Proc Natl Acad Sci አሜሪካ ኤ. ኤም. 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.
ዛሬ በመስመር ላይ ሐምሌ 15, 2014 ታትሟል. መልስ: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
ኒውሮሳይንስ
ቴሩኮ ዳጃኦ,a ኬንጂ ዮሺሚ,b ካዙኦ ፈነባኪ,a Satoshi Yawata,a ና ሺግታዳ ናካኒሲa,1
ይህ መጣጥ በ የተጠቀሰው በ PMC ውስጥ ያሉ ሌሎች ጽሑፎች.
ግምት
Dopamine (DA) በአቫይራል ብልት አካባቢ (VTA) ውስጥ የነርቭ ሴሎች በአብዛኛው በአስደንጋጭ ተፅዕኖ ምክንያት በአጭር ጊዜ ፀጥ መዘጋት ምላሽ ይሰጣሉ. ይህ ድርጊት አይነምድርን ለመከተል አጸያፊ ምላሾችን በቀጥታ የሚያመጣ መሆኑን ወይም አለመሆኑ ግልጽ አይደለም. በ VTA ውስጥ የነበርን የነርቭ ሴራዎች በመምረጥ ይህንን ጥያቄ መርምረናል እና የአንስሳት የነርቭ ሕዋስ (ስነ-ህዋስ) እንቅስቃሴዎችን ማበላሸቱ አስደንጋጭ ምላሽ እና መማርን አስከተለ. የ VTA DA ነርቮቶች ዋናው ውጤት ኒዩክሊየስ አክሰንስንስ (ናይክ), ለዚህ ምላሽ ተጠያቂ እንደሚሆን ይታመናል, ስለዚህ በ NAC ውስጥ የትኛው መሠረታዊ አካሄድ ለዚህ ባህሪ ወሳኝ እንደሆነ በመመርመር የ D1 ወይም D2 ተቀባይ መቁረጥን, እና D2 ተቀባዩ-ተኮር ርዝመት ለዚህ ባህሪ ወሳኝ መሆኑን ደርሶበታል.
ረቂቅ
Dopamine (DA) ከቫልፊክ ቱልታ አካባቢ (VTA) የሚያስተላልፍ ስርጭት ሁለቱንም ጠቃሚ እና አሰቃቂ ባህሪያትን ለመቆጣጠር ወሳኝ ነው. የኤ.ኤን.ኤን. የነርቭ ኅዋሳት መዘጋት ለአሳሳቢ ፈሳሾች ከሚሰጡት ምላሾች አንዱ ነው, ነገር ግን ተጸዕኖዎችን እና መማርን አስመልክቶ የሚያስከትላቸው ውጤቶች እና የነርቭ አካላት በአብዛኛው አልተሳኩም. እዚህ, የ VTA DA ሴሎች በአዝርዕታ ቁጥጥር የተደረገበት የደም ደረጃዎች እና የኒውክሊየስ አክቲቭስ (ኒክሊን አክሰንስ)) በሚሰነዝረው ሀሳብ ተሞልቷል. ቲኤን ኤን ኤን የተባለውን የነፍስ ማጥፊያ ኤነርጂ (ኤ.ኤም.) የነፍስ ማጥፋት ሴራ በአስቸኳይ ወደ ቀድሞው ጨለማ ክፍል ውስጥ አጸያፊ ምላሾችን አነሳስቷል እናም ወደ ምልመዔል-አመጣጥ ሁኔታ ወደ ተመሳሳዩ ሁኔታ ወደ ወረርሽኝ አመራ. በጣም አስገራሚ, ይህ ቦታ ጥላቻ የዲ ፖታሚን D2 ተቀባይዎችን በማንሳት በ NAc ውስጥ በ D1 ተቀባዮች አልተወገዱም.. በ VTA ውስጥ የነበርን የነርቭ ሴሎች ድምጾችን ማስወገድ በአስቸኳይ ምላሾችን መጨመር እና በዲኤምፔን D2 ተቀባዮች በ NAc መማር በጣም አስፈላጊ ነው.
Mesomyimbic dopaminergic በተርታ በተግባር እና ተፅእኖ ውስጥ ወሳኝ ሚና ብቻ አይደለም.1-3), ነገር ግን የደም መፍሰስ ችግር በፓርኪንሰን በሽታ, ስኪዞፈሪንያ እና የአደገኛ ሱሰኝነት በተገለጸው ከባድ ኒውሮፕላሪቲስ ዲስኦርደርስ ውስጥ ተካትቷል. በ <ቬፐለሚን> (ኒውቨንስ) ውስጥ በአስረኛው ግዙፍ አካባቢ (VTA) ላይ የንፋስ ሽግሽግ ፈገግታዎችን ለመሸከምና በተቃጠለ ሁኔታ ሲቃጠሉ የሚፈጠረውን የሽምግልና ውጤት ይመለከታቸዋል. ይህ የ "ዒላማው ዋና ተግባር" ሽልማቱን "የሽልማት ትንበያ ስህተት" እውነተኛ ዋጋ4). ሽልማት ለሚሰጡ ፈጣን ምላሽ ከተሰጠው ምላሽ በተቃራኒው ወደ አጸያፊ ተፅዕኖዎች የሚሰጡት ምላሽ ከግኝተኝነት በጣም የራቀ ነው. ማለትም, የተወሰኑ የነርቭ ሴሎች ለአስፊኝ ማነቃቂያዎች ምላሽ ይሰጣሉ, ሌሎቹ ብዙ ደግሞ በተፈጥሯዊ መጨፍጨፋቸው ምክንያት ምላሽ ይሰጣሉ. (5-9). እንዲያውም, በቅርብ ጊዜ የተደረጉ ጥናቶች እንዳመለከቱት የጋባሪያን የነርቭ ሴል ማግኘትን እና የንፋስ ነርቮትን እንቅስቃሴ ማበላሸትን ሽልማት ሽልማትን በመቀነስ እና አጸያፊ ምላሽ10, 11). ይሁን እንጂ በ VTA ውስጥ ኤ.ኤን.እንዳይቶች እንዳይንቀሳቀሱ ከተደረገ በኋላ የአራማ ጎሳ ትምህርት ለመቀበል ወሳኝ የሆነው ትምህርት በአዕምሮ ዑደት ውስጥ በጣም አስፈላጊ ሆኖ የተገኘ ሲሆን እንዲሁም የባህሪይ ምላሽዎች ሽልማትን ለመጨመር እና አጸያፊ ስነምግባርን ለማነሳሳት እንዴት እንደሚቆጣጠሩ.
የተበረከቱት ማስረጃዎች እንደሚያመለክቱት ለአንዳንድ አወንታዊ እና መጥፎ አሉታዊ ተፅእኖዎች በመነሳሳት ላይ የተመሰረተ ትምህርት በአብዛኛው የሚቆጣጠሩት ኔኦልዩስ ዑደትዎች (ኦርኬቲንግ ሰርቪስ)12), ከፍተኛ መጠን ያለው የዲፓኒማክ ሽፋን ከሥርብ ሽብለሩ ይቀበላል. በሬታቱም ሁለት መሰረታዊ የነርቭ ዑደትዎች በተወሰኑ መካከለኛ እርከን የነርቭ ኒውሮኖች (MSNs) የተመሰረቱ ሲሆን እያንዳንዳቸው ልዩ የሆነ የ DA ምላሽ ተቀባይ13).
- አንድ ዑደት ቀጥተኛ መንገድ ነው, ይህም በቀጥታ ወደ ናሙሊን ኦክሊየም ኡደ-ኡደ-ኡደ-ኡራጅ-ናስቲ-ፐሬኪላታ (SNr) ናሙና ናሙና-ኤክስ-ኤክስ ሪለሲለታ (SNr).
- ሌላው ደግሞ ቀጥተኛ ባልሆነ መንገድ ነው, ይህም ከግሎቡስ ፓሊሉከስ ወደ ደቡብ ዋልታ የሚጓዙትን እና በተለምዶ ዶፔይን D2 ተቀባዮች (D2Rs) የሚለቀቁትን ኤምኤስ የያዘ ነው.
በማዕከላዊዋ ላይ ያሉት የዲኤንኤስ ምልክቶች በተቃራኒው በ D1Rs እና በ D2Rs በኩል በተቃራኒው እነዚህ ሁለቱን ዱካዎች ይለቃሉ, እና ይህ አወቃቀር ተነሳሽነት /3, 14).
- ለሽልማት የሚያበረታቱ ተፅዕኖዎች, በተሻሻለው የዲ ኤን ኤ ደረጃዎች የዲ ኤክስኤንሲዎች (ሪከርድ ፐሮጀክቶች) የሚንቀሳቀሱ ተፅዕኖዎች በ "ኒውክሊየስ አክሰንስ" (ኤን.ኤ.ሲ).
- በተቃራኒው ተጨባጭ ማነቃቂያዎች ላይ ስለ ኤሌክትሮኒካ ነርሶች መ, እና ይህ ግምት በ "D2Rs" አማካኝነት በተዘዋዋሪ መንገድ በኩል የሲግናል ልውውጥ ተለዋዋጭ ነው.
ፋርማኮሎጂካል ስትራቴጂዎችን እና ተለዋዋጭ ኒውሮጅን ማገጃ (RNB) ዘዴን የሚጠቀሙ ጥናቶች ይህን የ NAC (NAC)15, 16), የነርቭ ሴል ማኮባኩን ማጥፋት ቀጥተኛውን መንገድ ለማራመድ እና በማስወገድ የማስወገጃ ባህሪን ለማምጣት በቂ እንደሆነ አልታወቀም. በዚህ የምርመራ ጥናት ውስጥ, በ VTA ውስጥ የምርምር ነርቮችን በመምረጥ / በመምጠጥ የሴል ሴል ማባዛትን በመምረጥ /17) እና በ VTA ውስጥ የነበርን የነርቭ ሴሎች መከልከል በመቀጠል የ DA ደረጃዎችን በ NAC ውስጥ በመቀነስ የተጋለጡ የአጻጻፍ ምላሽ እና መማር. በተጨማሪም, የዚህን ቅደም ተከተል ደንቦች እና መርገጫዎች በ NAc ውስጥ በቀጥታ በ D2Rs ተወስነዋል.
ውጤቶች
ኤ.ኤም.ኔሮጅን ኢንጂን (ኤትሮንስኔሽን) ኦንሰር ኤንኦ ኦውቶርን (Darken Room) ምርጫን ያካትታል.
የኤል.ኤን.ኤን. የነርቭ ሴሎች መነሳት በጥንቃቄ ለመምረጥ, Cre-inducible adeno- የተጎዳኘ ቫይረክ ግንባታ ኢንኮዲንግ17) በዋናነት ወደ ትልልቅ ትንተና (VTA) ታይሮሲን ሃይድሮክሊየስ (ኤች) -ከ አይጥ (18) እና የዱር ወጭ (WT) ቆርቆሮዎችን እና ከ VTA (ኦፕቲካል ፋይበር) በላይ የሆነ ኦፕቲክስ ፋይበር (ምስል S1 A ና C). ከቀዶ ጥገናው ከሁለት ሳምንት በኋላ, Arch-eGFP በ VTA ውስጥ በተወሰነ ተገኝቷልምስል S1B). በኤሌክትሮፒየስዮሎጂካዊ ቅኝት የሮኪን ፕሮቲን ውቅረ ንዋይ ተጽእኖውን በመሞከር እና ከ AAV-DIO-Arch ጋር በተተገበረ የ TH-Cre ድሮ ቬቲቭ ኦክቲቭ ማነቃቃትን ውጤት ተከነን. በኤን ኤች ክሬ ድክተሮች ውስጥ ከኤች ኤ ቲ ኤች ኤሌክትሮሲካዊ ቀረፃዎች ውስጥ እንደታየው አስገዳጅ የደም ሴሎች የነርቭ ሴሎች መነቃቃታቸውን ()ምስል S2), የኦፕቲካል ማነጣጠሪያው የኤል ኤል ሴሎችን በማጣቀሻነት እና በመተጣጠፍ የተቃጠለውን የቃላት ፍንጣቂነት ለመግነጫው የሚጋለጥ መሆኑን የሚያመለክት ነው.
በነዚህ አይጦች በመጠቀም, በ VTA ውስጥ የነርቭ ሴሎች በአይን መነቃነቅ በባህሪው ትምህርት ላይ እንደ ጠቋሚ ምልክት ሆኖ ያገለግላልን. አይጥ ጥቁር አካባቢን የመምረጥ ውጫዊ ዝንባሌ አለው (19). አይጦች በጨለማ ክፍልና በነፃ ደማቅ ብርሃን ክፍት የሚሆንበት የባህሪ አካል ንድፍ አዘጋጅተናል (የበለስ. 1A). ከተለመደው በኋላ የ WT አይጥ በጨለማ ክፍሉ ውስጥ ወይንም ምንም ሳይታወቅ ማነቃቃትን በጨለማ ክፍል ውስጥ ይቀና ነበር.ምስል S1D), ኦክቲቭ ማነቃነቅ በጨለማ ክፍላቸው ላይ ተፅእኖ እንደሌለው ማረጋገጥ. የእንስሳት የባህሪዎችን የባህሪይ ባህሪይ ባህሪይ (የነርቭ ሴል ሴሎች) ን በተንሰራፋቸው ባህሪ ላይ ተጽዕኖ እንዳያሳድሩ መርሐ ግብሩን ወስነናል (ምስል S1E). ከተለመደው እና ቅድመ ምርመራ በኋላ, በጨለማ ክፍል ውስጥ ሲቆዩ በአይቲን (VTA) ውስጥ የነኩ ነጭ ነትንሳሮች (ኦርአን) ለመምታታቸው አይጦች ናቸው. በመጀመሪያዎቹ 5 የሙከራ ማሽኖች እንኳን, TH-Cre ፍየል ከመደበኛ የጨለማ ክፍል ወጥቶ በጨለማ ክፍል ውስጥ ጨለማ ክፍልን ተረክቧል (የበለስ. 1B). የ TH-Cre አይጦች በጨለማው ክፍል ውስጥ ምንም ዓይነት የመተንፈስ ስሜት ባይኖራቸውም (በማንኮራኩሩ) ላይ እንዳይገኙ አላደረጉትም (የበለስ. 1C). እነዚህ መረጃዎች እንደሚያመለክቱት የልብ ሕዋስ ንክክራትን (አልአይነር) ቀስ በቀስ የመጥፎ ጠንከር ያለ ባህሪን ብቻ ሳይሆን እንደ ጥቁር ክፍል ላይ ተፅዕኖ ያለው ትምህርት ለመከታተል እንደ ምልክት ምልክት ሆኖ ያገለግላል. በተጨማሪም የአካል ጉዳት መንቀሳቀሻዎች በሁለቱም ጊዜያዊ የመተጣጠፍ ባህሪ እና ረዥም የተንሳፈፍ ትምህርትን መንከባከብን እንደ ሚያሳዩ ያመላክታሉ.
በ NAc ውስጥ የኤኤምኤስ ደረጃዎች የመርጃ ኤንጂኔሪስ ዝቅ ማለት.
ከዚያም በ VTA ውስጥ የነርቭ ሴል ሴሎች እንዳይሠሩ መደረጉ በእርግጥ የዲ ኤን ኤ ትኩረት በዋና ዋና ዒላማው አካባቢው, ኤን.ኤ.ሲ. በኤስ.ኤስ-ዲ ኤይ-አርክ ውስጥ ወደታሰበው VTA ውስጥ በቆሸሸ ቲ-ክሬ አይሪስ ውስጥ በፍጥነት ምርመራ (ሲስቲክ ቮልቴምኬሚመር) (ኤፍ ሲ ሲ ኤስ) በ DAC ደረጃዎች ውስጥ ተለጥፈናል. በ NAC ደረጃ ያሉ የኤኤንኤ ደረጃዎች በኤሌክትሮዊክ ማራዘሚያ (VTA) ተሻሽለው በከፍተኛ ሁኔታ ከፍ ብለው ተቆጥረዋል, እና በ VTA (ኦት ኤን) (VTA) ላይ አንድ ጊዜ ማነቃቃት (ምስል S3). ከዚያም የ VTA መነፅር በ NAC ውስጥ የቶን ኤክስቴንሽን መጠን ለመቀነስ ሞክርን ይሆን? በዚሁ ተመሳሳይ የሙከራ አማራጮች ውስጥ, በ NAc ውስጥ ኤኤንኤ ደረጃው በ V (90) የ VTA (ኦቲኤ) የመነሻ ማነቃነጫነት በጊዜያዊነት እንደተቀነሰ አስተውለናል.የበለስ. 2), እሱም በአስፈላጊው ተነሳሽነት (FSCV) ምላሽ ከተሰጠው20). እነዚህ መረጃዎች የ VTA መነፅር የ VTA DA ነርቮቶችን ለማጥቃት እና በባህሪው ሙከራ ጊዜ የኤአይኤ ደረጃን ለመቀነስ የሚያስችል ውጤታማ መሆኑን ያሳያል.
በ VTA ውስጥ የነዳጅ ነርቮች መነፅር (ኢንአክቲቭ ኦንላይን) ኦፕሬቲንግ ኦፍ ኔግንስ ኦቭ ኔዘርን (ኤነር)
በ VTA (ኤኤንአርኤ) ውስጥ ኤ.ኤን.ዲ.ኤ (ኤ.ኤን.ሲ) በተገቢው ሁኔታ እንዳይንቀሳቀሱ ምክንያት የሆነው የባህርይ ለውጥ የመነጽር ማነቃነቅ በቀጥታ የነርቭ እንቅስቃሴን በመቀያየር እና የባህሪ አፈፃፀምን ለውጦታል. ስለዚህ የነርቭ እንቅስቃሴውን የነርቭ ሴሎች እንቅስቃሴ በማራዘም የክልትን ወሳኝ የሆኑትን ክልሎች በመመርመር የፊስ (የፎክስ) ፈጣን የጂን (Fos) አገላለፅን በመመርመር ነው. ክሊኒንግ በጨለማ ክፍል ውስጥ ከተካሄደ ብዙም ሳይቆይ, አይጦች በአይነተኛነት በየትኛው የዝርያ ውስጥ የተዳቀለ ዲዛይን ትንተና (Fos)የበለስ. 3 ና ምስል S4). ከ NATA ከፍተኛ መጠን ያለው dopaminergic projections የሚቀበለው ኤን.ኤ. (NAc), በ TH-Cre ክዋስ (Fos) ፍጥነት (Fos)የበለስ. 3). ይህ የደንብ መቆጣጠሪያም በዚሁ የኩላሊት የኢንፌክሽን ኢንፌክሽን ውስጥ በሚታየው የኦፕቲካል ማነቃቃ ትከሻ በኩል ተገኝቷል. ይሁን እንጂ የአጠቃላይ የአሠራር ስርዓቱ የኦፕቲካል ነርቮች ከዋነኛው ጎን ለጎን ሲታጠፍ ከሚገኘው የኦፕቲካል ማእቀፍ አንጻር ሲታይ የኬፕላር ነርቮች ቀጥተኛ ያልሆኑትን የኬሚካላዊ እንቅስቃሴዎችን ቀጥተኛ ቁጥጥር ስርዓት መቆጣጠሩን ያመለክታል. በሌሎቹ አንጎል ክፋዮች ውስጥ ጭስ, ፐዳል ዴላ (ዋልታ) እና ፔንታታ ሂውታ ሄልተን (paralleular habenula) ወይም መካከለኛ ቅድመራል ባህርይ (mPFC; ምስል S4). እነዚህ ውጤቶች እንደሚያመለክቱት የ ኤ.ኤን.ኤን. የነርቭ ሴሎች ኦክሳይክተሩ (ኦ.ኤም.) የነቃባቸው አካባቢዎች በ VTA ኤ.ኤን. ኒርዮን ቀጥታ ዒላማ አካባቢዎች ላይ ብቻ የተገደቡ አይደሉም, ነገር ግን በተዘዋዋሪ በነርቭ ስርዮሽ-ጥገኛ መንገድ ሊተኩ የሚችሉ ክልሎችን ያካትታሉ. ይህ ምልከታ እንደሚያሳየው የልብ አያያዦች ኦውነንሲዮሽንን ማሠራጨት በዩኤስ-አቀፍ እርኩስ ተግባር ላይ የተስተካከለ እና የተንሰራፋ ነገርን ከማጋለጥ ውጪ ብቻ ሳይሆን እንደ ጭንቀት, ፍራቻ እና የጭንቀት ምላሽ21).
የ D2R በ DXNUMXR በኩል ምልክት ማድረጊያ / የተራቀቁ / የተጋለጡ ሁኔታዎችን የሚያርፍበት ሁኔታ.
ከ VTA አብዛኛዎቹ የ dopaminergic ምልክቶች በ NAc በኩል በኤኤሲኤስ ተቀባይ ልኬቶች, D1R እና D2R ወደ ኤም ኤች ኤስ ይተላለፋሉ. D1R በ "P" (በ Tac1 ጂን የተመዘገበ) - በይነተገናኝ በተለቀቀ መልኩ የተጻፈ ነው - MSN ን መጫን, እና D2R በአብዛኛው በተገለፀው ኤንኬፊለሊን (በፔንክ ጂን የተሰየመ) - MSN ን በመጫን; እያንዳንዱ አይነት MSN ያላቸው ቀጥተኛ እና ቀጥተኛ ያልሆኑ መንገዶች, በ NAc (3). የ D2R (nM ቅደም ተከተል) ከ D1R (μM ቅደም ተከተል) ይልቅ ለኤድኤንነት በጣም ከፍተኛ በመሆኑ (22, 23), የእንስሳት ደረጃ መቀነስን የ G ን (ኢንአክቲቭ) መቀነስ እንደሚያስከትል ይታመናልi-coupled D2R ነገር ግን በ D1R ላይ ምንም አድናቂ ውጤት የለውም3, 24), በዚህ መንገድ ነርቭ እንቅስቃሴውን በተዘዋዋሪ መንገድ ይቆጣጠሩ. ከዚህም በተጨማሪ በ <Pk-> ወይም <Drd2> (D2R) - ከ Tac1- ወይም ከ Drd1a (D1R) -የተጨመባቸው ሕዋሳት (ፋክስ-ኤክስፕሬስ) አናት ላይ Fos አስነተኛነት ይታያል (ምስል S5). በእነዚህ ምልከታዎች ላይ በመመርኮዝ, በ D2R በኩል ምልክት ማድረጊያ ባመዛኙ አከባቢ ሁኔታ ውስጥ ትልቅ ሚና ሊኖረው እንደሚችል ተገነዘብን.
ይህንን መላምት ለመሞከር, በሶስት ማእከላዊ ቦታን ተቆጣጣሪነት (ሲፒኤ) ፈተና አደረግን (ምስል S6). ከተለዩ ተመሳሳይ ሁኔታዎች እና አንድ አነስተኛ ኮሪደር ሁለት ክፍሎችን የያዙ ባህሪያቶችን አዘጋጀን. በካ.አ.ካ. በአካባቢያችን ሲተካ የነበረው የንብረቱ የአካባቢያዊ ሁኔታ የቫት ኤን ኤ ህዋስ ነርቮች እንቅስቃሴ እንዳይታወክ ለመቆጣጠር ያስችለናል. ሁሉም እንስሳት በነጻው አካባቢ ሁሉ በነጻነት እንዲንቀሳቀሱ ሲፈቀድላቸው, አብዛኛዎቹ በቅድመ-መዋዕለ-ሕጻናት ውስጥ ምንም ዓይነት የተጨባጭ ባህሪ ልዩነት ሳይኖራቸው በሁለት ክፍሎች ውስጥ ይቆያሉ. የኦፕቲካል ማጣሪያ በአንድ ህንፃ ቋት ላይ በማነጣጠር የመነጽር ማነጣጠር ተካሂዶ ነበር. ምንም እንኳን ለሙያው መቆጣጠሪያነት ሁለቱም ክፍሎች ቢጠቀሙም, የ TH-Cre ድካም አይሮፕላኑ እና በፓስተሩ ጊዜ (በመጠባበቅ እና በድህረ-ወጭው ውስጥ በሚታዩበት ሁኔታ በሚታተመው ክፍል ውስጥ መቆየት ያለማቋረጥ እና በጣም በርቀት (ምስል S6 B-E). ስታቲስቲክ ትንተና በኩይስ-ነክ ክሎሪስ ውስጥ በ TH-Cre ክሮስ ውስጥ በ WT አይጦች (በ WT አይጥ ውስጥ ከሚቆየው ጊዜ ጋር ሲነፃፀር ጋር ሲነፃፀር) በ TH-ምስል S6F).
ከዚያም በያንዳንዱ ኤጄንሲ (DAC) ውስጥ ያሉትን የ DA (DA) ተቀባይዎችን (በተለይም ኤኤንሲ (NDA) ን በመጨቆር በዚህ አጋዥ ባህሪ ውስጥ የተካተተውን DAED receptor ንዑስ ምድቦችን ለመጥቀስ ሞክረናል (የበለስ. 4 ና ምስል S7). ለእያንዳንዱ የ DA ምላሽ ተቀባይ ኤሌክትሮኒካዊ አረብኛ አጭር ኤች.ኢ. አር ኤን ኤ (shRNA) አዘጋጅተናል እና አረጋግጠናል. ሎንስቫይረስ ወደ ኤንአይሲ ውስጥ ከተለቀቁ ሦስት ሳምንታት በኋላ ኤችኤችቲ (ኤክስሬተር) በጠንካራ የአጻጻፍ ስልት በ NAC ውስጥ ተካቷል (የበለስ. 4B). የእያንዳንዱ ተቀባይ ተቀባይ ኤምአርኤን (ኤን ኤች ኤ ኤን) በትክክል መወሰድ በእውነተኛ የ PCR ትንተና (ምስል S7) ተረጋግጧል.A). በምእራባዊው ፍራቻ በፕሮቲን ደረጃዎች መለካት የእያንዳንዱ የእንስሳት አይነጣይ ቫይረሶች የሴቲካል ፕሮቲን መርጠው በሌላው የዲ ኤን ኤ ተቀባይ ተቀባይ (Pc DA)የበለስ. 4C ና ምስል S7 B-G). የ ShD1R- እና shD2R-የሎተቫይረስ ፈሳሾች ዒላማው ቫይረሱ ዒላማው ወደ ፐላንት ፐርሰንት ወደ ጂኤንኤክስ ፐርሰንት ፐርሰንት ፐርሰንት ወደ ጂ O ዲ ኤም ኤ (46.2 ± 1.1% እና 38.4 ± 4.9%) ቀንሷል.የበለስ. 4C). እነዚህ ውጤቶች የኤል ቲቪን ቫክተሮች ለ D1R እና D2R የሚመጥን shRNA የሚመስሉ እና የታለመላቸውን አር ኤን ኤዎች በመምረጥ እና የፕሮቲን ምርቶች መጠን እንዲቀንሱ ማድረጉን አረጋግጠዋል. በተጨማሪም በቫይረሪው-ቪዲኤ የሻንቸር ኤኤንአርኤን በቀጥታ ከ VTA ጋር ተፅእኖ ሳያደርግ በቫይረሰ-ተሃድሶ የተደገፈ የ MC-Chery መግለጫ በቫውቲቭ ውስጥ አልተገኘም.
የ ShRNA ን የያዘውን የሊቲቭ ቫይረሶች በመጠቀም, የትኛው የ DA ምላሽ ተቀባይ በ ኤችአርኖን መርዛማነት (ኢንአክንሴሽን) ውስጥ በሚታየው ባዕድ ባሕርይ ምክንያት የየትኛው DA recipient ተጠያቂ ነው. በ "TH-Cre" አይጥ ውስጥ ከ "AAV-DIO-Arch" ጋር ወደ ሁለቱ የኤችአይቪ ኤኤንሲ (ኤንአይኤፍ-ዲ ኤይ-አርቲ) ወደ lethivitivirus ወይም የ Lentivit መከላከያ (ሎቲቫይሪ) ተላከን. የኦፕቲካል ፋይበር ከ VTA (VTA) በላይ ተጭቷል (የበለስ. 4A). የሶስት-ቻርሲ CPA ምርመራ ከተደረገ በኋላ በሶስት ሳምንታት ውስጥ ሲካሄዱ, የ TH-Cre ክሮማ በጥቅሉ ሲታገሉ ነበር-shD1R-mCeryry አሁንም ግልጽ የሆነ CPA በኦክቲክ ማነቃቂያ-በተቃራኒ ቻውስ ውስጥ ከሚታተሙ TH- lentivirus (lenti: mCherry) ን ይቆጣጠሩ. በተቃራኒው, የ TH-Cre ድሪም በእርሳስ (ኢንቲን) የተገጣጠሙ ናቸው-shD2R-mCherry በማቀዝቀዣ ጊዜ ግልጽ CPA ማሳየት አልቻለም (የበለስ. 4D). በ "ቲ-ክሪ" አይጥ ተብሎ የሚጠራው የ "TH-Cre" አይጥ ያለው ብቸኛው የትምህርት ደረጃ ጉድለት; የ "shD2R-mCherry" በተጨባጭነት አተኩረው በመጥቀስ ትምህርትየበለስ. 4E). እነዚህ ውጤቶች በኤ.ኤስ.ኤ. ኤይነር እንቅስቃሴ ማቃለያ (ኮኔክተሩ ኤን ኤን) ስራ ላይ ተመርኩዞ የተከሰተው ባህሪ በተለይ በ D2R (በ D1R), በ NAc ውስጥ አይደለም.
ዉይይት
በሬታቱም ላይ ጥናቶች እንደሚያመለክቱት የ "G" ን አግብርs-coupled D1R የመብቱን ስራ ያመቻቻል, ነገር ግን የ G ን ማግበር ይቻላልi-dougles D2R ውጤቶች በተጨመረው የቃላት ፍጥነት (25). Acከኤይ ዳይኤስ መቀበያ ኤክስፐርት መግለጫዎች ትክክለኛነት ጋር ሲነፃፀር, የ DA ሴሎች አተኩሮ ፈጣሪዎች በአብዛኛው ቀጥተኛውን መስመር በ D1R ይንቀሳቀሳሉ, የኤ.ኤን.ኤን. የነርቭ ማቀነባበሪያዎች በአጥጋቢ ሁኔታ መቀነስ በ D2R ቀጥታ ያልሆነ የጎዳና ላይ ችሎታ (3, 26). በዚህ የአሠራር ዘዴ መሰረት በአስደንጋጭ ተነሳሽነት ምክንያት የነርቭ ሴሎች ድምፁን ማስወገድ በአብዛኛው ቀጥተኛ ባልሆኑ መንገዶች እና በአሰቃቂ ባህሪያት (3). በቅርብ ጊዜ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ተዘዋዋሪ መንገዱን የሚያመሳስለው የሲፕሊፕ ሽግግር ማቆም በኤሌክትሪክ ንዝረት (ኤሌክትሪክ ጭንቀት)15) እና ይህ እክል የተከሰተው በ D2R-mediated signal transmission (መገናኛ)16). እኔበተጨባጭ, የ D2R መፈለጊያ ላይ የደንበኝነት ማጠናከሪያ-MSN ን በተዘዋዋሪ መንገድ ሲገልፅ የጠባይ ማረም (27). ሆኖም ግን, የነርቭ ሴሎች ለአንባቢዎች ማነቃቂያዎች ምላሽ እና ማራኪነት ስለሚያሳዩ እና ከአንዳንዶቹ አስደንጋጭ የስሜት ህዋሳት መረጃ በአንድ ጊዜ በአንጎል ውስጥ ስለሚኬዱ, ኤ.ኤን.ኔራንስ ጸጥ ለማለት መሞከር በቀጥታ አስከፊ ምላሽ እና መማርን ሊያስከትል ይችላል, እና ይህ ምላሽ በ D2R ላይ ቁጥጥር የሚደረግበት ይሁን-MSN ን በተዘዋዋሪ መንገድ ላይ ያሳያሉ.
በዚህ ጥናት ውስጥ በሁለቱ የስነምግባር ፈተናዎች ላይ የንጥረትን ነርሶች (ኤ.ኤም.ኤል) ማስነቶችን መከላከያ እንጠቀማለን: ጨለማ ክፍልን የምርጫ ፈተና እና የሶስት ክፍል CPA ፈተና. የዝግመተ-ምህዶአችን ማባዛታችን በ VTA እና በኤክስኤ ደረጃዎች ላይ የኤኤንኤ ደረጃዎች ንቀሳቀሻዎችን በከፍተኛ ደረጃ መቆጣጠር. የሴሬን የነቀርሳ ተመጣጣኝ ንፅፅር በእርግጠኝነት በእርግጠኝነት መቸኮል ሲገባ ብቻ እንስሳቱ ማረፊያ ውስጥ በሚቆዩበት ክፍል ውስጥ በንጽህና እና በመርማሪው ውስጥ በሚኖሩበት ጊዜ በግልጽ የሚያስተላልፍ ተፅእኖን እና መማርን ያነሳል. በተጨማሪም, ይህ የምርመራ አሰጣጥ ይህ የጠለፋ ምላሽ እና መማርን ለመግታቱ ወሳኝ መወሰን ወሳኝ መሆኑ D2R-mediated signal processing ማቅረቡን ያመለክታል.
ምንም እንኳን የዲኤክስኤክስኤንሲ የ CPA ለውጥ ለማምጣት በባህሪያዊ ሙከራዎች ላይ ምንም ውጤት እንደሌለው ቢያሳዩንም, በርካታ ጥናቶች እንዳስቀመጡት የ "x" ን የነርቭ ሴሎች በአጥፊዎች ላይ ሲቃጠሉ ለፌርፋሽ ምላሾች እና ለአሳሽ ትምህርቶች አስፈላጊ ናቸው28, 29). ይህ ልዩነት በሙከራ ቅንብር ምክንያት ነው; ለምሳሌ, የችሎተ-ነቀርአዊ አቀራረብ የጠለቀ ባህሪን ለማንሳት በማንቆራጩ ኤችአርቮች ላይ ምልክት መኖሩን ሊያመለክት አልቻለም. በአስደንጋጭ ተነሳሽነት የተከናወነው የንቃተ-ጉባዔ ተኩስ ተግባር እና ሰርከም ፕሮሴስ በዚህ ጥናት ላይ ከተካሄዱት የተንሰራፋ ስነምግባር የተለያዩ አስተዋፅኦዎች አሉት, እና ለወደፊቱ ግልጽ መሆን አለበት.
በተጨማሪም የነርቭ ሴሎች በተጨማሪ ኤም ፒ ሲ, ኤሜዳላ እና ሂፖፖፓየስ ጨምሮ የተለያዩ የተለያዩ ክልሎችን ያካትታሉ. በቅርብ የተደረገ አንድ ጥናት እንዳመለከተው በ VTA ውስጥ ወደ ነርቮች ነርቮች የተንቆጠቆጡ የኋለኛው የቤንኖላ ነርቮች መነፅር (ኢንቬንዩላር) ማግኘታቸው አረመኔ ባህሪን ሊያሳድጉ የሚችሉ ናቸው, እናም እነዚህ የኤሌክትሮኒካዊ ነርቮቶች በተለይም ለኤምኤፒሲ (30), ምንም እንኳን የእነሱ የመርጫዊ ፍጡር (ኮንዲሽኔሽን) ሁኔታ አሁን ባለው ጥናታችን ላይ ካለው የተለየ ነበር, ምክንያቱም የእነሱ የምርምር ማበረታቻ ሙሉ በሙሉ ለክፍሉ ክፍለ ጊዜ እንዲራዘም ስለሚያደርግ ነው. ምክኒያቱም ለኤምፒፒሲው የ dopaminergic ግብዓት አስጊ በሆኑ እንቅስቃሴዎች ብቻ ሳይሆን በተከታታይ ውጥረት (<31, 32), የ mPFC-ፕሮጀክት ኤን.ኤስ. የነርቭ ሴሎች ቀጣይነት ማግኘታቸው ከፍተኛ ጭንቀት ባለው ሁኔታ ውስጥ እንደ ምልክት ማሳያ ሊሆኑ ይችላሉ. እና በውጥረት ምክንያት የተረጋጋ የአየር ሁኔታ መከማቸታቸው, እንስሳቱ ለጉልበት ክፍል እንዲጋለጡ ያሳያሉ. በተቃራኒው ግን እንስሳቱ በሚተከለው አዳራሽ ውስጥ ሲቆዩ ብቻ የነበርስ ነርቮችን ብቻ ነበር. በጊዜ መሌካምነትን በመጠቀም ባህሪያዊ ሙከራዎቻችን ያመጡት ውጤት ድንገተኛ ዲኤንሲን መገደብ እንደ ድንገተኛ የአሳታፊ ግፊት ይታይበታል, ይህም ፈጣን ምላሽ አሰጣጥ ውጤት ያስከትላል.
በተጨማሪም የነርቭ ሴሎች ለፌርሃት ምላሽ የሚሰጡትን የአሚጋዳላ አካባቢን ያካትታሉ. በእርግጥ ለዐሚዳላ ምልክት የተደረገባቸው ሰዎች በፍርሀት ምላሽ እና በፍርሀት ማህደረ ትውስታ ውስጥ መግባባት ላይ ተፅዕኖ አሳድረዋል (33, 34). በጥናታችን ውስጥ በ VTA ውስጥ የ DA ሴሎች የተለጠፉትን የነርቭ ሴራዎች (ኤ.ኤን.ኤል.) መለጠፍ ወደ BLA ፕሮጀክቶች ተወስነዋል, ነገር ግን የእነዚህ ሽፋኖች መጠነ-ገደብ ናሲ ውስጥ ከሚታየው እጅግ በጣም ያነሰ ነበር. ምንም እንኳን በአጋንዳ የታቀደ የኤድኤ (DA) ምልክት በአይምሮአችን ባህርይ ላይ ያለውን ጥቃቅን ውጤት ማስወገድ ባንችልም, የኤንአር ኒውሮንስ ኤንጂን (ኤን ኤን) የጠለፋ ባህሪ. ኤሌክትሮኒካዊ ነርቮች ላይ ለውጦችን በማነሳሳት እና በፍርሃት ሁኔታ ላይ ለውጤታማነት ለማነጣጠር ተኮር የዲ ኤምኤስ ምልክት ማሳያዎችን በተመለከተ ወደፊት የሚደረጉ ምርመራዎች ያስፈልጋሉ.
ቁስአካላት እና መንገዶች
የትምህርት ዓይነቶች.
Tyrosine hydroxylase :: IRES-Cre (TH-Cre) knock-in mice (EM: 00254) (18) የተሰበሰቡት ከአውሮፓውያን የማፑንትንት ማህደሮች ነው. ሁሉም የሙከራ እንሥቶች ከዘጠኝ ትውልድ በላይ ወደ C57BL / 6J ውህደት ተላልፈዋል. አይጦች በ C10BL / 57J WT አይጦች ውስጥ ይጣመሩ እና በመደበኛ የ 6-h ብርሃናት / 12-h ጥቁር ዑደት ውስጥ ተጠግበዋል እና የምግብ እና የውሃ ማስታወቂያ መፍቻ. Cre+ እና ፍጥረት- ተመሳሳይ ፍጥነቶች (3-6) እድሜ ላላቸው ሙከራዎች ጥቅም ላይ ውለው ነበር. ሁሉም የእንስሳት ሙከራዎች በእንስሳት ሙከራዎች መመሪያ መሰረት በእንስሳት ኮሚቴው የኦሳካ ባዮሳይንስ ኢንስቲት ነው.
የስነምግባር ሙከራዎች.
በሁሉም የባህርይ ሙከራዎች, አይጥ (ኦፕቲካል ፋይበር) ከአይነምድር ነርቭ ጋር ተገናኝተው በመላው መሳሪያ ውስጥ እንዲንቀሳቀሱ ተፈቅዶላቸዋል. የአንጎል እንቅስቃሴ በእራሳቸው ኦፕቲካል ፋይበር ውስጥ ቢገናኙም ምንም አይነት መሰናክል መንቀሳቀስ እንዲችሉ ቁጥጥር ተደርጎባቸው ነበር. የመዳፊት ሁኔታ በባህሪው መሳርያ ተግሶ በቪዲዮ ካሜራ ተገኝቷል, እና LabVIEW ሶፍትዌርን በመጠቀም በብጁ በተዘጋጀ ፕሮግራም ተንትኖታል.
የጨለማ ክፍል ምርጫ ፈተና.
በፈተና ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው ብጁ የሆነ የተግባር ባህሪ ከጨለማ ክፍል (15 x 9.5 cm) እና ደማቅ ክፍት ቦታ (15 × 11 ሴንቲሜትር) ያካትታል. የጨለማው ክፍል ግድግዳዎች, ወለልና ጣሪያዎች ነበሩት, ሁሉም በጥቁር ቀለም የተሞሉና ወደ ክፍት ቦታ (4.5 ሳ.ሜ ርዝመት) የሚገቡ ነበሩ. ክፍት ክፍሉ ቦታ እንደ ኤሊፕስ ቅርጽ ያለው ሲሆን የብረት አጥር እና ጣሪያ የሌለው ወለል ያለ ጣሪያ አለው. ከሙከራው በፊት, ሁሉም አይጦች በካሜኑ ውስጥ ለ 10 ደቂቃዎች የመለማመሻ ጊዜ ውስጥ ነበሩ. ሙከራው ሶስት ክፍለ ጊዜዎች ነበሩ. በቀን መጀመርያ ግማሽ ቀን 1 (ድምር: 5 ደቂቃ), አይጦች መላውን መሳሪያ እንዲመረምሩ ይፈቀድላቸው ነበር. ከጠቅላላው ከግማሽ ቀን 1 ጀምሮ እስከ ቀን 4 (በአክሲዮን: በጠቅላላ 35 ሙላት), አይጦች በጨለማ ክፍል ሲቆዩ የመብረቅ መነቃቃትን ይቀበላሉ. በቀን 5 ላይ, የጨለማ-ክፍል ምርጫው ያለ ምንም ማነቃቂያ ተፈትኗል (በደብዳቤ: 5 ደቂቃ; ምስል S1E).
የሶስት-ክፍል CPA ፈተና.
በፈተና ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው በባለጉዳይ የተሰራ ሶስት መቀመጫ የቦታ አመላካች / CPA መሳርያ ሁለት ህንፃዎች (10 x 17 cm) እና አገናኝ አገናኝ ነበር. ፈተናው ሦስት ክፍለ ጊዜዎች ነበሩት. ቀን 1 (ቅድመ-ታክሲ: 15 ደቂቃ): አይጦች መላውን መሳሪያ ማሰስ እንዲፈቀድላቸው ተፈቀደላቸው. ከሌላው ጋር ሲነፃፀር 1.5xx ጊዜ ያህል የቆየ አይንም ከፈተናው ተገልሏል. ቀኖች 2 እና 3 (ሁኔታ: 15 ደቂቃ እያንዳንዱ): አይኖች በተቃራኒው ክፍል ውስጥ ሲቆዩ የመብረቅ መነቃቃትን ይቀበላሉ. የብርሃን ጥንድ ክፍል የተመረጠው በጣም የተመጣጠነ ነበር. ቀን 4 (የጊዜ ገደብ: 15 ደቂቃ): ሙከራው በቅድመ-ወትሮምስል S6A).
አይጦች ከመጠን በላይ እንዳይጋቡ በሚያስፈልግበት ጊዜ በጨለማ ክፍል ውስጥ ወይም ባለ ብርሃን-ተጣጣፊው ክፍል ውስጥ አይክሶቹ በቋሚነት በ 30 ቶች ውስጥ ሲቆዩ ክላስተር ቅስቀሳ ለ 30 ሲ ቆሞ ነበር. በሁሉም የጠባይ መለኪያዎች ውስጥ የኦፕቲካል ፋይበር ጫፍ ላይ በ xNUMX mw ገደማ ላይ የጨረር ኃይል ቁጥጥር ይደረግ ነበር.
In Vivo Fast-Scan Scanner በሲቪል ሞተረትሜትር.
የ FSCV ሙከራዎች የተካሄዱት በቀድሞ ጥናቶች የተገለፀውን ዘዴ በመጠቀም ነበር (35-37). አይጦች በሚከተለው ውስጥ በተገለጸው የኬቲሚን / xylazine ድብልቅ ውስጥ ሰመመ SI ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች እና በሶሬቶታክክ ክፈፍ ውስጥ እንዲቀመጡ ይደረጋል. ኤሌክትሮኒክስ የነርቭ ሴሎች (ኤ.ኤም.) የነርቭ ሴል (ኤ.ኤስ) ወደ ማነቃቂያ ገመድ (ኤሌክትሮጅል) ቅርብ ነበር. የማንቀሳቀስ ኦፕራሲዮኖች በ VTA (ከኔጋማ; በፊት-ኋላ, -3.2 ሚሊ ሜትር, የኋላ, 0.5 ሚሜ, እና የኋላ ሹል, 3.5 ሚሜ) እና በ 0.25-mm ልዩነቶች ላይ ዝቅ ተደረገ. የካርቦን-ፋይበር ማይክሮኬርዴ (የ 300 μm ርዝማኔ) ለቬልሜትሜትሪክ ቀረፃ ወደ ናሲ (ከኔጋማ, ከኋላ, በኋላ, 1.0 ሚሜ, የኋላ, 1.0 ሚሜ, እና የኋላ ሹል, 3.5 ሚሊ ሜትር) ወደ ታች ተቀንሷል. የቮልታሜትሪክ መመዘኛዎች በ 100 x ላይ ሲሆኑ በካርኖ-ፋይበር ማይክሮ ኤሌክትሮይድ ውስጥ የሶስት ማዕዘን ሞገድ ቅርጸት (-0.4 V እስከ + 1.3 V እስከ -0.4 V እና ag / agc, በ 400 V / s) በመጠቀም. ግላዊነት የተላበሰ የ potentiostat ጥቅም ላይ የዋለው ለዋና ፎርሙላር እና ወቅታዊ ማመቻቻ ነው. የ 24-pulse stimulation (100 μA, 5 ms ርዝመት, 30 Hz) በመጠቀም የ ኤንኤን ኤሌክትሮጊያዎች በኤሌክትሮኒክ መነሳሳት የተለወጠ ነበር. የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ከመጀመሩ በፊት የ X nexons (532 nm, ~5 mW ኃይል በፋሚቲስ ጫፍ ላይ) ማነጻጸሪያ ልኬት ማራዘሚያዎች ለ 10 ዎችን መጀመረው. በካርቦ-ፋይበር ማይክሮ-ኤሌክትሮሰዶች የታወቁ DA (5 μM, 0.2 μM, እና 0.5 μM) አማራጮች ውስጥ በተለመደው ተካሂደዋል. ሁሉም የቮልትሞሜትር መረጃዎችን LabVIEW እና Matlab ሶፍትዌርን በመጠቀም በተበጁት ፕሮግራሞች ተቀርፀዋል. በዲ ኤን ደረጃዎች ቅነሳ ማነሳሳት በዲ ኤን ኤም ምልክት (ዲ ኤ ኤን ኤን)35, 36).
ስታትስቲክስ ትንታኔ.
ስታትስቲክስ ትንታኔ የተካሄደው GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad ሶፍትዌር) በመጠቀም ነው. መረጃ በተደጋጋሚዎች በተወሰኑ እርምጃዎች ተንትቷል ANOVA (ምሰሶዎች. 1B, , 4D,4D, እና ምስል S6 D ና E) ወይም አንድ-መንገድ ANOVA (ምሰሶዎች. 1C, , 3D,3D, 4 C ና E, እና ምሰሶዎች. S4 K-M, S6F, እና S7A), እና በድህረ-ጥንታዊ ትንታኔዎች የተደረጉትን የቦንፈርሮኒን ፈተና ተጠቅመዋል. አማካኝ እና ዓምዶች እና አሞሌዎች እኩል እና ± ሲኢልም ተገኝተዋል.
የቫይረስ ዝግጅት እና የፍሳሽ, ኤሌክትሮፊዚካዊ ቀረፃ, እና የሆቫይድጂኬቲክስ እና ኤምአርኤን ኤንጂን ጨምሮ ሌሎች ሙከራዊ ሂደቶችን በዝርዝር በዝርዝር ተብራርቷል. SI ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች.
ምስጋና
ኢ. ቦይነን ለክይድ ግንባታ, አር. ሙትሱ በአይሮድቬሽንስ ማምረቻ እና ማጽዳት ቴክኒካዊ ምክሮች እና Y. Hayashi በመረጃ ትንታኔ ሂደቶች ውስጥ የቴክኒካዊ ምክሮችን ለማክበር እናመሰግናለን. ይህ ሥራ በትምህርት ሚኒስቴር, በባህል, በሣይንስ, በሳይንስ, እና በቴክኒክ ሚኒስቴር ሚኒስቴር በኩል በ "Research Grants-in-Aid 22220005 (ወደ SN), 23120011 (ወደ SY እና SN), 24700339 (ወደ TD), እና 25871080 (ወደ SY) የጃፓን ቴክኖሎጂ እና ከትካ ሳይንስ ፋውንዴሽን (ወደ ስኪ) የገንዘብ ስጦታ.
የግርጌ ማስታወሻዎች
ደራሲዎቹ የጥቅም ግጭቶችን አያሳዩም.
ይህ ጽሑፍ በ I ንተርነት ላይ መረጃን በ I ንተርኔት ውስጥ ይዟል www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/- /DCSupplemental.
ማጣቀሻዎች
;