Cdk5 Phosphorylates ዳፖሚን D2 ተቀባዩ እና የወራጅ ውሃ ምልክት (2013)

አስተያየቶች: Cdk5 የ dopamine D2 ተቀባዮች መመሪያን እንደሚያፈላልግ ያሳያል. በሚያስገርም ሁኔታ, የትርጉም ፍርግም ዴታፍፋስክ የ Cdk5 ን ምርት ያስገኛል.

Jeong J, ፓርክ ዩ, ኪም ዱን ኪ, ሊ ኤስ, ዱክ ዬ, እና ሌሎች. (2013) PLoS ONE 8 (12): e84482. አያይዝ: 10.1371 / journal.pone.0084482

ረቂቅ

ዳፖሚን D2 ተቀባይ (DRD2) እንደ ዲ ኤን ሚሜን የተያያዙ የአንጎል ተግባራት ማለትም እንደ ስሜት, ሽልማት, እና ስሜትን የሚያገናኝ ቁልፍ ተቀባይ ነው. በሳይንሳዊ ጭቆና ላይ የተመሠረተ kinase 5 (Cdk5) በፕሮጀክቱ የታዘዘ ሲሪን / ቲሮኖኒን kinase ነው, ተግባሩ በሂሳብ ሽልማት ወረዳ ውስጥ ተካትቷል. በዚህ ጥናት ውስጥ የሲንሰሩ የ 321 ቅርስ (S321) በሶስተኛ አውራሪው የ DRD2 ዙር (D2i3) የሲዲክስክስ ኒውቲያን ተቆጣጣጣይ ጣቢያ ነው. በ D5X5 ውስጥ የ S321 በ Cdk2-ጥገኛ phosphorylation ውስጥ በ < በብልቃጥ ውስጥ እና የሕዋስ ስርዓት ሥርዓቶች ናቸው.

ከዚህም በተጨማሪ የ S321 ፎስዮፕሊጂየም የ DRD2 ን እና የ G ፍንጅክ ቅንጣቶችን ወደ DRD2 የሚያጓጉዙትን አግኖይድ-ነቃሳ ገጽታ ንክኪዎች ተስተውለዋል. ከዚህም በላይ የደም ዝውውር (ሲኤምኤፒ) ጎዳና በሃቲሮሎጂካል እና በመጀመሪያ ደረጃ የነርቭ ባሕል ላይ ተፅዕኖ ያሳደረው በፒዲኤክስክስ አውሮፕላን ማቆልቆል ምክንያት በ DRD35 ን ዝቅተኛ እንቅስቃሴ ምክንያት ነው. እነዚህ ውጤቶች የሲዲክስክስ-ሲፒኦሪየሎጅን የ S5 የ DRD321 ተግባርን የሚያግድ ሲሆን ለዲፓሚን ምልክት ማሳያ አሰራሮች አዲስ የቁጥጥር አሰራሮችን ያቀርባል.

አሃዞች

ጥቅስ: Jeong J, ፓርክ ዩ, ኪም ዱን ኪ, ሊ ኤስ, ዱክ ዬ, እና ሌሎች. (2013) Cdk5 Phosphorylates የዱፕታሚን D2 ተቀባይን ይቀበላል እና የዝናብ ድምዳሜ ዝቅተኛ ነው. PLOS ONE 8 (12): e84482. አያይዝ: 10.1371 / journal.pone.0084482

አርታኢ: ጄምስ ፖርተር, የሰሜን ዳኮታ ዩኒቨርሲቲ, አሜሪካ

ተቀብሏል: ግንቦት 20, 2013; ተቀባይነት አግኝቷል ኖቨምበርን 14, 2013; ታትሟል: ታኅሣሥ 31, 2013

የቅጂ መብት © 2013 Jeong et al. ይህ ክፍት በሆነ ስርዓት ስር የተሰራ ግልጽ መዳረሻ ጽሑፍ ነው የጋራ ፈጠራ ባለቤትነት ፍቃድግሪንስቶን መጠቀም እና ማባዛትን በየትኛውም ማኑያ ውስጥ እንዲፈቅዱ የሚፈቅድ ሲሆን ዋናው ጸሐፊ እና ምንጭ ከታወቁ.

የገንዘብ ድጋፍ: ይህ ሥራ ከኮሪያ መንግሥት (ኤም.ኤም.ፒ.) (NRF-2012R1A2A2A01012923 እና NRF-2012R1A4A1028200) ድጋፍ የተደገፈ ሲሆን በኮሪያው ናሮፎር (2012K2A1A2033117) የሚመራው ዓለም ዓቀፍ የጋራ ት / የ MSIP (2031-415) መሠረታዊ ጥናት ፕሮግራም. SKP የ 2004 እና 2006 ብሔራዊ ምርምር የአረጋዊያን አልዛኒሪስ እና የመንፈስ ጭንቀት (NARSAD) ወጣት የምርምር ሽልማት ተጠቃሚ ነበር. ገንዘቡ በማስተማሪያ ዲዛይን, በመረጃ አሰባሰብ እና ትንተና, በስራ ላይ ለማተም ወይም የፀሐፊው ዝግጅት ለማዘጋጀት ምንም ሚና አልተጫወተም.

ተወዳጅ ፍላጎቶች- ደራሲዎቹ ምንም የተወዳጅ ፍላጎት እንደሌላቸው ተናግረዋል.

መግቢያ

የዲፖሚን ምልክት ማሳያ በተለያዩ የአእምሮ ተግባራት ውስጥ የተካተቱ ናቸው, ሞተር ቅንጅትን, የስሜት ቁጥጥር እና ሽልማት ዘዴዎች [1]. በጀርባ አጥንት ውስጥ የዶፔን ማሳያ (ሲንዲን) ምልክት ዋናው ንጥረ ነገር በዲታሚን መቀበያ መቀበያ መሳሪያዎች (MSN) ላይ የሚመረጥ እና በኦፕላስቲክ (ቫይታሚን) (VTA) እና በንፁህ ነጋ (SN) [2]. የዱፖሚን ሌፕተሮች በ G protein-coupled receptors (GPCR) አማካኝነት ሰባት የሜዲኤምዳ ጎራዎች ናቸው እናም ሁለት ንዑስ ደረጃዎች አሉት, D1-like እና D2-like receptors, በ dopamine ኤሌክትሮኒክ ምልክት [1]. ለምሳሌ, dopamine D1-like receptors (D1, D5) በቅደም ተከተል adenylylcyclase ይጀምራል Gα ዎች ሆኖም የዲፕሚን D2 ልክ እንደ ተቀባይ (D2, D3, D4) የ adenylyl ነካሳይስ በ Gሀይ እና የ cAMP ውስጣዊ ደረጃን ይቀንሱ [1], [3].

በ dopamine መቀበያዎች ውስጥ, የ D2 ተቀባይ (DRD2) በርካታ የስነ-ልቦና በሽታዎችን ጨምሮ, የስሜዛኒያ እና የአደንዛዥ ዕጽ ሱስ [4]ብዙ ግብረ-መልስ ያላቸው መድሃኒቶች ቢያንስ ቢያንስ በከፊል DRD2 ን ያጠቃልላል. በተጨማሪም DRD2 እንቅስቃሴ በእንስሳት ሞዴሎች ላይ የጥቃት ሰለባ ባህሪ ከሚያስከትላቸው ባህሪያት ጋር የሚጣጣም መሆኑን ይታወቃል [5]. ፀረ-ድብርት እና የስሜት ተረጋግጣነት ውጤታማነት በ DRKX ወይም በኤሌክትሪክ መስመር ውስጥ በዲ.ሲ. [1], [4], [6]. ለአንዳንዶቹ አንገብጋቢነት ለ DRD2 የዚህን ሚና ቢኖርም የሃይድሮሎጂን እና ውስብስብነትን ወደ DRD2 ንብረቶች የሚያስተዋውቁ ዝርዝር የቁጥጥር ስርዓቶች ሙሉ በሙሉ አልተረዱም.

በርካታ የድህረ-አስተርጓሚ ማሻሻያዎች በ DRD2 በተስተካከለ መልኩ ተካተዋል. የ DRD2 ሰፊ የጂን ኮሲልሲዝነት ቀደምት የፎቶ-ጂቲ ትንተና ጥናቶች ላይ ተካቷል [7], እና በ DRD2 ውስጥ የሽምችት ውስጣዊ ትስስር መፈጠር ለሊግ ሰንደቅነት አስፈላጊ ማሻሻያ ተለይቷል [8]. ከዚህም በተጨማሪ የ DRD2 የፎክስሎሬሽን ጣቢያዎች በቅድሚያ ተለይተዋል በብልቃጥ ውስጥ በተለያዩ የኬንዶሶች አማካይነት የተዋሃዱ የተለያዩ የዘርፍ መስመሮችን የሚያጓጉዙ የሬዲዮሶፖፖዎችን ይፈትሻሉ [9]. በእርግጥ, ፕሮቲን ኪይነስ ሲ (ፒኤንሲ) DRD2-mediated የስጋ-ምድራዊ ካልሲየምን በማስተዋወቅ እና የ DRD2 ን ልውውጥ ከሴይሴኬላሊት ፕሮቲኖች ጋር ያስተካክላል. [10]. በ GPCR kinase 2 (GRK2) የፒዮፒኦሪሊሽን ፍቃደኛነት የ DRD2 የግፊት ማነቃቂያ ቅጦችን ይቆጣጠራል [11].

በሳይንሳዊ ጭቆና ላይ የተመሠረተ kinase 5 (Cdk5) በሂደት ላይ የተመሠረተ የሲሊን / ታሮሮኒን ኪንዳይ ሲሆን እጅግ ወሳኝ የሆኑት አንቲባዮታዊ መግለጫዎች በአእምሮ አንፃር መግለጫዎች ምክንያት, p35 እና p39 [12]. Cdk5 በተለያዩ የኒርኖል ሂደቶች ውስጥ ኒዩራንን ፍልሰት እና የአዞን መመሪያን ጨምሮ, Cdk5 እና p35 null mice በ cortical layering ውስጥ ጉድለቶችን ያሳያል [13]. በቅርቡ በ WAV1 ፎርም እና በ Cdk5 ኤክስፕሲየሽን (ፔፕሆሲን) የዲንቸሪክ ስነ-ስርአትን (morphogenesis) [14]. በተጨማሪም, Cdk5 በ NMDA ዳቨረስትር, NR2B እና NR2A-mediated NMDA ዎች የውኃ አካላትን የውስጥ መግለጫዎች ደረጃዎች ይቆጣጠራሉ. [15], [16]. በጣም ብዙ ማስረጃዎች በሲዲክስክስ እና በዲፓሚን ሲስተም መካከል ጥብቅ ግንኙነት እንደሚያመለክቱ ልብ ማለት ይገባል. Cdk5 ፎስፎሌትላጥ tyrosine hydroxylase (TH), የተረጋጋበትን ሁኔታ በመቆጣጠር, እና በዚህም ምክንያት ዶምፔርመሪስ የቤት ሆስተሲስን በመጠበቅ [17]. በ postsynaptic neurons, T75 የ dopamine እና የክትትል-AMP ን በ phosphoprotein-32kD (DARPP-32) የሚቆጣጠሩት በ Cdk5 የተበተነ ነው, የ PKA እንቅስቃሴን ሊያግድ እና በዲፓይን መከላከል ይቻላል DRD1-mediated PKA ማሳያ [18]. የሚገርመው ኮኬይን, የዱፖሚን ተቀባይ ተቀባይ ተቆጣጣሪ አጫጭር ኬሚካሎች በወንዶች ውስጥ በአብዛኛው የሚተዳደሩት በአይጦች ውስጥ ሲሆን, የሲዲክስክስ ኤር ኤን ኤ ኤን ኤ እና ፕሮቲን ደረጃዎች መካከለኛ አኒሜኖች [19]. በጋራ, Cdk5 በአደገኛ መድሃኒት ማስተካከያዎች ውስጥ የተሳተፈ ይመስላል. በዚህ ጥናት ውስጥ የዲዲሚን ምልክት ምልክት በ Cdk2 ውስጥ የሚጨምር የ DRD5 እና Cdk5 ተግባራዊ ተግባራትን እናሳያለን.

ቁስአካላት እና መንገዶች

ፀረ

ፀረ ጥንቸል / serum ጥንቸሎች በሶስተኛ ዙር የ DRD321 (D321i2) የሶስት-ግማሽ ዙር ቅርጽ በ phospho-serine 2 (ፒኤስ 3) ከያዙ በፒፕሲ-ዘይቤዎች ላይ ተነሱ. ፎስፖ-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON) ጥቅም ላይ የሚውለው ህንፃ የመንፃት ማጣሪያ (20401, PIERCE) ለማጣራት ነው. ፀረ-ፒኤስክስNUMX ን ፀረ-ሙስ በአምራቹ መመሪያ መሠረት የአካንዲንግ ማጣሪያ ስርዓት ተገኝቷል. የተጣራ phospho-antibody በፒቢኤኤ ውስጥ በ 321% ሶዮዲየ azide እና በ 0.1% ጋልታል ውስጥ ተከማችቷል. ፀረ-አንጸባራቂ ፀረ-ካዲንክስ ፀረ-ነቲ (sc-0.1) እና ፀረ-ፀጉር ፀረ-ፒክስክስ ፀረ-ነቀርሳ (sc-5) በካንድ ክሎክክስ / ፖንሰ-ኒውዝ ውስጥ ለምዕራቡ የመፍለጥ እና የመተንፈስ ህዋስ ማከሚያ ጥቅም ላይ ውለው ነበር. ፀረ-መዳፊት ፀረ-ጂፕቲን ፀረ-ነት (sc-249) ለዲፕሎፔፕቲኒቲን እና የ DRD35-GFP የምዕራባውያን ቦምብ ጥቅም ላይ ውሏል. ፀረ-ፀጉር ፀረ-ፀጉር ፀረ-ፀጉር (sc-820) ፀረ-ፀጉር ፀረ-ፀጉር ፀረ ተሕዋስያን (sc-5), ፀረ-አንጸባራቂ ፀረ-ፀጉር አንቲባክ (sc-35), ፀረ-ፀጉር ፀረ-ፀጉር ፀረ- 9996) ከ Santa Cruz Biotechnologies የተገዙ ናቸው.

እንስሳት

የ P35 የሰከን አውቶቡስ በጃፓን የ RIKEN ብሬኒስ ሳይንስ ተቋም ከዶክተር Katsuhiko Mikoshiba እና ለዋነኛው የነርቫልን ባህል ጥቅም ላይ የዋለ ልዩ ስጦታ ነበር. ከዚህ ቀደም አስቀድሞ እንደተገለፀው ለጂኖቲፕቲንግ ቀዳፊዎች ዋነኛ ማመሳከሪያዎች ነበሩት 5'GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC እና 5'-GCACGAGACTAGT [20]. የ ICR አይጦች እና የፕላስፔል ዳሌሎች ለአንጎል ላሊስ ዝግጅት ዝግጅት ጥቅም ላይ ውለዋል. ሁሉም የ እንስሳት አሠራሮች በፖንዋንግ ዩኒቨርሲቲ የሳይንስ እና ቴክኖሎጂ ተቋማት የእንስሳት ጥበቃና አጠቃቀም ኮሚቴ ተቀባይነት አግኝተዋል.

የፕላስሲድ ግንባታ

በ PFLAG-CMV-2 ፕሪሚዲስክ ቬክተር ጥቅም ላይ የዋለው የ DRD1 የረጅም ጊዜ ፎረም በ EGFP-N2 የፕላስሲድ ቪትሌት እና በሦስተኛው የጨርቃ ጨርቅ ስርዓት DRD212 (373-29 የ A ልዩ A ፍ ቅንስቶች ጨምሮ የ 2 ተጨማሪ የ A ልዩ A ፍ ቅንስቶች ለ DRD2 long estoform). የሰው Cdk5 በ pCMV-HA ፕሲስቲዲክ ቫክተል ውስጥ ተጨምሯል እና ሰው p35 በ pcDNA 3.1 plasmid vector ውስጥ ገብቷል. ለኮምፕሎኬሚስትሪ, ለተቀበለው ውስጣዊ ውስጣዊ ምርመራ, የሰዎች ሲዲክክስNUMX በ "ሳይትሜጋሎቫይረስ" (ሲኢኤምቪ) ማራጊያን "ፒንክስ ኤክስ" (pxDNA 5 vector)35S] -GTPγS ተያያዥ ሙከራ, ራዲያሊግንድ ተያያዥ መመርያ እና ኤንኤምኤፒ ኢንዛም ኢን ሞይ ሞገሴ.

በብልቃጥ ውስጥ Kinase Assay

IP ተያያዥ በብልቃጥ ውስጥ ኪንሴይ ምርመራ የሚከናወነው እንደሚከተለው ነው. ተመሳሳይ የአንጎል አንሶላዎችን ለመፈለግ አንድ የኩላሊት አንጎል በ 3 ኤም ኤች ኤሪታሮክሳይስ ሌብስ (ELB) (50 ኤም ትራይስ Tris (pH 8.0), 250 ኤምኤም NaCl, 5 ኤም ኤ ኤ ታ ቲ, 0.1% NP-40) . እነዚህ የማጣበቂያዎች በ 20 min, በድምፅ ሲቀዱ እና በ 30 × ውስጥ በፅሮው ላይ እንዲፈኩ ተደርገዋል g ለ 10 ደቂቃ. የላይኛው ተዋናዮች የንቁ Cdk35 / p5 ውስብስብነት ለማግኘት ከጸረ-ጥፍ-ፀጉር ፀረ-ፒክስክስ ፀረ-ተከላካይ (immunotherapy) ጋር እንዲዳረሱ ይደረጉ ነበር. Cdk35 / p5 ውስብስብ እና የተጣራ የ GST ጤንነት ፕሮቲን ከ adenosine 35'-triposphate, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) እና በ kinase ነጭ ቋት (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 ኤም ዲ ዲ ቲ ቲ) በ 1 h በቤት ሙቀት ውስጥ [18], [21]. የተጣራ Cdk5 / p25 ውስብስብ (14-516, Millipore) እንደዚሁ ጥቅም ላይ ውሏል በብልቃጥ ውስጥ ከላይ የጠቀስነው የኪንሴይ ምርመራ. የ 2 × ናሙና የመጫኛ ቋት ወደ ምግብር ጥፍሩ ውስጥ ተጨምኖ በ xNUMX ° ሴ ተቀጨ. ናሙናዎቹ ለ SDS-PAGE ተገዢ ነበሩ እና የደረቀውን አመር በድምጽ ማሳያ ምርመራ ይመረምራሉ.

ሊት አይቲ ክሎግራፊ (LC) -ማሳሪያሜትሪክ (MS) / ኤም.ኤች ትንታኔ

Recombinant GST-D2i3 ፕሮቲን በ IP-linked ተከትሎ በ LC-MS / MS ተመርጧል በብልቃጥ ውስጥ kinase assay. X !! Tandem (ስሪት ዲሴም-01-2008) በመጠቀም የ LC-MS / MS ውሂብ መለኪያ ተደረገ. እያንዳንዱ የ RAW መረጃ ፋይል ወደ መጀመሪያው ወደ mzXML ተቀይሮ የፕሮቲን-ፕሮፖሊክ መስመር (TPP, ስሪት 4.3) በመጠቀም ተለውጧል. በተቀየረው mzXMLs ውስጥ MS / MS ስካንሲው በ XPS ሁለቴ በመጠቀም በ GST-D2010i07 ተከታታይ GPro-D2i3 ቁምፊን ጨምሮ UniProt የተባለውን መዳብ የፕሮቲን ቅደም ተከተል የውሂብ ጎታ (የተለቀቀ 3_2) ይፈትሽ ነበር. መቻቻል ለቅድመ ቀደሚ ions እና ለ 57.021 Da ለስላሳ ions የተጠቆመ ወደ 15.995 ቀና ተዘጋጅቷል. ለቲዩሲን ኢንዛይሚን ልዩነት ጥቅም ላይ ውሏል. ተለዋዋጭ የለውጥ አማራጮች ለካቢቢሚዶኤቲሽነት የሳይስቴይን (0.987 Da), የሜቲንየን ኦክሲዴን (79.966 Da) ኦክሳይሲን (XNUMX Da) እና የሴሪየም ፎፎሎሪሊቲ (XNUMX Da) ተሃድሶ ጥቅም ላይ ውለዋል.

Immunopercipitation

የፀረ-ኢንስፔክቲክቲክ መድሐኒት በ ELB ህይራዊ ቆራጭ ውስጥ በተንቀሳቃሽ ሴሎች ላይ ተካሂዷል. የጸረ-ጂፕ አንቲባስ ፀረ ተሰብሳቢነት እና በ 3 ° C ውስጥ ለ 4 h ኢንክ ጨምሯል. Immunocomplexes ፕሮቲን-አን agarose በመጠቀም ተጣሩ. ፍሳሽዎቹ በ 30 ° C ውስጥ ለ 37 ደቂቃዎች በ SDS ናሙና በሚሞላ ቋት, እና ለ SDS-PAGE እና ለምዕራባውያን ቦቶች ተገዝተዋል.

የ GST ጎን-አሲድ ሙከራ

10 μግ የጨመረው GST እና GST-D2i3 በ 1.5 ° C በ 4 h በአይሮል አንጎል መስመር ውስጥ እንዲቆዩ ተደርገዋል. ግዙትቶኒዮኒ (GSH) - የተቀናጀ የሴፍሮሶ 30B ቢዲሶች (4-17-0756, GE Healthcare) ከሊይሲስ ማጠራቀሚያ ጋር እኩል የሆነ እና ለተጨማሪ 01 h. ስንዴን በ 1 x በማጣቀሻነት ይሰበስባልg እና በንፋስ ማጠራቀሚያ የተጣራ 4 ጊዜ [22], [23]. በምዕራባውያን ላይ ፀረ-Cdk5 እና ፀረ-ፒክስክስ ፀረ-ተባይ ፀረ-ተባይ መድሃኒቶች ተገኝተዋል.

Immunocytochemistry

በሄክታር ላይ የ HEK 293 ሴሎች እና በጣሪያ ሽፋኖች ላይ የተጋለጡ የሬ ቲቶል ነርቮች በፕላስቲክ ታች ስሚን (ፒ.ቢ.ኤስ) እና በአንድ ፍጥነት በ 4% parformaldehyde / ፒኤስቢ ለ 30 ደቂቃ በማንጠባጠብ ተጠብቀው ነበር. ዋነኛው አንቲቫይዲ በማደናገሪያ መፍትሄ (2% የፈረስ እራት እና 1% Triton X-100 በፒ.ቢ.ኤስ ውስጥ) ተጠናቅቋል. የ Alexafluor-647-የተዋሃደ አንቲን አንቲን (A20990, Invitrogen) እና Alexafluor-568-conjugated የጸረ-እንቁላል ፈሳሽ (A11011, Invitrogen) እንደ ሁለተኛ ፀረ-ተሕዋስያን ያገለግሉ ነበር. ሆቴክ ለኒዩክሊየስ ቀለም ጥቅም ላይ ይውሉ ነበር. ምስሎች የተሰበሰቡት በፕላስቲክ ማይክሮስኮፕ (ኦሊምፒስ, ፍላወር እይታ-1000) ነው.

የገንቢ ውስጣዊ ምርመራ

24 h ከተደረገ በኋላ, ሴሎች በ 1 μM ኩንፐርሶል (Q102, ሲግማ) ለ 30 ደቂቃ እና ለ 90 ደቂቃ በ 37 ° ሴ. በእያንዳንዱ ሙከራ ውስጥ ሴሎች በ 2 mL ቅዝቃዜ PBS እና 200 μL አልብጦዎች ጥቅም ላይ ውለው ነበር. በሚቀጥሉት ፍጥነት ደረጃዎች ላይ የ 3 h በሚገኝ የሙቀት መጠን ውስጥ የአደንዛዥ ዕፅ ሕክምናዎች ይደረጉ ነበር. 3 nM [3H] -ፓትፐረንሮን (NET-565, PerkinElmer), 3 μሞ የሱልዲይድ (895, TOCRIS), 10 ኤም ኤም haloperidol (H1512, ሲግማ). ሃይድሮፋቢክ [3H] -ስፒፐርሰሮን ሙሉ የተቀየሩ ተለዋዋጭ መለያን (labeled receptors) እና የውሃ ሃይድሮፊሊክ ሳልአራዲይ (ፕላስቲክ) ተጠቅሞ የማሳፈሪያን ተቀባይት-ተዳዳሪነት ለመተካት ጥቅም ላይ ውሏል [3H] -የስፔፐሮን ምልክት. Membrane-related receptor signals ከጠቅላላው የተገቢ ተቀባይ ተቀባይ እሴት ውስጥ የጨጓራ ​​ክፍል ተቀባይ ሴሎች በመውሰድ የተሰለፉ ናቸው. ህዋሶች በ GF / B (Millipore) ማጣሪያ ላይ ተጣራ እና በንፅሕና ማጠራቀሚያ (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) ውስጥ ተጣርቶ 100 ጊዜ ታጥቧል. ማጣሪያዎች ደርቀው ይሞቀሩና የሬዲዮአይነር ተለጥፎ የተሰራዉ በፈሳሽ ማቀዝቀዣ ቆጣሪ በኩል ነው [24].

ሴል Membrane Preparation

በክትክላት ጊዜ በ xNUMX mm ሚሊ ሜትር ሙቀት ውስጥ ያሉ የሙቀት-አማቂ ነገሮች በበረዶ ቀዝቃዛ ፒቢኤስ ሲታጠብ እና በ 100 mL HME ድፍራፊ (1 mM HEPES (pH 25), 7.5 mM MgCl2, 1 ኤም ኤም EDTA). የተለያዩ ሞለኪውሎች በ 500 xg ለ 15 ደቂቃዎች ሲተነተኑ እና በመጨረሻም ተጓዥ ነጋዴዎች በ 36,000 xg ለ 30 ደቂቃዎች ሲሞሉ ተወስደዋል. በ HME ፔፐር እንደገና እንዲታዩ በፕላስተር ተለጥፈዋል.

[35S] -GTPγኤስ ቢንድሲንግ

የሴል ማብለያዎች ክፍል በ 1 μM ፈንጅፐርለል (Q102, ሲግማ) ውስጥ ቅድመ-ጉበት የተደረገላቸው (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 ኤምኤም NaCl, 1 ኤም ኤ ኤዳ እና 0.01 mM ግቢት) ለ 10 ደቂቃዎች. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) በ 3 μL ውስጥ ባለ የ 30 nM የመጨረሻ ደረጃ ላይ ተጨምሮ ለ xNUMX ደቂቃ ተጨማሪ አከለዋል. 90 μL የበረዶ ቅዝቃዜ ቋት (170 mM Tris-HCl (pH 10), 8.0 mM NaCl, 100 mM MgCl2, እና 0.1 mM GTP) ተካትቷል. Membranes በ GF / B ማጣሪያ (ሚሊፒዮር) ላይ ተጣርተው በንፅህና ማጠቢያ ማጠራቀሚያ (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) መታጠብ ተከስተዋል. ማጣሪያዎች የደረቁ ናቸው እና የሬዲዮዚክቲቭ መጠን በስታንቲንዲሽነር ቆጣሪ በመጠቀም ይለካል [25], [26].

Radioligand Binding Assay

የተዘጋጁት የሕዋስ ሴሎች በ 0.01 nM እንዲቀንሱ ተደርገዋል [3H] -ፓትሮይነን (NET-565, PerkinElmer) እና በ 21 ደቂቃ ውስጥ በ 102 mM HEPES (pH 30), 25 ኤም ኤም ማጂግ (ፒኤን 7.5) ውስጥ የኩሊንሰሮል (Q1.5, ሲግማ)2, 100 mM NaCl, 1 ኤም ኤም EDTA). Membranes በ GF / B ማጣሪያ (ሚሊፒዮር) ላይ ተጣርተው በንፅህና ማጠቢያ ማጠራቀሚያ (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) መታጠብ ተከስተዋል. የ GF / C ማጣሪያዎች በፍጥነት በማጣራት ምክንያት ውጤቱ ተቋርጧል. ረቂቅ ሬዲዮቲቭነት የሚለካው ፈሳሽ በሆነ የሽምሽላ ዘንግ በመጠቀም ነው [27]-[29].

ካምፕ ኢንዛም ኢንቫይረሰይ

የሄክታር HEK 293 ሕዋሳት በ 10 μM ሮሊፕራም (R6520, ሲግማ) ለ 1 ኤ እና በ 0.1 μM ለስኬሊን (F6886, ሲግማ) እና በ 102 ደቂቃ የጨመረውን የኳንፐርለር (Q30, Sigma) ጭምር ተይዘዋል. ዋናው ባሕላዊ ነጠብጣብ ነርቮች በ 10 μM ሮሊፕራም ለ 1 ሰዓት ተይዘዋል, ከዚያም 1 μM ዲፖሚን ለ 1 ኤች [22]. የሕዋስ ማይሊስቶች በ 0.1 M HCl ተዘጋጅተው እና የ CAMP ኤን ኤም ኢንጅን ሞኒቫይቫይድ ኪት (Sapphire Bioscience) የተባለ የኬሚስተር ግኝቶች በአምራቹ መመሪያ መሠረት ተገኝተዋል.

ዋነኛ ባህል የባህላዊ ኔርሮን

የፀረ-ተባይ አካባቢ ከመዳኛ አንጓ የአንጎል አንፃር ተነስቶ ነበር (E15). በ 11095 ° C በ 0.25 ° C ውስጥ የ 4549% ፕሮቲንሲን (T100-0.1, ሲግማ) እና 6% DNase I ባካተተ በጣም አነስተኛ የሆኑ መሠረታዊ የሆኑ ማቴሪያሎች (37, Invitrogen) ተለያይቷል. ሴሎች በማጣቅር ማህደረት (MEM) በ 0.01 M HEPES (pH 7.4) እና 10% (ፍ / ፍላት) ፈረስ ሸምነው (16050-122, GIBCO)). ኒርሞኖች ለ (NULX) ቀናት እንደ ነበሩ በብልቃጥ ውስጥ (DIV 7) በ MEM እና B27 ተጨማሪ (17504-044, Invitrogen) በ CAMP ኤንገም ሞትን መሞከሪያ ከመተግበሩ በፊት.

ውጤቶች

በሶስተኛ አውሮፕላኖች የ DRD5 ዙር Cdk321 Phosorylates Serine 2 ን በብልቃጥ ውስጥ

አዲስ የ Cdk5 ንብረቶችን ለመለየት እኛ (S / T) PX (K / H / R) በሲዲክስክስዮግራፊ የጋራ መግባቢያ ቅደም ተከተሎችን [30] እና እንደ የምርጫ ሰፊ ስርዓት DRD2 ተለይቷል. ሰርሚን 321 ጨምሮ የጋራ ስምምነት ቅደም ተከተል በሦስተኛ ውስጣዊ ዙር DRD2 (D2i3) ውስጥ የተካተቱ የተለያዩ የቁጥጥር ስርዓቶች ተካትተዋል [3], [10], [11]. ቅደም ተከተል በጀርባ አጥንት ውስጥ በ DRD2 ውስጥ በዝግመተ ለውጥ ውስጥ የተቆረጠ ነው, ይህም ለቀሪዎቹ አስፈላጊ ጠቀሜታ ነውምስል 1A).

ድንክዬ

ምስል 1. በሶስተኛው ውስጣዊ ዙር DRD5 ዙር ሲክክስክስክስሎሌትስ ሴሬን 321 ይጠቀማል በህዋስ ውስጥ.

(ሀ) ከተለያዩ ዝርያዎች (ጥላዎች) የተጠበቁ የ DRD2 ክልሎችን የሚያሳይ የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተል አቀማመጥ. ሊኖረው የሚችለው Cdk5 ፎስፈፍሬሽን ጣቢያ በካርታ ምልክት ይገለጻል. (B) አይፒ ጋር የተያያዘ በብልቃጥ ውስጥ የ kinase ሙከራ በ recombinant GST-D2i3 እና GST-D2i3 የተወገዱ ፕሮቲኖች. ከአይጤት አእምሮ አንፃር በፀረ-ፒክስክስ ፍኖሪፕቺፒቲን የተገኘው Cdk5 / p35 ውስብስብ ለ kinase ምላሾች ጥቅም ላይ ውሏል. በኦቾሎኒ ብሩህ ሰማያዊ ብስባሽ ጥቁር ሰማያዊ ብስባሽ ጥቁር እና የፕሮቲን ኦፕሎይድ የራጅዮግራፊ ፊልም ታይቷል. ቀስት አውሮፕላን ከ GST-D35i2s ጋር የሚገናኝ ሬዲዮ ታክሏል ምልክት ያሳያል እና ክፍት ቀስት ርዝማኔ ከፖክታር ጨረር ታሳያዎችን የሚያመለክት ነው. (C) የ D3XXXXX በ phosphorylated peptide ፈሳሽ የ MS / MS ሽግግር. የቲዎሬቲክ የመነጣጠሉ ቅርጾች ከስርጭቱ በታች ይታያሉ. ከቁጥጥርዎቹ ሁሉ ions ውስጥ የ y- እና b-ionዎች ተገኝተዋል. እነሱ6 እና y7 ions የሴሪን 321 ፎስፎረሲሌሽን በጥብቅ ያመላክታሉ. (ዲ) በብልቃጥ ውስጥ የ GST-D5i25 እና የ GST-D2i3 ዝርያ ፕሮቲን በመጠቀም የኪንሴይ ማጣሪያ በንፁህ Cdk2 / GST-p3 ኮምፕሌተር. የፍሎረክሎሬድ ፕሮቲኖች በኦቶማሲው ውስጥ ከኮማሲያ ብሩህ ሰማያዊ ብዥታ ጋር በአንድ ፊርማዮግራፊ ውስጥ ታይተዋል. ቀስት አውሮፕላን GST-D2i3 የሚባል ሬዲዮ ታይተ ምልክት ያሳያል እና ክፍት ቀስት ርዝማኔ ከ GST-p25 በሬዲዮአክቲቭ ሲግናሎችን ያሳያል.

አያይዝ: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

የ Cdk5 ን መጠን ወደ ፍስስብልላ D2i3 አቅም ለመገምገም IP ጋር የተገናኘን በብልቃጥ ውስጥ የኬንሴስ ምርመራን በመጠቀም ከአንጎል አንጎል ረቂቅ በፒክስቲክስ ረቂቅ (P5 immunoprecipitation) እና በንፁህ የኃይል አሃድ (GST-D35i35) (አሚኖ አሲድ እጥረት 2-3) ፕሮቲንች ተክሎች እንዲሰሩ ተደርገዋል. በንጹህ GST-D212i373 እና GST-D2i3 S2A ፕሮቲኖች ውስጥ የፎሆሎሌሽን ምልክቶችን ተመልክተናል, ሆኖም ግን GST-D3i297 S2Aምስል 1B). በ GST-D321X2 ውስጥ የ serine 3 ፎስፈርፊሊሽንን ይበልጥ ለማረጋገጥ በኤ.ፒ.አይ. የተገናኙ ናሙናዎች LC-MS / MS ትንተረው በብልቃጥ ውስጥ የ kinase ምዘናዎች በመጠቀም LTQ XL mass spectrometry በመጠቀም ነው. በተደጋጋሚ ጊዜ ከፎክስ-ሴሪን የ 321 peptides ብዛት ጋር የሚመጣጠን የፎስፒ-ፖይቲድስ ፍሳሽ ተገኝቷል (ምስል 1C). በ LC-MS / MS ትንተና ላይ በዳታ-የተመሰረተ ትስስር ላይ የተከማቸ ግኝቱ ናሙና ውስጥ የተትረፈረፈ ፕሮቲን ለማወቅ ይጠቅማል [31], ይህ መረጃ የሲሚንቶን 321 ቅሪት የ Cdk5 ን በ D2XXXX ክልል ውስጥ ዋነኛው የፎክስሎዜሽን ጣቢያ ነው. በ Cdk3 ውስጥ የሲንሰንት 321 ቀጥተኛ PHOSPHILLEMENTን በ GST-D23 ውስጥ ለማረጋገጥ, በብልቃጥ ውስጥ የተጣራ ሪሆላጂን GST-D5i25 ፕሮቲን ተከናውኗል የኪንደይት ማጣሪያ በመጠቀም የተጣራ Cdk2 / GST-p3 ኮምፕሌክስ ተከናውኗል. በ GST-D2i3 S2A (GST-D3i321 SXNUMXA (GST-DXNUMXiXNUMX SXNUMXA (GST-DXNUMXiXNUMX SXNUMXA (GST-DXNUMXiXNUMX SXNUMXAምስል 1D). አንድ ላይ ተወስዶ እነዚህ ውጤቶች የ D2i3 S321 ቅሪት የ Cdk5-mediated phosphorylation ቀዳሚ ተመራጭ ነው.

በሲ ኤን ኤ ውስጥ ሶስት ውስጥ የ DRD5 በሴል ውስጥ የሲዲክስክስ ሎሌዎች ሲክክስክስክስፎለስሲን ሲሮክሎሌትስ Serine 321

የሰርሪን 321 ፈጠራን ለይቶ ለማወቅ, ለ phospho-serine 321 (ፒኤስ 321) ልዩ የሆነ አንቲቫይሮን አነሳን. ከ IP ጋር የተገናኘ ናሙና በብልቃጥ ውስጥ የ kinase ሙከራ በምዕራቡ ዓለም የፀረ-ተፅዕኖ ፀረ-ፒኤስክስNUMX ን ፀረ-ሙዝ ተመርምሮ ነበር. ነጠብጣቦች በ GST-D321XXXXXX ላይ የተመሠረተ የ kinase ግብረመልስ ልዩ ጥንድ አሳይተዋል (ምስል 2A). በሴሎች ውስጥ በ Cdk321 ውስጥ በሲዲክስNUMX ውስጥ የሴሪን 2 ፈጠራን የማጣራት ሁኔታ ለማረጋገጥ, የ DRD5-GFP ን እና DRD293 S2A-GFP ን የሚያሳዩ የ HEX2 ሕዋሶች ወይም የ HA-Cdk321 ን እና P5 ን የተወነጨውን ፀረ-ጉድፍ መከላከያዎች ከፀረ-GFP እና ፀረ-ፒኤስክስNUMX ፀረ እንግዳ አካላት. በ DRD35 ከፍተኛ መጠን ያለው የግብፅ ጋይኮሲዜሽን በመባል የሚታወቁት በፀረ-ጂ ኤም ፒን-ፀረ-ባክቴሪያዎች የሚታይ የብራንድር ምልክት በ DRD321-GFP በተገኙ ብቻ የሚታይ ሲሆን ፀረ-ፒኤስ2 ን ፀረ-ጥምብ ተመሳሳይ የ DRD2 ምልክትዎችን በ Cdk321 / p2 ኮምፕሌክስ ብቻ አግኝተዋልምስል 2B) [7]. በሲድክስክስክስ, የሲንክስ 321 ፍሮንቶፒክስ (ፐላክስ-D5i2) እና ተለዋጭ ቅፅ D3i2 (FLAG-D3i2 S3A) ተገኝቷል. በ HEK2 cells ውስጥ በ HA-Cdk3 እና በ P321 ውስጥ የተንጸባረቀው በ FLAG-D2i3 እና በ FLAG-D2i3 S321A በ SDS-ገላጭ ተንቀሳቃሽ ፍተሻ ይመረመራል. በ FLAG-D5XXXXX ላይ ከፍተኛ የሆነ የ Cdk35-ጥገኛ ተንቀሳቃሽነት ለውጥ ተስተውሏል ነገር ግን ለ FLAG-D293i5 S2A (ለ FLAG-D3i2 S3A አይደለም)ምስል 2C). በ A ልዮሲስ ቅስመት ወቅት በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ጠቃላይ በ A ንድን A ስተያየት ወስደዋል DRD2-GFP እና Cdk321 / p293 ኮንትራትን የሚጽፉ HEK 2 ሕዋሶች በ quinpirole ተነሳሽነት እና ፀረ-ጉርፍ ኬሚካሎች ከሴል ኢ ኤስፕሊፕሲት የተባሉ ፀረ-ፔርፕፔሪቲቴንስን በመጠቀም ፀረ-ጂፕ እና ፀረ-ፒክስክስ ፀረ-ፀረ-ፀረ-ፀረ-ፀረ-ፀጉር ፀረ-ሙስ-ነቀል ፀረ-ሙስ-ነቀል ፀረ-ተውሳዎች ተደረገ. በ Ser5 የ DRD35 በ Cdk321-mediated phosphorylation በ A ልዮሲቭ ማነቃቃቻ ላይ ምንም ተጽ E ኖ የለውም, ይህም ከ GRK- እና PKC-mediated phosphorylations (ምስል 2D) [32], [33]. በጋራ እነዚህ ውጤቶች Cdk5 በሴሉ አካባቢ ውስጥ የሲዲን 321 ን የሲዲዲክስን ጥሬ እምችት በፎሊዮትሮፕሊየስ ውስጥ ማስገባት ይችላሉ.

ድንክዬ

ምስል 2. በሴሎች ውስጥ ሶስት ውስጥ ያለው የ DRD5 ዙር DRD321 ውስጥ ሲንክስክስክስክስ ሎሌን 2 ይዟል.

የ serine 5 Cdk321-mediated phosphorylation የተደረገው በፀረ-ፒኤስክስNUMX ፀረ-ተውኔ አማካኝነት ነው. (ሀ) ከ IP ጋር የተገናኙ ናሙናዎች በብልቃጥ ውስጥ ኬንስትስ ምርመራ GST-D2i3 ፕሮቲን በመጠቀም በምዕራቡ የደም መፍሰስ (WB) ከተመረጡ ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ተንትኖ ነበር. የቀስት ራስ ዎች GST-D2i3s ናቸው. (B) DRD2-GFP እና DRD2 S321A-GFP በ HA-Cdk5 እና P35 ውስጥ በ HEK293 ሕዋሶች ውስጥ ነው የተንጸባረቀው. ፀረ-ጉድፍ እና የፀረ-ፒኤስ321 ፀረ ፀረ ፀረ ፀረ-ፀረ-ጉድፍ ፀረ-ፕላስተር ፀረ- ቅንፍው DRD2 ምልክቶችን ያመለክታል እና ክፍት ቀስ ቀስት ከ ፀረ-ጉድፍ መርፌዎች (immunogrecipitates) ውጪ ያልሆኑ ምልክት ማሳያዎችን ያመለክታል. '% input' ለ IP ምላሽ ከጠቅላላው የሊይሶል መጠን% ነው. ደካማ የተሟሉ የ Cdk5 ምልክቶች በአስተርጓሚዎች ጠቁመዋል. (ሐ) የንጥረትን ተንቀሳቃሽነት መለኪያ ሙከራ. እንደሚገልጸው እንደ HEK 293 ሴሎች የተላለፉ ህዋሳት በምዕራባው የመንጠባጠብ ሁኔታ ተንትኖባቸዋል. (D) ተሻሽለው HEK 293 ሕዋሳት በኬንጊሮሌ እና በፀረ-ፀረ-ጂፕ ፕሮቲሪፕቺፒቲንስ የተደረጉ ሲሆን በምዕራቡ ዓለም በፀረ-GFP እና በፀረ-ፒኤስክስNUMX ፀረ-ተውሳዎች ተመርተው ነበር. ክፍት ቀስት ራስጌ የፀጉር መርገጫ ፀረ-ነክ ምልክቶችን ያሳያል.

አያይዝ: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex እና DRD2 በአካል የተጎዳኙ ናቸው

ብዙ የ Cdk5 ንብረቶች ከ Cdk35 / p2 ውስብስብ ጋር ተቆራኝተው ስለሆኑ በ Cdk5 / p5 ውስብስብ እና በ DRD35 መካከል ያለውን አካላዊ መስተጋብር ሊሆን ይችላል. [23], [34], [35]. በመጀመሪያ, የ GST ቆራጣነት ሙከራ ተፈጽሟል. የተጣራ ተሃድሶ GST-D2i3 ፕሮቲን በአክራሪ አንጎል ረዣዥን እና ከግታቲሽ (GST) ጎርጎታ ጋር ተዳምሮ ለምዕራባው መንከስ ተንትኖ ነበር. እንደሚታየው ምስል 3A, የተጣጣሙ Cdk5 እና p35 በ "DRD2" እና በ "Cdk5 / p35" መካከል የተገቢነት መስተጋብር (አካባቢያዊ መስተጋብር)ምስል 3A). ከዚህም በላይ HA-Cdk5 እና P35 በ DRK293-GFP እና በ Cdk2 / p5 ን በሚገልጹ የ HEK 35 cells lysates ውስጥ በፀረ-ጉርፍ ፔፐርፒፒከቶች ውስጥ ተገኝተዋልምስል 3B). በተጨማሪም, የክትባት ኬሚካላዊ ትንታኔዎችን ያደረግን ሲሆን DRD2-GFP, HA-Cdk5 እና p35 በሂትካን የሴክሼን ሴሎች ውስጥ ጉልህ የሆነ የትብብር ማሳያዎችን አሳይተዋል (ምስል 3C, የላይኛው ፓነል). በ DRD2 እና በ Cdk5 / p35 ውስጥ በንዑስ አውድ ውስጥ ኮዶ-ያተረጉሙበትን ሁኔታ መርምረናል. በተመሳሳይ መልኩ, DRD2-GFP በ "DRD5" እና "Cdk35 / p7" (በዲ.ሲ.ኤን.ዲክስ) በ "ሲቲኖክስ" ነርቮች (DIV2) ውስጥ በ "ምስል 3C, ታች ክፍተቶች). ውጤቶቹ DRD2 እና Cdk5 / p35 ውስብስብ ሊሆኑ ይችላሉ ብሎም DRD2 የ Cdk5 የፊዚዮሌክ ምሰሶ መሆኑን ይደግፋሉ.

ድንክዬ

ምስል 3. Cdk5 / p35 ከ DRD2 ጋር ውስብስብ ሊሆን ይችላል.

(A) የተጣራ የሃይቲን (GST-D2i3) ፕሮቲን ከጠቅላላው የአደም ክምችት ጋር ተመጣጣኝ የሆነ የቲስትሬቲንግ (GST) አወቃቀር. የስትሮክቲቭ የጨጓራ ​​ቀስቶች የምዕራባው ነጠብጣብ ምርመራ ተደረገባቸው. 'ዱቄት' (GST) ያለ የ GST ፕሮቲኖች (ኤችአይቪ / ኤን) (B) የ DRD2 እና Cdk5 / p35 ውክልና መከላከያ. በተሸከርካሪ ሕዋሳት ላይ የተጣራ የፀረ-ጂፒፒ ሕዋሳት በምዕራባውያን የመመርመሪያ ምርመራዎች ተካተዋል. ቅንፍው DRD2 ምልክቶችን ያመለክታል እና ክፍት ቀስ ቀስት ከ ፀረ-ጉድፍ መርፌዎች (immunogrecipitates) ውጪ ያልሆኑ ምልክት ማሳያዎችን ያመለክታል. ለግቤቶች እጅግ በጣም የተጋለጥ ብጥብጥ በቀኝ በኩል ይታያል. (ሐ) የ DRD2 እና Cdk5 / p35 ኢሜርኦክኬኬሚካል ትንታኔዎች. DRK293-GFP እና Cdk2 / p5 ን የሚገልጹ HEK35 ሕዋሶች በፀረ-Cdk5 እና በፀረ-ፒክስክስ ፀረ-ተቀጣጣዮች (የላይኛው ፓነል) ይታከሙ ነበር. DRD35-GFP በባህላዊ ነርቮች ነርቮች ውስጥ ብቻ ተገለጠ እና በፀረ-Cdk2 እና ጸረ-ፒክስክስ ፀረ-ተባይ (ታችኛው ፓነል) ጋር ቀልሞ ይታያል. ሆቴክ ለኒዩክሊየስ ቀለም ጥቅም ላይ ይውሉ ነበር. የመመዘኛ አሞሌው 5 μm ነው. ሁሉም ምስሎች ተሰባስበው ኩዊክ አጉሊ መነጽር (ኦሊፒስ, ፍላወር እይታ-35) በመጠቀም ነው.

አያይዝ: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-mediated Phosphorylation የ DRD2 ርዝመት ተቀባይ ተግባርን

ፊፋዮሌሽን (ፕሮቲን) እንደ ጂፒኤን (ጂፕሲን) ትብብር, ተቀባይ ተቀባይ ውስጣዊ (ውስጣዊ አከባቢ), የውስጥ አከባቢ (localization), እና ከአማከለ ፕሮቲኖች ጋር ግንኙነት መፍጠርን [9], [11], [24]. አንድግሎሰንስ-ተመጣጣኝ ተቀባይ ተቀባይ ውስጣዊ ተቆጣጣሪ ሂደት የቴሌቪዥን ማስተላለፊያ ሂደት ነው. በ Cdk5-mediated modulation የ DRD2 ውስጣዊ ምርመራን መርምረናል. የ DRD293-GFP ን እና DRD2 S2A-GFP ን የሚያሳይ ወይም ያለምንም የ Cdk321 / p5 ን የሚገልጹ HEK35 ሕዋሶች በ "1 μM quinpirole" ውስጥ የ "agonist-stimulated" DRD2 ውስጣዊ (internal) (ኢንች) ውስጠ-ገፅ (ኢንች)ምስል 4A). [3H] -ፐፐሮን ፒኖን የ DRD2-GFP ፈሳሽ ሕዋሳቶች በ 30 min quinpirole ሕክምና ላይ በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል, በ 90 ደቂቃዎች ደግሞ ተመልሰዋል. የሚገርመው, [3H] -የ SPEPONE ምልክቶችን DRD2-GFP እና Cdk5 / p35 የሚገለገሉ ህዋሶች በ 30 min quinpirole ሕክምና ላይ ተወስደዋል, ነገር ግን በ 90 ደቂቃ ውስጥ አልተመለሱም (ምስል 4A, ሁለተኛ ክፍል). በሌላ በኩል, [3H] -ፐፐሮን ሲንዲሎች የ DRD2 S321A-GFP ሕዋሶችን የሚያንጸባርቁ ሲግናሎች በ 30 ደቂቃ ቀንሷል እና በ CNUM2 / P90 ኮም-መግለጫ ያለው ሳይሆኑ በ 5 ደቂቃዎች ተመልሰዋል. ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የውስጥ ዲጂታል ሲዲ (DRD2) ረዘም ያለ የሲንዲ ማወዛወዝ (ፕላንት) [11]. ቲDRD5 በ Cdk2-mediated phosphorylation ውስጥ አሲያን-የሚፈጥረው DRD2 ውስጣዊ-ተኮጂነት ከተፈጠረ የማጠቃለያ ሂደት ጋር የተያያዘ ይመስላል.

ድንክዬ

ምስል 4. Cdk5-mediated phosphorylation DRD2 የፊት ገጽታ እና የታችኛው ምልክት ማሳጠትን ያቃልላል.

(ሀ) DRD2 ን መስመሮች በ [3H] -የስፓይኦንሰር ማጽዳት ሙከራ. የተላለፈ HEK293 ሕዋሳት በ 1 ኤም ኤም ማኮረሊን ተመርጠው ለተጠቀሰው ጊዜ ተወስደው ተሰብስበው በቀን 3 nM [3ሸ] -ፒፕፔሮን ሕክምና ለ 3 ሰዓታት ፡፡ የራዲዮአክቲቭነት ተለካ እና የወለል ምልክቶች ተቆጥረዋል ፡፡ የስህተት አሞሌዎች ማለት ± SE ን ይወክላሉ (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; One-way ANOVA with Dunnett post hoc test: ሁሉንም አምዶች ከቁጥጥር አምድ ጋር ያወዳድሩ)። (ለ) [35S] -GTPγS ተያያዥ ሙከራ. የሕዋስ ክምችቶች እንደታጠቁ ከተደረጉ ሕዋሳት የተዘጋጁ ናቸው. የሜምባብ ቁሳቁሶች በ 1 μM ፈንጅፐርብል እና በ 3 nM [35S] -GTPγኤስ ለ 90 ደቂቃ ፡፡ የስህተት አሞሌዎች ማለት ± SE ን ይወክላሉ (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; One-way ANOVA with Bonferroni post hoc test: ሁሉንም ጥንድ አምዶች ያወዳድሩ). (ሲ) ኪንፒሮሌል-ውድድር3H] -የስፓይኦንሰር ማጽዳት ሙከራ. ከተሸረሸሩ ሴሎች የሚወጣው የሜምባዳ ዝግጅቶች በ 0.01 nM ይፈለፈላሉ.3H] -spiperone እና ለ 30 ደቂቃዎች የ quinpirole ብዛት መጨመር። መስመራዊ ያልሆነ መልሶ ማገገም በ GraphPad ተገኝቷል። የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± SE ያመለክታሉ (n = 3)። በተሸጋገረ የ HEK 293 ሕዋሶች ውስጥ ካምፓም ኢንዛይም የበሽታ መከላከያ ዘዴዎች ፡፡ የተለወጡ ህዋሳት ለ 10 ሰዓት በ 1 µM ሮሊብራም ቅድመ-ህክምና የተደረገላቸው ሲሆን በመቀጠልም በ 0.1 µM ፕራኮሊን በጋራ ተስተናግደው ለ 30 ደቂቃዎች የኳንፒሮል ብዛት ይጨምራሉ ፡፡ መስመራዊ ያልሆነ መልሶ ማገገም በ GraphPad ተገኝቷል። የስህተት አሞሌዎች ማለት ± SE ን ይወክላሉ (n = 4; ** p <0.01; ባለ ሁለት ጅራት) t-ፈቶች). (ሠ) የዱር ወለላ ነርቮች ከድስት ዓይነት እና ፒክስክስ ፐርሰንግ ኤድስ (DIV 35) በ 7 μM ሮሊፓም ለ 10 h እና በ 1 μM ዲፖሚን ለ 1 ሰዓታት ተወስደዋል. የስህተት አሞሌዎች ± SE (n = 1; **) ን ይወክላሉp<0.01; ባለ ሁለት ጅራት t-ፈቶች).

አያይዝ: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

በተጨማሪም የ A ፍሮይድ-የተገጠመ የ G ባክቴጅ A ስተሳሰብ ለውጥ ከ Cdk2-mediated phosphorylation ጋር የተያያዘውን የ DRD5 ለውጥ ሊተገበር E ንችላለን.35S] -GTPγS ተያያዥ ሙከራ [25], [26]. በ HEK2 ሕዋሶች በ DRD2-GFP እና በ DRD321 S5A-GFP የተያዙ ወይም ያልተነቀቁ የ Cdk35 / p293 ናቸው. ማባዣዎች በ 1 μM ፈንጅልብልል ተዘጋጅተው ታፍነዋል, እና [35S] -GTPγS incorporation. የሕዋስ (ሴል ሽፋን) የሚያሳይ መግለጫ DRD2-GFP እና Cdk5 / p35 በጣም የሚጎዱ ናቸው [35S] -GTPγS ማዋሃድ ከሁሉም የሴል ሴሎች (ቤዚን)ምስል 4B). እነዚህ ውጤቶች Cdk5-mediated phosphorylation በ DRD2 ላይ አሲድ-የተገጠመ የ G ፕሮቲን ማቆራረጥን ይቆጣጠራሉ.

በተጨማሪም, ኳን-ፐርቡል-ተፎካካሪ [3H] -የስፔሊንየም ማጣቀሻ ምርመራዎች በ Cdk2-mediated phosphorylation በ DRD5 ላይ ያለ የለውጥ አመላካችነት ለውጥ ለማጣራት ተከናውነዋል. የጫካ ባህሪይ [3H] -ፐርሰንትፐርፐርፐሮን በከፍተኛ ፍጥነት የሚከማች የማጠራቀሚያ ክምችት በፕላስተር ዝግጅት ላይ ተገኝቷል. የኳንፐር ሮቤል እና [3H] -spiperone በ DRD2-GFP እና DRD2 S321A-GFP ተመሳሳይ የመዝገብ ሂደትን አi እሴቶች (-9.789 ለ DRD2-GFP -9.691 ለ DRD2 S321A-GFP), ይህም የ ligand ኳስ ወደ DRD2 ንነት በ DRD5-mediated phosphorylation በ DRD2 (በምስል 4C).

Cdk5-mediated Phosphorylation ዝቅ ማለት-DRD2-cAMP Signaling Pathway

ቀጥሎ በ Cdk2 የ DRD5 ለውጥ ማለቁ ተጓዳኝ የምልክት ማሳለጫ መንገዶች ላይ ተጽዕኖ እንደሚፈጥር መርምረናል. በ DRD2-mediated መገደብ በስራ ላይ የሚውለው የ «ለኮሌን-ፈገግታ» ሲአፓል ፕሮቲን በ <DRD2-GFP> እና በ DRD2 S321A-GFP በተገለጹት ሴሎች ውስጥ በ cAMP enzyme immunoassay በመጠቀም በ adenylylcyclase ተቆጣጥረናል. DRD2-expressing cells የተቀመጠው በኳን-ጥገኛ ጥገኛ ላይ ለ quinpirole ምላሽ በመስጠት የ CAMP ደረጃዎች ቀንሷል. በሚያስገርም ሁኔታ, የ Cdk5 / p35 የጋራ መግለጫ የቡድኑን (cAMP) ፈጠራን ከፍተኛ ገደብ አሳዷልምስል 4D, ግራ ፓነል). በሌላ በኩል, በ DRD2 S321A-GFP ሕዋሶችን ሲያሳዩ የ Cdk5 / p35 (የ CdkXNUMX / pXNUMX (የ CdkXNUMX / pXNUMX) መግለጫ ምንም ይሁን ምን የ quinpirole ሕክምናን በመቀበል በተግባር ላይ ውሏል.ምስል 4D, ቀኝ ፓነል). እነዚህ ውጤቶች DRD5-mediated PHOSPHILYING DRD2 በ DRD2 ን በመግቢያው CAMP ማሳወጫ መንገድ ላይ ያለውን አጣብቂ እንቅስቃሴ ያቃልላል. ይበልጥ ስነልቦናዊ አገባብ ውስጥ ያለውን ክስተት የበለጠ ለማረጋገጥ, ዋናው ባህል-ነርቮች ከፒንጁን እጥረት ውስጥ በ P35 የጎደለው, አስፈላጊ የሆነውን የ Cdk5 ማንቃሪያ ነው. ዋናው ሕንፃዎች የሚያስተላልፉ የነርቭ ሴሎች በ 1 μM dopamine እና በ CAMP ኤንዛይ ኢንፌክሽን መመርመሪያ ተመርተዋል. ከ P35 የንጥል ጅራቶች የነርቭ ሴል ከዳዊ-ዓይነት ኒውሮንስ ጋር ሲነጻጸር በዲፓሚን ሲነፃፀር የ CAMP ደረጃዎችን አሳዷልምስል 4E). ቲከተመዘገቡ በኋላ, DRD5-mediated phosphorylation DRD2 ውጤቶችን በ DRD2 በሚተገበረው የ CAMP ፍጥነት መቀነስ ላይ.

ዉይይት

DRD2 ን እንደ Cdk5 የአዳዲስ ንኡስ ጥራዞች መለየት. ፎፍ ሆሄሌት DRD2 G ን በመቀነስ የ DRD2 ድማሚን በመፍጠር የ DRD2 ን የውስጥ ገላጭ ፊደል ተከታትሏል.i-ከኬፕሊንግ እና የታችኛው የ cAMP መንገድ. የ PHOSPHILLElATION ቅሪት S321 በ DRD2 ረጅም እና አጭር አሲዮ ዎች ውስጥ ስለሚገኝ በዚህ ጥናት ውስጥ የቀረበው አሰራር በ DRD2-mediated signaling.

DRD2 በአማካይ አጠራር የነርቭ ሴሎች እንደ ዋነኛ የዱፖሚን ተቀባይ ተቀባይ ተቀባይነታቸው ብቻ ሳይሆን በአካባቢ ተነሳሽነት ምላሽ ላይ ተፅዕኖ ሊኖርበት እንደሚችል ተገንዝቧል. አግዶቲዝስ የዲ ኤን ኤንስ ዲሰንሴሽን እና የሲዲዲክስን ድብደባ በስፋት ተዳሷል [11], [24]. በተለይም, በርካታ ጥናቶች እንደሚያሳዩት, የከፋ የስነ-ልቦ-ስጋ ልምዶች (ለምሳሌ ኮኬይን እና አምፌታሚን), በዲፕታይም ኦክሲጅን (extracellular level) ውስጥ የ dopamine መጠን ከፍ የሚያደርጉት የ DRD2 ልኬቶች በተለዋዋጭ ለውጦች [36]. በእርግጥ, የከባድ የኮኬይ ተጠቃሚ ተጠቃሚዎች በዲስትሪክቱ ውስጥ የ DRD2 ን መጠን መቀነስ ይታወቃሉ, እናም በ Nucleus accumbens (NAcc) ውስጥ DRD2 መገኘቱ በአዕዮስ እና በንቦች ውስጥ ከአደገኛ ዕጾች መፈለጊያ እና ማጠናከሪያ ባህሪ ጋር አሉታዊ ቁርኝትን ያሳያል [37]-[39]. እነዚህ ግኝቶች እንደሚያመለክቱት DRD2 ተግባራዊነት ለበርካታ የአደገኛ መድሃኒቶች (ኤችአይዲ) መጋለጥን ጨምሮ ለበርካታ ማነቃቂያዎች ምላሽ ሊሆን ይችላል. ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት በሶስተኛ ዙር የ DRD321 ዙር የ S2 ቅሪት በ Cdk5 በ phosphorylate ሊገኝ ይችላል, ይህም በ CAMP መንገድ ላይ በ DRD2 መቆጣትን መገደብ ያስከትላል. ይህ መስተጋብር በ Dopaminoceptive ኒውሮኖች ውስጥ ከ DRD5 ተለዋዋጭ ተፈጥሮ ጋር የተገናኙ አዳዲስ የአሠራር ዘዴን ያቀርባል.

Cdk5 የአየሩን ለውጥ ማምጣትን ለመለማመድ ቁልፍ አካል መሆኑን ይታወቃል. ለምሳሌ ያህል, በተቆራረጡ የውጭ ዑደትዎች ውስጥ የሚገኙት የዱር ነክ ነጠብጣቦች መዋቅሮች እና ተግባራት በተደጋጋሚ የአእምሮ ማስታገስ / [40]. እነዚህ ለውጦች በተለያዩ ሞለኪውላዊ ለውጦች አማካኝነት የተካተቱትን የ cAMP ምላሽ ንጥረ-ተያያዥ-ፕሮቲን (CREB) እና ΔFosB (ኢንፌክቶች) መለዋወጥን ጨምሮ, ለከባድ የኮኬይን አስተዳደር ምላሽ [41], [42]. በጣም አስፈላጊ, Cdk5 የ ΔFosB ዒላማ ነው [19], እና እንደ በ PSD-95, ፒክስኤንሲን (activated kinase) (ፒኬ), β-ካቴኒን እና ስፖኒፊሊን የመሳሰሉ በዲንቸሪክ አከርካሪ አሠራር ውስጥ ያሉ በርካታ ወሳኝ ክፍሎች እንደ ሲዲክስክስ [43]-[46]. በዴንቨር የጄኔሲካል ወይም የፋርማኮሎጅ ክውነቶች የዲንቸሪክ ስነምድ ስነ-ምህላቶችን እና የኮኬይን ባህሪይ ለውጦች ሲሆኑ በ Cdk5 ውስጥ ወሳኝ ሚናዎችን የሚያመለክቱ ሞለኪዩላር እና የሞርሞሎጂ ለውጦች የ Mesomimbic dopamine መአከኖች [47], [48]. የ DRd2 ማሳያ ውጤት የሆነው የ Cdk5 ዒላማ እንደአስፈላጊነቱ በዲፒሚን ስርዓት ለውጦችን ለመመለስ ተጨማሪ የዲ ኤም ፒን ስርዓት ለውጦችን በዲ.ሲ. . በተጨማሪም DRD5 በበርካታ የሞባይል ሂደቶች ላይ ተፅዕኖ ያሳድራል, ይህም የ cAMP እና የ MAP kinase መተላለፊያ መንገዶች እና የዝቅተኛውን የዝግጅት አቀራረብ ክስተቶች [42], [49]. ስለዚህ በዚህ ጥናት ውስጥ የተገኘው ግኝት DRD2 በ Cdk5 ቀጥተኛ ቁጥጥር ብቻ ሳይሆን ዳፓሚን የተባለውን ስርዓት ወደ ተመጣጣኝ መድሃኒት በተጋለጡበት ሁኔታ ላይ አዲስ ማስተዋል ይሰጣል.

የደራሲ መዋጮዎች

ሙከራዎቹን አስተውለው እና ንድፍ አውጥተዋል JJ YUP DH SKP. ሙከራዎቹን አከናውነዋል: JJ YUP DKK YK. መረጃውን አጣርቶታል: - JJ YIUP DKK SL - YK SAL HL YSG DH SKP. የተበረከቱት ተቆጣጣሪዎች / ቁሳቁሶች / የትንታኔ መሳሪያዎች-YHS. ወረቀትዎን ሰጥቷል JJ SKP.

ማጣቀሻዎች

  1. 1. ሚሊካል ሲ, ናሽ ሲ ሪ, ሮቢንሰን ኤስኤን, ጃባር ኤም, ካርሮን ኤምጂ (1998) የዱፖሚን ተቀባይ ተቀባይዎች ከአቅርቦቱ ወደ ተግባር. Physiol Rev 78: 189-225.
  2. 2. WIE RA (2002) የአንጎል ሽልማት ወሳኝ: የተጎዱ ማበረታቻዎች ግንዛቤዎች. Neuron 36: 229-240. አያይዝ: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. ጽሁፍን ተመልከት
  4. PubMed / NCBI
  5. Google ሊቅ
  6. ጽሁፍን ተመልከት
  7. PubMed / NCBI
  8. Google ሊቅ
  9. ጽሁፍን ተመልከት
  10. PubMed / NCBI
  11. Google ሊቅ
  12. ጽሁፍን ተመልከት
  13. PubMed / NCBI
  14. Google ሊቅ
  15. ጽሁፍን ተመልከት
  16. PubMed / NCBI
  17. Google ሊቅ
  18. ጽሁፍን ተመልከት
  19. PubMed / NCBI
  20. Google ሊቅ
  21. ጽሁፍን ተመልከት
  22. PubMed / NCBI
  23. Google ሊቅ
  24. ጽሁፍን ተመልከት
  25. PubMed / NCBI
  26. Google ሊቅ
  27. ጽሁፍን ተመልከት
  28. PubMed / NCBI
  29. Google ሊቅ
  30. ጽሁፍን ተመልከት
  31. PubMed / NCBI
  32. Google ሊቅ
  33. ጽሁፍን ተመልከት
  34. PubMed / NCBI
  35. Google ሊቅ
  36. ጽሁፍን ተመልከት
  37. PubMed / NCBI
  38. Google ሊቅ
  39. ጽሁፍን ተመልከት
  40. PubMed / NCBI
  41. Google ሊቅ
  42. ጽሁፍን ተመልከት
  43. PubMed / NCBI
  44. Google ሊቅ
  45. ጽሁፍን ተመልከት
  46. PubMed / NCBI
  47. Google ሊቅ
  48. ጽሁፍን ተመልከት
  49. PubMed / NCBI
  50. Google ሊቅ
  51. ጽሁፍን ተመልከት
  52. PubMed / NCBI
  53. Google ሊቅ
  54. ጽሁፍን ተመልከት
  55. PubMed / NCBI
  56. Google ሊቅ
  57. ጽሁፍን ተመልከት
  58. PubMed / NCBI
  59. Google ሊቅ
  60. ጽሁፍን ተመልከት
  61. PubMed / NCBI
  62. Google ሊቅ
  63. ጽሁፍን ተመልከት
  64. PubMed / NCBI
  65. Google ሊቅ
  66. ጽሁፍን ተመልከት
  67. PubMed / NCBI
  68. Google ሊቅ
  69. ጽሁፍን ተመልከት
  70. PubMed / NCBI
  71. Google ሊቅ
  72. ጽሁፍን ተመልከት
  73. PubMed / NCBI
  74. Google ሊቅ
  75. ጽሁፍን ተመልከት
  76. PubMed / NCBI
  77. Google ሊቅ
  78. ጽሁፍን ተመልከት
  79. PubMed / NCBI
  80. Google ሊቅ
  81. ጽሁፍን ተመልከት
  82. PubMed / NCBI
  83. Google ሊቅ
  84. ጽሁፍን ተመልከት
  85. PubMed / NCBI
  86. Google ሊቅ
  87. ጽሁፍን ተመልከት
  88. PubMed / NCBI
  89. Google ሊቅ
  90. ጽሁፍን ተመልከት
  91. PubMed / NCBI
  92. Google ሊቅ
  93. ጽሁፍን ተመልከት
  94. PubMed / NCBI
  95. Google ሊቅ
  96. ጽሁፍን ተመልከት
  97. PubMed / NCBI
  98. Google ሊቅ
  99. ጽሁፍን ተመልከት
  100. PubMed / NCBI
  101. Google ሊቅ
  102. ጽሁፍን ተመልከት
  103. PubMed / NCBI
  104. Google ሊቅ
  105. ጽሁፍን ተመልከት
  106. PubMed / NCBI
  107. Google ሊቅ
  108. ጽሁፍን ተመልከት
  109. PubMed / NCBI
  110. Google ሊቅ
  111. ጽሁፍን ተመልከት
  112. PubMed / NCBI
  113. Google ሊቅ
  114. ጽሁፍን ተመልከት
  115. PubMed / NCBI
  116. Google ሊቅ
  117. ጽሁፍን ተመልከት
  118. PubMed / NCBI
  119. Google ሊቅ
  120. ጽሁፍን ተመልከት
  121. PubMed / NCBI
  122. Google ሊቅ
  123. ጽሁፍን ተመልከት
  124. PubMed / NCBI
  125. Google ሊቅ
  126. ጽሁፍን ተመልከት
  127. PubMed / NCBI
  128. Google ሊቅ
  129. ጽሁፍን ተመልከት
  130. PubMed / NCBI
  131. Google ሊቅ
  132. ጽሁፍን ተመልከት
  133. PubMed / NCBI
  134. Google ሊቅ
  135. ጽሁፍን ተመልከት
  136. PubMed / NCBI
  137. Google ሊቅ
  138. ጽሁፍን ተመልከት
  139. PubMed / NCBI
  140. Google ሊቅ
  141. ጽሁፍን ተመልከት
  142. PubMed / NCBI
  143. Google ሊቅ
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Dopamine የክትባት መልእክት ምልክት. የ "J" ምልክት ምልክት ማስተላለፍ 24: 165-205. አያይዝ: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) የዶሴ-ፖታሪስ ዲፓንሚን (DXamineX receptor signal receptor signaling components) ተካፋይ መሆን. Int J Neuropsychopharmacol 2: 11-197. አያይዝ: 205 / s10.1017
  146. 5. ካይየን SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) የኮኬይን ዲክስክስ-ልክ እንደ ተቀባይ (ኮኬን) ራስን መግዛትን (ኮፔን) (DTP) መርሃግብሮች ሚና በ D2 ተቀባዮች መፈልፈፍ እና በአዳዲስ D2 ተቀባይ ተቀባይ ተውሳኮች. J Neurosci 2: 22-2977.
  147. 6. ሊ ኤስ, ጂንግ ጂንግ, ፓርክ ዩ, ዊክ ኤ, ሊ ሳ, ሳ. (2012) Valproate ከ Par-4 ፕሮቲን ኤክስፕሬሽን ጋር ተያይዞ የ dopamine ማቀንወሻን ይለውጣል. PLoS One 7: e45618. አያይዝ: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) የ D2 dopamine መቀበያ ለረጅም እና አጭሩ የኢሶ ፎርማቶች ዲጂኔሲዜሽን እና የውስጥ አስገዳጅ ህገወጥ ዝውውር. ጆ Biol Chem 270: 29819-29824. አያይዝ: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. ማርቲን ኤ ቲ, ሞሊና-ሆልጋዶ ኤ, ሊማ ሊ, ቡሊኔ ኤስ, ደዋር KM (1992) የተወሰኑ [3H] ስሮፕሎፕረደ ማኔጅቲክ dopamine D2 ተቀባዮች መያያዝ: የዲፋፋይድ እና የሱልፊርል ቡድኖች ሚና. ኒውሮሚክ ሬጅናል 17: 749-759. አያይዝ: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. ጉን ጋይ, ኦውዶድ ብ ኤፍ, ካሮን ሚ, ዴኒስ ኤም, ብራን አርዲ, እና ሌሎች. (1994) በሰውነት ውስጥ የ D2L dopamine መቀበያ በ Sf9 ሕዋሳት ውስጥ. J Neurochem 63: 1589-1595. አያይዝ: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) በ dinin-binding ፕሮቲን (ABP-2) የ dopamine D (280) ተቀባይ መለዋወጥ. ሞል ፋርማኮል 57: 446-452.
  152. 11. ለ D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) የአሲኖኒዝም በሽታ መከላከያ መድሃኒት እና የሆድ አንቲፋፋሎፕላሽን እርዳታን የ dopamine D (2) ተቀባይ የሆኑትን ድክመትን ያጠናክራል. Mol Endocrinol 24: 574-586. አያይዝ: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. ሼይ ኤል ኤል, ዳሌል I, ካቪቪየስ, ጄ, ቻ ጤ, ሃሮው ኢ (1994) p35 የሳይሚን-ጥገኛ ነጭ ኪኖሲን 5 ኒውራል-ተኮር የቁጥጥር ንዑስ ክፍል ነው. ተፈጥሮ 371: 419-423. አያይዝ: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. ዲቫን ሪ, ታኢይ ኤል ኤች (2001) የ CDK5 አስር ዓመት. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749-759. አያይዝ: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) በሳይንሳዊ ጭንቅላት ላይ የተመሰረተ ኪንጀንት 5 በቆዳ ሽክርክሪት ውስጥ በኩንሰር ስኪሌለተን ወደ አሲንኪኬሌተን የሚወስዱ ከርኒካል ኮከንዶች ጋር የተገናኙ ናቸው. ሕዋስ ማጂም 1: 110-112. አያይዝ: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. ዌንግ ጀይ, ሊዩ ኤስ, ፉ ዬ, ጂንግ ጄ ኤች ኤ, ሉ ዩ (2003) Cdk5 ማግበር የሂፖፖፓካል CA1 ሕዋስ ሞትን በቀጥታ በማክሸፍ የዲ ኤን ኤ ኤም ተቀባይዎችን በቀጥታ ያመነጫሉ. Nat Neurosci 6: 1039-1047. አያይዝ: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 የ tyrosine 1472 NR2B የፎቶፊዮሌሽን ፍሰት እና የ NMDA መቀበያ ገፆች ንፅፅር ይቆጣጠራል. J Neurosci 28: 415-424. አያይዝ: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. ሞይ LY, Tsai LH (2004) Cyclin-dependent Kinase 5 የፎክስዮትሎሌዝ የሲሮሲን ሃይድሮላላይዜዥን ሴሪን 31 እና የተረጋጋ እንዲሆን ያደርጋል. ጆ Biol Chem 279: 54487-54493. አያይዝ: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) በ Cdk32 የ DARPP-5 ፎስፌትሪሊን በዲናኑ ውስጥ ዲፓሚን ምልክት ማድረጊያ ያስተካክላል. ተፈጥሮ 402: 669-671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001) ለኮንያ ኮኔክንሲያን መከሰት የሚከሰቱ ውጤቶች በኒውሮኖል ፕሮቲን Cdk5 ቁጥጥር ይደረግባቸዋል. ተፈጥሮ 410: 376-380.
  161. 20. ኦሃማ ቲ, ኦጋቫ ኤም, ቬራና, ሐራሳሳ ሚ, ሎንግኬከር ጂ, እና ሌሎች. (2001) የሳይንቲን-ጥገኛ ኪንጀንት 5 / p35 እና Reelin / Dab1 ን በማኅፀን አንጎል ውስጥ የአከርካሪ ሕዋሳት ንጣፍ አቀማመጥን ለማስተካከል. ናዝ ናታል አፓድ ሴሲ ዩ ኤስ ኤ የ 98: 2764-2769. አያይዝ: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. ሞርታው ኤ ኤም, ሺን ሚ, ሲኤይ ኤልኤ (2004) በሳይንሳዊ ሁኔታ ላይ የተመሰረተ ኪንጀንት 5 ፎስፎርየስክቴሪያቲክቲክ ጥብቅ ፕሮቲን PSD-95 በ "ኒውሮኒየም" ጎራ ውስጥ ወደ ፎርማትነት ይለካል. J Neurosci 24: 865-876. አያይዝ: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. ፓርክ SK, Nguyen, MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, እና ሌሎች. (2005) Par-4 አገናኞችን dopamine ማሳያ እና ዲፕሬሽን. ሕዋስ 122: 275-287. አያይዝ: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL ከ LIS5 እና ከሳይቶፕላሪሚክ ዲንየን ጋር የተቆራኘ ዲዛይነር ሲዶክስክስ ኒውሴድ ነው. Neuron 1: 28-697. አያይዝ: 711 / s10.1016-0896 (6273) 00-00147
  165. 24. ኪም ኬ ኤም, ቫለንዛኖ ኪጄ, ሮቢንሰን አርክ, ዮድ ደብሊው ዲ.ዲ., ባራ ኤ ኤል ኤልኤ, እና ሌሎች. (2001) በጂ ግንድ-የተዳደሩ ተቀባይ ተቀባይ ኬንስ እና ቤታ-ቁምፊዎች የዲ ፖታመር D2 እና D3 ተቀባዮች ተፈጥሮል. ጆ Biol Chem 276: 37409-37414. አያይዝ: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) የ A1 adenosine እና የ D2 dopamine ማመቻቻ ፈሳሽ መፍታት በንሳም እና በ I ቱም ኢቴልታይዊል ሰሚኒን (NF037) የተለያየ ቅኝት. ሞል ፋርማኮል 53: 808-818.
  167. 26. ቦፊል-ካርዲና ኤ, ኩደላክ ኦ, ያንግ ኪ, አሆን ኤች, ፍሪሜማ ሜ, እና ሌሎች. (2000) የ calmodulin ወደ D2-dopamine መቀበያ መቀበያ ተቀባይ የ G ግፊት መቆጣጠሪያውን በመያዝ የክትትል ምልክት ማሳለጥ ይቀንሳል. ጆ Biol Chem 275: 32672-32680. አያይዝ: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. List SJ, Seeman P (1981) የጠቅላላው የጠቅላላው የጠቅላላው የ [3H] spiperone የ dopamine እና የሴሮቶኒን ተቀባይ ንጥረ ነገሮች. ናዝ ናታል አፓድ ሴሲ ዩ ኤስ ኤ የ 78: 2620-2624. አያይዝ: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. ጀነር ቢ, እንግዳ PG (1998) በ D2 (ረጅም) ዳፖምሚን ተቀባይ ተካካይዎች ላይ: ligand binding እና functional tests. ቢ ኤ ኤፍ ፋርማኮል 124: 978-984. አያይዝ: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopamine በከፍተኛ ደረጃ በሚገኙ የዶፖሚን D3 ተቀባይ ተቀባይ ታዳጊዎች ውስጥ [2H] raclopride ወይም [3H] spiperone በ አይቶቶኒክስ መካከለኛ (ሚዛን) ውስጥ አይደለም. 3 synaptic: 49-209. አያይዝ: 215 / syn.10.1002
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: በጥቅል ቅደም ተከተል በመጠቀም የሴል ምልክት ማሳያ መስተጋብሮችን (ፕሮቲን) የሚመለከት ትንበያ. ኑክሊክ አሲዶች Res 31: 3635-3641. አያይዝ: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) በሻምጉን ፕሮቲሞሚስ ውስጥ የፕሮቲን የበለጸገ ዘረ-ብልጭነት ናሙና እና መገምገም ሞዴል. አናል ኬም 76: 4193-4201. አያይዝ: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. ኢኪ ኬ, ሀጋ T, ላሜ ጄ, ሳዴ ደብሊው (1999) የ dopamine የ D2 ቅሪተ አካላት ቅሪቶች በ G-protein-coupled receptor kinases 2 ወይም 5 ላይ ተፅእኖ ላይ የተመረኮዘ ነው. ኢዩር ቢ ቢሃምኤም 260: 112-119. አያይዝ: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. ናንኪንግ ዮ, ሲቢዲ DR (2004) ፕሮቲን ኪንሴሲ ሲ የፎክስዮፕላሪሽን, የዝምታ ጣፋጭነት እና የ D2 dopamine መቆጣጠሪያን ያካትታል. ጆ Biol Chem 279: 49533-49541. አያይዝ: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. ዋንግ ኤኤስ, ሊ ሮኤች, ቻንግ አይ, ዪንግ ፒ ኤች, ቹ ቼንግ ኬ, እና ሌሎች. (2011) Cdk5-mediated phosphorylation of endophilin B1 በፖንሲንሰንስ በሽታ ሞዴል ውስጥ ለሚገኙ ራስ-አደገኛ (በራሰ-ተውሰነ-ፈሳሽ) ራስን መሞከር ያስፈልጋል. የኒት ሴል Biol 13: 568-579. አያይዝ: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 ማስኬድ እና ፎስፎሌት ቤታ-ካቴኒን እና የቤታ-ካቴኒን / ፕሬንኢሊን-1 መስተጋብር ይቆጣጠራል. ዩር ጄር ኒውሮሲሲ 13: 241-247. አያይዝ: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. ኩሃር ኤምጄ, Ritz MC, Boja JW (1991) የኮኬይን የማጠናከሪያ ባህሪያት ዲፓሜሚ መላምት. አዝማሚያዎች Neurosci 14: 299-302. አያይዝ: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. ፍሎውቭ ኖድ, ፎወል ጄ.ኤስ, ቮልፍ ኤፒ, ስሊይደር ዲ, ሹጂ ሲ ኤ, እና ሌሎች. (1990) የዱርኬፕቲክ dopamine መድሐኒቶች የከባድ የኮኬይን በደል ያስከተለው ውጤት. Am J የሥነ ልቦና 147: 719-724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 ተቀባዮች ባህርይ አለመታዘዝ እና የኮኬይን ማጠናከሪያ ይልካሉ. ሳይንስ 315: 1267-1270. አያይዝ: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. በዱካዎች ራስን መቆጣጠር በሚያስፈልግበት ጊዜ የዶላሚን D2006 ተቀባዮች (2) PET ምስሎች. Nat Neurosci 9: 1050-1056. አያይዝ: 10.1038 / nn1737
  181. 40. ሮቢን ቲል, ኮልቢ ቢ (1997) በኒውክሊየስ ክሬምስ እና በቅድመፍራርድ ኮርቴክስ ነርቮች ውስጥ በተደጋጋሚ ጊዜያት በ አምፊፋሚን በተሰራው የቋሚነት ለውጥ. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. ሮቢን ቲ, ኮልቢ ቢ (1999) በኒውክሊየስ ክሬምስ እና በቅድመ በፍላንት ፊንጢጣዎች ውስጥ በተደጋጋሚ በሚታወቀው የዲንቸርት እና የዴንቴክቲክ ስሮች ላይ በአፋፊሚን ወይም ኮኬይን በተደጋጋሚ ህክምና በመተካት. ዩር ጄር ኒውሮሲሲ 11: 1598-1604. አያይዝ: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. ማክሊን CA, Nestler EJ (2003) በ CREB እና DeltaFosB የጂን አገላለፅ እና የኮኬይ ሽልማት ደንብ. Nat Neurosci 6: 1208-1215. አያይዝ: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) ስፒኖፊሊን የዲንቴክቲክ ስሮች አሠራር እና አሠራር ይቆጣጠራል. ናዝ ናታል አፓድ ሴሲ ዩ ኤስ ኤ የ 97: 9287-9292. አያይዝ: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. ፕሬንግ ኦ, Murphy TH (2001) ሞዳል ትራንስፓንሲቲክ እምብርት-የ 95 ክላስተሮች እና ከዋነኛው የጎን ቀዶ ጥገናዎች ጋር በማስተዋወቅ የአከርካሪ ነርቮች እድገት ሲጀመር. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarization በሲፕቲክ አወቃቀር እና ተግባር ላይ ለውጥ ለማምጣት ቤታ-ካቴኒን ወደ ኒውሮሊን ሽክርክሪት ይፈጥራል. Neuron 35: 91-105. አያይዝ: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. ሃሃሺ ሞሌሎ, ቾይ ሲ, አርኦ ቢ ኤስ, ጀንግ ሃይ, ሊ ኬ, እና ሌሎች (2004) በቅድመ-ወሳኝ-ወሳኝ-አልባ ፒካ ትራንስሚክ አይጦች ውስጥ የተጎዱ የአሰራር ስነ-ፆታ ንክኪዎችን እና የአዕምሮ ቅልጥፍናን ማጠናከር. Neuron 42: 773-787. አያይዝ: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. ቤንቪስስ ዲ.ዲ., ኩዊን ጂ ጃ, ቾንግ ፒ, ሀዋስሊ ኤ ኤች, ዲኤልን RJ, et al. (2007) Cdk5 የኮኬይንን ሽልማት, ተነሳሽነት, እና ወሳኝ የነርቭን ተነሳሽነት ይለካል. J Neurosci 27: 12967-12976. አያይዝ: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) የ Cdk5 የድንገተኛ ቁስ አካላት ከኮኮን, ከሞተሩ, እና ከዴንቸር ሥነ-ምህዳሮች የመኪና ሞተር እርምጃዎችን ይለውጣል. ናዝ ናታል አፓድ ሴሲ ዩ ኤስ ኤ የ 105: 18561-18566. አያይዝ: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) አዳዲስ ግንኙነቶችን ማድረግ: - በአርነን አንቲሚኒየም ውስጥ የ ERK / MAP kinase ምልክት ማሳያ. Neuron 23: 11-14. አያይዝ: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3