astrattu
L'alterazione indotta da psicostimulanti di spine dendritiche nantu à i neuroni dopaminocettivi in nucleus accumbens (NAcc) hè stata ipotizzata cum'è una risposta neuronale adattativa chì hè ligata à cumpurtamenti addictive di longa durata. NAcc hè largamente cumpostu da duie sottopopulazioni distinte di neuroni spinosi di medie dimensioni chì esprimenu livelli elevati di recettori di dopamina D1 o D2. In u presente studiu, avemu analizatu a densità di a spina dendritica dopu u trattamentu cronicu di cocaina in neuroni spinosi di medie dimensioni chì cuntenenu receptori D1 o D2 distinti in NAcc. Questi studii facianu l'usu di topi transgenici chì espresu EGFP sottu u cuntrollu di u promotore di u receptore D1 o D2 (Drd1-EGFP o Drd2-EGFP). Dopu à 28 ghjorni di trattamentu di cocaina è 2 ghjorni di ritirata, a densità di a spina hè aumentata in i neuroni Drd1-EGFP- è Drd2-EGFP-positivi. Tuttavia, l'aumentu di a densità di a spina hè stata mantinuta solu in i neuroni Drd1-EGFP-positivi 30 ghjorni dopu a retirazzione di a droga. In particulare, l'espressione ΔFosB aumentata hè stata osservata ancu in i neuroni Drd1-EGFP- è Drd2-EGFP-positivi dopu à 2 ghjorni di ritirata di droga, ma solu in neuroni Drd1-EGFP-positivi dopu à 30 ghjorni di ritirata di droga. Questi risultati suggerenu chì a densità di a spina aumentata osservata dopu u trattamentu cronicu di cocaina hè stabile solu in i neuroni chì cuntenenu receptori D1 è chì l'espressione ΔFosB hè assuciata cù a furmazione è / o u mantenimentu di spine dendritiche in D1 è ancu in neuroni chì cuntenenu receptori D2. in NAcc.
A via dopaminergica mesolimbica hè cumposta di neuroni in l'area tegmentale ventrale chì innervate u nucleu accumbens (NAcc), tuberculu olfattiu, corteccia prefrontale è amigdala (1), mentre chì i neuroni dopaminergici nigrostriatali in a substantia nigra (pars compacta) furnisce una proiezione ascendente à u striatu dorsale (2). I psicostimolanti elevanu a concentrazione sinaptica di dopamina in NAcc: cocaina, bluccà l'assorbimentu di dopamina da a fessura sinaptica, è anfetamina, prumove a liberazione di dopamina da i terminali nervosi (3-5). L'amministrazione ripetuta è intermittente di psicostimulanti si traduce in risposti cumportamentali aumentati (sensibilizazione) à l'effetti stimulatori aguti di sti droghe.6-8). A maiò parte di e linee di evidenza suggerenu chì i cambiamenti adattativi in l'area tegmentale ventrale-sistema dopaminergicu NAcc sò centrali per l'alterazioni in a plasticità dipendente da l'esperienza chì sottumette u cumpurtamentu indottu da a droga.
In più di a dopamina, u glutamate hè necessariu per u sviluppu di a sensibilizazione cumportamentale in risposta à i psicostimulanti (9, 10). I neuroni spinosi di medie dimensioni (MSN) in u striatum ventrale ricevenu proiezioni glutamatergiche eccitatorie da a corteccia prefrontale chì sinapsi nantu à i capi di spine dendritiche. I MSN sò ancu l'obiettivu principale per l'assoni dopaminergici chì sinapsi nantu à u collu spinale (1, 11, 12). Dunque, e spine dendritiche in MSN rapprisentanu u compartmentu cellulare induve a trasmissione dopaminergica è glutamatergica sò inizialmente integrate.
A dopamina agisce nantu à dui sottofamiglie maiò di receptori, a sottofamiglia D1 (sottotipi D1 è D5) è a sottofamiglia D2 (sottotipi D2, D3 è D4) (13). In u striatum dorsale, studii anatomichi anu dimustratu chì i MSN striatonigrali cuntenenu alti livelli di receptori D1 (inseme cù a sostanza P è a dinorfina), mentre chì i MSN striatopallidali sprimenu principarmenti i receptori D2 (inseme cù l'enkefalina).14-17). I proiezioni da NAcc sò più cumplessi ch'è in u striatum dorsale, cù a cunchiglia è e parti core di u NAcc chì prughjettanu à distinte subregioni di u pallidum ventrale è à l'area tegmentale ventrale è substantia nigra.18). Mentre chì i receptori D2 è l'enkefalina sò altamente espressi in proiezioni à u pallidum ventrale, i receptori D1 è a sostanza P si trovanu ugualmente distribuiti in proiezioni à u pallidum ventrale è l'area tegmentale ventrale.19). Studi di agonisti è antagonisti selettivi per i receptori D1 o D2 anu dimustratu chì i recettori D1 è D2 sò richiesti per i cambiamenti di comportamentu dipendente da psicostimulanti.20-25). In ogni casu, i roli di sti receptori pareanu esse sfarenti. Per esempiu, l'estimulazione di i receptori D1 attenua a ricerca di cocaina indotta da iniezioni di prima di cocaina è segnali ambientali ligati à a cocaina, mentre chì l'estimulazione di i receptori D2 facilita a reintegrazione indotta da cocaina (26-28).
L'anormalità cumportamentali assuciate à a dipendenza da psicostimulanti sò estremamente longeve. Per quessa, ci hè statu un interessu considerableu à identificà cambiamenti indutti da droghe à longu andà à u livellu moleculare è strutturale in i circuiti neuronali regulati da dopamina è glutamate.29-32). In particulare, l'esposizione à longu andà à a cocaina o anfetamina hè stata trovata per aumentà u numeru di punti di ramu dendriticu è spine di MSN in NAcc (33-35). Questi cambiamenti strutturali sò stati dimustrati per persiste finu à ≈1-3.5 mesi dopu l'ultima esposizione di droga (30, 35) è sò stati suggeriti per sottumette alterazioni longu à a plasticità sinaptica assuciata à l'esposizione psicostimulante.
L'obiettivu di u presente studiu era di esaminà l'alterazioni strutturali indotte da cocaina di spine dendritiche in sottopopolazioni di MSN accumbal chì esprimenu recettori D1 o D2. In questi studii, avemu usatu topi transgenici di cromosomi artificiali bacteriali (BAC) chì esprimenu EGFP sottu u cuntrollu di u promotore di u receptore di dopamina D1 (Drd1-EGFP) o D2 (Drd2-EGFP).36). I risultati indicanu chì, ancu s'è a densità di a spina aumentata inizialmente si trova in MSN chì cuntenenu u receptore D1 è MSN chì cuntenenu u receptore D2, a densità spine alterata hè stabile solu in i neuroni chì cuntenenu u receptore D1. Inoltre, truvamu cambiamenti simili in l'espressione di u fattore di trascrizione ΔFosB, suggerenu chì ΔFosB pò esse implicatu in a furmazione è / o mantenimentu di spine dendritiche in D1 è ancu neuroni chì cuntenenu receptori D2 in NAcc.
Risposte alla lingua
Analisi di MSN in Drd1-EGFP è Drd2-EGFP BAC Transgenic Mice.
U mudellu di proiezione di MSN da striatum dorsale è ventrale in i topi transgenici Drd1-EGFP o Drd2-EGFP BAC hè statu carattarizatu da l'analisi di l'espressione GFP (36). L'espressione differenziale di GFP in MSN di striatum dorsale currisponde generalmente à quella di i receptori D1 o D2 endogeni, rispettivamente.36). Avemu analizatu ancu l'espressione differenziale di GFP in NAcc in i topi Drd1-EGFP o Drd2-EGFP (Fig. 1a e b). Ancu se ≈ 58% di i neuroni in NAcc esprimenu GFP in i topi Drd1-EGFP (Fig. 1a), ≈48% di i neuroni in NAcc espressi GFP in i topi Drd-2-EGFP (Fig. 1b). I MSN rapprisentanu u 90-95% di tutti i neuroni in NAcc (12, 37). I recettori D1 sò spressi solu in MSN, è i receptori D2 sò spressi in MSN è in interneuroni colinergici, chì rapprisentanu 1-3% di i neuroni striatali.37). Pigliendu questi fattori in contu, i risultati suggerenu chì, minimamente, ≈10-15% di MSN in NAcc sò prubabilmente spressione i dui receptori D1 è D2.
Analisi di spine dendritiche in i topi Drd1-EGFP è Drd2-EGFP.
L'espressione di GFP in i topi Drd1-EGFP è Drd2-EGFP hè stata utile per tinghje i corpi di cellule neuronali. In ogni casu, u signale GFP in dendrites è spines dendritic era troppu debule per permette a so analisi dopu à immunostaining cù anticorpi anti-GFP. A consegna balistica mediata da particelle di coloranti fluorescenti hè stata recentemente aduprata per etichettate e populazioni neuronali in modu rapidu è efficiente (38). Neuroni interi ponu esse etichettati cù sta tecnica, è u metudu pare esse paragunabile à a tintura Golgi-Cox. Per analizà a morfologia dendritica di i neuroni in NAcc, fette di accumbal fissi sò state etichettate cù u colorante di fluorescenza lipofila 1,1′-diotadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) utilizendu una pistola genica. Un esempiu di un MSN macchiatu DiI hè mostratu in Fig. 1c. In e cundizioni aduprate, avemu generalmente osservatu neuroni etichettati senza dendriti sovrapposti da altri neuroni etichettati. À un ingrandimentu più altu, a morfologia dendritica dettagliata, cumprese spine dendritiche, puderia esse osservata (Fig. 1d).
Dopu avemu usatu una cumminazione di l'etichettatura DiI è l'immunoistochimica per a GFP in i topi transgenici Drd1-EGFP o Drd2-EGFP, chì hè statu pussibule cù l'usu di una bassa concentrazione di detergente per a permeabilizazione di i tessuti (vede mètudi). Attraversu un paragone attentu di a macchia DiI è l'espressione di GFP in i corpi cellulari di MSN, pudemu identificà neuroni DiI- è GFP-positivi o DiI-positivi è GFP-negativi in Drd1-EGFP (Fig. 2a) o Drd2-EGFP (Fig. 2b) surci. Per i studii seguenti, avemu analizatu a morfologia dendritica solu in neuroni positivi DiI è GFP da i topi Drd1-EGFP o Drd2-EGFP.
U trattamentu cronicu di cocaina risultati in una densità di spina aumentata in Accumbal MSN chì esprimenu Drd1-EGFP o Drd2-EGFP.
I topi Drd1-EGFP o Drd2-EGFP sò stati iniettati ripetutamente cù cocaina (30 mg / kg) o salina per quattru settimane consecutive (vede mètudi). Dui ghjorni (2WD) o 30 ghjorni (30WD) dopu l'ultimu trattamentu di droga, i cervelli sò stati processati per l'etichettatura DiI è l'immunohistochimica cum'è descritta sopra. Un studiu precedente hà infurmatu chì u trattamentu cronicu cù l'anfetamina hà aumentatu a densità di a spina nantu à i dendriti distali ma micca proximali di MSNs in NAcc.35). Avemu dunque limitatu a nostra analisi à i dendriti distali (vale à dì, quelli cù rami di seconda o terza ordine), cumprese e regioni terminali. Quandu analizatu à 2WD, a densità di a spina hè stata trovata per aumentà in MSN Drd1-EGFP-positivi (128% di u gruppu saline) (Fig. 3a e c) è in una misura minore in i neuroni Drd2-EGFP-pusitivi (115% di u gruppu saline) (Fig. 3 b e d). Dopu à 30WD, a densità di a spina aumentata hè stata mantinuta in i neuroni Drd1-EGFP-positivi (118% di u cuntrollu saline) (Fig. 3 a e c) ma micca in i neuroni Drd2-EGFP-positivi (Fig. 3 b e d).
A morfologia di e spine dendritiche hè variabile in quantu à a so lunghezza è a larghezza di a testa di a spina. Dunque, avemu classificatu i protrusioni dendritiche in quattru classi di spine (stubby, mushroom, thin è filopodia) à 2WD da cocaina (dati micca mostrati). A densità di funghi (119.7 ± 4.0%, P < 0.01) è spine sottili (120.0 ± 3.4%, P <0.01) hè stata aumentata da u trattamentu di cocaina in MSN Drd1-EGFP-positivi, mentri a densità di stubby (182.4 ± 21.6%, P < 0.05) è spine di funghi (122.5 ± 5.0%, P < 0.01) hè stata aumentata in i MSN Drd2-EGFP-positivi. Ùn ci era micca un aumentu significativu di spine stubby in neuroni Drd1-EGFP-positivi o di spine sottili in neuroni Drd2-EGFP-positivi.
A cocaina cronica induce l'espressione ΔFosB in MSN Drd1-EGFP- o Drd2-EGFP-Positive in NAcc.
ΔFosB hè un membru di a famiglia Fos di fattori di trascrizione. Mentre l'amministrazione acuta di cocaina induce una induzione rapida è transitoria di parechje isoforme Fos in NAcc, l'esposizione ripetuta à a cocaina aumenta u livellu di ΔFosB. Inoltre, l'aumentu di l'espressione di ΔFosB persiste in NAcc da settimane à mesi dopu a discontinuazione di l'esposizione à a droga è hè statu suggeritu per esse implicatu in una regulazione di longa durata di l'espressione genica, ancu dopu a cessazione di l'assunzione di droghe.29, 39, 40).
Per esaminà l'induzione di ΔFosB in NAcc da i topi Drd1-EGFP o Drd2-EGFP dopu u trattamentu di cocaina, avemu analizatu l'espressione FosB è GFP per doppia etichettatura (Fig. 4 e Table 1) L'anticorpu anti-FosB ricunnosce tutte e forme di FosB, ma assumemu chì l'immunostain aumentata rapprisenta ΔFosB (vede mètudi per ulteriori discussioni). In i topi trattati cù salina, u 16% di i neuroni Drd1-EGFP-positivi è u 15% di i neuroni Drd2-EGFP-positivi esprimenu l'immunoreattività FosB cù intensità relativamente debule (Fig. 4 a e b e Table 1). U trattamentu ripetutu di cocaina seguita da 2WD hà risultatu in un aumentu significativu di u numeru di neuroni positivi Drd1-EGFP chì coexpressed ΔFosB (55% di neuroni GFP-positivi) (Fig. 4c e Table 1). Un aumentu più chjucu, ma ancu significativu di l'espressione ΔFosB hè statu trovu in i neuroni positivi Drd2-EGFP (25% di neuroni positivi GFP) (Fig. 4d e Table 1). Cum'è cù i cambiamenti in a densità di a spina, l'espressione aumentata di ΔFosB hè stata mantinuta in neuroni positivi Drd1-EGFP (46% di neuroni positivi GFP) ma micca in neuroni positivi Drd2-EGFP (15% di neuroni positivi GFP) dopu 30WD (Fig. 4 e e f e Table 1). Nota chì l'espressione ΔFosB aumentata osservata in Fig. 4f hè presente in i neuroni Drd2-EGFP-negativi.
Articulu discussione
L'adattazioni di longa durata in a neurotrasmissione dopaminergica sò crede chì sottumettenu cumpurtamenti addictive assuciati cù droghe psicostimulanti. In particulare, l'aumentu indottu da psicostimulanti in a densità di a spina dendritica di MSNs in NAcc sò stati ipotizzati per esse ligatu à a riurganizazione di a connettività sinaptica.30). U NAcc hè largamente cumpostu di duie subpopulazioni distinte di MSN chì esprimenu livelli elevati di recettori di dopamina D1 o D2. In u presente studiu, avemu analizatu a densità di a spina in MSN distinti chì cuntenenu receptori D1 o D2 in NAcc dopu u trattamentu cronicu di cocaina. I risultati ottenuti mostranu chì, ancu s'è a densità di spine aumentata inizialmente si trova in MSN chì cuntenenu u receptore D1 è MSN chì cuntenenu u receptore D2, a densità spine alterata hè stabile solu in i neuroni chì cuntenenu u receptore D1. Inoltre, truvemu un mudellu simili di cambiamenti in l'espressione di u fattore di trascrizione ΔFosB in MSN chì cuntenenu receptori D1 è D2.
Questi studii anu fattu usu di topi transgenici BAC chì esprimenu GFP in subpopulazioni specifiche di MSN sottu u cuntrollu di u promotore di u receptore D1 o D2. Inoltre, avemu sviluppatu un metudu di doppia etichettatura chì combina l'immunoistochimica per a GFP cù l'etichettatura balistica di i neuroni cù DiI. Studi precedenti anu utilizatu u metudu Golgi-Cox per analizà l'effettu di i psicostimulanti nantu à a densità di a spina.34), è u metudu DiI utilizatu quì hà datu risultati chì eranu quantitativamente paragunabili. Avemu sviluppatu u metudu di doppia etichettatura perchè a tintura di Golgi ùn hè micca cumpatibile cù l'immunoistochimica. L'immunostaining generalmente richiede permeabilizazione di tissuti cù detergenti, un prucessu chì tipicamente porta à solubilizazione di coloranti lipofili da a membrana (38). Tuttavia, in i nostri studii attuali, l'immunostaining GFP ùn hà micca bisognu di una alta concentrazione di detergente per a permeabilizazione di i tessuti è cusì puderia esse aduprata in cunjunzione cù l'etichettatura di tintura lipofila. U nostru metudu di doppia etichettatura deve esse generalmente utile per studii di cambiamenti strutturali in spine dendritiche, per esempiu, quandu s'utilice per l'analisi di e linee di topi transgenici BAC induve GFP hè espressa in pupulazioni specifiche di neuroni in a corteccia.36).
Ancu s'ellu hè sempre un pocu cuntruversu, si crede chì i receptori D1 è D2 sò largamente segregati anatomicamente à i neuroni di projezzione striatale diretta (striatonigral) è indiretta (striatopalidali), rispettivamente (17, 41). A caratterizzazione iniziale di a localizazione di GFP in i topi Drd1-EGFP è Drd2-EGFP era coherente cù sta cunclusione (36). Inoltre, a nostra analisi di u numeru di neuroni GFP-positivi in NAcc da i topi Drd1-EGFP è Drd2-EGFP hè coherente cù a cunclusione chì ≈50% di MSNs esprimenu solu receptori D1, chì ≈35-40% esprimenu solu receptori D2, è chì ≈10-15% coexpress i dui receptori D1 è D2. Stu valore di coespressione hè simile à quellu implicatu da studii di striatum dorsale chì combina l'analisi di patch-clamp di neuroni striatali unichi cù tecniche RT-PCR per isolà è amplificà l'mRNAs (≈17% coexpression of enkephalin è sustanza P) (42). Semu devi esse nutatu chì i nostri studii attuali ùn anu micca trattatu a quistione di l'espressione di i receptori D3, D4 è D5, nè ùn trattanu micca u prublema di bassi livelli di spressione di i receptori D1 in MSN chì esprimenu alti livelli di receptori D2 o vice versa.
Diversi studii precedenti anu esaminatu a localizazione neuronale di l'espressione Fos indotta da psicostimulanti è u rolu di i receptori D1 è D2.43-45). Quelli studii sustenevanu a cunclusione chì l'induzione Fos è ΔFosB hè mediata da l'attivazione di i receptori D1. Tuttavia, a localizazione cellulare di l'espressione Fos hè influenzata da u cuntestu ambientale in quale sò amministrati droghe psicostimulanti (46, 47). Per esempiu, l'anfetamina o a cocaina data in a gabbia di casa induce geni precoci immediati (inclusi Fos) preferenzialmente in cellule P-positivi di sustanza chì coexpress receptori D1. In cuntrastu, queste droghe ponu induce l'espressione di Fos in MSN chì cuntenenu receptori D1 è D2 quandu sò amministrati in un ambiente novu. U protokollu utilizatu in i nostri studii attuali ùn includeva micca l'accoppiamentu di l'iniezione di droga cù l'esposizione à un ambiente novu. Tuttavia, ùn pudemu micca escludiri una sorta di stress dipendente da u cuntestu chì hè rispunsevule per l'espressione ΔFosB in MSN chì cuntenenu receptori D2.
Una caratteristica notevole di i risultati attuali era u mudellu parallelu di a densità di a spina aumentata è l'espressione ΔFosB. A densità di a spina aumentata è l'espressione ΔFosB si sò inizialmente accaduti in MSN chì esprimenu Drd1-EGFP è Drd2-EGFP. Tuttavia, sti cambiamenti eranu stabile solu in i neuroni chì cuntenenu u receptore D1. Una spiegazione pussibule per l'osservazione chì l'aumentu di a densità di a spina è l'espressione ΔFosB hè stata trovata transitoriamente in i neuroni chì cuntenenu u receptore D2 hè chì questu hè accadutu in a piccula frazione di MSN chì coexpress i recettori di dopamina D1 è D2. Cusì, a natura transitoria di questi aumenti pò esse assuciata cù effetti antagonistichi di l'attivazione di u receptore D2 nantu à i camini di signalazione dipendente da D1 (48). Hè d'interessu chì i cambiamenti in a densità di a spina è l'espressione ΔFosB eranu riversibili, chì ponu riflette l'abilità di i camini di signalazione dipendente da u receptore D2 per influenzà a stabilità di ΔFosB.
L'osservazione chì ci sò cambiamenti paralleli in l'espressione di ΔFosB è a densità di a spina hè coherente cù l'idea chì ΔFosB hè implicatu in a furmazione iniziale è u mantenimentu sussegwente di spine dendritiche in i neuroni chì cuntenenu receptori D1 in NAcc. L'espressione di ΔFosB hè cuntrullata da a via di signalazione dipendente di D1 / DARPP-32 / PP1 in MSN (49). Diversi studii anu dimustratu chì ΔFosB ghjoca un rolu impurtante in l'azzioni gratificante è attivazione locomotore di psicostimulanti (39), prubabilmente influenzendu l'espressione di geni multipli chì includenu i receptori di neurotrasmettitori, proteine di signalazione, è proteini implicati in a regulazione di a morfologia neuronale (50). Tuttavia, i meccanismi molecolari specifichi implicati in a furmazione cronica di a spina indotta da a cocaina ùn sò micca cunnisciuti attualmente. I nostri studii precedenti anu dimustratu chì l'infusione intraaccumbal di l'inibitore di Cdk5 roscovitine attenuava l'aumentu indottu da a cocaina in a densità di a spina.51). Inoltre, Cdk5 hè un genu di destinazione downstream per ΔFosB è hè statu implicatu in cambiamenti adattativi compensatori assuciati à u trattamentu cronicu di cocaina (52). Dunque, l'alterazione in a fosforilazione dipendente da Cdk5 hè un mecanismu plausibile sottu à a furmazione di a spina indotta da cocaina è / o a stabilità di a spina. PAK (53), β-catenine (54), PSD-95 (55), è spinofilina (56) sò sustrati per Cdk5 è sò tutti implicati in a regulazione di a morfogenesi di a spina (57-60). A più carattarizazione di questi è altri sustrati di Cdk5 in spine speraranu di mette in luce nantu à i miccanismi implicati in a regulazione di a furmazione di spine da psicostimulanti.
mètudi
Animals.
I topi chì portanu un transgene EGFP sottu u cuntrollu di i recettori di dopamina D1 o D2 sò stati generati da u prughjettu transgenicu Gensat BAC (36). I topi transgenici utilizati in stu studiu avianu 4-5 settimane d'età è eranu nantu à un fondu Swiss-Webster. I topi sò stati mantinuti in un ciculu di luce / scuru di 12: 12 h è allughjati in gruppi di 2-5 cù l'alimentariu è l'acqua dispunibule ad libitum. Tutti i protokolli di l'animali eranu in cunfurmità cù a Guida di l'Istituti Naziunali di Salute per a Cura è l'Usu di l'Animali di Laboratoriu è sò stati appruvati da u Cumitatu Istituziunale di Cura è Usu di l'Animali di l'Università Rockefeller.
Trattamentu di droga.
U trattamentu cronicu di cocaina (30 mg / kg, ogni ghjornu) hè statu informatu per pruduce un robustu aumentu di a densità di a spina di MSN sia in u core è in a cunchiglia di NAcc da u ratu, ma una dosa più bassa (15 mg / kg) hà aumentatu a densità di a spina solu in a cunchiglia (61). Dunque avemu usatu a dosa più alta di cocaina per induce a mudificazione strutturale in e duie parti di NAcc. I topi anu ricevutu una iniezione (ip) di 30 mg / kg di cocaine-HCl (o salina) ogni ghjornu per 5 ghjorni consecutivi, seguitu da 2 ghjorni senza iniezione, è sta prucedura hè stata ripetuta per 4 settimane consecutive. L'injections sò state realizate in a gabbia di casa. 2WD o 30WD, i cervelli di i mouse sò stati processati per l'etichettatura DiI è / o immunoistochimica.
Etichettatura balistica cù a tintura fluorescente DiI.
I topi sò stati anestetizzati cù 80 mg / kg di sodium pentobarbital è perfused transcardially cù 5 ml di PBS, seguitu da perfusione rapida cù 40 ml di 4% paraformaldehyde in PBS (20 ml / min). I cervelli sò stati sguassati rapidamente da u cranu è postfixed in 4% paraformaldehyde per 10 min. I fette di u cervellu (100 μm) sò state marcate da a consegna balistica di coloranti fluorescenti DiI (Molecular Probes) cum'è descritta in a ref. 38. Un metudu cumminatu di etichettatura DiI-immunoistochimica hè statu sviluppatu cù una bassa cuncentrazione di detergente. E sezioni marcate DiI sò state permeabilizate cù 0.01% Triton X-100 in PBS per 15 min è poi incubate in 0.01% Triton X-100 è 10% serum di capra normale in PBS per 1 h per minimizzà l'etichettatura non specifica. I sezzioni di tissuti sò stati poi incubati cù 1% di serum di capra normale / 0.01% Triton X-100 è anticorpi anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA) per 2 h à a temperatura di l'ambienti, lavati è incubati in una diluzione 1: 1,000 di FITC- anticorpu secundariu cunjugatu (Molecular Probes). E rùbbriche sò stati posti nantu à diapositive di microscopiu è coperti cù un mediu di muntatura. U metudu di etichettatura balistica hà permessu l'analisi dettagliata di a struttura di a spina dendritica, è i risultati ottenuti eranu paragunabili qualitativamente è quantitativamente cù studii precedenti chì utilizanu u metudu di impregnazione Golgi-Cox in fette di cervellu di ratti (34). In ogni casu, in cuntrastu à i studii precedenti, raramente avemu osservatu spine à dui capi in neuroni macchiati di DiI. Sta differenza pò esse causata da a sensibilità di i metudi di tintura o a variabilità di u mouse (stu studiu) versus u tissutu di u topu (34).
Immunohistochemistry.
L'animali sò stati anestesiati è perfusi cum'è descrittu sopra. I cervelli sò stati eliminati è almacenati per a notte in 4% paraformaldeide à 4 ° C. I cervelli sò stati trasferiti à 30% di saccarosi in suluzione PBS per a crioprotezzione. Sezioni coronali (12 μm) sò state tagliate nantu à un microtomu di congelazione (Leica) è poi processate per immunoistochimica. E sezioni di u cervellu sò state poi permeabilizate in 0.3% Triton X-100 in PBS per 15 min è lavate duie volte in PBS. I sezzioni sò stati preincubati in 10% di serum di capra normale in PBS per 1 h à 37 ° C, esposti à anticorpi primari (diluitu in 1% di serum di capra normale in PBS) durante a notte à 4 ° C, è poi sciacquati in PBS è incubati cù secundariu. anticorpi per 1 h à 37 ° C. I seguenti anticorpi sò stati utilizati: rabbit anti-pan-FosB (SC-48, 1:500; Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-NeuN (Chemicon), rabbit anti-GFP, FITC-conjugated anti-rabbit IgG, è rhodamine- Conjugated anti-mouse IgG (Molecular Probes). Per l'etichettatura tripla (ΔFosB, NeuN è GFP), e sezioni di u cervellu sò state prima immunostained cù anticorpi anti-pan FosB è anticorpi anti-NeuN è poi incubati cù anticorpi secondari (IgG anti-coniglio coniugato con rodamina e IgG anti-topo coniugati con ciano. ). E sezioni cerebrali doppia macchiate sò state ulteriormente processate per l'immunostaining GFP utilizendu a tecnulugia di etichettatura Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). L'anticorpu anti-pan-FosB hè statu elevatu à l'estremità N di FosB è ricunnosce ΔFosB è FosB full-length (62). Basatu nantu à studii precedenti chì anu dimustratu chì ΔFosB ma micca FosB o altri antigeni legati à Fos sò espressi in modu stabile dopu à u trattamentu cronicu di cocaina, assumemu chì l'aumentu di l'immunoreattività à longu andà rapprisentanu l'espressione stabile di ΔFosB. Tuttavia, l'identità di u signale FosB immunoreattivu osservatu in i topi trattati cù salina hè scunnisciuta. Analisi statistica in Table 1 utilizatu u Studiente t test.
Analisi di a spina dendritica.
I MSN individuali in u NAcc sò stati scelti per l'analisi spine basatu annantu à parechji criteri. (i) Ci era una superposizione minima o nulla cù altre cellule etichettate per assicurà chì i prucessi di e diverse cellule ùn saranu micca cunfunditi. (ii) Almenu trè dendriti primari avianu bisognu à esse visibili per e cellule per esse usate per l'analisi. (III) I dendriti distali (dendriti terminali o vicinu à a dendrite terminal) sò stati esaminati. Dendriti da i dui MSN in u core è a cunchiglia di u NAcc sò stati analizati. Ancu se avemu osservatu MSN scarsamente spined (spiny type II), avemu analizatu solu MSN densamente spined (spiny type I). Per calculà a densità di a spina, una lunghezza di dendrite (> 20 μm long) hè stata tracciata cù un microscopiu confocale (Zeiss LSM 510) cù una lente d'immersione d'oliu (×40). Tutte l'imaghjini di dendriti sò stati pigliati in diverse z livelli (intervalli di prufundità 0.5-1 μm) per esaminà a morfologia di e spine dendritiche. Tutte e misurazioni sò state fatte cù un software di analisi di l'imaghjini metamorfosi (Universal Imaging, Downingtown, PA). L'analisi statistiche hà utilizatu a prova di Kolmogorov-Smirnov.
Protrusioni da i dendriti sò stati classificati in quattru tippi basati nantu à a so lunghezza cum'è descritta in refs. 63 e 64. I protrusioni di a Classe 1, ancu chjamate protuberanza stubby, eranu <0.5 μm in longu, mancava una grande testa di spine, è ùn pareva micca avè un collu; a classa 2, o spine in forma di fungo, eranu trà 0.5 è 1.25 μm longu è sò carattarizati da un collu curtu è un capu di spine grande; a classa 3, o spine sottili, varieghja trà 1.25 è 3.0 μm è avianu u collu spine allungatu cù capi chjuchi; a classe 4, o estensioni filopodiali, eranu protrusioni filamentose longu chì mancavanu una testa spine discernibile.
Acknowledgments
Stu travagliu hè statu sustinutu da i Stati Uniti Public Health Service Grant DA10044 (à PG è ACN) è da The Simons Foundation, Peter J. Sharp Foundation, Picower Foundation è FM Kirby Foundation.
Abbreviations
- NAcc
- nucleus accumbens
- MSN
- neurone spinoso di medie dimensioni
- BAC
- cromosoma artificiale batterica
- Drd1
- U receptore di dopamina D1 guidatu da u promotore
- Drd2
- U receptore di dopamina D2 guidatu da u promotore
- DiI
- 1,1′-diotadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato
- 2WD
- 2 ghjorni dopu l'ultimu trattamentu di droga
- 30WD
- 30 ghjorni dopu l'ultimu trattamentu di droga.
Vede ancu
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