PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
мавҳум
Тағирёбии Кокаин дар таркиби генӣ боиси тағйирёбии морфология ва рафтори неврологӣ мегардад, ки метавонанд дар таҳлили кокаин дар зери таъсири он қарор гиранд. Мо барои рентген 3 лента 9 (H3K9) dimethylation ва лизин dimethyltransferase G9a дар пластикаи структуравӣ ва таркибии кокаин нақши муҳимро муайян намудем. Идораи такрории кокаин сатҳҳои глобалии H3K9 dimethylation дар атомҳои нуклеус кам карда шуд. Т.кам кардани вай дар мелиоратив histone аз сабаби зӯроварии G9a дар ин минтақаи мағзие, ки аз ҷониби омилҳои кокси тавлиди оҳангефтаи ΔFosB танзим шуда буд, ба миён омад. Истифодаи mutagenesis ва вирус-вируси вирусии муосир нишон дод, ки коҳиши G9a афзоиши бензоликии рентгении невлусро дар атрофи невунҳо ва афзалиятҳои афзоянда барои кокаин ба вуҷуд овардааст, ки ин ба нақши муҳими муомилоти геномикӣ дар амалҳои дарозмӯҳлати кокаин асос меёбад.
Муқаддима
Таъсири кокаинҳои такроршаванда бо тағирёбии доимӣ дар ифодаи геносома ва тағйирёбии морфологияи ноқилии дохили ҳуҷайраҳои nucleus (NAc), ҷузъи калидии сектори мукофоти пулӣ (1-2). Тағироти Chromatin дар тағйироти табиии кӯтоҳтарини ин минтақаи майна муҳим аст, ки асбоби кашидани кокаинро (3-9). Танзими кокаинии сохтори хроматиро дар натиљањои НА-њо, ќисман, аз таѓироти мустаќими кокаин вобаста ба мошинњои хроматини enzymatic, ки ба таѓирёбии гидрилатсия ва фосфатдорї (4, 7-9); Бо вуҷуди ин, нақшҳо барои фишор болои ферментҳои эндокринӣ histone ҳанӯз таҳқиқ нашудаанд.
Таҳлили охирини генетикаи эффективӣ бо ёрии иммунопрограммаҳои хромограмма бо микросхемаҳо (Чип-Чип) муайян карда шудааст, ки шаклҳои тағйирёбандаи гипертоникӣ H3 9 (H3K9) ва 27 (M3K27) methylation дар протсессори генетикии мушаххас дар NAc пас аз табобати кокси такрорӣ (6). Аз ин рӯ, мо метавонем бисёре аз methyltransferases (KMTs) ва демократизатсияҳо (KDMs), ки барои назорат кардани H3K9 ё M3K27 (Намунаи 1A). Танҳо ду ферментҳо, G9a ва GLP, соатҳои шабақаи 24-ро пас аз идоракунии кокаинҳои такрорӣ нишон доданд, вақте ки ҳарду ҳарду ба таври назаррас паст карда шуданд. Зеро G9a ва GLP махсусан dimethylation H3K9 (H3K9me2) омехта мекунанд, пастшавии он бо кокаин бо сатҳи пастшавии сатҳи гипертоникии H3K9me2 ба инобат гирифта мешавад (Намунаи 1B). Баръакс, мелиоративии гидротехникии H3K27 глобалӣ бо таъсири кокси такрорӣ такмил ёфт (Намоиши S1 дар дастгирӣ кардани маводи онлайн). Бо сабаби сатҳи баланди фаъолияти catalytic ҳам дар vitro ва дар вирус (10), мо ба омӯхтани аҳамияти функсионалии зӯроварии G9a пас аз таъсири кокси такрорӣ дар NAc таҳия кардаем. Сатҳи сафедаи G9a, монанди сатҳҳои mRNA-и худ, соатҳои 24 баъди идоракунии кокаинҳои такрорӣ (Намунаи S2). Гарчанде тавсифи G9a mRNA аз ҷониби 35% дар NAc кам карда шуда буд, таҳлили immunohistochemical коҳиши нисбатан заиф 15a дар сатҳи сафедаи G9a, бо коҳиши% 21%Намунаи 1B). Эъломияи G9a mRNA дар ин минтақаи майна аз ҷониби 20% пас аз худкушӣ аз кокаин (такрорӣ)Намунаи S3).
Барои муайян кардани он, ки оё тағиротҳои электронии H3K9me2 бо тағирёбии генҳо дар экспертизаи генетикӣ дар NAc алоқаманд аст, мо ба таҳлили генҳои таблиғотиро, ки бо миқдори ғадуди кокаин дар ҳайвонҳо бо ё аз таърихи пешакии кокаин гузаштааст, дида мебароем. рӯйхати генҳо дар Tables S1-S3). Ҳайвоноте, ки ба кокаин такрорӣ кардаанд, нишон доданд, ки як соат дертар 1 нишон дод, ки дар муқоиса бо ҳайвонҳои шифобахшТасвири 1C). Ин афзоиши ифодаи генҳо ҳанӯз дар посух ба мушкилоти кокаин, ки баъди ҳафтаи 1 аз коксури такрорӣ боздошта шуда буд, рух дод. Мутобиқи ҳисоботи пешакӣ, фоизи хурди генҳо (~ 10%) пас аз такрори маъмури кокси такрорӣ (Тасвири 1C; бинед Ҷадвали S1) (5). Барои бевосита нақши паст кардани нармшавии G9a дар таркиби генетикаи такрорӣ, ки баъди кокаин такроран мушоҳида шудааст, мушакҳо дар дохили VA-NAc вирусҳои вирусҳои гипсикс гипервис (HSV) -ро, ки бо GFP ё G9a ифода мекунанд ва бо шӯр ва ё такрори такрорӣ бо мақсади муайян кардани он ки G9a excerexpression барои пешгирӣ намудани такрори коэффисиентҳои гигиении такрории такрори генҳои кофӣ кофист. Аз маҷмӯи 12 генҳои интихобшудаи ҷудошуда нишон доданд, ки сатҳҳои баланди ифодаи кокаинро такрор карда, мо мебинем, ки G9a ифодаи ифодаи ифодаи 50% аз ин genҶадвали S4).
Барои муайян кардани воқеаҳои мураккаби трансплантатсионӣ, ки мафҳуми координатаи такрории ғизои ғизоии G9a мебошад, мо барои ΔFosB, маҳсулнокии доимии гинтерҳои барвақтии мавсим Фосфат. ΔFOSB дар NAc пас аз такрори кокаин такроран такрор карда мешавад, ки он ба афзоиши музди кокаин вобаста аст (11). ΔFosB метавонад ҳамчун як фаъолкунандаи transcriptor ё такрорӣ вобаста ба ген кардани ҳадаф3, 5, 6, 12). Истифодаи bitransgenic NSE-ТТА × tetOP-ΔФосБ Фаронса, ки дар он ифодаи ΔFosB метавонад интихобан дар NAc ва дральтиуми дральти ҳайвоноти калонсолон (13), мо таъсири ΔFosBро оид ба танзими кокаинии H3K9me2 ва KMTs дар NAc тафтиш кардем. ΔFOSB барои баланд бардоштани сатҳи ҳарорати H3K9me2 кофӣ буд (Намоиши 1D) ва баёнияи G9a (Намунаи 1E), ба ин васила ба таъсири омехтаи кокаин такрор карда мешавад. Баръакс, ΔFOSB дар ин минтақаи ҷудоӣ изҳороти GLP-ро кам кард ва ба SUV39H1 ва EZH2, ферментҳои асосии trimethylating барои H3K9 ва H3K27 ҳеҷ гуна таъсир надошт (Намунаи S4). Барои тасдиқи ин маълумот тавассути системаи мустақили ΔFosB мустақиман, мушакҳои калонсоле, ки дар дохили NAc дучори вирусҳои Адаё-алоқаманд вируси (AAV) -ро, ки GFP ё ΔFosB ифода мекунанд, ба даст оварданд. Viral-mediated expression ΔFosB дараҷаи заифии G9a дар ин минтақаи майна (Намунаи 1E).
Чунин танзими зеҳнӣ ва мушаххаси G9a ба мо фаҳмонд, ки оё тағйир додани таркиби G9a, махсусан дар NAc неворҳо ҷавобгарии рафториро ба кокаин танзим мекунад. Чашмакҳои Wildtype дарёфт карданд, ки intra-NAc тазриқи вирусҳои HSV-ро, ки GFP ё G9a-ро ифода мекунанд ва баъдтар бо истифодаи парагигмаҳои норозигии кокаин, ки ба таври ғайримустақим мукофотпулиҳои нархро таъмин мекунад, таҳлил карда шуд. Гирифтани вирус аз G9a дар NAc нейронон пас аз санҷиши рафтор тасдиқ карда шуд (Намунаи 2A). G9a изофанависӣ барои кокаин дар муқоиса бо ҳайвонҳо хеле баланд аст, ки GFP (Намунаи 2B) ва сатҳҳои H3K9me2 дар NAc (Тасвири 2C). Миқдори зиёдшавии mutant catalytic dead G9a (G9aH1093K) (14) ба афзалияти кокаин таъсир намерасонад (Намунаи 2B) ва дар сатҳҳои ҳаҷмии H3K9me2 ба ин минтақаи майнагӣ таъсир нарасониданд (Тасвири 2C).
Барои минбаъд омӯхтани нақши G9a дар таъсироти рафтори кокаин, ва махсусан, ба такмил додани шиддатнокии кокаин вобаста ба G9a дар NAc, калонсолони G9aФлеш / фл мушакҳо (14) ба даст овардани дахолати NAc-ро ба векторҳои AAV-ро, ки рекомбинатсияро ба реаксия ё ГФП ҳамчун назорати назорат мегиранд, гирифтанд. AAV-Cre-knockdown аз G9a дар NAc, ки тасдиқ immunohistochematik (Намунаи S5), таъсироти кокаинро дар таҷрибаҳои таназзули заминсозӣ зиёд намуда, сатҳҳои H3K9me2 дар NAc (Намунаи 2D, E). Панели тиҷоратии дастраси фармакологии G9a ва GLP, BIX01294 (15-16), барои муайян намудани он, ки пӯсти ферментӣ низ ба кокаин таъсир мерасонад, таъсир мерасонад. Дар ҳақиқат, пешгирии фармакологии G9a ва GLP, афзалиятро барои кокаин ва афзоиши H3K9me2 дар NAc (Намунаи 2F, G).
Идоракунии такрории кокаин зичии рагҳои дендритӣро дар NAc микрофилҳои миёна (17), раванди алоқаманд бо тағйироти функсионалии дар изолятсияҳои эндоматикии эпетамерге ба ин нурҳо (18-19) ва ҷавобҳои рафтории рафтор ба маводи мухаддир (17, 20). Мо чунин тасаввур карда будем, ки паст кардани сатҳи фаъолияти G9a дар NAc бо кокаин такроран метавонад қобилияти кокаинро барои танзими зичии рентгении нобаробарии NAc мутақобил кунад. Бо истифода аз антигени зидди гемоглобин бо истифода аз иммунопрозия (хлопин) immunoprecipitation (CHIP), мо якчанд нуктаҳои G9a генетикиро дар NAc муайян намудем, ки ҳар яке аз он дар қабати пластикии кокаин вобаста шудааст (Намунаи 3A) (20-26). Мо мефаҳмем, ки маъмури кокаинии такрории такрори G9a, инчунин сатҳҳои H3K9me2, дар ин гендерҳои презентация (Намунаи 3B). Баръакс, маъмурияти шадиди кокаин босуръат ба G9a ба баъзе аз ин як гендерҳои якхела табдил ёфт, ки бо суръати баландтарини G9a, ки дар соати NAc 1 мушоҳида шудааст, пас аз як воҳиди норасоии кокаин (Намунаи S6). Гарчанде G9a, ки дар протсесси инфиродии алоҳида пайвастанашаванда бо тағирот дар ифодаи он алоқаманд аст, маълум нест, ки оё чунин чорабиниҳо бо тағйирёбии сатҳи глобалии G9a дар NAc ва / ё бо фарқиятҳои G9a пас аз шадид ва ғ. идоракунии Кокаин такроран.
Дар асоси танзими G9a бисёр генҳои вобаста ба пластикӣ дар NAc, мо бевосита ба он ишора мекунем, ки оё нигоҳдории G9a дар ин минтақаи ҳомила пас аз табобати такрории кокаин барои монеъ шудан ба ташаккули коэффитсиенти кендениталии рентгенӣ кофӣ буд. Истифодаи протоколҳои санҷиши кокаин пеш аз он, ки пешгирӣ намудани ангезиши дендритӣ дар NAc (20), мо зичии резиниро дар ҳайвоноте, ки HSV-GFP ё HSV-G9a дода шудааст, баррасӣ намудем. Дар мувофиқа бо пешгӯиҳои қаблӣ мо афзоиши назаррас дар зичии рентгении дендритӣ дар NAc пас аз табобати кокаин, ки таъсири он аз тарафи G9a excerexpressionТасвири 3C). G9a таносуби таносуби камшавии зичии рагҳои NAc dendritic дар набудани кокаин кофӣ набуд. Барои пур кардани ин маълумот, G9aФлеш / фл Фаронсаҳои дохилӣ-NAc-ро гирифтори бемориҳои HSV-крист ва сутунмӯҳра ба шумор мерафтанд ва дар муқоиса бо ҳайвоноте, ки HSV-GFP доранд, дар сурати мавҷуд набудани кокаин муқоиса карда шудаанд. Диққати зуҳури G9a зичии зичро дар найронҳои найчаҳои NAc миёна баланд бардошт (Тасвири 3C).
Бо назардошти далелҳое, ки дар NAc паст кардани сатҳи G9a баъди Кокаин такроран аз ҷониби ΔFOSB муҷаҳҳазанд, мо минбаъд санҷидаем, ки ин омилҳои трансплантатсия низ дар танзими НАc dendritic. Гарчанде ки ΔFosB пештар бо пластмассатсияи чунин дандисӣ аллакай алоқаманд набуд, як қатор мақсадҳои он, аз қабили зергурӯҳҳои Cdk5 ва NFBB, ба инобат гирифта шудаанд (20-23), ва ΔFosB ифодакунандаи доимии NAc неврон бо афзоиши зичии паҳншавии дендритӣ пас аз табобати кокаинии такрорӣ (27). Якум, мо муайян кардем, ки ΔFOSB дар функсияи bitransengic-ро дар сурати мавҷуд набудани кокаин, ки ифодаи G9a ва H3K9me2 (Намунаи 1D, E), заифии G9a -ро ба генҳои вобаста ба плитка алоқаманд кард, ки бисёре аз онҳо ба ҳадафҳои бевоситаи ΔFОБ нишон дода шудаанд (Намоиши 3D) (3, 6). Мо минбаъд нишон додем, ки фишори вирусии ΔFosB дар NAc зичии ангиштро дар шароити асосї афзоиш дод, ба монанди он, ки пас аз идоракунии Кокаин такроран (Намунаи 3E). Бешубҳа, аз ҳад зиёд изофанависӣ дар NAc аз ΔJunD, сафедаи мулоимии тазриқи манфии манфии ΔFosB, қобилияти кокаинро такмил додан барои ташаккули таркиби дендритӣ дар NAc (Тасвири 3C).
Мо мушоҳида мекунем, ки ΔFОБ ифодаи G9a -ро дар NAc танзим мекунад ва ΔFosB ва G9a баъзе аз як генҳои ҳадафиро танзим намуда, моро ба дигар муносибатҳо байни ΔFosB ва G9a омӯхтанд. Пас аз кокаин шадид, вақте ки сатҳҳои G9a зиёд шудаанд, пайвастшавии G9a ба Фосфат гено афзуд, дар ҳоле ки баъд аз кокаин такроран, вақте ки изҳороти G9a қатъ карда шуд, G9a ба маҳдудиятҳое, Фосфат gene decrease (Намунаи 3A). Пас аз фурӯши G9a коҳиши кокаин такроран ба қайд гирифта нашудааст c-fos, ки маҳдудияти G9a бо кокаин такрорӣ шудааст (Намунаи S7). Ин бо он аст, ки, ба назар мерасад Фосфат, c-fos ки аз таъсири психотиммуланалии музмини5). ΔFosB баландсифат дар маскани bitransgenic барои қавӣ барои кам кардани G9a мӯҳтавои фосфор ген (Намоиши 3D). Ғайр аз ин, G9a изофанависӣ барои паст кардани суръати афзоиши ΔFОБ, ки баъди такроршавии кокси такрорӣ (Ҷадвали S4). Маълумоти мазкур инъикоси autoregulatory-ро пешниҳод мекунад, ки G9a аввалан огаҳии ΔFOSB аз ҷониби маъмурияти шадиди кокаинро маҳдуд менамояд. Аммо, чунон ки ΔFosB бо зуҳуроти такрории такрорӣ ҷамъоварӣ мекунад, онро G9a фишурда ва аз ин рӯ инъикоси минбаъдаи худро тақвият медиҳад.
Дар натиҷа, мо нишон додем, ки methylation lysine methylation дар NAc ба танзим дар танзими генофонияи нейронон дар ҷавоб ба кокаин ҷалб карда шудааст. Тафтиши G9a ва H3K9me2 пас аз идоракунии кокаин такрор ба такмили кокаин, қисман, тавассути фаъолгардии транстатрикии генҳои сершумор, ки танзими шаклҳои заифии пластмассии дандисиро танзим мекунанд, мусоидат мекунад. Гирифтани фаҳмиши беҳтарини генҳо тавассути чунин механизмҳо танзим карда мешавад, ки дониши мо дар асоси базаи мураккаби биологии маводи мухаддир беҳтар карда шавад ва метавонад дар таҳияи муассирии муассири ихтилофоти озодӣ кӯмак расонад.
Мавод ва усул
Ҳайвонот ва табобатҳо
Агар дар назар дошта нашуда бошад, мушакҳо дар чорчӯбаи доимии (12 ° C) бо чорчӯбаи доимӣ (7: 00 AM ба 7: 00 PM) дар давоми якуним соат дар як колония дар як колония бо 23 соати якум (XNUMX AM Озодӣ " дастрасӣ ба об ва хӯрок Ҳамаи протоколҳои ҳайвонот аз ҷониби IACUC дар маркази тиббии марказии UT ва Mount Sinai Medicine тасдиқ карда шуданд.
Барои санҷишҳои кокаин [immunohistochemitry, blotting, ғизои ғарбӣ, PCR микрографӣ, таҳлили микроэлементҳо ва иммунопрозилатсия (chipomatin immunoprecipitation (CHIP)], 8 - ба мушоҳидаҳои 10-и писарони C57BL / 6J истифода шуданд. Ҳайвонот ҳаргиз ҳаракати ҳаракати «saline» (7 saline, ip, cocaine), шифобахши шадиди хун (6 табобати шифобахш + табобатро 20 mg / кг Кокаин-HCl, ip) ё кокаин (такрорӣ) (7 treatments 20 мг / кг кокаин-HCl, ip). Фаронсаро дар як соат 1 ё 24 пас аз табобати ниҳоӣ қурбонӣ мекарданд. Барои тадқиқоти микроорганизмҳо ҳайвонҳо ҳар рӯз бо "saline" (шифоҳои табобатӣ 15, ip), 'cocaine' шадиди (табобати 14 табобат + 1 муолиҷа 20 mg / kg кокаин-HCl, ip), 'кокаин' Кокаинҳои табобатӣ 7-ро мефиристанд ва рентгени 8 / mg-кг Кокаин / HCI, ip) ё 'коғазҳои такрорӣ + кокаин' (табобати 20 7 mg / kg табобати ширин + 20 табобат + 7 муолиҷаи xNUMX mg / kg Кокаин-HCl, ip) ва пас аз табобат дар охири 1 қурбонӣ карда шуданд. Дар озмоишҳои физикӣ мушакҳо баъд аз ҷарроҳӣ ҷойгир шудаанд ва бо кгино-HCl, 20 мг / кг, ҳамчун рабте, ки дар поён оварда шудаанд, муносибат карданд. Барои таҳлили дендритӣ ва самаранокии микрогресс баъди сироятшавии HSV-GFP ва HSV-G1a-GFP, мушакҳо бо «ширин» (шифо, рентген) 10 ё 'кокаинҳои такрорӣ' (9 treatments 5 mg / kg Кокаин-HCI ) дар тӯли рӯзҳои 5, чунки протоколи тазриқӣ пештар зичтарини зичии рентгени атомҳои Nuclei (NAc) дар нимсолаи Вируси осиёи Вирус (HSV) ифодаи transgene (Шабакаи иловагӣ S1). Фариштаҳо барои таҳлили релефи рентгенӣ истифода шудаанд, баъд аз табобати охирон соатҳои 4 қурбонӣ карда шуданд.
Барои исбот кардани маҳалҳои маҳалии G9a, ки ба NAc невунҳо маҳдуд аст, мо аллотеки mutter homosygous барои герби G9a allele, ки дар ҷузъиёти дигар ҷойгир шудаандS2). Реаксияи эффективӣ истеҳсолоти 22-ро ба 25 берун аз чаҳорчӯбаи беруна пешкаш мекунад, ки ба нокомии ноустувори нусхаи mutated. Мо мушакҳои G9a floxedро истифода бурдем, ки ба Mice C57BL / 6J пурра пушида буданд. Фариштаҳо ба sterotaxically-ба NAc бо вирусҳо (АВВ) вирусҳо (serotype 2) ифода мекунанд GFP ё Cre-GFP байни синну солҳои 7 ва 10. Таҳлили иммуногогхимикӣ барои тасдиқ кардани самаранокии реформаҳои криминализатсия истифода шудааст (ниг Намунаи иловагӣ S5). Мо AAV-ро ҳайвонҳои тазриқӣ 21 пас аз ҷарроҳӣ истифода бурдем, зеро рекурсия дар G9a популятсия бо суръати мӯътадил ва дар айни замон, бо дарназардошти ҳисоботҳои чопшудаS3-S4). G9a ва ΔJUND озмоишҳои экспрессиментӣ бо истифодаи векторҳои вирусии HSV, ки GFP, wildtype G9a-GFP, catalytically dead G9aH1093K-GFP ё ΔJunD-GFP S2 барои маълумоти муфассал дар бораи рушди G9a сохторҳо). Чашмакҳои HSV аз миқдори зиёди миқдори зиёди 3 баъди ҷарроҳӣ истифода мешуданд, зеро аз ҳад зиёд миқёс дар ин лаҳза нуқтае, ки аз тариқи тавассути immunohistochemistry мушоҳида шудааст. Дар робита ба хусусияти мувозинатии шарҳи HSV ва хусусияти нисбатан устувори ААВ, экспертизаи HSV дар экспериментҳо талаб карда мешавад, ки экспертизаро зуд ва кӯтоҳтарини transgene истифода баранд, вале векторҳои AAV дар озмоишҳое, ки талаботҳои дарозмуддати ифодаи трансгентиро истифода мебаранд, истифода бурданд. Ҳарду векторҳо дар таҳқиқоти қаблӣ, ба танҳо ҷарроҳии ҳуҷайраҳои нуриотик дар дохили майдони тазриқӣ, бе ягон сирояти нангинӣ ё нофармонӣ нишон дода шудаанд.
Барои санҷишҳои рафтори истифодабарандаи G9a / GLP inhibitor, фармоишҳои BIX01294 (25 ng / μl), мушакҳо бо ду дуюм насосҳои хурд, инчунин канали роҳнамоии дуҷониба ба NAc дода шудаанд. Мини Mini-моддаҳои қабати 12 то оғози кишти такрорӣ (0.25 μl / соат) -и ҳар як нақл (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) ё маводи мухаддир барои рӯзҳои 14, ки дар он вақт арзёбӣҳои рафторӣ анҷом дода шудаанд, фаъол карда шуданд.
Барои таҷрибаҳои экскурсияҳои ΔFosB [blotting western, qPCR ва CHIP], эрозияи мардалии NSE-ТТА × tetOP-ΔФосБ Чорчӯбаҳо (ҳафтаи 10) истифода шуданд, ки дар натиҷа дар сурати мавҷуд набудани тектаксивӣ диссисиклинӣ (ҳафтаҳои ҳафтаи XIXXXXXXXX), ҳайвонҳо нишондиҳандаи асосии изофанависии ΔFosB -ро нишон доданд (S5). ΔFosB дар ин мушҳо аз тарафи qPCR тасдиқ карда шуд. Барои тасдиқи натиҷаҳои истифодаи NSE-ТТА × tetOP-ΔФосБ Фариштаҳо, мушакҳои 8-ҳафтаи сола C57BL / 6J мардон дар дохили NAc бо векторҳои AAV, ки GFP ё ΔFosB-GFP-ро ифода мекунанд, манъ карда шудаанд. Векторҳои AAV дар ин маврид истифода бурданд, ки дар ҳафтаи 8 экспертизаи максималии ΔFosB-ро пас аз ҷарроҳӣ истифода бурд, ки ба муқоисаи бевосита дар байни функсияҳои ΔFOSB вируспазирии вируспазири вирус ва сирояти вируспазири организм имконпазир аст. Вируси сафеда бо истифода аз qPCR дар ҳафтаи 8 баъди ҷарроҳӣ анҷом дода шуд (15-gauge NAc пӯпакҳо дар зери сайти тазриқӣ) дода шуданд. AAV-GFP ва AAV-ΔFosB-GFP мушоҳидаҳои зиёдеро, ки барои QPCR истифода намешаванд, бо шӯр меномиданд (Xineum saline, saline) ё кокаин (такрори 14 mg / kg Кокаин-HCl, ip) аз аввали ҳафтаҳои 14, ҷарроҳӣ Рӯзҳои 30 пас аз табобати ниҳоӣ, ғафсҳо бо 6% paraformaldehyde, ки дар як vibratome ҷойгир шудаанд ва барои таҳлили рентгенӣ истифода мешаванд.
Таҳлили забони англисӣ
14-нишондиҳандаҳои NAc қуттиҳои сохти 1 мм бо истифода аз матритсаи пӯсти пӯсти косметикӣ гирифта шудаанд ва дар 1 M HEPES lysis (1% SDS) -ро дар бар мегиранд, ки протестант ва фосфататонро пешгирӣ мекунанд. 10-Намунаҳои 30 миқдори сафедаи умумӣ дар 18% SDS-electrophoresed electrophoresed. Нишондиҳандаҳо ба мембранаҳои PVDF интиқол дода шуданд ва бо ҳам зидди H3K9me2 (моноклонҳои мушак, 1: 500), anti-β-tubulin (monoclonal mouse, 1: 60,000), гилеми зиддимикробӣ H3 (харгӯш поликлинал, 1: 5,000), (anti-GFP) (барои тасдиқи ифодаи экспертизаи вирусӣ дар матоъҳои пӯсида) (поликлиникаи харбуза, 1: 1000), anti-H3K27me3 (polyclonal харобӣ, 1: 500) ё antibodies anti-actin (monoclonal mouse, 1: 60,000) дар як шабонарӯз дар 4 ° C (Ҳамаи мембранаҳо дар шири 5% шуста шуда буданд ё 5% сутунҳои лимфавии сафедаҳо). Пасмонадҳо бо антибиотикҳои иловагии эпидемиологӣ (1: 15,000-1: 60,000, вобаста ба антибиотикҳои ибтидоӣ истифодашуда) ва бандҳо бо истифодаи SuperSignal West Dura substrate. Ҳайвонҳо бо NIH Image J Software ва H3K9me2 гурӯҳҳо барои аксарияти активи ё β-tubulin муқаррар карда шуданд ва ҳаҷми умумии histone H3 барои идоракунии ҳамарӯзаи баробар муқаррар карда шуданд. Кокаинҳои такроршуда дар сатҳи сатҳи активНамунаи S8) ё умумияти ҳозира 3 (Намунаи S1) дар NAc. Илова бар ин, сироятшавии HSV-G9a-GFP ва HSV-G9aH1093K-GFP ба сатҳи умумии β-tubulin дар NAc (Намунаи S8).
Иммунохогохимия
Фариштаҳо бо як водии ҳашароти гидрохиди хлор ва бо изофаи 4% paraformaldehyde пеш аз омӯхтан аз ҷониби якуним ё дучанд immunohistochemistry, ки пештар тасвир шудаандS6). Ба таври мухтасар, бениҳоҳои баъдина дар ҳарорати хона дар як шабонарӯз дар 30% sucrose пеш аз он ки дар 35 мм (ҷилдҳо барои таҳлили релефи рентгенӣ истифода бурда шудаанд, дар vibratom дар 100 μm дар сурати набудани 30% sucrose ҷудо карда шудаанд). Шаклҳои ройгон бо NAc бо 1X PBS, шустушӯй (3% serum Normal мони, 0.1% tritonX, 1X PBS) ва баъдтар бо анти-GFP (polycloni chicken, 1: 8000) ва / ё anti-G9a , 1: 500) antibodies дар ҳалли блок. Хусусиятҳое, ки барои ҷинсҳои дендриталӣ таҳлил карда шудаанд, бо антиоди зиддимикробӣ зидди полиэтилени anti-GFP дар 1: 200. Пас аз тавлиди шабона, фаслҳои NAc барои ҳалли 3 бо 10X PBS, пас аз инкубатсия бо Cy1 ва / ё CytumXXX antibodies in the 2X PBS blocking solution барои соатҳои 3 рехтанд. Қисмҳои барои таҳқиқоти морфологӣ истифодашуда дар антиоди миёна дар ҳарорати хонагӣ дар як шабонарӯз истифода карда шудаанд. Ҳамоҳангсозии ядро тавассути таҳия намудани фаслҳо дар 1X PBS, ки дорои DAPI (2: 1) барои дақиқаҳои 1 ба даст омадааст. Қисмҳо боз ҳам шуста шуданд ва баъд аз фалаҷшавии ethanol ва насб бо ДПХ. Ҳама қисмҳо бо микроскопи конфигуратсияшуда тасвир шудаанд.
Ҷудокунии RNA ва qPCR
Панҷаҳои дуҷонибаи 14-дараҷаи NAc дар Тризол якхела карда шуданд ва мувофиқи дастури истеҳсолкунанда коркард карда шуданд. РНК бо сутунҳои RNAesy Micro тоза карда шуд ва спектроскопия тасдиқ кард, ки RNA 260/280 ва 260/230> 1.8 мебошанд. Пас аз он РНК бо истифода аз маҷмӯаи Bio-Rad iScript транскрипция карда шуд. cDNA аз ҷониби qPCR бо истифодаи SYBR Green муайян карда шуд. Ҳар як реаксия дар ду ё се нусха иҷро карда шуда, пас аз усули ΔΔCt таҳлил карда шуд, ки қаблан бо истифодаи глицералдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) ҳамчун назорати мӯътадилсозӣ тавсиф шуда буд (S7). Нигоҳ кунед ҷадвали иловагӣ S5 барои мафҳумҳои primer mRNA.
Таҳлили Microbiary DNA
Чор гурӯҳи (3 мустақилияти биологии мустақим аз гурӯҳи гурӯҳҳо) барои таҳсили микроавтобӣ, ҷамъи микроэлементҳои 12 истифода шудаанд. Сониян 1 баъди гузаштани охирин тазриқи кокаин, ҳайвонҳо босуръат қатъ карда шуданд ва гулҳо тоза карда шуданд. Нашрияҳо аз NAc бо истифода аз пневматикӣ 15-gauge гирифта шуданд ва зуд ба яхбандии яхкардашуда яхбандӣ шуданд. Помидорҳои дуҷониба аз чор ҳайвон ҳайрон буданд, ки ба як гурӯҳи мушҳо 12 ҷамъ оварда шудаанд. Изотопи RNA, коркарди микрограмма ва таҳлили маълумот ҳамчун пештар тасвир шудааст (S8). Хулоса, РНК ҷудокунӣ ва тоза карда шуд, тавре ки дар боло тавсиф карда шуд ва сифаташро бо истифода аз Биоанализатори Agilent санҷиданд. Транскрипсияи баръакс, афзоиш, тамғагузорӣ ва гибридизатсия ба массиви Illumina MouseWG-6 v2.0 бо истифодаи расмиёти стандартӣ аз ҷониби ядрои микроаррайи УТ Ҷанубу Ғарбӣ анҷом дода шуданд. Маълумоти хом бо истифода аз нармафзори Beadstudio заминаи коҳишёфта ва квантӣ ба эътидол оварда шуданд. Маълумоти мӯътадил бо истифода аз нармафзори GeneSpring таҳлил карда шуданд ва умумистҳо бо истифода аз меъёрҳои аҳамияти коҳиши тағирёбии 1.3 баробар дар якҷоягӣ бо коҳиши қатъии арзиши p <0.05 тавлид карда шуданд.
Мо дар ин маълумот ба якчанд сабабҳо эътимод дорем. Аввалан, ҳамаи ҳайвонҳо дар як муддат дар як шароит кор карда, дар якҷоягӣ кор мекарданд. Ҳамчунин, ҳамаи РАМА ва коркарди асбобҳо якхела иҷро шуданд. Дуюм, мо як қатор ҷуфтҳои гуногунро иҷро кардем ва дар як қатор ҳайвонот якчанд ҳайвонҳоро ҷамъ овардем ва бо ин сабаб кам кардани ихтилофот аз сабаби тағйироти инфиродӣ ва баланд бардоштани қудрати оморӣ (S9). Сеюм, меъёрҳои таҳлили маълумоте, ки барои омӯзиши мо истифода мешаванд, аз ҷониби лоиҳаи MicroArray Control, тавсиф карда мешавад, зеро ин меъёрҳо барои таъмини баланд бардоштани дараҷаи баланди реабилитатсионӣ байни дуҷониба ва дохилӣ ва такрори ретсептсионерӣ (S10-S11).
Сохтмони векторҳои вирусӣ
Бо сабаби вирусҳои вирусии вирусии вирусҳо, пайдарпаии рамзҳо барои G9a ё G9a (G9a) ё catalytically dead G9a (G1093aH1005K), ба PICNUMX + HSV плазмикӣ (GFP) таҳти назорати профилактикии ибтидоии аввомегалововируси одам (CMV) (G9a) Андозаи ҷойгиркунӣ ~ 3.96 kb буд, ки аз андозаи ҳадди аксизи барои векторҳои AAV-2 зиёдтар аст). Намояндаи IE4 / 5 ифодаи G9a мебошад. Параграфҳо ба P1005 + HSV плазмайдӣ бо ёрии Klenow бо PMI ва EcoRI ғудошуда G9a (аз pcDNA3.1) ва CIP бо ёрии P1005 + пас аз ҳосилхезии EcoRI муҷаҳҳаз шуданд. Барои истеҳсоли HSV-ΔJunD-GFP, пайдарпайии рамзии ΔJunD аз тарафи сайтҳои маҳдудкунии EcoRI бо ёрии PCR бо истифодабарии огонуклодидҳои ибтидоӣ, ки дар он экологияи EcoRI истеҳсол шудааст, оварда шудааст. Маҳсулоти PCR пас аз он ба сайти EcoRI аз p1005 + вектор баста шуд. Эзоњи мањаллии рекомбиназрии реаксия дар NAc невронњо тавассути расонидани генофизики вирусї ба воситаи вектор AAV тавсиф шудааст (S12). GFP ё фишори N-терминалии GFP ба Тренинг дар винтҳои AAV-2, ки дорои як ташаббусгари CMV бо сигнали қабулкунанда ва тақвияти сотсиализатсия тақсим карда мешавад. Ҳамаи варақаҳои вектор бо диди навбатӣ тасдиқ карда шуданд. Векторҳои вирусӣ бо истифода аз усули сегменатсионӣ, усули бепарастор, тавре ки пештар тасвир шудааст (S13). Вируси сафед дар-80 ° C захира карда шудааст. Сифати вирусҳо бо тарзи сироятӣ дар ҳуҷайраҳои HEK293 арзёбӣ карда шуд. Вирусҳои AAV-ΔFosB-GFP низ монанд буданд. Барои HSV-Cre, ифодаи рамзгузорӣ бо ташаббуси IRES, ба муқоисаи ташаббуси IE4 / 5 бо мақсади кам кардани ифодаи эффективӣ ва пешгирии токсикии ноқилӣ (нигаред) S14 барои сохтмони вирус). Дар ҳама ҳолатҳо, миқдори зиёди вирусҳо тасдиқ карда шуданд дар vitro ва дар воиз, тавассути QPCR, ва вирусҳо нишон доданд, ки намоиши NAc-маҳдудкунии ифодаи ҷории баъди ҷарроҳӣ immunohistochemically.
Ҷарроҳии Stereotaxic
Дар зери кетамин (xNUMX мг / кг) / xylazine (100 мг / кг), мушакҳо дар асбоби хурди чорвои калони ҳайвонот ҷойгир карда шуданд Сутунҳои сеюмро барои сӯзанакҳои сирипинӣ истифода бурданд, ки ба NNC дар 10 ° кунҷӣ (AP + 0.5; ML + 10; DV-1.6) бо суръати 1.5 μl / min ба таври ҳамаҷониба 4.4 μл вирусро истифода мебаранд. Ҳайвоноте, ки ба тозакунии HSV гирифтор шуданд, барои рӯзи ҷарроҳӣ барои 0.1 иҷозат дода шуданд, дар ҳоле, ки мушакҳо барои санҷиши рафторӣ, ки барои гирифтани санҷиши АВОТ барои рӯзҳои 2 иҷозат дода шудаанд, пеш аз он, Ин вақтҳо бо давраҳои изофии максималии вирусӣ ба ду векторҳо мувофиқат доранд. Барои фаромадани BIX20, ҳар як аз ду насосҳои хурд, ки дар пушти муш пайдо шуданд. Бо ҷойгиркунии каналҳо бо сӯхтан ду сӯрохиҳои хурд аз болои NAc, ва тавассути таҳвили каннул аз bregma (AP + 01294; ML + 1.5; DV-1.0) ба даст оварданд. Часпонҳо барои гирифтани ҷарроҳӣ аз рӯзи ҷарроҳӣ барои 5.4 то 4 пеш аз оғози тартиб додани иқлим барои кокаин тавре, ки дар поён оварда шудаанд, иҷозат дода шуд.
Аввалан,
Раванди таъмири макони ҷойгиршавии пешакӣ бо тағйироти зерин (S7). Хулоса, пас аз 3 рӯз аз инфузияҳои дохили-NAc HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP ё HSV-GFP, мушҳо ба камераҳои кондиционер ҷойгир карда шуданд, ки аз се муҳити гуногун иборатанд. Мушҳое, ки барои ҳарду палатаи кондитсионерӣ афзалияти назаррас нишон доданд, аз тадқиқот хориҷ карда шуданд (<10% тамоми ҳайвонот). Сипас гурӯҳҳои кондитсионерӣ мутобиқ карда шуданд, то ҳама гуна ғарази камераро, ки то ҳол вуҷуд дорад, мутобиқ кунанд. Дар рӯзҳои минбаъда, ҳайвонҳоро бо намак сӯзандору карданд ва баъд аз зӯҳр дар як камера дар давоми 30 дақиқа нигоҳ доштанд ва сипас бо кокаин (10 мг / кг, ip) сӯзандору карданд ва 30 дақиқа дар камераи дигар шом дар давоми 2 рӯз (ду шӯр ва ду ҷуфт кокаин). Дар рӯзи санҷиш, мушҳоро бе табобат дар давоми 20 дақиқа дубора ба дастгоҳ ҷойгир карданд ва озмоиш карданд, то кадом тарафро афзалтар шуморанд. Аксуламалҳои локомотив ба кокаин тавассути танаффусҳои чӯб дар камераҳои кокаин ҷуфтшуда барои таъмини самаранокии табобати нашъамандӣ арзёбӣ карда шуданд. Барои таҷрибаҳои AAV ва BIX01294 CPP, протоколи каме тағирёфта истифода шудааст. Ҳайвонот дубора бо намак ё кокаин (10 мг / кг, ip) сӯзандору карда, дар камераҳои мушаххас барои сеансҳои 30 дақиқаӣ маҳдуд шуданд, аммо ба ҷои онҳо танҳо дар як рӯз дар як рӯз 4 рӯз шартгузори карда шуданд ва пас озмоиш дар рӯзи 5 (ҳайвонот кондиционер карда шуданд) бегоҳӣ ва табобат бо табобат иваз карда шуданд). Барои ҳамаи гурӯҳҳо, локомотивҳои ибтидоӣ дар посух ба шӯр баҳогузорӣ карда шуданд, то локомотив аз табобати вирусӣ ё inhibitor таъсир нарасонад.
Худидоракунии кокаин дар дохилӣ
Писарони навраси Long-Evans, ки дар ибтидои таҷрибаи 230-250 гтозанд. Онҳо дар таркиби температурӣ ва температураи контролӣ дар як давра нуршакл / торикӣ (12: 9 am Озодӣ " дастрасӣ ба озуқаворӣ ва об. Чашмҳо ба муҳити нав мубаддал гаштанд ва рӯзи ҳафтаи 1 то оғози озмоиш ҳар рӯз кор карда шуданд. Ҳамаи тартибҳо мутобиқи Институти миллии тандурустии барои нигоҳубин ва истифодаи лабораторияҳои ҳайвонот гузаронида шуданд ва Кумитаи оид ба нигоҳдории чорводорӣ ва истифодабарии ҳайвоноти ваҳшӣ тасдиқ карда шуданд. Таҷҳизоти худидоракунӣ бо усули нурафканӣ барои тарзи рафтори рафтори потенсиал баста шудааст. Худтанзимкунӣ ҳамчун пештар тасвир шудааст (S15-S16) бо катетерҳое, ки ба раги гулӯлаи рости зери изофлуран (2.4-2.7%) ҷойгир карда шудаанд. Катетерҳоро бо 0.1 мл маҳлули шӯр, ки дорои 10 U гепарин ва амписиллин (50 мг / кг) буд, тоза карданд. Пас аз як ҳафтаи барқароршавӣ аз ҷарроҳӣ, омӯзиши худидоракунӣ дар марҳилаи торикии давраи равшан / торик оғоз ёфт. Ҳайвонот дар як шабонарӯзи тақвими таносуби-3 (FR0.75) ба кокаин (1 мг / кг / инфузия) иҷозат доданд, ки дар он 1 фишанги фаъол ба як сӯзишвории ягона оварда расонад. Каламушҳо истеъмоли кокаинро пас аз 1 рӯз ба эътидол оварданд (<6% тағирёбии сатҳи посух дар тӯли 15 рӯзи пай дар пай ва ҳадди аққал 3% дар фишанги тақвиятӣ посух дод). 75 соат пас аз ҷаласаи ниҳоии худидоракунӣ, калламушҳо зуд сар буриданд, мағзҳо босуръат хориҷ карда шуданд ва барои ҷудосозии RNA ва qPCR коркард карда шуданд.
Иммунопрозия (ChP)
Чораҳои NAc тару тоза буданд, ба расмият дар ванна пайвастанд ва барои ЧИП омода шудаанд, ки пештар тасвир шудаанд (S17-S18) бо тағйироти хурд. Хулоса, 4 14-нишондиҳандаи NAc ҳар як ҳайвон (5 ҳайвонҳои дар як мисол ҷамъовардашударо) мекушояд, бо 1% formaldehyde пайваст карда шуда, пеш аз яхкунӣ - 2 ° C бо 80 M glycine қатъ карда шуд. 1 рӯзи пеш аз санҷиши намуна, гӯсфанд бар зидди равған / мушак (вобаста ба антибиотики боришот) Говҳои магнитии IgG бо инкубатсияи лаҳзаҳои мувофиқи магнитӣ бо ҳам зидди G9a (синфи GPRS) ва H3K9me2 (синфи HOCNUMXK4meXNUMX) антибиотикҳо дар як шабонарӯз дар XNUMX ° C дар фосилаи доимӣ дар ҳалли блок. Sonication Tissue and shearing chromatin, ки пештар тасвир шудааст (S17). Баъди санҷиш, консентратҳои баробар ба штоматин ба қубурҳои нав интиқол дода шуданд ва ~ 5% -и маҳсулоти ниҳоӣ барои идора кардани назорати дохилӣ захира карда шуданд. Пас аз шустани шиддат ва барқароркунии омехтаҳои омехтаи омехта / антиқӣ, ҳаҷми баробари омехтаи антидиявӣ / омехта ба ҳар як мисраи ғадудин илова карда шудаанд ва дар давоми 7.5 соатҳои дар 16 ° C гузаранд. Санҷишҳо минбаъд дар 4 ° C дар як шабонарӯз пеш аз пайвастшавии ДНК бо истифода аз маҷмӯи тозакунии PCR дар якҷоягӣ пайваст шудаанд. Пас аз покшавии ДНК, намунаҳо ба QPCR ба зери назорат гирифта шудаанд ва ба назорати "мувофиқати" мувофиқ ба таври пештар тасвиршуда (S17). Иммунопрозилҳои мутобиқшудаи IgG бо истифода аз антигени anti-IgG anti-polyclonal mouse низ барои назорати пурзӯр намудани такмили сигнал дода шуданд. Фонфорбосилтрансфертези Аденин (APRT) ҳамчун санҷиши манфӣ барои санҷишҳои косий ва ΔFOSB истифода бурда шуд. Нигоҳ кунед Ҷадвалии иловагӣ S5 барои таблиғгарони аввалия.
Таҳлили Дендрит
Барои омӯхтани нақши G9a дар танзими морфологияи морфологӣ дар вирус, мо усулҳои пештар бо тағйироти зерин тасвир карда шудем (S1). Се рӯз баъд аз вируси HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (ҳамаи вирусҳо дар wildtype C57Bl / 6J мушакҳо), ё HSV-Cre-GFP истифода шуданд (дар G9aФлеш / фл Фаронса), вақте ки ифодаи вирусӣ максимӣ буд, мушҳо комилан истифода мешуданд, бронхҳо гулпотрасида шуда, баъдтар дар 100 мм дар vibratome тақсим карда шуданд. Баъд аз марҳилаҳо, бо истифода аз антибиотик муқобили GFP, ки дар боло тавсиф шудааст, (immunohistochemistry) истифода намешаванд. Барои арзёбии таъсири G9a баландбардорї ва рехтани рехтани зардолу, инчунин таъсири ΔJunD-ро баландии изофї нишон медињад, ки шумораи ќабатњо дар бораи 1-2 нейритњо дар њар як ноњияи баробар ба њадди камтарини 299 микдори дендритњо аз GFP-ифодакунандаи NAc миёна Нишонҳои ночизи (MSN). Бо дарназардошти он, ки MSNҳо аз одамони дигари нейлон дар NAc мафҳуманд, инчунин гузоришҳое, ки қаблан нишон медиҳанд, ки HSV асосан ба DARPP-32 ба ҳуҷайраҳои невронҳо дар ин минтақаи ақлS19), мо боварӣ дорем, ки MSN дар ин тадқиқотҳо танҳо баҳо дода шудааст. Барои ҳар як ҳайвон, мо 6-8 невронҳо дар ҳайвонҳои 3-4 дар як гурӯҳ (7 гурӯҳҳо), ки баъд аз он барои ҳар як ҳайвон барои таҳлили оморӣ аҳамияти миёнаҳоро ба даст овардем. Таҳқиқоте, ки барои бартараф кардани таъсири ΔFosB оҳиста-оҳиста дар зичии оҳании NAc низ ба монанди он, ки дар боло баён шудаанд, ба истиснои векторҳои AAV барои ифодаҳои GFP ё ΔFosB-GFP барои ҳафтаҳои дарозтар истифода мешаванд (ҳафтаҳои 8). Ҳамаи тасвирҳои HSV бо микроскопи конфигуратсионӣ бо мақсадҳои 100X равғани баистифодабарӣ гирифта шуданд (тасвирҳои AAV бо ҳадафи равғани равғани 63X гирифта шуданд). Тасвирҳо бо маҷмӯи пневматикӣ дар 1 воҳиди функсионалӣ ва андозаи 1024 × 1024 пайдо шуд. Дарозии дендрит бо нармафзори NIH Image J баҳогузорӣ карда шуд, ва рақамҳои адад аз рӯи таҷрибаи ибтидоӣ ба чашм расиданд, зеро слайдҳо пеш аз сканкунии таҷрибавӣ танзим карда шуданд. Шумораи миёнаи заҳракҳо барои ҳар як 10 мм аз dendrite ҳисоб карда шуд.
Таҳлили оморӣ
Як ва ду-якқабата ANOVA барои муайян кардани аҳамияти шароити мусоиди макони зист ва таҳлили дендритӣ бо зиёда аз ду гурӯҳ анҷом дода шуданд. Тестҳои хонандагон барои муқоисаҳои дигар, аз ҷумла QPCR, парокандагии ғарбӣ, таҳлили релефи рентгенӣ бо HSV-GFP ба HSV-Cre дар G9aФлеш / фл мушҳо, таҳлилҳои микроаррай (ба боло нигаред) ва таҷрибаҳои иммунопреципитацияи хроматин. Т-тестҳои банақшагирифтаи донишҷӯён пас аз таҳлили дуҷонибаи ANOVA оид ба зичии сутунмӯҳраи дендритӣ пас аз ΔFosB аз ҳад зиёд бо тасдиқи таъсири назарраси асосии табобати маводи мухаддир ва вирус истифода шуданд. Ҳама арзишҳое, ки ба афсонаҳои рақам дохил карда шудаанд, маънои ± SEM -ро доранд (* p-0.05; ** p <0.001). Таҳлилҳои муфассали оморӣ барои Намуд. 1-3 дар матни асосӣ дар: додаҳои екранкаҳои рақамӣ, аз ҷумла оморӣ.
Далелҳо
Ман тасдиќ мекунам, ки ягон мавод дар матни дастгиркунанда мављуд нест Нақши асосӣ аз Histone Methyltransferase G9a дар пӯсти Кокаин пештар нашр шуда буданд, ё дар ҷои дигар, аз ҷумла дар Интернет.
Ҳамаи корҳое, ки бо истифода аз ҳайвонот истифода мешаванд, тибқи дастурҳои институтсионалӣ ва IACUC дар ҳамбастагии Донишгоҳи Техас дар маркази тиббӣ ва кӯҳи Синяи тиббӣ гузаронида шуданд.
Паёмҳо ва ёддоштҳо
;