Средњи (± сем) пораст телесне тежине код пацова само са цхов-ом, ограниченим приступом и продуженим приступом (приступ × дневна интеракција: Ф39,702 = 7.9, П <0.0001; * П <0.05 у поређењу са групом само са цхов-ом, пост хоц тест). (б) Просечна (± сем) процентна промена у односу на основни праг награде (приступ × временска интеракција: Ф78,1092 = 1.7, П <0.0005; * П <0.05 у поређењу са групом само за цхов, пост хоц тест).

Када смо детаљно испитали понашање у исхрани (Слика КСНУМКС), открили смо да је укупан дневни унос калорија био сличан између штакора само са чау и ограниченим приступом (Слика КСНУМКСа, д). Насупрот томе, укупни унос калорија код пацова са проширеним приступом био је скоро двоструко већи од оног код пацова са ограниченим приступом и само за храну (Слика КСНУМКСа, д). Иако су пацови са ограниченим приступом и само цхов-ом одржавали приближно исти дневни унос калорија (Слика КСНУМКСа, д), штакори са ограниченим приступом добили су само ~ КСНУМКС% својих дневних калорија из хране (слика КСНУМКСб, д), што указује да развили су понашање код преједања и конзумирали ~ КСНУМКС% њиховог дневног уноса калорија током КСНУМКС х приступне сесије у кафетерију диетКСНУМКС (Слика КСНУМКСд). Код штакора са продуженим приступом добије се само мали део (~ КСНУМКС%) њиховог укупног уноса калорија из хране (слика КСНУМКСб); конзумирали су храну у кафетерији готово искључиво (сл. КСНУМКСд). Промена у прехрамбеним преференцијама у групама са ограниченим и проширеним приступом такође се одразила на значајно повећање уноса масти у поређењу са пацовима који су имали само храну (Слика КСНУМКСц и Допунска слика КСНУМКС). У складу са претходним извештајимаКСНУМКС, постојала је тенденција да се исхрана у кафетерији временом смањује код штакора са продуженим приступом. Ово може одражавати развој толеранције на укус прехрамбених производа који се дају као дио исхране кафетерије током времена. Ипак, склоност ка исхрани кафетерија у односу на стандардну храну остала је конзистентно висока код ових пацова (допунска слика КСНУМКС). Ови подаци показују да проширени, али не и ограничени приступ укусној исхрани са високим садржајем масти изазива зависност као наградни дефицит, преједање и губитак хомеостатског енергетског биланса. Насупрот томе, ограничен приступ укусној храни доводи до преједања као код потрошње, али не ремети хомеостатски енергетски биланс нити функцију награђивања мозга. Међутим, могуће је да ограничени приступ исхрани у кафетерији за више од КСНУМКС узастопних дана изазове значајно повећање тежине и поремећај функције награђивања мозга.

Слика КСНУМКС: Узорци потрошње код пацова са проширеним приступом исхрани у кафетерији.

(а) Средњи (± сем) дневни унос калорија код пацова само са цхов-ом, ограниченим приступом и продуженим приступом (приступ: Ф1,324 = 100.6, П <0.0001; време: Ф18,324 = 7.8, П <0.0001; приступ × временска интеракција: Ф18,324 = 4.6, П <0.0001; * П <0.05 у поређењу са групом само са цхов-ом, пост хоц тест). (б) Средњи дневни унос калорија (± сем) од чау (приступ: Ф2,504 = 349.1, П <0.0001; време: Ф18,504 = 5.9, П <0.0001; приступ × време интеракције: Ф36,504 = 3.52, П <0.0001; * П <0.05 у поређењу са групом само са цхов-ом, пост хоц тест). (ц) Средњи дневни унос калорија (± сем) масти (приступ: Ф2,486 = 118.7, П <0.0001; време: Ф18,486 = 8.8, П <0.0001; приступ × време интеракције: Ф36,486 = 6.2, П <0.0001; * П <0.05 у поређењу са групом само са цхов-ом, пост хоц тест). (д) Поређење средњег (± сем) укупног калоријског уноса и калорија које се конзумирају искључиво од чаја током целог 40-дневног периода приступа (приступ: Ф2,54 = 25.0, П <0.0001; извор калорија: Ф2,54 = 1235.2, П <0.0001; приступ × интеракција извора калорија: Ф2,54 = 485.7, П <0.0001; *** П <0.001 у поређењу са укупним калоријама у групи само са чавом, ### П <0.001 у поређењу са укупним калоријама у иста група пацова, пост хоц тест).

После 40 дана, пацовима више није био дозвољен приступ укусној исхрани, али су и даље имали ад либитум приступ стандардном лабораторијском чау. Процењивали смо прагове награда и потрошњу чаја свакодневно током овог периода принудне апстиненције. Повишење прагова награде задржало се најмање 2 недеље код пацова са продуженим приступом када више нису имали приступ укусној исхрани (слика 3а). Ово је у супротности са релативно пролазним (~ 48 х) дефицитом функције награђивања забележеним код пацова који су апстинирали од самоконтролисаног кокаина13. Такође је забележен значајан пад уноса калорија (слика 3б) и постепено смањење телесне тежине (слика 3ц) код пацова са продуженим приступом, а у мањој мери код пацова са ограниченим приступом, током овог апстиненцијског периода, у складу са претходни извештаји11, 15. После 14 дана апстиненције, пацови су убијани и постављање електрода одређивано је бојењем крезил љубичастом бојом (слика 3д).

Слика КСНУМКС: Упорна дисфункција награђивања и хипофагија током апстиненције код пацова са проширеним приступом исхрани у кафетерији.

(а) Просечна процентуална промена у односу на основни праг награде (± сем) током апстиненције од укусне дијете са високим уделом масти (приступ: Ф2,112 = 3.7, П <0.05; време: Ф4,112 = 2.3, П> 0.05; * П <0.05 у поређењу са групом само за цхов, пост хоц тест). (б) Средњи унос калорија (± сем) последњег дана приступа исхрани са високим уделом масти (основно стање) и током 14 дана апстиненције када је био доступан само стандардни чау (приступ: Ф2,168 = 41.7, П <0.0001 ; време: Ф6,168 = 65.6, П <0.0001; приступ × време интеракције: Ф12,168 = 38.3, П <0.0001; * П <0.05 у поређењу са групом само за цхов, пост хоц тест). (ц) Промена средње телесне тежине (± сем) у поређењу са телесном тежином последњег дана приступа исхрани са високим уделом масти (основно стање) и током 14 дана апстиненције када је био доступан само стандардни чау (приступ: Ф1,126 = 37.2, П <0.0001; време: Ф7,126 = 3.1, П <0.01; приступ × време интеракције: Ф7,126 = 40.9, П <0.0001; * П <0.05 у поређењу са групом само за цхов, пост хоц тест). (д) Хистолошка реконструкција локације БСР стимулирајућих електрода у бочном хипоталамусу само паприкаша (троуглови), пацова с ограниченим приступом (квадратићи) и продуженог приступа (кругови).

Стриатал ДКСНУМКСРс код гојазних пацова: улога у дефициту награђивања

Следеће смо тестирали хипотезу да прекомерна конзумација укусне кафетерије може смањити густину стриаталног Д2Р, доприносећи развоју хипосензибилности награде налик зависности. Новој кохорти пацова само са цхов-ом, ограниченим приступом и продуженим приступом био је дозвољен приступ исхрани у кафетерији све док није дошло до статистички значајног повећања телесне тежине код пацова са продуженим приступом у поређењу са групом која је имала само цхов (П <0.05 ; Слика 4а). Стријатална експресија, наводно, јако гликозилираног (~ 70 кДа) облика Д2Р везаног за мембрану, била је нижа код пацова са продуженим приступом него код пацова са ограниченим приступом или само са цхов-ом (слика 4б; видети Интернет методе). Када смо пацове у свакој приступној групи поделили у две подгрупе на основу средњег дела телесних тежина (лаких или тешких), открили смо јасну обрнуту везу између телесне тежине и стријаталне експресије Д2Р (слика 4а, ц). Нисмо открили статистички значајно смањење експресије негликозилираних незрелих (~ 39 кДа) и интермедијарно гликозилираних цитоплазматских (~ 51 кДа) облика Д2Р (допунска слика 4) 17, што указује да је стриатална експресија Д2Р код пацова са продуженим приступом вероватно регулисани пост-транскрипционим механизмима.

Слика КСНУМКС: Повећање тежине је обрнуто повезано са стриалним нивоима ДКСНУМКСР.

(а) Пацови само са Цхов-ом, са ограниченим приступом и са продуженим приступом подељени су у две групе према условима приступа на основу средњег подела телесне тежине: лагане (Л) или тешке (Х). (б) Читав стриатални комплекс прикупљен је од свих пацова и нивоа Д2Р у свакој групи мерено Вестерн блот-ом. Д2Р опсег повезан са мембраном раздвојен је на 70 кДа, а контрола оптерећења протеинима приказана је испод (β-актин, 43 кДа). Имуноблоти пуне дужине приказани су на допунској слици 12. (ц) Релативне количине Д2Р у стриатуму пацова само са цхов-ом, ограниченим приступом и продуженим приступом квантификоване су дензитометријом (Ф2,6 = 5.2, П <0.05, главна ефекат приступа; * П <0.05 и ** П <0.01 у поређењу са групом само са цхов-Л).

Затим, да бисмо тестирали функционалну релевантност смањења стриатне ДКСНУМКСР у функцији награђивања мозга изазване дијетом, дизајнирали смо и валидирали лентивирусни вектор како бисмо испоручили кратку укосницу која омета РНК (схРНА) да би срушили ДКСНУМКСР (Ленти-ДКСНУМКСРсх; КСНУМКС и Допунска слика КСНУМКС). Прагови награде су почели да се повећавају код пацова који су третирани са Ленти-ДКСНУМКСРсх скоро одмах након што им је одобрен проширени приступ исхрани у кафетерији, док су прагови награда остали непромењени у штакорима са продуженим приступом који су третирани празним лентивирусним вектором (Ленти-контрола) током релативно кратког периода приступ исхрани у кафетерији (КСНУМКС д; Сл. КСНУМКСа). Латенције реакција су биле непромењене у обе групе пацова, што је показало да овај ефекат није секундаран у погледу дефицита у перформансама задатка (додатна слика, КСНУМКС). Прагови награде су такође били непромењени код пацова третираних са Ленти-ДКСНУМКСРсх или Ленти-контролом који су имали приступ храни само током истог периода (Слика КСНУМКСб).

Прагови су остали стално повишени током додатне КСНУМКС д апстиненције када су сви пацови имали приступ само стандардној храни (допунска слика КСНУМКС). Уклањање стриаталне ДКСНУМКСР стога је повећало рањивост на хипофункцију награђивања узроковану дијетом, али није промијенило основну активност система награђивања мозга.

Слика КСНУМКС: Лентивирус-посредована нокдаја стриаталне експресије ДКСНУМКСР.

(а) Графички приказ стриаталних подручја у којима је Ленти-Д2Рсх био превише изражен. Зелени кругови у левој стриаталној хемисфери представљају места на којима су циљане вирусне инфузије. Зелено бојење у десној стријаталној хемисфери је репрезентативно имунохемијско бојење за зелени флуоресцентни протеин (ГФП) из мозга пацова Ленти-Д2Рсх. (б) Репрезентативни имуноблот смањене експресије Д2Р у стриатуму пацова Ленти-Д2Рсх. Имуноблоти пуне дужине приказани су на допунској слици 13. (ц) Релативне количине Д2Р у стриатуму Ленти-цонтрол и Ленти-Д2Рсх пацова, квантификоване дензитометријом (* П <0.05 у поређењу са Ленти-контролном групом, пост хоц тест ). (д) Инфекција глија ћелија у стриатуму вектором Ленти-Д2Рсх није откривена. Зелено бојење је ГФП од вируса; црвена је астроцитни маркер глијалних фибриларних киселих протеина (ГФАП); ћелијска језгра су истакнута ДАПИ бојењем у плаво. Беле стрелице означавају локализовано подручје глиозе пронађено само на месту убризгавања вируса у стриатуму, а не у околним ткивима у која се вирус дифузио. Чак и на овом подручју, ниједан астроцит није позитиван на ГФП. Жуте стрелице на увећаној слици истичу типичне ГФП-негативне астроците који су откривени. (е) Висок ниво неуронске инфекције у стриатуму од вектора Ленти-Д2Рсх. Зелено бојење је ГФП од вируса; црвена је неуронски нуклеарни маркер НеуН; ћелијска језгра су истакнута ДАПИ бојењем у плаво. Жуте стрелице на увећаној слици истичу ГФП-позитивне и НеуН-позитивне неуроне у стриатуму. (ф) Слика већег увећања вирусно инфицираног (ГФП-позитивног) неурона у стриатуму пацова Ленти-Д2Рсх која показује типичне морфолошке особине средње бодљикавих неурона.

Слика КСНУМКС: Кноцкдовн стриатал ДКСНУМКСР повећава рањивост за награђивање дисфункције код пацова са проширеним приступом исхрани кафетерије.

(а) Просечна (± сем) процентна промена у односу на основни праг награде код пацова Ленти-цонтрол и Ленти-Д2Рсх који су продужили приступ исхрани у кафетерији током 14 узастопних дана (вирус: Ф1,156 = 5.9, П <0.05; време: Ф13,156 = 2.2, П <0.05; интеракција вирус × време: Ф13,156 = 2.2, П <0.05; #П <0.05, ефекат интеракције). (б) Просечна (± сем) процентна промена у односу на основни праг награде код пацова Ленти-цонтрол и Ленти-Д2Рсх који су имали приступ само са чавом. (ц) Средњи (± сем) калоријски унос пацова током 14 дана само чау или продуженог приступа (приступ: Ф2,28 = 135.6, *** П <0.0001). (д) Средњи (± сем) пораст телесне тежине током 14 дана само чаја или продуженог приступа (приступ: Ф2,28 = 96.4, П <0.0001; *** П <0.001, главни ефекат приступа).

Открили смо да су унос калорија (сл. КСНУМКСц) и добитак тежине (сл. КСНУМКСд) слични у Ленти-ДКСНУМКСРсх и одговарајућим Ленти-контролним групама под условима за само чау или проширени приступ (додатне слике КСНУМКС и КСНУМКС). Према томе, стриатална ДКСНУМКСР нокаута није промијенила ни преференцију за дијететску исхрану нити укупни унос калорија када је укусна храна била слободно доступна за конзумирање.

Компулзивна исхрана код гојазних пацова: улога стриаталне ДКСНУМКСР

Следеће смо тестирали хипотезу да се компулзивно једење може појавити код пацова са проширеним приступом исхрани у кафетерији и да би недостаци у стриаталној Д2Р сигнализацији могли да допринесу овом ефекту. Новој скупини пацова само са цхов-ом, ограниченим приступом и продуженим приступом дозвољен је приступ исхрани у кафетерији> 40 дана све док се код продужених пацова није десио статистички значајан пораст тежине (П <0.05 у поређењу са пацовима само са цхов-ом; подаци нису показано). Свим трима групама пацова тада је било дозвољено само 30 минута дневног приступа исхрани у кафетерији током 5-7 дана у оперантној комори док се није постигао стабилан унос (дефинисано као <10% варијација дневног уноса). Половина пацова у сваком од услова приступа била је изложена светлости (условљени стимулус) упарен са испоруком удараца стопалима (кажњена група), док су преостали пацови у свакој групи били изложени сигналној лампици у одсуству шока стопалима (некажњена група ). На дан испитивања, испитали смо ефекте изложености светлосном сигналу само на укусну потрошњу хране (слика 7; видети Интернет методе). Открили смо да је средњи унос калорија током 30-минутних почетних сесија био већи код пацова који су имали само чав и ограничен приступ него код пацова са продуженим приступом (слика 7а, б). То сугерише да су се пацови само са цхов-ом и ограниченим приступом опирали на укусну храну током испрекиданих 30-минутних сесија приступа, што се огледа у чињеници да су ти пацови конзумирали ~ 40-50% дневног уноса калорија, обично ~ 100 кЦал, током ових сесија (слика 7а, б). Супротно томе, пацови са продуженим приступом изгледају отпорни на развијање овог понашања храњења налик на преједање, можда зато што је њихова историја готово неограниченог приступа укусној храни током> 40 узастопних дана утврдила обрасце исхране који су били релативно нефлексибилни за промену. На дан испитивања, нисмо приметили статистички значајне ефекте поновног приказивања сигналне реплике на потрошњу хране код некажњених пацова из група које су имале само цхов, ограничени приступ или продужени приступ у поређењу са уносом током основног периода (слика 7а). Стога само светло сигнала није имало мотивацијску истакнутост. Код кажњених пацова, светло удараца упареним шоком значајно је смањило укусан унос хране код пацова само са чавом и ограниченим приступом. Међутим, светло светло није имало утицаја на укусан унос хране код пацова са продуженим приступом, показујући да је њихова конзумација била неосетљива на аверзивне еколошке знаке који предвиђају невоље. Почетни унос енергије код пацова са продуженим приступом био је нижи од уноса у осталим групама. Међутим, пошто је унос цхов-а током сличних временских периода био далеко нижи (слика 7д), мало је вероватно да ово представља „ефекат пода“ који збуњује наша открића. Заједно, наши подаци подржавају идеју да се компулзивно понашање у исхрани може појавити код пацова са продуженим приступом на начин аналоган компулзивном узимању кокаина виђеном код пацова са историјом продуженог приступа леку18.

Слика КСНУМКС: Компулзивна реакција за укусну храну.

(а) Средња (± сем) укусна исхрана код некажњених пацова током 30-минутних почетних сесија и на тест дану када су пацови били изложени неутралном условљеном стимулусу који претходно није био упарен са штетним шоком стопала (приступ: Ф2,20 = 5.2, П <0.05; #П <0.05 у поређењу са пацовима само са цхов-ом). (б) Средња (± сем) укусна исхрана код кажњених пацова током 30-минутних почетних сесија и на тест дан када су пацови били изложени условљеном стимулусу који је претходно био упарен са штетним шоком стопала (приступ: Ф2,21 = 3.9 , П <0.05; знак: Ф1,21 = 8.6, П <0.01; интеракција приступ × знаку: Ф2,21 = 4.7, П <0.05; * П <0.05 у поређењу са уносом током основне сесије, #П <0.05 у поређењу са пацови само са чау). (ц) Средња (± сем) укусна конзумација дијете током 30-минутних основних сесија и на дан теста код пацова Ленти-цонтрол и Ленти-Д2Рсх који су претходно имали само цхов или продужени приступ исхрани у кафетерији (знак: Ф1,26, 29.7 = 0.0001, П <0.05; * П <0.01, ** П <30 у поређењу са уносом током почетних сесија, пост хоц тест). (д) Средња (± сем) потрошња чау током 2-минутних почетних сесија и на дан теста код пацова Ленти-цонтрол и Ленти-Д1,26Рсх који су претходно имали само цхов или продужени приступ исхрани у кафетерији (знак: Ф44.9 = 0.0001, П <0.05; * П <0.01, ** П <XNUMX у поређењу са уносом током почетних сесија, пост хоц тест).

На крају, испитали смо ефекте условљеног стимулуса упареног кажњавањем на унос хране код пацова Ленти-цонтрол и Ленти-Д2Рсх који су раније имали приступ само цхов-у или проширеном приступу исхрани у кафетерији (пацови са слике 6). Открили смо да је основни укусни унос хране током 30-минутних почетних сесија био слично висок (~ 40 кЦал) у све четири групе (слика 7ц). Поред тога, укупна дневна потрошња чаја (у кућном кавезу) била је слична између све четири групе пацова током кондиционих сесија и на дан теста (допунска слика 10). 14 дана претходног приступа исхрани у кафетерији, према томе, није било довољно за блокирање прехрамбеног понашања налик на преједање на начин сличан ономе који се приметио код пацова који су имали> 40 д продуженог приступа исхрани у кафетерији (слика 7а, б). Аверзивни светлобни стимулус пореметио је укусан унос хране код пацова Ленти-цонтрол и Ленти-Д2Рсх који су претходно имали приступ само за чав (слика 7ц). Слично томе, аверзивни условљени стимулус пореметио је укусан унос хране код пацова са Ленти контролом који су претходно имали 14 дана продужени приступ исхрани у кафетерији. Супротно томе, аверзивни условљени стимулус није имао утицаја на укусну потрошњу хране код пацова Ленти-Д2Рсх који су претходно имали 14 дана продужени приступ исхрани у кафетерији (слика 7ц). Прагови БСР-а остали су значајно повишени код ових пацова када су забележени 48 сати након сесије испитивања, док су прагови остали стабилни и непромењени у остале три групе пацова

(Допунска слика КСНУМКС). Да би се потврдило да отпорност на условљено потискивање подстакнуте конзумације укусне хране у Ленти-ДКСНУМКСРсх штакорима са продуженим приступом није била секундарна у односу на оштећења у класичним процесима условљавања, тестирали смо ефекте аверзивног условљеног стимуланса на потрошњу мање укусне стандардне хране у све четири групе пацова. За разлику од конзумирања укусне хране, открили смо да су све четири групе пацова конзумирале малу храну (~ КСНУМКС кЦал) током КСНУМКС мин сесије (Слика КСНУМКСд) и да је унос хране био поремећен у све четири групе сличне величине након излагања аверзивно увјетованом стимулусу (Слика КСНУМКСд). Ови подаци показују да је нокаутирање стриаталних ДКСНУМКСР-ова значајно убрзало појаву компулзивне исхране укусне хране, али само код пацова са историјом проширеног приступа. Штавише, пошто је компулзивно једење откривено само код Ленти-ДКСНУМКСРсх пацова који су имали повишене прагове БСР-а, хипофункција награђивања која је изазвана исхраном може бити неопходан претходник настанка компулзивног тражења хране.

Дискусија

Лакоћа приступа укусној храни са високим садржајем масти сматра се важним фактором ризика по животну средину за претилост КСНУМКС. Открили смо да је проширени приступ веома укусној исхрани у стилу кафетерије резултирао преједањем и повећањем тежине у комбинацији са прогресивно подизањем прагова БСР код пацова. Овај ефекат на прагови БСР-а може се објаснити постепеним смањењем одзивности кругова награђивања мозга, што је у складу са чињеницом да ограничење хране и губитак тежине могу да повећају НУМКС, док акутно претерано храњење може пролазно смањити НУМКС, одговарајући за БСР код пацова. Овај налаз представља продужетак рада који показује да акутно прекомерно храњење пацова кроз интрагастрично храњење тубеКСНУМКС, и желудачна дистанца или интравенозна инфузија глукагона која опонаша постпрандијални сатиетиКСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС, смањује реаговање на награђивање латералне хипоталамичке БСР и повећава реакције сличне аверзији стимулатионКСНУМКС. Претходни рад је такође показао да узастопно принудно храњење пацова кроз интрагастричне епрувете док се њихова тежина не повећа за КСНУМКС г слично смањује стопе одговора за БСР, ефекат који траје док се телесна тежина не нормализује. Као и код ових налаза код пацова, реаговање код мачака за латерални хипоталамички БСР било је инхибирано претходним храњењем са сатацијомКСНУМКС, показујући да су интеракције између функције награђивања мозга и метаболичког стања конзервиране и да се тако могу јавити и код људи. Једноставност приступа и посљедично преједање прехране у стилу кафетерије код људи се сматра важним доприносом животној средини за тренутну епидемију гојазности у западним друштвимаКСНУМКС. Наши подаци показују да се хипофункција награђивања јавља код штакора који волонтирају прекомерно укусну храну кафетерија сличну оној коју конзумирају људи и да тај ефекат постаје прогресивно гори када добију већу тежину. Значајно, сви пацови са повишењем прага за награђивање ≥КСНУМКС% имали су БСР електроде лоциране унутар ~ КСНУМКС μм форникса дорсолатерално. Осетљивост неурона везаних за награду у овој области повећава се ограничењем хране на начин који је осетљив на хормон лептин из масти, а ово подручје мозга се сматра важним супстратом за награђивање хране. Мрежни кругови који регулишу хедонику хране су стога инхибирани постингестивним сигналима који предвиђају засићеност, у складу са недавним хуманим сликарским студијама које показују да желучани дистензиони КСНУМКС и постпрандијални пептид ИИКСНУМКС-КСНУМКС (ПИИ) КСНУМКС модулирају активност региона мозга укључени у процес награђивања. Поред тога, системи награђивања су такође инхибирани претјераним добивањем на тежини. Недавни извјештаји показују да циркулирајући лептин, кључни регулатор енергетске равнотеже, може продријети у ткива мозга и инхибирати активност кругова награђивањаКСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС.

Дефицити награде код пацова са прекомерном тежином могу да одражавају протуприлагодљиво смањење почетне осетљивости кругова награђивања мозга како би се супротставили њиховом прекомерном стимулисању укусном храном. Таква хипофункција награђивана дијетом може допринети развоју гојазности повећањем мотивације за конзумирање „обесогених“ дијета са високим наградама како би се избегло или ублажило ово стање негативне награде6, 32. То би могло објаснити хипофагију коју смо приметили у продуженом приступу пацови и у мањем степену код пацова ограниченог приступа када је укусна храна повучена и када је била доступна само она мање укусна чау. Такав сценарио је такође у складу са подацима студија о сликању људског мозга у којима је отупљена активација стриатума као одговор на изузетно укусну храну, посебно код особа са генетским полиморфизмима за које се сматра да смањују експресију стријаталног Д2Р, повезана са дуготрајним повећањем телесне тежине4. Није јасно да ли се таква хипосензибилност награђивања код гојазних особа манифестује пре развоја гојазности и да ли је повезана искључиво са генетским факторима („синдром недостатка награде“) или да ли преједање може проузроковати поремећај у обради награда. Наши подаци показују да продужени приступ укусној високоенергетској храни и накнадно преједање туповима награђују осетљивост и стога могу представљати важан хедонски механизам који промовише развој гојазности. Дисфункција награђивања слична оној која је овде пријављена код гојазних пацова такође се открива код пацова са историјатом проширеног приступа интравенском самоконтроли кокаина или хероина, али не и код оних који имају историју ограниченог приступа12, 13, 14. Штавише, прелазак са случајно до компулзивног тражења дроге резултат је покушаја ублажавања упорног стања умањене награде изазване овом дисфункцијом награде изазване лековима12, 32, 33. Дакле, наши подаци указују да гојазност и зависност од дрога могу делити основне хедонске механизме.

Смањење експресије стрикалне ДКСНУМКСР је значајан неуроадаптивни одговор на претјерану конзумацију укусне хране. Доиста, смањење густине стрикуларне ДКСНУМКСР се види код појединаца са прекомерном тежиномКСНУМКС, КСНУМКС и глодавацаКСНУМКС, КСНУМКС. Насупрот томе, појединци са анорексијом имају повишен стрикални ДКСНУМКСРКСНУМКС, а губитак тежине код гојазних појединаца након бариатричне (желучане премоснице) операције је повезан са повишеном густином стрикса ДКСНУМКСРКСНУМКС. Полиморфизам гена који се назива ТакИА АКСНУМКС алел доводи до смањења густине стриксалне ДКСНУМКСР, а појединци који носе овај алел су превише заступљени у гојазним популацијамаКСНУМКС. ТакИА алел такође повећава осетљивост на алкохол, опиоидне и психомоторне стимулансе. Смањење густине стрикатне ДКСНУМКСР, која се јавља или путем конститутивних генетских фактора или као последица преједања, може допринети неуробиолошким механизмима гојазности. Открили смо да су стриатални нивои КСНУМКС кДа ДКСНУМКСР изоформе, за које се сматра да одражавају мембрански повезани ДКСНУМКСР, били обрнуто повезани са телесном тежином код пацова из група само за храну, ограниченог приступа и проширеног приступа (Слика КСНУМКС). Укидање стриаталне експресије ДКСНУМКСР, најуочљивије у дорзолатералној стриатуму (сл. КСНУМКС), проузроковало је повећање прага БСР-а готово одмах по излагању прехрани кафетерије. Смањење стриаталне експресије ДКСНУМКСР стога убрзано убрзава појаву награђене хипофункције код пацова са проширеним приступом врло укусној храни, што је у складу са подацима о људском мозгу који указују на то да дефицити у стриатној густини ДКСНУМКСР доприносе награђивању хипофункције код гојазних појединацаКСНУМКС.

Три карактеристике Ленти-ДКСНУМКСРсх пацова су такође вредне пажње. Прво, иако је стрикатна ДКСНУМКСР комбинација са проширеним приступом на укусну исхрану резултирала повећањем БСР прагова, није било разлика у уносу калорија или повећању тежине код ових пацова у поређењу са контролним пацовима. То би могло одражавати чињеницу да су пацови имали само КСНУМКС д приступа исхрани у кафетерији; дужи период приступа могао је резултирати већим повећањем тежине током времена, слично као и већа осетљивост на повећање телесне тежине која се види код људи са дефицитом у стриатном сигналу ДКСНУМКСРКСНУМКС. Међутим, предност ограничавања приступа исхрани кафетерије само на КСНУМКС д је да су нокаутни пацови са проширеним приступом били једина група која је показивала повишене граничне вредности БСР-а, што нам је омогућило да проценимо потенцијалну улогу хипофункције награђивања у развоју компулзивне функције. јести (види испод). Друго, БСР прагови су остали стабилни и непромењени у нокаутираним пацовима који су имали приступ само храни. Ово указује да смањена експресија стрикалног ДКСНУМКСР сама није била довољна да изазове награђивану хипосензитивност; умјесто тога, чинило се да је у интеракцији с прекомјерном потрошњом укусне хране како би се убрзао настанак овог стања смањене осјетљивости на награду. Други адаптивни одговори у круговима награђивања мозга могу стога изазвати хипосензитивност награђивања код штакора са проширеним приступом исхрани кафетерије. Имајући то на уму, напомињемо да агонист ДКСНУМКСР бромокриптин смањује нивое лептина у циркулацији, а лептин инхибира храњење бар делимично инхибирањем стриаталних региона који контролишу хедонске одговоре на хрануКСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС. Према томе, могуће је да снижавање стриаталне ДКСНУМКСР као одговор на повећање телесне тежине повећава сигнализацију лептина и на тај начин повећава инхибиторне ефекте овог адипокина на системе награђивања мозга. Коначно, напомињемо да смо циљали наше лентивирусне векторе према дорзолатералној стриатуму. Ово је било првенствено из техничких разлога, јер је латерално постављање канила за унос вируса у стриатум омогућило и да се смјести стална електрода за стимулацију хипоталамуса за одређивање БСР прага. Према томе, могуће је да циљање ДКСНУМКСР-а за нокаутирање у другим подручјима стриатума, посебно дорсомедијалних и вентралних подручја (језгра и љуска нуклеуса акумбенс), може имати повишене прагове БСР чак иу одсуству укусне исхране.

Дорсолатерални стриатум је у великој мери умешан у учење навика са реакцијама на подстицај, што се огледа у развоју саображајног понашања које није осетљиво на девалвацију претходним храњењем до засићења или упаривањем са штетним стимулусима40. Циљајући претежно дорсолатерални стриатум, могли бисмо срушити популације Д2Р које регулишу рањивост пацова на развој компулзивног једења. У складу са улогом стриаталних Д2Р у компулзивном понашању, ТакИА алел хуманог генуса ДРД2 – АНКК1 гена - што резултира ниском густином Д2Р стриата5, отупљује активацију стријата као одговор на укусну храну4 и подиже рањивост на гојазност4 - такође дефицити у учењу како би се избегле радње са негативним последицама41. Губитак инхибиторне контроле над понашањем које може имати негативан исход карактеристична је карактеристика и гојазности и зависности од дроге, у којима конзумирајућа понашања настављају упркос негативним социјалним, здравственим или финансијским последицама. Понашање узимања кокаина код пацова са историјом опсежног узимања дрога може постати нефлексибилан и отпоран на поремећаје аверзивним условљеним стимулусом који предвиђа негативан исход (шок стопала) 18. Слично томе, мишеви који су раније имали приступ укусној исхрани са високим уделом масти проводиће више времена у непријатном окружењу (осветљеном) како би добили укусну храну од мишева који нису имали искуства са исхраном42. Открили смо да је укусна конзумација хране код пацова са проширеним приступом исхрани у кафетерији била слично неосетљива на аверзивни условљени стимулус. У складу са улогом стриаталних Д2Р у овом ефекту, компулзивно јело пронађено је код стриаталних Д2Р пацова који су претходно имали 14 дана продужени приступ исхрани у кафетерији, али не и у контролним групама. Из перспективе неуроцирцуитриа, продужени приступ укусној храни могао би покренути пластичност у кортикостријалним путевима, чинећи тако животиње рањивијима на развој компулзивног понашања, са дефицитима у стриаталном Д2Р који сигнализирају појачавајући овај процес. Заправо, смањена густина стриаталног Д2Р код гојазних особа корелира са смањеним метаболизмом у префронталним и орбитофронталним кортикалним областима43 који врше инхибиторну контролу над понашањем44.

Значајно, компулзивна конзумација укусне хране откривена је само код нокаутираних пацова који су раније имали проширени приступ исхрани у кафетерији, а не у контролним пацовима који су проширили приступ исхрани у кафетерији за исти временски период, нити у нокаутираним пацовима који су имали приступ само за цхов. Главна разлика између нокаут-штакора са претходним проширеним приступом и другим групама била је њихова константно повишена БСР прагова. То може одражавати заједничке неуробиолошке изворе хипофункције награђивања и појаву компулзивног једења, које су временски коинцидирајуће али независне појаве. Алтернативно, хипофункција награђивања узрокована исхраном може послужити као супстрат за негативно појачање које олакшава развој компулзивног једењаКСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС. Какви год да су основни механизми, наши налази показују да зависност налик компулзивном одговору за укусну храну може да се појави код гојазних пацова, и указују на то да дефицити у стриатном ДКСНУМКСР сигнализацији повећавају рањивост на развој овог понашања.

Укратко, открили смо да претјерана стимулација система награђивања мозга путем прекомјерне конзумације укусне, енергетски густе хране изазива дубоко стање награђивања и развој компулзивне исхране. Ови маладаптивни бихевиорални одговори код гојазних пацова вероватно потичу од дефицита изазваних дијетом у стриатном ДКСНУМКСР сигнализирању. Прекомерна потрошња лекова злоупотребе на сличан начин смањује густину стрија ДКСНУМКСР, индукује дубоко стање хипофункције награђивања и изазива појаву компулзивног понашања узимања дроге. Наши налази стога подржавају претходне радовеКСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС у указивању на то да гојазност и овисност о дрогама могу настати због сличних неуроадаптивних одговора у круговима награђивања мозга.

Методе

Пацови.

Мужјаци Вистар пацова који су тежили КСНУМКС-КСНУМКС г на почетку експеримената су добијени од Цхарлес Ривер. По доласку, пацови су били смештени појединачно на константној температури на КСНУМКС-х циклусу светлости и мрака (светла у КСНУМКС х). Пацовима је дозвољен ад либитум приступ стандардној лабораторијској храни и води током трајања експеримента. Све процедуре су одобрене од стране Институционалног комитета за негу и употребу животиња Сцриппс Флорида, а пацови су третирани у складу са смерницама које су поставили Национални институти за здравље у вези са принципима бриге о животињама.

Хируршке процедуре.

Штакори припремљени са БСР стимулативним електродама прво су анестезирани инхалацијом КСНУМКС-КСНУМКС% изофлурана у кисеонику и позиционирани у стереотаксичном оквиру (Копф). Биполарне БСР електроде (КСНУМКС мм дужине) су имплантиране у постериорни латерални хипоталамус (антеропостериорни, -КСНУМКС мм из брегме; медиолатерални, ± КСНУМКС мм од средње линије; дорсовентрални, КСНУМКС мм из дуре; инцизивна шипка је прилагођена КСНУМКС мм изнад интерауралне линије ) КСНУМКС. Пацови који су примали ињекције вируса такође су припремљени са билатералним водичем (КСНУМКС мерач, дужина КСНУМКС мм) постављеним изнад стриатума (антеропостериорни, КСНУМКС мм од брегме; медиолатерал, ± КСНУМКС мм од средине; дорсовентрал, -КСНУМКС мм од дура) КСНУМКС и испуњен са КСНУМКС-мм стиловима. Четири вијка за лобање од нерђајућег челика и зубни акрил држали су електроду и каниле на месту. Хируршка рана је третирана топикалним антибиотицом једном кНУМКС х за КСНУМКС д после операције. Пацовима је дозвољено да се опораве од хируршке интервенције КСНУМКС-КСНУМКС д, а затим су обучени у БСР праговној процедури.

БСР процедура.

Пацови су обучени да реагују на БСР стимулацију у складу са дискретно-пробном процедуром прага струје сличном оној описаној другдеКСНУМКС, КСНУМКС. Укратко, нивои струје БСР-а су варирали у наизменичној и силазној серији у корацима КСНУМКС-μА. У свакој тестној сесији представљена су четири наизмјенична низа у низу. Праг за сваку серију дефинисан је као средина између два узастопна интензитета струје за које су пацови одговорили у најмање три од пет студија, и две узастопне јачине струје за које пацови нису реаговали у три или више од пет испитивања. Укупни праг сесије дефинисан је као средња вредност прагова за четири појединачне серије. Свака сесија тестирања трајала је приближно КСНУМКС мин. Стабилни прагови БСР-а дефинисани су као варијације ≤КСНУМКС% прагова током КСНУМКС узастопних дана, обично успостављених након КСНУМКС-КСНУМКС д тренинга. Латенција одговора за сваку испитну сесију је дефинисана као средња латенција одговора свих испитивања током којих је дошло до позитивног одговора.

Паковање и испорука вируса.

РНА са кратком укосницом је испоручена и конститутивно изражена коришћењем пРНАТ-У6.2 / Ленти векторског система (ГенСцрипт). Вирусне честице су припремљене према протоколу произвођача. Укратко, ХЕК 293ФТ ћелије су трансфектоване вектором који садржи схРНА уметак (5′-ГГАТЦЦЦГЦГЦАГЦАГТЦГАГЦТТТЦТТЦААГАГАГАААГЦТЦГАЦТГЦТГЦГЦТТТТТТЦЦААЦТЦГАГ-3 ′) или празни вектор, плус ВираПовер Пацкагинг Мик Мик (72) хв (24 х хВ) (76,755). Супернатант је затим сакупљен и концентрован ултрацентрифугирањем (32 г, Бецкман Цоултер СВ 90 ТИ ротор., 4 мин, 80 ° Ц), а вирусни титар је одређен сортирањем ћелија активираним флуоресценцијом према упутствима произвођача. Вирус је аликиван и чуван у кутијама заштићеним од светлости на -XNUMX ° Ц до употребе.

Пацови са стабилним прагом БСР примили су билатералне вирусне ињекције на три места у стриатуму сваке хемисфере мозга (КСНУМКС μл по ињекцији, КСНУМКС μл мин-КСНУМКС, КСНУМКС мин између ињекција, укупно шест ињекција по пацову). Штакорима је дозвољено да добију најмање КСНУМКС-КСНУМКС д опоравак од интрастриаталних ињекција пре него што је процена БСР прага настављена. Дневна процена БСР прага је настављена за КСНУМКС д после ињекција вируса да би се осигурало да је постигнуто максимално стриатно смањење ДКСНУМКСР пре него што је дозвољено пацовима приступ храни у кафетерији. Није било разлика у БСР праговима између Ленти-контролних и Ленти-ДКСНУМКСРсх пацова током ових КСНУМКС д (подаци нису приказани).

Иммуноблоттинг.

Пацови су убијени отприлике КСНУМКС х након редовног приступа дијететској кафетерији, а мозгови су брзо уклоњени. Сегменти мозга дебљине ~ КСНУМКС-КСНУМКС мм припремљени су помоћу короналног матрикса мозга (КСНУМКС-мм интервал пресека; Пластицс Оне) на блоку леда и узимани су ударци ткива дорзалног стриатума (брегма: ~ КСНУМКС до -КСНУМКС мм). Ударци за стријајуће ткиво су брзо сакупљени, брзо замрзнути и чувани на -КСНУМКС ° Ц до употребе. Појединачни узорци су одмрзнути на леду и једнаке количине стријаталног ткива су сакупљене на основу медијанског раздвајања приступних група које зависе од тежине (КСНУМКС – КСНУМКС пацови по базену). Ткиво је ресуспендовано у КСНУМКС μл ледено хладном РИПА пуферу (Тхермо Сциентифиц) који садржи натријум ортхованадате, инхибиторе фосфатазе коктела КСНУМКС и КСНУМКС (Сигма-Алдрицх), леупептин и пепстатин пре хомогенизације. Лизати ткива су кувани током КСНУМКС мин у пуферу за узорке и нанети на КСНУМКС% -КСНУМКС% или КСНУМКС% Трис-глицин СДС гелове (Инвитроген). Протеин је пребачен на нитроцелулозне мембране, блокиран за КСНУМКС х на КСНУМКС-КСНУМКС ° Ц (КСНУМКС% безмасно суво млеко и КСНУМКС% Твеен-КСНУМКС у ПБС, пХ КСНУМКС), и инкубиран у примарном антителу преко ноћи на КСНУМКС ° Ц. Следећа примарна антитела су разблажена у блок раствору: ДКСНУМКСР мишји моноклонални (Санта Цруз, КСНУМКС: КСНУМКС) или п-актински мишји моноклонски (Санта Цруз, КСНУМКС: КСНУМКС). Кемилуминесцентни ЕЦЛ реагенс је додат након инкубације са пероксидазом - коњугираним секундарним антителима (Амерсхам, КСНУМКС: КСНУМКС). Зрела мембрана-повезана форма ДКСНУМКСДР (КСНУМКС кДа) КСНУМКС, КСНУМКС је нормализована на контролу пуњења протеина (П-актин; КСНУМКС кДа) и квантификована дензитометријски коришћењем НИХ Имаге Ј софтвера.

Иммуноцхемицал аналисис.

Пацови су анестезирани и транскардијално перфундирани са КСНУМКС% параформалдехидом у ПБС (пХ КСНУМКС). Мозгови су уклоњени, постфиковани преко ноћи и чувани у сахарози (КСНУМКС% раствор у ПБС, пХ КСНУМКС) најмање КСНУМКС х. Смрзнуте секције ткива (дебљина КСНУМКС μм) сакупљене су из микротома и блокиране (КСНУМКС% БСА, КСНУМКС% нормални козји серум и КСНУМКС% Тритон Кс-КСНУМКС у ПБС) за КСНУМКС х на КСНУМКС-КСНУМКС ° Ц. Следећа примарна антитела су додата у блок раствор и инкубирана преко ноћи на КСНУМКС ° Ц: пилећи поликлонал на ГФП (Абцам, КСНУМКС: КСНУМКС); зечјег моноклоналног у ГФАП (Миллипоре, КСНУМКС: КСНУМКС); мишји моноклонски у НеуН (Миллипоре, КСНУМКС: КСНУМКС). Секције су инкубиране са флуоресцентно-коњугираним секундарним антителима на КСНУМКС-КСНУМКС ° Ц: анти-пилећа-КСНУМКС-нм боја (Јацксон ИммуноРесеарцх, КСНУМКС: КСНУМКС), боја против зеца-КСНУМКС-нм (Инвитроген, КСНУМКС: КСНУМКС) ), и бојом анти-моусе-КСНУМКС-нм (Инвитроген, КСНУМКС: КСНУМКС). Секције су монтиране са Вецтасхиелд носачем који садржи ДАПИ (Вецтор Лабс) и покривен. Слике су снимљене користећи Олимпус БКСКСНУМКС флуоресцентни микроскоп (× КСНУМКС објектив) или Олимпус конфокални микроскоп (к КСНУМКС и × КСНУМКС циљеви).

Поступак храњења.

Пацови су смјештени појединачно на папирнату постељину (алфа јастучићи; Схепхерд Специалти Паперс) како би се спријечило запрљање прехрамбених производа лабавим материјалима. Дијета у кафетерији састојала се од сланине, кобасице, колача од сира, колача, сланине и чоколаде, који су појединачно одмјерени прије него што су били стављени на располагање штакорима. Дијететски прехрамбени производи у кафетерији испоручивани су у малим металним посудама. Све намирнице, укључујући стандардну лабораторијску храну, поново су измерене након завршетка сесије храњења. Уношење калорија из различитих макронутриената израчунато је коришћењем информација о хранидби које је дао произвођач.

Цуе-индуцед потискивање храњења понашање.

Поступци храњења одвијали су се у звучно пригушеним оперантним коморама идентичних димензија од оних коришћених у експериментима БСР. Пацови су смештени у оперантну комору и имали су приступ исхрани у кафетерији или чају 30 минута. Прехрамбени производи су се испоручивали у малим металним посудама. Сви прехрамбени производи су вагани пре и после сесије храњења, које су се изводиле током нормалног периода храњења пацова. Потрошња чау-чаја процењена је потрошњом 45-мг пелета од цхов-а, идентичног по саставу са чау-ом у кућним кавезима пацова. Пацовима је тада било дозвољено 30 минута дневног приступа исхрани у кафетерији док се није постигао стабилан унос (дефинисан као <10% варијација дневног уноса), што је захтевало 5-7 дана. Након стабилизације уноса укусне хране током овог почетног периода, пацови су у сваком приступном стању били распоређени у две групе: кажњени (они који су претрпели шок стопала) и некажњени (који нису примили шок стопала). Пацови су затим подвргавани четири сесије кондиционирања узастопних дана у истој оперантној комори у којој су претходно имали приступ укусној храни. Током 30-минутних сесија кондиционирања, сигнална лампица (условљени стимулус) активирала се 10 минута, искључила 10 минута, а затим поново укључила 10 минута. Кажњени пацови су доживели шок ногом само током приказивања белог светла (0.5 мА током 1.0 с; 10 стимулација са интервалима од ~ 1 мин). Некажњеним пацовима је на исти начин представљена штапна лампица, али без наношења шока на стопалима. На дан испитивања, дан након последње кондиционе сесије, пацови у кажњеним групама су имали повремени шок стопала (укупно пет стимулација) упарен са активирањем сијалице у трајању од 5 минута. Некажњени пацови су поново били изложени додирујућем светлу у одсуству ударца стопалима. После периода кажњавања од 5 минута, свим пацовима је дозвољен приступ укусној храни током 30-минутне сесије са кондиционим стимулусом који се активира с прекидима (10 минута укљученог светла, 10 минута искљученог светла, 10 минута укљученог осветљења).

Статистичке анализе.

Основни прагови награђивања дефинисани су као просечна вредност прага за КСНУМКС д пре приступа исхрани кафетерије за сваки субјект. Прагови награде су изражени као процентуална промена од основне вредности прага. Подаци о проценту основних граничних вредности награде, повећању тежине, потрошњи калорија и потрошњи калорија из масти анализирани су анализом варијација са два фактора, поновљених мера, са приступом (само за храну, ограничен приступ или проширени приступ), извор калорија ( стандардна исхрана са храном или кафетеријом), вирус (Ленти-контрола или Ленти-ДКСНУМКСРсх) и знак (упарени или неспарени са казном) као фактори међу субјектима и време као фактор унутар субјеката. Када је било прикладно, главни ефекти у анализама варијансе су даље анализирани Бонферрони пост хоц тестовима. Све статистичке анализе извршене су уз помоћ софтвера ГрапхПад Присм.

Референце

Референце

Кореспонденција са:

· Паул Ј Кенни[емаил заштићен])