Густина синапсе и дендритична комплексност смањене су у префронталном кортексу након седам дана принудне апстиненције од само-администрације кокаина (КСНУМКС)

Изложеност хроничном кокаину код овисника и код овисника код људи са глодавцима смањује префронталну кортикалну активност, која касније ремети регулацију награђивања и извршну функцију вишег реда. Нето ефекат овог поремећеног отварања понашања је повећана рањивост на повратак. Раније смо показали да кокаином изазвано повећање експресије неуротрофног фактора (БДНФ) из мозга у медијалном префронталном кортексу (ПФЦ) је неуроадаптивни механизам који ублажава појачавајућу ефикасност кокаина. Пошто је познато да БДНФ утиче на преживљавање неурона и синаптичку пластичност, тестирали смо хипотезу да би апстиненција од само-администрације кокаина довела до измена морфологије неурона и синаптичке густине у ПФЦ-у. Коришћењем нове технике, математичке томографије и Голгијевог бојења, морфолошке промене у ПФЦ пацова анализиране су после КСНУМКС дана самоуправе кокаина и КСНУМКС дана присилне апстиненције. Наши резултати показују да су укупна дендритска гранања и укупна синаптичка густина значајно смањени у ПФЦ пацова. Насупрот томе, густина танких дендритичних бодова значајно је повећана на пирамидним неуронима слоја В ПФЦ-а. Ови налази указују да се током кокаинске апстиненције дешавају динамичке структурне промене које могу да допринесу посматраној хипоактивности ПФЦ код појединаца који су овисни о кокаину.

Животиње и становање

Мушки пацови Спрагуе-Давлеи (Раттус норвегицус) тежине 250–300 г добијени су из Тацониц Лабораториес (Германтовн, НИ). Животиње су појединачно биле смештене са храном и водом доступном ад либитум у свом кућном кавезу. Сви експериментални протоколи били су у складу са смерницама америчког Националног института за здравље, а одобрио их је Медицински факултет Перелман на Универзитету у Пенсилванији и Одбор за институционалну негу и употребу животиња Универзитета у Пенсилванији.

Хирургија

Пре операције, пацови су анестезирани са КСНУМКС мг / кг кетамина и КСНУМКС мг / кг ксилазином (ип; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО). Унутрашњи силастични катетер (унутрашњи пречник КСНУМКС мм, спољни пречник КСНУМКС мм) убачен је у десну југуларну вену и зашивен на месту. Катетер је затим пропуштен субкутано преко лопатице за раме и преусмерен на платформу са мрежицом (ЦамЦатх, Цамбридге, УК) која је зашивена испод коже директно изнад лопатице. Катетери су свакодневно испрани са КСНУМКС мл антибиотика Тиментина (тицарцилин динатријум / калијум клавуланат, КСНУМКС мг / мл; Хенри Сцхеин, Мелвилле, НИ) растворени у хепаринизованом раствору соли (КСНУМКС У / мл). Катетери су затворени пластичним обтураторима када нису били у употреби.

Кокаинска самоуправа

Штакорима је омогућено КСНУМКС дана да се опораве од операције пре него што је кокаинска самоуправа започела. Пацови су насумично распоређени у једну од две групе: животиње које се самостално дају кокаин и контролисане слане соли. Сваки пацов обучен да реагује на контингентне кокаинске инфузије упарен је са субјектом који је имао јајника и који је добио исти број и временски образац инфузија као и самопримењени од стране упареног кокаин-експерименталног пацова. Притисак на полугу за пацове који су били подвргнути физиолошком раствору нису имали планиране последице.

У почетку, кокаин-експериментални пацови су смештени у модуларне оперантне коморе (Мед Ассоциатес, Ст. Албанс, ВТ) и дозвољено им је да притисну притисак за интравенске инфузије кокаина (КСНУМКС мг кокаин / КСНУМКС µл слан, инфузија преко КСНУМКС с) на фиксној однос КСНУМКС (ФРКСНУМКС) распоред арматуре. Једном када је кокаин-експериментални пацов постигао најмање инфузије кокаина КСНУМКС у једној оперантној сесији под распоредом ФРКСНУМКС, захтев за одговор је пребачен на ФРКСНУМКС распоред појачања. За одговарање на оба фиксна распореда, максимални број инфузија кокаина је био ограничен на КСНУМКС по дневној сесији самоуправе, а КСНУМКС с периодом одгоде након сваке инфузије кокаина, током којег су активни одговори полуге табелирани, али нису имали планиране последице . Дневне КСНУМКС х оперантне сесије (КСНУМКС дана / седмица) проведене су за укупно КСНУМКС дана. Одговори на неактивну полугу, која нису имали планиране последице, такође су забележени током тренинга ФРКСНУМКС и ФРКСНУМКС.

После КСНУМКС-а^th дневне оперативне сесије, контролни пацови са кокаином и експериментом са салином су враћени у њихове кавезе где су били подвргнути КСНУМКС данима апстиненције. На КСНУМКС-у^th Дан апстиненције кокаина, мозак је уклоњен и ПФЦ је дисециран на леду. Седам дана апстиненције кокаина изабрано је како би се директно упоредила са нашом раније објављеном студијом која је испитивала промене у пФЦ БДНФ [КСНУМКС].

Перфузија

Пацови су анестезирани (КСНУМКС мг / кг, ип натријум пентобарбитал) и перфундирани са ледено хладним КСНУМКС% параформалдехидом у КСНУМКС М ПБ, пХ КСНУМКС (ПФА). Једна хемисфера из сваког мозга је коришћена за бојење голгија, а друга хемисфера за матричну томографију. Хемисфере матрице су пост-фиксиране у КСНУМКС% ПФА са КСНУМКС% сахарозом за КСНУМКС сати, а Голги хемисфере су постављене за КСНУМКС х у КСНУМКС% ПФА.

Арраи Томограпхи

Експерименти за матрични томографију су изведени као што је претходно описано [КСНУМКС], [КСНУМКС]. Укратко, ПФА фиксно ткиво је уклопљено у смолу и короналне (КСНУМКС нм) секције на нивоу мПФЦ-а су сечене и сакупљене као врпца. Траке су хидриране у КСНУМКС мМ глицину у Трис и блокиране у раствору за блокирање (КСНУМКС% Твеен / КСНУМКС% говеђег серумског албумина у Трис пуферу (КСНУМКС мМ Трис / КСНУМКС мМ НаЦл, пХ КСНУМКС). Цхемицон), ПСДКСНУМКС (Целл Сигналинг), или синаптопхисин (Абцам), у раствору који блокира преко ноћи на КСНУМКС ° Ц. Траке су испране са Трис пуфером и обојене са секундарним антителима на КСНУМКСКСНУМКС у блокирајућем раствору (козји анти-мишји брашно АКСНУМКС и козји анти-зечји циКСНУМКС или магарећи анти-зечји циКСНУМКС). Траке су биле обојене ДАПИ-јем како би се олакшало проналажење истих локација на сваком одељку. Слике скенирања плочица су сакупљене помоћу Зеисс АкиоИмагер ЗКСНУМКС епифлуоресцентног микроскопа. Слике са истог сајта на сваком од КСНУМКС-КСНУМКС серијских секција по рибону су набављене у КСНУМКСк-у са аутоматизованим програмима специјализованим за матричне томографије.

Арраи Томограпхи Аналисис

Серијске слике са сваке траке су секвенцијално отворене, претворене у стог и усклађене са додатцима МултиСтацкРег и СтацкРег (захваљујући Б. Буссе на Станфорд универзитету и [КСНУМКС], [КСНУМКС]. Кутије за усеве (КСНУМКС µмкКСНУМКС ум) су коришћене за селекцију региона од интереса (РОИ) у неуропилу за квантификацију. Избори су морали да искључе неуронска ћелијска тела или друге нејасне особине. За аутоматску анализу слике, интересне културе (или РОИ) за синаптофизин, декарбоксилазу глутаминске киселине-КСНУМКС (ГАДКСНУМКС) и ПСДКСНУМКС су аутоматски постављене у аутоматском алгоритму у ИмагеЈ. Усјеви су кодирани и анализа је била слепа за стање. Као што је претходно описано, употребљен је аутоматизовани програм детекције на основу прага за квантификацију броја пункта идентификованих као позитивне синапсе. [КСНУМКС]. Густине пресинаптичких терминала, ексцитаторних постсинаптичких терминала и проценат ГАД-позитивних (инхибиторних) синапси израчунате су из просека узорака КСНУМКС узорака по животињи сакупљеним из два различита блока ткива из ПФЦ (н).=КСНУМКС третиране кокаином, животиње које су третиране са КСНУМКС физиолошким раствором) за укупно КСНУМКС постсинаптичких пункта и КСНУМКС пресинаптичких пункта са КСНУМКС места узорковања код КСНУМКС физиолошки третираних животиња и КСНУМКС постсинаптичких и КСНУМКС пресинаптичких пункта са КСНУМКС узорака животиња. Израчунате су средње вредности за густину синапси и проценат инхибиторних синапса по животињи, а т-тестови се изводе уз помоћ медијана животиње да би се тестирало да ли постоји разлика између средстава групе.

Метод Рапид-Голги

Једна секција Голгијевог бојења је изведена као што је претходно описано [КСНУМКС], [КСНУМКС]. Укратко, мПФЦ из једне хемисфере сваке животиње се исече у КСНУМКС µм короналне секције и пост-фиксира у КСНУМКС% осмијум тетраоксиду након чега следи три испирања у КСНУМКС М ПБ, пХ КСНУМКС. Секције су инкубиране у КСНУМКС% калијум дикромату преко ноћи, кратко испране и инфилтриране са КСНУМКС% сребрним нитратом сендвич методом [КСНУМКС]. Секције су постављене на плочице пресвучене желатином са КСНУМКС% сахарозом и дехидриране кроз серију концентрација алкохола праћену де-тензијом у ксилену и прекривању.

Голги анализа

Голгијеви слајдови су кодирани и анализирани слепи до стања и сви су анализирани од стране истог експериментатора. Неуроналне слике и трагови и репрезентативне слике дендритских бодља сакупљени су помоћу усправног БКСКСНУМКС Олимпус микроскопа са интегрисаном моторизованом фазом (Приор Сциентифиц, Роцкланд, МА) са КСНУМКС × КСНУМКС НА циљем. За дендритску анализу гранања, КСНУМКС неурони су изабрани за анализу по животињи. Измерили смо неуритску дужину и комплексност користећи макрое НеуронЈ и Адванцед Схолл Аналисис, респективно. Између група је мерен број раскрсница (тачака гранања) у концентричним круговима у радијусима између КСНУМКС-КСНУМКС µм (укључујући базалне и апикалне дендрите). За анализу густине кичме, КСНУМКС – КСНУМКС сегменти од најмање КСНУМКС µм дужине од базалних дендрита трећег реда анализирани су по неурону из неурона КСНУМКС – КСНУМКС по животињи користећи Зеисс АкиоИмагер ЗКСНУМКС епифлуоресцентни микроскоп са КСНУМКСк уљем. Морфологија кичме је класификована као што је претходно описано [КСНУМКС]. Линеарна густина кичме за сваки дендритички сегмент и морфологију кичме (танка, здепаста, гљива, у облику чаше) сваке кичме поређена је између група. Софтвер отвореног кода из Националног института за здравље (ИмагеЈ) је коришћен за анализу података Голги и математичке томографије.

Апстиненција од кокаина смањује укупну густину синапси

Арраи томографија је коришћена за мерење промена у екситаторним и инхибиторним синапама како би се одредиле специфичне морфолошке промене које се јављају у ПФЦ-у као одговор на апстиненцију од само-администрације кокаина. Арраи томографија је високо пропусна метода која омогућава прецизну квантификацију укупних, инхибиторних и ексцитаторних синапси у структурама које су премале да би се правилно идентификовале или локализирале традиционалним методама конфокалне микроскопије. [КСНУМКС]. Као и инхибиторни и ексцитаторни синапси су есенцијалне компоненте круга награђивања лијекова [КСНУМКС], [КСНУМКС], [КСНУМКС] Користили смо ову нову методологију за процену морфолошких промена у ПФЦ-у током апстиненције од кокаина. Седамдесет нм секција ПФЦ-а из једне хемисфере мозга са КСНУМКС-јал-сланим и КСНУМКС кокаин-искусним пацовима обојени су антителима на ПСДКСНУМКС, постсинаптички ексцитаторни маркер, синаптофизин, пресинаптички маркер и ГАДКСНУМКС, који су обележили инхибиторне неуроне и синапсе. Густине синапса и проценат инхибиторних синапси одређени су у кортикалном слоју В (Слика КСНУМКСА и КСНУМКСБ). Наши резултати показују да је током апстиненције од кокаина дошло до значајног смањења густине синаптофизина (Слика КСНУМКСЦ), који мери све пресинаптичке терминале [т (КСНУМКС)]=2, п <0.05]. Није било значајног смањења густине ексцитационе синапсе [т (8)=КСНУМКС, стр=КСНУМКС] мерено бројањем ПСДКСНУМКС пунцта (Фигуре КСНУМКСД). Интересантно је да није било значајног тренда повећања процента ГАДКСНУМКС-позитивних инхибиторних синапси [т (КСНУМКС)=-КСНУМКС, стр=КСНУМКС] (Фигуре КСНУМКСЕ).

 

Слика КСНУМКС

Матрична томографија открива промене у густини синапси у ПФЦ-у после КСНУМКС дана апстиненције од кокаина.

 

Слика КСНУМКС

Једна секција Голгијеве анализе открива промене у дендритичком гранању и формирању кичме у ПФЦ-у после КСНУМКС дана апстиненције од кокаина.

Апстиненција од кокаина смањује дендритско гранање док пролазно повећава густину кичме у ПФЦ

Голги метода је коришћена за испитивање измена у гранама неурона и густоћи дендритске кичме како би се потврдиле ултраструктурне промене у густини синапси (Слика КСНУМКС). Провели смо једну секцију брзе Голгијеве импрегнације на подскупу неурона у ПФЦ-у из других хемисфера истих животиња које су кориштене за студије матричне томографије. Процењене су дендритске гранање, број дендритских кичми и морфологија кичме. Два репрезентативна пирамидална неурона из ПФЦ-а контролисаног јогом-сланим раствором и пацова изложених кокаину приказана су у Слика КСНУМКСА. Схолл-ова парцела је измерила број пресека (тачке гранања) у концентричним круговима у радијусима између КСНУМКС-КСНУМКС µм. Наши резултати показују да је након КСНУМКС дана присилне апстиненције од само-администрације кокаина дошло до значајног смањења дендритичке комплексности (Слика КСНУМКСБ). Анализа АНОВА-е двосмерним поновљеним мерењима података шолске парцеле открила је значајне главне ефекте третмана [Ф_(1,738)=30.59, п <0.0001] и полупречник [Ф_{(КСНУМКС, КСНУМКС)}=289.6, п <0.0001] (Слика КСНУМКСБ), потврђујући губитак дендрита који се слажу са губитком синапси измереним у низу студија (Слика КСНУМКСЦ). Анализа базиларних дендрита другог и трећег реда показала је значајно повећање дендритичних бодљикаша после КСНУМКС дана апстиненције кокаина [т (КСНУМКС)]=−3.12, п <0.05] (Фигуре КСНУМКСД). Конкретније, апстиненција од излагања кокаину повећала је број танких подтипова кичме, док није имала значајан утицај на друге подтипове кичме (Фигуре КСНУМКСЕ), откривен двосмјерним поновљеним мјерењима АНОВА са главним ефектима третмана [Ф_(1,30)=КСНУМКС, стр=КСНУМКС], подтип спине [Ф_(4,30)=57.7, п <0.0001], и значајна терапија к интеракција подтипа кичме [Ф_{(КСНУМКС, КСНУМКС, КСНУМКС)}=8.8, п <0.0001].

Аутори се захваљују Гавину Сангреију на помоћи у припреми уграђених капсула.