Диабетологиа. КСНУМКС; КСНУМКС (КСНУМКС): КСНУМКС – КСНУМКС.
Објављено на мрежи КСНУМКС Маи КСНУМКС. дои: 10.1007/s00125-017-4305-4
ПМЦИД: ПМЦКСНУМКС
1Апстрактан
Циљеви / хипотеза
Преједање масти узрокује гојазност код људи и глодара. Недавне студије на људима и глодавцима показале су да зависност од масти дели заједнички механизам са зависношћу од алкохола, никотина и наркотика у смислу дисфункције система награђивања мозга. Истакнуто је да дијета са високим садржајем масти (ХФД) слаби сигнализацију допаминског ДКСНУМКС рецептора (ДКСНУМКСР) у стриатуму, кључном регулатору система награђивања мозга, што резултира хедоничким преједањем. Раније смо извештавали да је биоактивни конституент и-оризанол специфичног био-активног састава риже ослабио преференцију за ХФД преко контроле хипоталамуса. Стога смо истражили могућност да γ-оризанол модулира функционисање система награђивања мозга код мишева.
Методе
Мужјаци ЦКСНУМКСБЛ / КСНУМКСЈ мишеви храњени ХФД су орално третирани са и-оризанолом, и процењени су стриатални нивои молекула укључених у ДКСНУМКСР сигнализацију. Испитиван је утицај γ-оризанола на метилацију ДНА промотора ДКСНУМКСР и накнадне промене у преференцијама за дијететску маст. Поред тога, испитивани су ефекти КСНУМКС-аза-КСНУМКС′-деоксицитидина, моћног инхибитора ДНК метилтрансфераза (ДНМТс), на преференцију хране, ДКСНУМКСР сигнализацију и нивое ДНМТ у стриатуму. Инхибиторни ефекти и-оризанола на активност ДНМТ-а су ензиматски процењивани ин витро.
Резултати
У стриатуму из мишева храњених ХФД, продукција ДКСНУМКСРс је смањена повећањем ДНА метилације промоторског региона ДКСНУМКСР. Орална примена γ-оризанола смањила је експресију и активност ДНМТ, чиме је повратио ниво ДКСНУМКСР у стриатуму. Фармаколошка инхибиција ДНМТ-а КСНУМКС-аза-КСНУМКС′-деоксицитидином такође је побољшала преференцију за дијететску масноћу. У складу са овим налазима, ензиматски ин витро тестови су показали да је γ-оризанол инхибирао активност ДНМТ.
Закључци / тумачење
Показали смо да γ-оризанол ублажава ХФД-индуковану ДНК хиперметилацију промоторског региона ДКСНУМКСР у стриатуму мишева. Наша експериментална парадигма истиче γ-оризанол као обећавајућу супстанцу против гојазности са својством да је нови епигенетски модулатор.
Електронски додатни материјал
Онлине верзија овог чланка (дои: КСНУМКС / сКСНУМКС-КСНУМКС-КСНУМКС-КСНУМКС) садржи рецензирани, али необрађени допунски материјал, који је доступан овлаштеним корисницима.
увод
Преједање код гојазних појединаца дијели, барем дјелимично, заједничке механизме са овисношћу о алкохолу, никотину и наркотицима [1]. Поред хипоталамичке и хормонске регулације апетита, систем награђивања мозга, посебно сигнализирање допаминских рецептора, је уско повезан са овисничким или хедонистичким хранидбеним понашањем.2]. Претходна студија на пацовима показала је да је нокаутирање стриатног рецептора допамин ДКСНУМКС (ДКСНУМКСР) лентивирусом посредоване кратке укоснице са сметњама које изазивају наглу појаву зависности од награђивања и компулзивног тражења хране.3]. Због смањене густине ДКСНУМКСР, дорзални стриатум је мање осетљив на награђивање хране у поређењу са витким контролним групама код гојазних људи и глодара [3-5]. У складу са овим појмом, ТакИА алел АНКККСНУМКС локус гена (кодирајући ДРДКСНУМКС / анкирин понављање и киназни домен који садржи КСНУМКС), који смањује продукцију стриаталне ДКСНУМКСР, је повезан са фенотипом гојазности код људи [6], док су ефекти губитка тежине након бариатриц кирургије повезани са повишеном густином стрија ДКСНУМКСР [7]. Ови подаци снажно указују на значај стриаталне ДКСНУМКСР као нове терапеутске мете за лечење гојазности. Међутим, неки лекови који су развијени и који су деловали на систем награђивања мозга проузроковали су значајне нежељене ефекте, укључујући озбиљне психијатријске проблеме, што је резултирало њиховим евентуалним повлачењем из клиника [8].
Епигенетске модификације су критичне не само за развој и диференцијацију, већ и зато што настају као резултат промјена у окружењу, укључујући и дијету и начин живота.9]. Метилација ДНК је главни епигенетски догађај за стабилност експресије гена.9]. Код пацова, мајчинска изложеност храни са високим садржајем масти (ХФД) интергенеративно мења метилацију ДНК у оквиру централног система награђивања у потомству, што доводи до прекомерне потрошње ХФД од стране штенаца.10]. Посебно, ДНА метилтрансферазе (ДНМТс) играју критичну улогу у регулацији и понашања храњења и физичке активности.10, 11], сугеришући да ДНМТ могу бити обећавајући терапеутски циљеви за терапију синдрома гојазности - дијабетес. Важно је да су неке природне супстанце добијене из хране, укључујући кофеинску киселину и епигалокатехин, познате да делују као инхибитори ДНМТ [12, 13].
Недавно смо показали да биоактивни, смеђи риж специфична компонента γ-оризанол, мешавина естера феруличне киселине и неколико фитостерола, смањује склоност ка исхрани масти путем смањења стреса хипоталамичког ендоплазматског ретикулума (ЕР).14]. Код мишева и кунића, орално примењени γ-оризанол се брзо апсорбује из црева и дистрибуира углавном у мозак [15, 16]. Узимајући ове налазе заједно, природни производи добивени из хране који дјелују на централни нервни систем могу бити алтернатива за сигурно побољшање поремећаја у храњењу код гојазности. У овом контексту, тестирали смо хипотезу да би γ-оризанол могао да промени статус метилације ДНК у систему награђивања мозга, што је резултирало смањењем преференције за ХФД код мишева.
Методе
životinje
Седам недеља стари мушки мишеви Ц57БЛ / 6Ј добијени из Цхарлес Ривер Лабораториес Јапан (Канагава, Јапан) били су смештени (3-4 по кавезу) у условима без специфичних патогена на 24 ° Ц под 12 х / 12 х светлости / мрачни циклус. После седмице аклиматизације, осмонедељни мишеви су прилагођени тежини и подељени у две или три групе да би прошли сваки експеримент. Мишевима је био дозвољен слободан приступ храни и води. Све експерименте на животињама одобрио је Етички одбор за експерименте са животињама Универзитета Риукиус (бр. 8, 5352 и 5718).
Примена и-оризанола и КСНУМКС-аза-КСНУМКС′-деоксицитидина
Да би се проценила преференција за ХФД, и-оризанол (Вако Пуре Цхемицал Индустриес, Осака, Јапан) је примењен на КСНУМКС-недељне мишеве старим сондом током теста избора хране као што је претходно описано [14, 17]. За друге експерименте, ХФД (ДКСНУМКСБ; Ресеарцх Диетс, Нев Брунсвицк, Њ, УСА) који садржи КСНУМКС% и-оризанол је произведен као пелет. Компоненте дијете су приказане у табели електронског додатног материјала (ЕСМ) 1. После 12 недеља храњења, ткиво је прикупљено из стриатума и хипоталамуса. Дневни унос γ-оризанола, процењен из просечног уноса хране мишевима, износио је приближно 320 μг / г телесне тежине. Дозе γ-оризанола одређене су како је претходно описано [14]. 5-аза-2′-деоксицитидин (5-аза-дЦ; Сигма-Алдрицх, Ст Лоуис, МО, САД) убризган је интраперитонеално (0.25 μг / г телесне тежине) три пута недељно током 12 недеља [18].
Процена преференције за дијететску маст
Да би се процијениле преференције за дијететску масноћу, тестови за храну омогућили су избор између хлебова и хфд (ДКСНУМКСБ и ДКСНУМКС; истраживачке дијете) као што је претходно описано.14]. Компоненте исхране приказане су у табели ЕСМ 1. Укратко, мишевима је омогућен слободан приступ цхов-у и ХФД-у. Унос чау и ХФД мерен је недељно и анализиран на промене у преференцији према хранљивим мастима. Преференција за ХФД израчуната је према формули: ХФД преференција = [(унос ХФД / укупан унос хране) × 100].
Бисулфитно секвенцирање за метилацију ДНК
ДНК је пречишћена употребом ДНеаси Блоод & Тиссуе Кит (КИАГЕН, Токио, Јапан). Раствор ДНК је помешан са свеже припремљеним 3 мол / л НаОХ, инкубиран на 37 ° Ц током 15 минута и додат је 5.3 мол / л урее, 1.7 мол / л натријум бисулфит и 4.9 ммол / л хидрохинона. Раствор је подвргнут 15 циклуса денатурације на 95 ° Ц током 30 с и инкубацији на 50 ° Ц током 15 минута [19]. Бисулфит третирана ДНК је пречишћена коришћењем комплета за прочишћавање МинЕлуте ПЦР (КИАГЕН) и амплификована помоћу ПЦР помоћу КАПА ХиФи ХотСтарт Урацил + РеадиМик ПЦР комплета (КАПА Биосистемс, Вобурн, МА, УСА) и прајмера око ЦпГ места промоторског региона ДКСНУМКСР . Секвенце прајмера биле су следеће: предњи прајмер, КСНУМКС′-ГТААГААТТГГТТГГТТГГАГТТАААА-КСНУМКС '; реверсе пример, КСНУМКС′-АЦЦЦТАЦЦЦТЦТААААЦЦАЦААЦТАЦ-КСНУМКС ′. Затим се додају секвенце адаптора и очисте помоћу Агенцоурт АМПуре КСП (Бецкман Цоултер, Бреа, ЦА, УСА). Узорци су затим сакупљени и напуњени на ГС Јуниор (Роцхе Диагностицс, Токио, Јапан) за секвенцирање према протоколу произвођача. Ниво метилације је изражен као проценат метилираних цитозина у свим остацима цитозина.
Анализа активности ДНМТ
Тест ДНМТ ензимске активности је изведен коришћењем ЕпиКуик ДНА Метхилтрансферасе Ассаи Кит (Епигентек Гроуп, Брооклин, НИ, УСА) и ЕПИгенеи Метилтрансферасе Ассаи кит (Цисбио Јапан, Цхиба, Јапан) према произвођачевим протоколима.
Да се процени инхибиторна активност сваког једињења на метилацију ДНК, формирање S-аденозил-20-хомоцистеин (САХ) је мерен у присуству сваког једињења (XNUMX μмол / л за скрининг тестове), S-аденозил метионин (САМ; 10 μмол / л) и ДНМТ супстрат (4 нг / μл) на 37 ° Ц током 90 минута. Да би се проценила Мицхаелис – Ментенова кинетика, ДНМТ1 (20 μмол / л) је инкубиран са γ-оризанол, САМ (5 μмол / л) и назначеном концентрацијом поли дИ-дЦ на 37 ° Ц током 90 минута. ДНМТ3а (100 μмол / л) и ДНМТ3б (100 μмол / л) су инкубирани са γ-оризанолом, САМ (5 μмол / л) и назначеном концентрацијом поли дГ · дЦ на 37 ° Ц током 120 минута. Анализе су изведене у четвороструком узорку. Екстраховани протеин (0.75 мг / мл) је инкубиран са САМ (5 μмол / л), поли дИ-дЦ (5 μг / мл) и поли дГ · дЦ (5 μг / мл) на 40 ° Ц током 120 минута, и Измерена је формација САХ.
Тест естрогена у вези са рецептор-γ активностима
Потенцијална антагонистичка активност γ-оризанола на рецептор-и повезаном са естрогеном (ЕРРγ) процењена је применом система за испитивање гама-репортера повезаног са људским естрогеном (ИНДИГО Биосциенце, Стате Цоллеге, ПА, УСА) према протоколу произвођача. Укратко, не-хумане репортерске ћелије сисара које конститутивно изражавају активни ЕРРи биле су изложене назначеним концентрацијама сваког једињења током 24 сата у три примерка.
Вестерн блоттинг
Ово је извршено као што је претходно описано [20] са антителима против Д2Р (1: 500, зец), транспортер допамина (ДАТ; 1: 500, зец), тирозин хидроксилаза (ТХ; 1: 1000, зец) (АБ5084П, АБ1591П и АБ152, Мерцк Миллипоре, Биллерица, МА, САД), претварач сигнала и активатор транскрипције 3α (СТАТ3α; 1: 1000, зец), ДНМТ1 (1: 1000, зец), ДНМТ3а (1: 1000, зец) (бр. 8768, 5032 и 3598; Целл Сигналинг Тецхнологи, Токио, Јапан), ДНМТ3б (1 μг / мл, зец), ЕРРγ (1: 1000, зец) и β-актин (1: 10,000, миш) (аб16049, аб128930 и аб6276; Абцам, Цамбридге, МА, САД).
Квантитативни ПЦР у реалном времену
Експресија гена је испитана као што је претходно описано [14]. нивои мРНА су нормализовани на РнКСНУМКСс (КСНУМКСС рРНА). Сетови примера који се користе за квантитативне ПЦР анализе у реалном времену су сумирани у ЕСМ табели 2.
Статистичка анализа
Подаци су изражени као средња вредност ± СЕМ. Једносмерна АНОВА и поновљене мере АНОВА праћене вишеструким тестовима упоређивања (Бонферрони – Дунн метода) коришћене су тамо где је било применљиво. Студенти t Тест је коришћен за анализу разлика између две групе. Разлике су се сматрале значајним на p <0.05.
Резултати
Фармаколошка инхибиција ДНМТ-а КСНУМКС-аза-дЦ ослабила је преференцију за дијететску маст код мишева
Код мишева који су хранили ХФД, метилација ДНК у промотерском региону ДКСНУМКСР у стриатуму је значајно повећана у поређењу са мишевима који су храњени храном (Фиг. (Фиг.КСНУМКСа) .КСНУМКСа). С друге стране, метилација хипоталамичке ДНК у промотерском региону ДКСНУМКСР била је очигледно већа од оне у стриатуму под храном (p <0.01) (сл. (Фиг.КСНУМКСа, КСНУМКСа, ф) и није измењен од стране ХФД (сл. (Фиг.КСНУМКСф) .КСНУМКСф). Код мишева који су хранили ХФД, повећана метилација ДНК у промоторској регији ДКСНУМКСР у стриатуму нормализована је третманом са КСНУМКС-аза-дЦ, јаким ДНМТ инхибитором (Фиг. (Фиг.КСНУМКСа) .КСНУМКСа). Насупрот томе, метилација ДНК у промотерском региону ДКСНУМКСР у хипоталамусу није значајно промењена третманом са КСНУМКС-аза-дЦ (Фиг. (Фиг.КСНУМКСф) .КСНУМКСф). У стриатуму 20-недељних мушких мишева храњених ХФД током 12 недеља, нивои мРНК и протеина Д2Р су значајно смањени (сл. (Фиг. КСНУМКСб, КСНУМКСб, к, л). Насупрот томе, нивои допаминских ДКСНУМКС рецептора (ДКСНУМКСРс, кодирани са ДрдКСНУМКС), који делују супротно од ДКСНУМКСРс на аденилил циклази и цАМП-ом посредоване интрацелуларне сигнализације, биле су непромењене (Фиг. (Фиг.КСНУМКСц) .КСНУМКСц). Даље, није било промена у нивоима других молекула везаних за ДКСНУМКСР сигнализацију, као што су ТХ и ДАТ на нивоу мРНК и / или протеина (Фиг. (Фиг. КСНУМКСд, КСНУМКСд, е, к, м). Са друге стране, нису уочене очигледне промене у хипоталамусу, укључујући и ДКСНУМКСР (сл. (Фиг.КСНУМКСг – м) .КСНУМКСг – м). Значајно је да су нивои протеина ДКСНУМКСР и ТХ у хипоталамусу били много нижи од оних у стриатуму (Фиг. (Фиг. КСНУМКСл, КСНУМКСл, м), вероватно одражавајући релативну важност сигнализације допаминског рецептора у систему награђивања мозга у поређењу са хипоталамусом.
Да би се испитало да ли ће метилација ДНК у промотерском региону ДКСНУМКСР изменити преференцију за дијететску маст, анализирано је понашање храњења мишева третираних са КСНУМКС-аза-дЦ. Као што се и очекивало, КСНУМКС-аза-дЦ значајно је повећао ниво мРНК и протеина за ДКСНУМКСР у стриатуму мишева храњених ХФД (Фиг. (Фиг. КСНУМКСб, КСНУМКСб, к, л). С друге стране, није било ефекта на нивое ДрдКСНУМКС, Th СлцКСНУМКСаКСНУМКС (кодирање ДАТ) у стриатуму, или на нивоима ДрдКСНУМКС, ДрдКСНУМКС, Тх СлцКСНУМКСаКСНУМКС у хипоталамусу (сл. (Фиг.КСНУМКСц – е, КСНУМКСц – е, г – м). Док мишеви третирани са носачем преферирају ХФД, преференција за ХФД је значајно смањена код мишева третираних са КСНУМКС-аза-дЦ (КСНУМКС% од вредности за мишеве третиране носачем) (Фиг. (Фиг.КСНУМКСн) .КСНУМКСн). Сходно томе, третман са КСНУМКС-аза-дЦ смањио је пораст телесне тежине (сл. (Фиг.КСНУМКСо).
γ-оризанол смањује нивое ДНМТ-а у стриатуму мишева храњених ХФД-ом
Као што смо раније пријавили [14, орална примена и-оризанола мушким мишевима са сондом значајно је смањила преференцију за ХФД (КСНУМКС% од вредности за мишеве третиране носачем) (Фиг. (Фиг.КСНУМКСа), КСНУМКСа) што резултира очигледним слабљењем прираста телесне тежине (сл. (Фиг.КСНУМКСб) .КСНУМКСб). Стога смо истражили потенцијални утицај γ-оризанола на епигенетску модулацију ДКСНУМКСР у стриатуму.
Код сисара постоје три главна ДНМТ - ДНМТКСНУМКС, КСНУМКСа и КСНУМКСб. Функције ДНМТКСНУМКС за одржавање метилације ДНА, док ДНМТКСНУМКСа и КСНУМКСб играју улогу у олакшавању де ново ДНА метилације [21]. Да бисмо истражили потенцијални утицај γ-оризанола на ДНМТ ин виво, проценили смо нивое ДНМТ-а у мозговима мишева који су храњени ХФД-ом. Иако ХФД пер се није имао ефекта на нивое мРНА и протеина ДНМТ у стриатуму или хипоталамусу, суплементација γ-оризанолом значајно је смањила ниво ДНМТ у стриатуму, али не иу хипоталамусу (сл. (Фиг.КСНУМКСц – е, КСНУМКСц – е, г – и, к – н). Ови подаци указују на могућност да γ-оризанол може регулисати ниво ДНМТ на стриатум-специфичан начин. На сличан начин, КСНУМКС-аза-дЦ је значајно смањио ниво мРНА ДНМТКСНУМКСа и КСНУМКСб преференцијално у стриатуму (ЕСМ Фиг. 1а – д).
На основу претходне студије која показује да је ниво мРНА ДНМТКСНУМКС позитивно регулисан, бар делимично, нуклеарним рецептором ЕРРγ [22], испитали смо потенцијални ефекат и-оризанола на активност ЕРРγ. Код не-хуманих ћелија сисара које конститутивно експримирају активни ЕРРи, КСНУМКС-хидрокси тамоксифен, снажан инверзни агонист ЕРРи, значајно смањује ЕРРγ активност. Треба напоменути да је и-оризанол делимично смањио активност ЕРРγ (приближно КСНУМКС% смањење урођене вредности) (Сл. (Фиг.КСНУМКСа) .КСНУМКСа). Важно је да је ЕРРγ био високо експримиран у стриатуму, али не иу хипоталамусу (сл. (Фиг.КСНУМКСб-д) .КСНУМКСб – д). Насупрот ситуацији за стриатум, γ-оризанол је значајно повећао ниво протеина ДНМТКСНУМКС само у хипоталамусу (сл. (Фиг.КСНУМКСк, КСНУМКСк, л). Ови резултати се могу објаснити, бар делимично, нашим налазом да је СТАТКСНУМКСα, позитивни регулатор нивоа ДНМТКСНУМКС [23], обилно је изражен у хипоталамусу, али не иу стриатуму (сл. (Фиг.КСНУМКСна пример).
Да би се даље процењивао утицај и-оризанола на активност ДНМТс ин виво, формирање САХ, нуспродукта метилације ДНК и такође снажног инхибитора ДНМТс, процењивано је у м-третираним мишевима који су били третирани са ХФД. Није било значајних промена у формирању САХ ни у стриатуму ни у хипоталамусу између ХФД храњених и храњених мишева (Фиг. (Фиг.КСНУМКСф, КСНУМКСф, ј). Приметно је да је γ-оризанол значајно смањио формирање САХ у стриатуму (сл. (Фиг.КСНУМКСф) КСНУМКСф) али не у хипоталамусу (сл. (Фиг.КСНУМКСј), КСНУМКСј), сугерирајући да и-оризанол може сузбити активност ДНМТ-а на стриатум-специфичан начин код мишева храњених ХФД-ом.
Ензиматске анализе инхибиторних својстава и-оризанола за ДНМТ ин витро
Затим смо проценили утицај γ-оризанола на активност ДНМТс ин витро. Процењене су инхибиторне јачине и-оризанола, феруличне киселине, КСНУМКС-аза-дЦ, халоперидола (репрезентативног ДКСНУМКСР антагониста), квинпирола (репрезентативног ДКСНУМКСР агониста) и САХ у односу на ДНМТ. Као позитивна контрола, САХ је снажно ослабио активности ДНМТ на дозно-зависан начин (Фиг. (Фиг.КСНУМКСа – ф) .КСНУМКСа – ф). Као што се очекивало, халоперидол и квинпирол нису показали никакав ефекат на активности ДНМТ (ЕСМ Фиг. 2). Приметно је да је γ-оризанол значајно инхибирао активности ДНМТКСНУМКС (ИЦ50 = 3.2 μмол / л), 3а (ИЦ50 = 22.3 μмол / л) и 3б (максимална инхибиција 57%) (сл. (Фиг.КСНУМКСд – ф) .КСНУМКСд – ф). Насупрот томе, инхибиторна активност феруличне киселине, метаболита и-оризанола, била је много нижа него она и-оризанола (Фиг. (Фиг.КСНУМКСд – ф).
Даље смо истражили инхибиторна својства γ-оризанола на ДНМТ. Формирање САХ је измерено да би се проценила инхибиторна активност и-оризанола на ДНМТс ин витро. Подаци о формирању САХ током ДНМТ-посредоване ДНА метилације указују на засићење обрасца Мицхаелис-Ментен кинетике и за присуство и за одсуство и-оризанола (сл. (Фиг.КСНУМКСг – и) .КСНУМКСг – и). У ДНМТКСНУМКС-посредованој ДНА метилацији, Еадие-Хофстее анализа је показала да γ-оризанол није показао никакве ефекте на V Мак формирања САХ (носач, 597 пмол / мин; γ-оризанол 2 μмол / л, 619 пмол / мин; γ-оризанол 20 μмол / л, 608 пмол / мин), док је γ-оризанол очигледно повећао K m (носач, 0.47 μг / мл; γ-оризанол 2 μмол / л, 0.67 μг / мл; γ-оризанол 20 μмол / л, 0.89 μг / мл) (сл. (Фиг.КСНУМКСј) .КСНУМКСј). Ови резултати указују да γ-оризанол инхибира ДНМТКСНУМКС бар делимично на конкурентан начин. С друге стране, за ДНМТКСНУМКСа и КСНУМКСб посредовану ДНА метилацију, γ-оризанол је смањио V Мак формирања САХ (ДНМТ3а: возило, 85.3 пмол / мин; γ-оризанол 2 μмол / л, 63.1 пмол / мин; γ-оризанол 20 μмол / л, 42.5 пмол / мин; ДНМТ3б: возило, 42.3 пмол / мин; γ -оризанол 2 μмол / л; 28.0 пмол / мин, γ-оризанол 20 μмол / л, 15.0 пмол / мин) и, слично, K m за ову реакцију (ДНМТ3а: носач, 0.0086 μг / мл; γ-оризанол 2 μмол / л, 0.0080 μг / мл; γ-оризанол 20 μмол / л, 0.0058 μг / мл; ДНМТ3б: носач, 0.0122 μг / мл; γ- оризанол 2 μмол / л, 0.0097 μг / мл; γ-оризанол 20 μмол / л, 0.0060 μг / мл) (сл. (Фиг.КСНУМКСк, КСНУМКСк, л). Ови резултати указују да γ-оризанол инхибира ДНМТКСНУМКСа и КСНУМКСб бар делимично на неконкурентан начин.
γ-оризанол повећава нивое ДКСНУМКСР у стриатуму мишева храњених ХФД
Затим смо тестирали могућност да γ-оризанол повећа садржај стриаталне ДКСНУМКСР путем инхибиције ДНМТ. Код мишева које су хранили ХФД, орално давање и-оризанола значајно је смањило стриатну ДНА метилацију у промоторском региону ДКСНУМКСРс (Фиг. (Фиг.КСНУМКСа), КСНУМКСа), док то није учинио у хипоталамусу (сл. (Фиг.КСНУМКСф) .КСНУМКСф). У складу са овим налазима, нивои мРНК и протеина ДКСНУМКСР су реципрочно повећани (Фиг. (Фиг. КСНУМКСб, КСНУМКСб, г, к, л). Слично подацима о третману са КСНУМКС-аза-дЦ (сл. (Фиг.КСНУМКС), КСНУМКС), није било очигледних ефеката на ниво РНК и протеина ДрдКСНУМКС, Th СлцКСНУМКСаКСНУМКС (ДАТ) у стриатуму, и нема ефеката на нивое ДрдКСНУМКС, Th СлцКСНУМКСаКСНУМКС у хипоталамусу (сл. (Фиг.КСНУМКСц – е, КСНУМКСц – е, х – к, м).
Претходне студије су показале да су нивои ДКСНУМКСР и ДНМТКСНУМКС регулисани стресом ЕР и упалом барем делом преко НФ-κБ [17, 24, 25]. Стога смо испитали нивое гена који су повезани са стресом и упалом. Као што је претходно приказано [26], ХФД повећава експресију гена који кодирају ТНФ-а (Тнфа, моноцитни хемоатрактантни протеин - КСНУМКС (МЦП-КСНУМКС) (ЦцлКСНУМКС, Хомологни протеин Ц / ЕБП (сецкати, ЕР-лоцализед ДнаЈ КСНУМКС (ЕРдјКСНУМКС)ДнајбКСНУМКС) и спојени облик Кс-бок везујућег протеина КСНУМКС (КсбпКСНУМКСсу хипоталамусу, али не у стриатуму (сл. (Фиг.КСНУМКС) .КСНУМКС). Значајно, додавање ХФД γ-оризанолом значајно је смањило повећану експресију ЦцлКСНУМКС, сецкати, ДнајбКСНУМКС КсбпКСНУМКСс искључиво у хипоталамусу, али не иу стриатуму (сл. (Фиг.КСНУМКС).
Дискусија
Главни налаз у овој студији је да γ-оризанол делује као снажан ДНМТ инхибитор у стриатуму мишева, при чему се, бар делимично, ублажава преференција за ХФД преко епигенетске модулације стриаталног ДКСНУМКСР. У стриатуму из мишева које су хранили ХФД, нивои ДКСНУМКСР су значајно смањени, док се вредности ДКСНУМКСР, ТХ и ДАТ нису мењали (Фиг. (Фиг. КСНУМКСб – е, КСНУМКСб – е, к – м). Ови подаци су у складу са идејом да дисрегулација стриаталне ДКСНУМКСР игра кључну улогу у перцепцији награђивања хране када је на ХФД, што доводи до хедонијске прекомерне потрошње ХФД код гојазних животиња [3]. У овој студији, третман мишева храњених са ХФД са КСНУМКС-аза-дЦ значајно је повећао ниво стриаталне ДКСНУМКСР (Слика. (Фиг. КСНУМКСб, КСНУМКСб, к, л) евентуално кроз смањење нивоа метилације ДНК у промотерском региону ДКСНУМКСР (Фиг. (Фиг.КСНУМКСа), КСНУМКСа), и сходно томе ублажавају преференцију за дијететску маст (сл. (Фиг.КСНУМКСн) .КСНУМКСн). Овај налаз такође подржава критичну улогу стриаталних ДКСНУМКСР у перцепцији награђивања хране када је на ХФД.
Наш ин витро тест је показао да је инхибиторна активност γ-оризанола против ДНМТ очигледно јача од његове метаболита феруличне киселине (сл. (Фиг.КСНУМКСд – ф), КСНУМКСд-ф), сугеришући значај комплетне структуре γ-оризанола за његово инхибиторно деловање на ДНМТ. Код мишева које су хранили ХФД, наша истраживања сугеришу да, након оралне примене, γ-оризанол допире до мозга као комплетна структура и смањује нивое и активности ДНМТ преференцијално у стриатуму, са последичним смањењем метилације ДНК у региону промотора. ДКСНУМКСР у стриатуму. Осим тога, наше ин витро студије су показале да γ-оризанол делује као парцијални антагонист против ЕРРγ, који првенствено служи као позитивни регулатор за производњу ДНМТКСНУМКС-а.22], а самим тим и смањење активности ДНМТКСНУМКС (сл. (Фиг.КСНУМКСа) .КСНУМКСа). Треба напоменути да је ЕРРγ био високо експримиран у стриатуму, али не иу хипоталамусу код мишева (Фиг. (Фиг.КСНУМКСб) .КСНУМКСб). Ови подаци указују да γ-оризанол има потенцијал да смањи ниво мРНА ДНМТКСНУМКС, бар делимично, путем инхибиције ЕРРγ. Насупрот стриатуму, γ-оризанол није показао ефекат на ниво ДКСНУМКСР у хипоталамусу од мишева храњених ХФД-ом (сл. (Фиг.КСНУМКСг, КСНУМКСг, к, л).
С друге стране, показали смо да је γ-оризанол значајно повећао ниво ДНМТКСНУМКС у хипоталамусу, али не иу стриатуму (сл. (Фиг.КСНУМКСк, КСНУМКСк, л). Показано је да СТАТКСНУМКС повећава садржај ДНМТКСНУМКС у малигним Т-лимфомским ћелијама.23]. Значајно је да смо претходно показали да је γ-оризанол значајно повећао лептин индуковану СТАТКСНУМКС фосфорилацију у хипоталамусу од мишева храњених са ХФД [14]. Такође треба напоменути да је СТАТКСНУМКСа у суштини експримиран у хипоталамусу, али не иу стриатуму код мишева (сл. (Фиг.КСНУМКСе – г) .КСНУМКСна пример). Ови подаци нас подстичу да спекулишемо да се очигледна разлика у ефекту и-оризанола на ниво ДНМТКСНУМКС између хипоталамуса и стриатума може приписати, бар делимично, регион-специфичном садржају СТАТКСНУМКСα и ЕРРγ у мозгу мишева ( Шипак. (Фиг.КСНУМКСб – г) .КСНУМКСб – г). Заједно, чини се да постоји реципрочни образац експресије ЕРРи и СТАТКСНУМКСа између стриатума и хипоталамуса код мишева. На основу наших резултата, разумно је спекулисати да у стриатуму, где је производња ЕРРγ у изобиљу, γ-оризанол може преференцијално смањити ниво мРНК и ензимску активност ДНМТКСНУМКС као негативног регулатора ЕРРγ. Насупрот томе, у хипоталамусу, где је производња СТАТКСНУМКСα доминантна, γ-оризанол може преференцијално повећати нивое ДНМТКСНУМКС.
Недавна студија је показала да атенуација стриатне ДКСНУМКСР сигнализације индуковане ХФД дисрегулира понашање храњења.3], што указује на потенцијални значај инхибиције стриатних ДНМТ за лечење гојазности. С друге стране, претходна студија је показала могућност да статус метилације ДНК гена меланокортин рецептора КСНУМКС експримираног у специфичним језграма хипоталамуса може модулирати трансгенерацијске облике гојазности у агутијежним жутим мишевима [27]. Иако је за даљње студије оправдано разјаснити механизме у основи, ове студије указују на важност метилације ДНК ткива, гена и секвенци у патофизиологији претилости изазване ХФД.
Недавно смо известили да је ХФД повећао ниво ДКСНУМКСР у панкреасним оточићима мишева.17, 24]. Врло је вероватно да је такво повећање посредовано, бар делимично, стресом ЕР и упалом преко НФ-κБ, јер постоји неколико НФ-κБ-одговорних елемената у промоторском региону ДКСНУМКСР [17, 24]. Осим тога, недавна студија је показала да ТНФ-α и ИЛ-КСНУМКСβ повећавају ниво и активност ДНМТКСНУМКС у адипозном ткиву код мишева храњених ХФД [25]. Важно је да је ова студија показала да ХФД индукује ЕР стрес и инфламацију преференцијално у хипоталамусу, али не иу стриатуму (Фиг. (Фиг.КСНУМКС) .КСНУМКС). Дубински механизми метилације и деметилације ДНК ткива, региона и локалитета у нашој експерименталној парадигми морају да чекају даље истраживање.
Заједно са нашим претходним извештајем који показује да γ-оризанол умањује склоност за ХФД преко хипоталамичке регулације ЕР стреса код мишева [14], γ-оризанол такође представља јединствену особину побољшања како хедонистичке тако и метаболичке дисрегулације понашања у исхрани. Пошто је познато да неки лекови против гојазности изазивају критичне негативне ефекте8], предвиђен је природан приступ заснован на храни за систем награђивања мозга како би се безбедно лечио синдром гојазности - дијабетес [16]. У овој парадигми, γ-оризанол је обећавајући кандидат за гојазност са израженом својством да је епигенетски модулатор.
Признања
Захваљујемо се С. Окамоту (Универзитет у Риукиусу, Јапан) за преглед рукописа. Захваљујемо се М. Хирати, Х. Канесхиру, И. Асату и Ц. Ногуцхи (Универзитет у Риукиусу, Јапан) за секретарску помоћ.
Скраћенице
| КСНУМКС-аза-дЦ | КСНУМКС-аза-КСНУМКС′-деоксицитидин |
| ДКСНУМКСР | Рецептор допамина ДКСНУМКС |
| ДКСНУМКСР | Рецептор допамина ДКСНУМКС |
| ДАТ | Допамине транспортер |
| ДНМТ | ДНА метхилтрансферасе |
| ER | Ендоплазматични ретикулум |
| ЕРР | Рецептор везан за естроген |
| ХФД | Дијета са високим удјелом масти |
| САХ | S-Аденосил-л-хомоцистеин |
| САМ | S-Аденосил метхионине |
| СТАТКСНУМКСα | Сигнални трансдуктор и активатор транскрипције КСНУМКСα |
| TH | Тиросине хидрокиласе |
белешке
Доступност података
Скупови података генерисани и / или анализирани током текуће студије доступни су од одговарајућег аутора у разумним захтјевима.
Финансирање
Овај рад је делимично подржан од стране Грантс-ин-Аид-а из Јапанског друштва за промоцију науке (ЈСПС; КАКЕНХИ Грант бројеви КСНУМКСККСНУМКС и КСНУМКС), Савет за науку, технологију и иновације (ЦСТИ), Међуминистарски програм за промоцију иновација (СИП) „Технологије за стварање пољопривреде, шумарства и рибарства сљедеће генерације“, Фондација Лотте, Јапанска фондација за примијењену ензимологију, Организација за развој нове енергије и индустријске технологије (НЕДО), Пројект за формирање мреже знаности о животу (фармацеутско поље) (Окинава, Јапан) и Пројекат промоције медицинског кластерирања Окинава, Јапан, заједно са донацијом Окинавске префектуре за промоцију напредне медицине (Окинава, Јапан).
Дуалност интереса
Аутори изјављују да не постоји двојност интереса везаног за овај рукопис.
Изјава о доприносу
ЦК и ХМ су дизајнирали истраживање. ЦК и ТК су извели експерименте и анализирали податке. ТК, ЦС-О, ЦТ, МТ, ММ и КА допринели су тумачењу података. ЦК и ХМ су написали рукопис. Сви аутори су допринели интерпретацији података. Сви аутори су се придружили ревизији рукописа и одобрили његову коначну верзију. ХМ је гарант овог посла, имао је потпуни приступ свим подацима и преузима пуну одговорност за интегритет података и тачност анализе података.
Фусноте
Електронски додатни материјал
Онлине верзија овог чланка (дои: КСНУМКС / сКСНУМКС-КСНУМКС-КСНУМКС-КСНУМКС) садржи рецензирани, али необрађени допунски материјал, који је доступан овлаштеним корисницима.
Референце
;